DK169346B1 - Tetradecapeptider (thrombin-beta-kæde-homologe) med mitogen aktivitet og fysiologisk acceptable salte deraf samt fremgangsmåde til stimulering af væksten af makrofag-lignende celler - Google Patents

Description

i DK 169346 Bl

Denne opfindelse angår hidtil ukendte peptider eller fysiologisk acceptable salte deraf, som har mitogen aktivitet for makrofag-lignende celler, samt en fremgangsmåde til stimulering af væksten af makrofag-lignende celler.

5

Opfindelsens baggrund

Det er kendt, at thrombin har mange slags virkninger på celler. Foruden dets evne til at koagulere fibrinogen og 10 enzymatisk aktivere andre faktorer i det plasmakoagulerende system, er det blevet rapporteret, at thrombin har mitogen aktivitet i en række forskellige fibroblastcelle-linier i vævskultur; se f. eks. Perdue et al., J. Biol. Chem. 256, 2767-2776 (1981). Dets funktion som vækststi-15 mulator for fibroblaster er intimt forbundet med dets esterolytiske aktivitet.

Thrombin er også mere for nyligt blevet beskrevet at have kemotaktisk aktivitet i humane perifere blodmonocytter; 20 Bar-Shavit et al., J. Cell Biol. 96, 282-285 (1983).

Der er blevet gjort forsøg på at identificere det eller de domæner i thrombin, som er ansvarlige for dets forskellige biologiske aktiviteter. Således konkluderer Bar-25 Shavit et al., Science 220, 728-730 (1983), at den kemo-taktiske aktivitet formidles af et specifikt område på thrombin-molekylet, som er uafhængigt af de centre, som kræves for esterolytisk aktivitet og fibrinogen-genken-delse. Betydningen af den kemotaktiske funktion er, at 30 den kan være en vigtig fysiologisk stimulator af inflammatoriske reaktioner ved steder for vævsbeskadigelse. Denne kemotaktiske funktion, som involverer retningsbevægelse af cellerne, må skelnes fra en mitogen funktion, som er en vækstfaktoraktivitet i celler, dvs. en faktor, 35 som stimulerer cellers deling og differentiering. Det er tidligere blevet antydet, at thrombin også kan udløse en mitogen virkning på makrofag-lignende celler; Bar-Shavit DK 169346 B1 2 et al., J. Cell. Biol. 97, 396a, Abstract 1494 (1983).

Kort beskrivelse af opfindelsen 5 Det har nu ifølge opfindelsen vist sig, at visse tetrade-capeptid-homologe til den humane thrombin-β-kæde er kraftige mitogener for makrofag-lignende celler. Disse mi togene peptider er kendetegnet ved at omfatte den følgende aminosyresekvens: 10 H-Tyr-Pro-Pro-X-Asn-Lys-Asn-Phe-Thr-Glu-Asn-Asp-Leu-Leu-OH, hvori X = Trp eller Tyr, eller fysiologisk acceptable salte deraf.

15

Opfindelsen omfatter også en fremgangsmåde til stimulering af væksten af makrofag-lignende celler, som er kendetegnet ved, at cellerne udsættes for en vækststimulerende mængde af et peptid ifølge opfindelsen.

20 I de peptidstrukturer, som vises i denne beskrivelse med krav, betegnes aminosyrekomponenterne ved konventionelle forkortelser som følger: 25 30 35 DK 169346 B1 3

Aminosyre_Symbol

L-alanin Ala eller A

5 L-arginin Arg eller R

L-asparagin Asn eller N

L-aspartaginsyre Asp eller D

L-cystein Cys eller C

L-glutaminsyre Glu eller E

10 L-glutamin Gin eller Q

Glycin Gly eller G

L-histidin His eller H

L-isoleucin Ile eller I

L-leucin Leu eller L

15 L-lysin Lys eller K

L-methionin Met eller M

L-phenylalanin Phe eller F

L-prolin Pro eller P

L-serin Ser eller S

20 L-threonin Thr eller T

L-tryptophan Trp eller W

L-tyrosin Tyr eller Y

L-valin Val eller V

25

Peptid I, som har aminosyresekvensen: H-Tyr-Pro-Pro-Trp-Asn-Lys-Asn-Phe-Thr-Glu-Asn-Asp-Leu-Leu-OH, 30 repræsenterer resterne 367-380 i den humane thrombin B-kæde (eller resterne 96-109 i den humane præthrombin 2 sekvens). Sekvensen af humant præthrombin 2 er blevet rapporteret af Butkowski et al., J. Biol. Chem. 252, 4942-4957 (1977). Ved udledningen af den primære struktur 35 af humant præthrombin 2 fremstillede Butkowski et al. visse chymotryptiske peptidfragmenter af cyanbromid-spaltningsproduktet af præthrombin 1, hvor et af fragmen- DK 169346 B1 4 terne svarer til resterne 95-109 i præthrombin 2. Imidlertid blev dette fragment ikke tilskrevet nogen biologisk aktivitet, og 96-109 fragmentet ifølge den foreliggende opfindelse blev heller ikke fremstillet eller fo-5 reslået.

Peptid II, som har aminosyresekvensen: H-Tyr-Pro-Pro-Tyr-Asn-Lys-Asn-Phe-Thr-Glu-Asn-Asp-Leu-Leu-OH, 10 er en analog til peptid I, hvori tryptophan er erstattet med tyrosin.

Overraskende viste det sig, at de hidtil ukendte tetrade-15 capeptider ifølge opfindelsen udviser kraftig mitogen aktivitet for makrofag-lignende celler, medens de følgende to fragmenter deraf er inaktive:

Peptid III H-Thr-Glu-Asn-Asp-Leu-Leu-OH

20 Peptid IV H-Asn-Lys-Asn-Phe-Thr-Glu-Asn-Asp-Leu-Leu-OH

Disse erkendelser tyder på, at den aminoterminale portion af peptiderne I og II er vigtig for den mi togene aktivitet af peptiderne ifølge opfindelsen.

25

Detaljeret beskrivelse af opfindelsen

Opfindelsen belyses nærmere ved den efterfølgende detailbeskrivelse af foretrukne udførelsesformer i forbindelse 30 med tegningerne, på hvilke: fig. 1 er en model af human a-thrombin-struktur; og fig. 2 er en grafisk repræsentation af makrofag-lignende 35 J774 musecellers thymidininkorporering og totale celle- protein-niveauer efter udsættelse af cellerne for et syntetisk mitogent peptid i en udførelsesform af opfindel- DK 169346 B1 5 sen.

Modellen af humant «-thrombin i fig. 1 er baseret på pro-teinnomenclaturen for prothrombin, et enkelt-kæde-zymo-5 gen, som senere aktiveres og spaltes i en 2-kæde-struktur ved resterne 272 og 321 af Factor Xa. Det således producerede aktive enzym deleterer de første 13 rester af A-kæden ved rest 285 ved en autokatalytisk hændelse til dannelse af α-thrombin. Strukturen af peptid CB67-129 er 10 vist med "løkke B"-indsætningssekvensen (dvs. resterne 367-375) angivet ved skravering. Lokaliseringerne af det aktive center His 363 (hexagon) og carbonhydrat-tilknyt-ningscenteret (ved Asn 373), vigtige strukturtræk hos dette fragment, er også angivet. Amidtilskrivningen på 15 Asx 355 og 371 er usikker, ligesom de præcise grænser for "løkke B" thrombin B-kædeindsætningssekvensen.

De hidtil ukendte mitogene peptider ifølge opfindelsen kan fremstilles ved passende tilpasning af konventionelle 20 fremgangsmåder til peptidsyntese. Således kan peptidkæden fremstilles ved en række koblingsreaktioner, hvorved ami-nosyrebestanddelene tilføjes den voksende peptidkæde i den ønskede sekvens. Anvendelsen af forskellige N-beskyttende grupper, f. eks. benzyloxycarbonylgruppen eller t-25 butyloxycarbonylgruppen (BOC), forskellige koblingsrea genser, f. eks. dicyclohexylcarbodiimid eller carbonyldi-imidazol, forskellige aktive estere, f. eks. estere af N-hydroxyphthalimid eller N-hydroxysuccinimid, og forskellige spaltningsreagenser, f. eks. trifluoreddikesyre, HC1 30 i dioxan, bortris(trifluoracetat) og cyanbromid, og reaktion i opløsning med isolering og rensning af mellemprodukter er velkendt klassisk peptidmetodologi.

Fortrinsvis fremstilles peptiderne ifølge opfindelsen ved 35 den velkendte Merrifield-fast-bærer-metode; se Merri- field, J. Amer. Chem. Soc. 85, 2149-54 (1963) og Science 150, 178-85 (1965). Selv om der herved anvendes mange af DK 169346 Bl 6 de samme kemiske reaktioner og blokerende grupper som ved klassisk peptidsyntese, tilvejebringer denne procedure en voksende peptidkæde forankret ved dens carboxylterminus til en fast bærer, sædvanligvis tværbundet polystyren el-5 ler styren-divinylbenzen-copolymer. Denne fremgangsmåde simplificerer på hensigtsmæssig måde antallet af procedu-remanipulationer, da fjernelse af overskudsreagenserne i hvert trin frembringes simpelthen ved vaskning af polymeren.

10

Den almene reaktionsfølge for konventionel Merrifield-peptidsyntese kan belyses som følger: 2 5 OCHjOCHj +

CICH;-^ PS + CHjOH

20

Chlormethyleringstrin for at tilvejebringe en reaktiv gruppe til fasthæftning af peptidet, hvori PS * polystyrenrest.

25 ° R' u {CH3)jCOCNHCHCOO-(CHjCH2)jN+H + cich2—^ y~ps- 30 11 I II / Λ (CHjJjCOCNHCHCOCHj ξ \_ps + (CHjCHihN+Ha-

Esterificeringstrin ved omsætning med triethylammonium-35 saltet af den første beskyttede aminosyre (R1) under anvendelse af t-BOC-beskyttelsesgruppen.

DK 169346 B1 7 i f τ'? y _

CCH3)jCOCNHCHCOOH + Q>HnN=C=NCfrHii + H2NCHCOCH2 f >—PS

5 O RJ O R1O L-\ O

(CHj)jCX)CNHCHCNHCHCOCH2 / J— PS + CiHuNHCNHCiHii^- 10 Peptiddannelsestrin med dicyclohexylcarbodiimid-koblings- middel. Efter dette trin III følger fraspaltning af t-BOC, f. eks. ved behandling med 25% trifluoreddikesyre i methylenchlorid og frigørelse af N-terminal amin med overskud af triethylamin, hvorved den sættes i stand til 15 at reagere med den aktiverede carboxylgruppe i den næste 2 beskyttede aminosyre (R ). Et afsluttende trin involverer fraspaltning af det fuldførte peptid fra PS-harpiksen, f. eks. ved behandling med vandfrit HF i anisol.

20 Yderligere baggrundsinformation vedrørende den etablerede fast-fase-synteseprocedure kan fås i afhandlingen af Stewart and Young, "Solid Phase Peptide Synthesis," W. Η. Freeman and Co., San Francisco, 1969, og oversigtskapitlet af Merrifield i Advances in Enzymology 32, side 221- 25 296, F. F Nold, Ed., Interscience Publishers, New York, 1969; og Erickson and Merrifield, The Proteins, Vol. 2, side 255 et seq. (ed. Neurath and Hill), Academic Press,

New York, 1976.

30 Vækststimuleringen af makrofag-lignende celler kan bestemmes ved måling af cellernes thymidinoptagelse ved forskellige koncentrationer af de mitogene peptider ifølge opfindelsen. Denne blev bestemt for flere makrofag-lignende cellelinier, herunder J774, P388D1, RAW og PU5.

35 Disse er velkendte musecellelinier, som kan skaffes f. eks. fra the American Type Culture Collection, Rockville, Maryland, U.S.A.

DK 169346 B1 8

De følgende eksempler tjener til nærmere belysning af opfindelsen.

5 Eksempel 1

Peptid I, H-Tyr-Pro-Pro-Trp-Asn-Lys-Asn-Phe-Thr-Glu-Asn-Asp-Leu-Leu-OH, repræsenterende resterne 367-380 i human thrombin-B kæden og indeholdende løkke B indsætningsse-10 kvensen som vist i fig. 1, blev syntetiseret ved en modifikation af den konventionelle Merrifield fast-fase-pep-tidsyntese, som beskrevet af Wilner et al., Biochemistry 15 (6), 1209-1213 (1976) og 18 (23), 5078-5082 (1979).

Det fuldt beskyttede peptid blev samtidigt afbeskyttet og 15 spaltet fra dets harpiksbærer ved den HF-katalyserede totrins SN2-procedure beskrevet af Tam et al., J. Am. Chem.

Soc. 105, 6442-6455 (1983). Det rå peptid blev definitivt renset ved ionbytterchromatografi på en DEAE- " Sephacel®" -kolonne ved den metode, der er beskrevet af Wilner et 20 al., Biochemistry 15 (6), 1209-1213 (1976). Peptidets renhed blev fastslået ved revers-fase C^g-højydelses-væs-kechromatografi (HPLC) ifølge den procedure, der er beskrevet Fulmer et al., J. Biol. Chem. 254, 7208-7212 (1979), hvor det chromatograferede som en enkelt top.

25 Peptidet fandtes også at være homogent ved tyndtlagschro-matografi (TLC), hvor det vandrede som en enkelt plet under anvendelse af to forskellige opløsningsmiddelsyste mer. Aminosyreanalyse gav molære forhold i overensstemmelse med den Ønskede peptidsekvens.

30

Ved denne peptidsyntese var alle komponenter af reagenskvalitet. Na-tert-butoxycarbonyl-(BOC)-L-aminosyrer blev købt fra Bachem, Inc., Torrance, CA, U.S.A. BOC-aminosy-rer med beskyttede sidekæder var r-benzylglutaminsyre, 0-35 benzylasparaginsyre, O-benzylthreonin, 2-chlorbenzyloxy-carbonyl-L-lysin, N-formyl tryptophan, og 0-benzyl tyrosin. Asparagin blev indført ubeskyttet ved direkte kobling med DK 169346 B1 9 dicyclohexylcarbodiimid i nærvær af ækvimolært 1-hydroxy-benzotriazol. Renheden af BOC-aminosyrerne blev bedømt ved smeltepunkter (ukorrigerede) og tyndtlagschromatogra- fi. DEAE-"Sephacel®" blev skaffet fra Pharmacia Fine 5 Chemicals, Piscataway, NJ, U.S.A. "Bio-Gel® P-2" (maskevidde 37-74 um) blev købt fra Bio-Rad Laboratories, Rockville Centre, NY, U.S.A. Styren-divinylbenzen-kugler, 1% tværbundet, maskevidde 37-74 um, chlormethyleret (1,16 mækv. Cl pr. g), blev købt fra Lab Systems, Inc., San 10 Mateo, CA. U.S.A., og blev ekstraheret med varmt (60 °C) dimethylformamid i 18 timer før anvendelsen.

Ved peptidsyntesen gennemførtes esterificering af den COOH-terminale rest til den uopløselige bærer ved neutra-15 lisering af den rest (dvs. leucin) med tetramethylammo-niumhydroxid og omsætning af komponenten Na-tert-BOC-L-leucin-tetramethylammoniumsalt med den chlormethylerede harpiks i dimethyl sul f oxid (DMSO) ved 80 °C i en time. Afbeskyttelsen af aminogruppen blev gennemført under an-20 vendelse af 25% tri fluoreddikesyre i methylenchlorid, og neutralisering udførtes under anvendelse af 10% triethyl-amin i methylenchlorid. Alle aminosyrekoblinger blev gennemført i methylenchlorid under anvendelse af dicyclohexylcarbodiimid (4 gange molært overskud af reagenser), og 25 koblingerne blev kontrolleret under anvendelse af Kaiser-(ninhydrin) prøvningen og, om nødvendigt, afsluttet ved anvendelse af N-acetylimidazol. Det fuldførte, fuldt beskyttede peptid blev spaltet fra dets uopløselige bærer og afbeskyttet ved den HF-katalyserede to-trins SN2-pro-30 cedure som angivet ovenfor.

Efter vaskning af harpiksen med tør diethylether blev det rå peptid ekstraheret i 10% eddikesyre og lyofiliseret. Peptidet blev samtidig afsaltet og definitivt renset på 35 en DEAE-"Sephacel®"-kolonne og elueret med lineære saltgradienter udviklet i en varigrad-indretning (Buchler Instruments, Inc., Fort Lee, N.J., U.S.A.). Udgangspuffe- DK 169346 B1 10 ren var 0,05 M natriumborat, og grænsepufferen var udgangspufferen indeholdende yderligere 0,5 M natriumchlo-rid. Kolonnedimensionerne var 1,2 x 40 cm. Eluatfraktioner blev analyseret ved absorbans ved 225 nm og ved 5 tyndtlagschromatografi under anvendelse af glasplader, som i forvejen var overtrukket med silicagel G (Merck Darmstadt, BRD). Fluorescamin- og chlor/o-tolidin-sprøjtninger blev anvendt til peptidvisualisering. De to opløsningsmiddelsystemer, som blev anvendt til tyndtlagschro-10 matografi, var (1) 1-butanol/eddikesyre/vand i volumenforholdet 1:1:1 og (2) ethylacetat/pyridin/eddikesyre/-vand i volumenforholdet 5:5:1:3.

Det ønskede peptid blev elueret som den dominerende top.

15 Denne top blev derefter afsaltet på en 2,5 x 100 cm "Bio-Gel© P-2" kolonne under anvendelse af en 0,5 M ammonium-hydrogencarbonatpuffer. HPLC-analyse af dette peptid under anvendelse af en revers-fase g-kolonne viste, at peptidet var homogent. Dette peptid gav også de forven-20 tede molære forhold ved aminosyreanalyse.

Eksempel 2

Peptid II, H-Tyr-Pro-Pro-Tyr-Asn-Lys-Asn-Phe-Thr-Glu-Asn-25 Asp-Leu-Leu-OH, blev fremstillet ifølge proceduren fra eksempel 1, undtagen at der anvendtes en ækvimolær mængde BOC-tyrosin i stedet for B0C-tryptophan ved fast-fasesyntesen.

30 Eksempel 3

For at bestemme de mitogene virkninger af det rensede te- tradecapeptid I fra eksempel 1 på makrofag-lignende cel ler udførtes de følgende prøvninger.

35 3 [ H]-TdR-inkorporering. Forskellige cellelinier blev ud-pladet i "Dulbeccos's Modified Eagle Medium (DMEM) inde DK 169346 B1 11 holdende 10 % føtalt kalveserum (FCS) i 95 % befugtet CC^-atmosfære ved 37 °C i en begyndelsestæthed på 5 x 10 pr. hul i 24 hullers éngangs plastikplader (Falcon, Oxnard, CA, U.S.A.). Standsning af DNA-syntese (dvs.

5 Gq/G,) blev opnået ved inkubering af cellerne i 48 timer i serumfrit DMEM indeholdende 0,1 % okseserumalbumin (BSA). Cellerne blev derpå udsat for peptidet eller for forskellige thrombinformer eller for FCS i 48 timer. Forhøjet thymidin-inkorporering blev bestemt efter en 2 ti- 3 10 mers incubation af cellerne med N-methyl-[ H]-TdR (1 tiCi/ml). Cellerne blev vasket 3 gange i PBS (phosphatpuf-ret saltopløsning, pH 7,4) ved 4 °C, udfældet med 10 % trichloreddikesyre (30 min ved 4 °C), og det uopløselige materiale ekstraheret 2 gange med ethanol/diethylether i 15 volumenforholdet 3:1. Bundfaldet blev solubiliseret i 1 N NaOH-opløsning, og alikvoter blev udtrukket til proteinbestemmelser under anvendelse af en farvebindingsprøvning (Bio Rad Labs., Richmond, CA, U.S.A) og væskescintilla-tionsspektrometri.

20

De forskellige cellelinier, som blev anvendt ved disse prøvninger, var de makrofag-lignende musecellelinier J774, P388D1, RAW og PU5. De forskellige thrombinformer, som blev anvendt ved disse prøvninger, var blodplade-25 vækstfaktor (PDGF), epidermal vækstfaktor (EGF), fibro-blast-vækstfaktor (FGF) og nerve-vækstfaktor (NGF). Med hensyn til baggrundsinformation vedrørende disse kendte polypeptid-vækstfaktorer kan f. eks. henvises til den nylige oversigtsartikel af Kris et al., Biotechnology, fe-30 bruar 1985, side 135-140, og den omfattende oversigt i Hormonal Proteins and Peptides, Ed. by Choh Hao Li, Vol.

12, "Growth Factors," Academic Press, 1984. EGF, NGF og FGF er kommercielt tilgængelige fra Biomedical Technologies, Cambridge, Massachusetts, U.S.A. Ved en re-35 præsentativ prøvning blev der 24 timer efter udsættelse af de vækststandsede celler for optimale koncentrationer

D

af peptidet (dvs. 10 M) fundet forøgelse i celleantal 12 DK 169346 B1 til omkring det dobbelte fra en kontrolværdi på (1,2 - 2) 5 x 10 celler/kulturhul. Til sammenligning udløste de kendte vækstfremmende midler PDGF, EGF, NGF og FGF ikke formering af disse celler i koncentrationsområder på op 5 til 500 ng/ml. Resultaterne er anført i fig. 2 og i tabel I nedenfor. I fig. 2 var basislinien for inkorporering af tritieret thymidin ([3H]-TdR) i hvilende J774-celler 5000 tæll./min » 420 (standardmiddelfejl) pr. hul. Resultaterne er udtrykt som gennemsnittet af tredobbelte bestemmel-10 ser.

15 20 25 30 35 DK 169346 B1 13

Tabel I

Mitogenstlmulering af vækst-standsede makrofag-lignende tumorcellelinier 5 3 [ H]-TdR-inkorporering/ b c

Celler Mitogen Kone./hul mg/protein (% forøgelse) 10 1) J774 Peptid 10“8 M 140 r 8,5 " PDGFa > 500 ng 9,4 τ 0,3 " EGFa " 5,2 t 0,2 " FGFa " 0 t 0,4 " NGFa " 0 t 0,5 15 2) J774 Peptid ΙΟ"8 M 190 τ 12 P388D1 " 10"7 M 226 τ 22 RAW " ΙΟ-8 Μ 276 τ 18 PU5 " 10"6 Μ 112 τ 4,4 20 _ a. Disse præparationer stimulerede > 4 ganges forøgelse 3 af [ H]-TdR-inkorporering i hvilende humane forhudsfibro-blast-(HF)-celler ved den angivne koncentration. Basislinie- inkorporer ingen i ustimulerede celler var 280 25 tæll./min. τ 21 (standardmiddelfejl) pr. hul.

3 b. Koncentrationen, der giver optimal specifik [ H]-TdR-inkorporering, er vist. Hvor stimuleringen ikke var væsentligt større end kontrollen (dvs. > 1,5 gange), er den 30 højeste prøvede koncentration angivet.

3 c. [ H]-TdR-inkorporeringen blev bestemt som anført ovenfor. Hver værdi repræsenterer den gennemsnitlige procentforøgelse τ standardmiddelfejlen ud fra tredobbelte kul- 35 turer ved en repræsentativ prøvning. Sammenligningsdata blev opnået ved mindst tre uafhængige prøvninger. Understregede værdier angiver væsentlig stimulering.

Claims (6)

1. Thrombin-5-kæde-homologt peptid med kraftig mi togen 5 aktivitet, kendetegnet ved, at det omfatter den følgende aminosyresekvens: H-Tyr-Pro-Pro-X-Asn-Lys-Asn-Phe-Thr-Glu-Asn-Asp-Leu-Leu-OH, 10 hvori X = Trp eller Tyr, eller fysiologisk acceptable salte deraf.

2. Peptid ifølge krav 1, kendetegnet ved, at X er Trp. 15

3. Peptid ifølge krav 1, kendetegnet ved, at X er Tyr.

4. Fremgangsmåde til stimulering af væksten af makrofag-20 lignende celler, kendetegnet ved, at cellerne udsættes for en vækststimulerende mængde af peptidet ifølge krav 1.

5. Fremgangsmåde ifølge krav 4, kendetegnet 25 ved, at X er Trp.

6. Fremgangsmåde ifølge krav 4, kendetegnet ved, at X er Tyr. 30 35