JPH0690201B2

JPH0690201B2 - ルテニウムコンプレックス

Info

Publication number: JPH0690201B2
Application number: JP60203205A
Authority: JP
Inventors: ミユーラーフランシス; シユミツトデイエター
Original assignee: エフ．ホフマン‐ラロシュアーゲー
Priority date: 1984-09-17
Filing date: 1985-09-13
Publication date: 1994-11-14
Anticipated expiration: 2009-11-14
Also published as: EP0178450A3; ES547019A0; DK365785D0; NO163694C; US4745076A; DE3582549D1; EP0178450A2; DK365785A; NO853635L; JPS6173066A; ES8705634A1; AU4733485A; EP0178450B1; NZ213420A; NO163694B; AU586831B2; CA1261744A

Description

【発明の詳細な説明】本発明は、免疫学的に活性な素材がカツプリングされる
ルテニウムコンプレツクスに関する。

本発明のルテニウムコンプレックスは下記の一般式
（Ｉ）で表される： Ru²⁺L₁L₂L₃ （Ｉ）一般式（Ｉ）において、 L₁およびL₂は同一または異なり、水溶性付与基としてス
ルホン酸基、特にその塩、好ましくはナトリウム塩、で
置換されているバソフェナンスロリンまたはベンゾバソ
フェナンスロリン基であり、そして L₃は、スペーサー基として最大８個の炭素原子を有する
アルキレン基で置換されているバソフェナンスロリンま
たはベンゾバソフェナンスロリン基であって、このアル
キレン基はその末端が、免疫学的に活性な素材をカップ
リングさせる反応性基として、−COOH、−NH₂、−NCS、
−Ｉまたは−SO₂Hal基で置換されており、そして−SO₂N
H−、−Ｓ−、−Ｏ−、−COO−または−CO−NH−基を含
んでいてもよい。

同一の３個のリガンドL₁,L₂およびL₃を有するルテニウ
ムコンプレツクスの場合は、このリガンドが水溶性付与
基のみでなく、反応性基をもつスペーサー基ももたなけ
ればならない。

この場合適当なリガンドは、式で示される。

２種の異なるリガンドを有するルテニウムコンプレツク
スの場合、一方のリガンドは水溶性を付与する１種また
は２種以上の基を有し、他方のリガンドは１種または２
種以上の結合基（異項環にスペーサーを介して結合する
反応性基）を提供することができる。

リガンドL₁およびL₂として、この場合式で示される基がとくに適している。リガンドL₃としては
次の基が好ましい。

結合基１個または２個以上をもつリガンドL₃の合成は、
以下に反応図に示す方法に従つて実例される。

ａ）〔（SO₂NH｛CH₂｝×COO-t-butyl）₂batho〕および
〔（SO₂Na）（SO₂NHCH₂CH₂COO-t-butyl）batho これらの化合物の合成は、バソフエナンスロリンジスル
ホン酸のジアゾニウム塩を出発原料として用いて行われ
る。これからまず、PCl₂との反応で相当するジスルホク
ロリドを製造する〔ムス（F.Muth）：フーベン‐ワイル
（Houben-Weyl）、メトーデン・デル・オーガニツシエ
ン・ケミー（Methoden der Organischen Chemie）、第
９巻、563頁、第４版、1955、テイーメ・フエルラーク
（G.Thieme Verlag）、シユトツトガルト（Stuttgart）
発行参照〕。これを次に、アミノ酸（たとえば、β‐ア
ラニン、グリシン、4-アミノ酪酸または6-アミノカプロ
ン酸等）のt-ブチルエステルにより、以下の反応式に従
い、相当するスルホンアミドに導く〔ムス（F.Muth）：
フーベン‐ワイル、メトーデン・デル・オーカニツシエ
・ケミー、第９巻、609頁、第４版、1955、テイーメ・
フエルラーク（シユトツトガルト）発行参照〕。

この反応では、ジスルホンアミドのほかに副生物として
モノスルホンアミドも生じる。

t-ブチルエステルの加水分解は相当するルテニウムコン
プレツクスの合成後にのみ実施する。

ｂ）〔（CH₂CH₂CH₂CH₂COOH）batho〕または〔（CH₂CH₂C
H₂CH₂CH₂COOH）batho〕結合基として吉草酸またはカプロン酸を有するこれらの
リガンドの合成は、4-フエニル‐8-アミノキノリン〔ケ
イス（F.H.Case）：ジヤーナル・オブ・オーガニツク・
ケミストリー（J.Org.Chem.）、第16巻、1541（1951）
参照〕と相当するω‐フエニル脂肪酸メチルエステルの
p-（β‐クロロプロピオニル）誘導体から、スクラウプ
の反応〔ケイスほか（F.H.Case ＆ P.F.Strohm）：ジヤ
ーナル・オブ・オーガニツク・ケミストリー（J.Org.Ch
em.）、第27巻、1641（1962）〕によつて実施する。後
者の原料は、5-フエニル吉草酸メチルエステル〔フルカ
（Fluka）または6-フエニルカプロン酸メチルエステル
〔トルースほか（W.E.Truce ＆ C.E.Olson）：ジヤーナ
ル・オブ・アメリカン・ケミカル・ソサイアテイ（J.A
m.Che.Soc.）、第75巻、1651（1953）参照〕を以下の反
応式に従いβ‐クロロプロピオニルクロリドでアシル化
することにより得られる。

ｎ＝4:5-〔p-（7-フエニル‐1,10-フエナンスロリン‐4
-イル）フエニル〕ペンタン酸〔（CH₂CH₂CH₂CH₂COOH）batho〕ｎ＝5:6-〔p-（7-フエニル‐1,10-フエナンスロリン‐4
-イル）フエニル〕ヘキサン酸〔（CH₂CH₂CH₂CH₂CH₂COO
H）batho〕ｃ）〔（CH₂CH₂CH₂CH₂COOH）benzobatho〕この化合物（ベンゾバソフエナンスロリン‐ペンタン
酸）の合成は、以下の反応に従い、2-アミノ‐3-ナフト
エ酸から数工程を経て行われる〔コフトほか（E.Koft
＆ F.H.Case）：ジヤーナル・オブ・オーガニツク・ケ
ミストリー（J.Org.Chem.）、第27巻、865（1962）参
照〕。

３個の同一のリガンドを有するルテニウムコンプレツク
スの合成については、２種の方法が文献に記載されてい
る。

ブラドツクほか〔Braddock ＆ Meyer:ジヤーナル・オブ
・アメリカン・ケミカル・ソサイアテイ（J.Am.Chem.So
c.）、第95巻、3158（1973）〕によれば、水溶性三塩化
ルテニウムをジメチルホルムアミド中、リガンドと長時
間加熱すると、溶媒の部分分解とともにコンプレツクス
が生成する。

しかしながら、リンほか（Lin et al:ジヤーナル・オブ
・アメリカン・ケミカル・ソサイアテイ（J.Am.Chem.So
c.）、第98巻、6536（1976）〕によつて報告された方法
を用いる方が好ましい。この方法によれば、ペンタクロ
ロアクオルテニウム酸カリウム（K₂RUCl₅・H₂O）を弱塩
酸中で化学量論量の３倍のリガンドと加熱し、次にこの
溶液を次亜リン酸ナトリウムで還元する。

２個の異なるリガンドを有するルテニウムコンプレツク
スの製造は、たとえば、ベルサーほか〔Belser et al.:
ヘルベチカ・シミー・アクタ（Helv.Chim.Acta）、第63
巻、1675（1980）〕により文献公知の方法に従つて行わ
れる。

これらのコンプレツクスにおいて、リガンドL₃がリガン
ドL₁およびL₂と異なる場合には、コンプレツクスは段階
的に合成するのが好ましい（もちろん、このコンプレツ
クスを統計的合成法によつて製造することもできるが、
コントロールが難しく、その確率は好ましいものではな
い）。したがつて、第一段階として、水溶性三塩化ルテ
ニウムと化学量論量の２倍のリガンドL₁またはL₂をジメ
チルホルムアミド中で反応させ（塩化リチウムを触媒と
して用いる）、中間体のRuL₁L₂Cl₂を得る。次に、この
中間体をリガンドL₃を有する所望の混合コンプレツクス
に変換する。

リガンドL₃として反応基が保護された形で存在する化合
物、たとえばバソフエナンスロリンのスルホンアミドで
それがt-ブチルエステルである化合物を用いる場合、こ
の保護基は相当するルテニウムコンプレツクスの合成後
に除去するのが好ましい。

生成したルテニウムコンプレツクスの単離および精製
は、常法に従い、再沈殿、カラムクロマトグラフイーま
たは製造薄層クロマトグラフイーによつて行われる。

上述のルテニウムコンプレツクスにカツプリングさせる
免疫学的に活性な素材としては、とくに抗原、ハプテン
または抗体（たとえばFabフラグメントを含む）を挙げ
ることができる。抗体としては、ポリクロナール抗体の
みでなく、モノクローナル抗体も使用できる。

とくに好ましい免疫学的に活性な素材は、がん胎児性抗
原に対する抗体である。とくに好ましい免疫学的に活性
な素材としては、さらに、ヒトコリオゴナドトロピンに
対する抗体ならびにα‐インターフエロンに対する抗体
を挙げることができる。

ルテニウムコンプレツクスの免疫学的素材へのカツプリ
ングはそれ自体公知の方法によつて行われる。好ましい
カツプリング方法は、ルテニウムコンプレツクスと免疫
学的に活性な素材を水溶性カルボジイミド誘導体、たと
えばN-シクロヘキシル‐Ｎ′‐（2-モルホリノエチル）
カルボジイミドメチル‐p-トルエンスルホネートで処
理する方法である。

本発明のルテニウムコンプレツクスは蛍光分光法できわ
めて感度よく検出することが可能で、高感度螢光免疫定
量法の標識分子として著しく適している。とくに、たと
えばドイツ特許OS26 28 158号に記載されているよう
な時間分解螢光免疫定量法に適当である。繁用されてい
るFITC（フルオレセインイソチオシアネート）の代わり
に、本発明によるルテニウムコンプレツクスを用いる
と、螢光免疫定量法の検出感度を改良できる。これは、
たとえば血漿や血清のような体液中の少量の抗原の定量
にとくに有利である。このような抗原の例としては、た
とえばがん胎児性抗原（CEA）、β‐HCGまたはα‐イン
ターフエロンを挙げることができる。

本発明の範囲内に包含される時間分解螢光測定法に使用
できる測定装置を第１図に示した一例に基づき以下に説
明する。

脈動光源‐カラーレーザーは、適当な波長λ＝453nmの
閃光とともに、測定サンプルを励起させて螢光を生じさ
せる。この際、閃光の持続ｔ＝0.7nsは螢光標識の崩壊
時間よりはるかに短い。螢光照射の方法を光素子によつ
て変え、標識の発光波長を通過させるエツジフイルター
〔バルザーズ（Balzers）610〕を通して、光電子倍増管
の光陰極に導く。個々に検知された光量子がパルス電流
を発生させるので、これを増幅、標準化後に、デジタル
で計数する（光量子計数法）。フオトダイオードによ
り、励起閃光は、調整された遅延時間δ＝２μｓ後にカ
ウンターを始動させ、測定アパーチヤーの調整された開
口時間Δｔ＝３μｓ後に再び計数過程を停止させるゲー
ト回路を同時に制御する。遅延時間Δは標遊光効果なら
びにバツクグラウンドの螢光がほぼ完全に消失するよう
に選択する。この方法によれば、計数されたパルス数
は、バックグランドと分離測定される標識の蛍光強度に
比例する。

例１バソフエナンスロリンジスルホクロリドの製造乾燥したベンゾフエナンスロリンジスルホン酸ニナトリ
ウム塩〔フルカ（Fluka）〕2.2gを、500mlの丸底フラス
コ中、FCl₅3.1gおよびPOCl₃750μとよく混合する。還
流コンデンサーと塩化カルシウム管を付したフラスコを
油浴中、110℃に2.5時間加熱する。フラスコの冷たい部
分に付着した昇華PCl₅をときどきかき落とす。ついで水
流ポンプ真空下、110℃に５時間加熱して、未反応PCl₅
とPOCl₃を完全に除去する。

室温に冷却したのち、粗スルホクロリドをまず、ベンゼ
ン150mlで短時間処理し、これは捨てる（痕跡の不純物
を除去する）。次に各回150mlのクロロホルムと室温で
１時間撹拌して、２回抽出を行う。

クロロホルム抽出液を合し、真空中で濃縮する。残つた
スルホクロリドを真空中、110℃で４時間乾燥する（収
量:1.8g）。

バソフエナンスロリとβ‐アラニンt-ブチルエステルと
のスルホンアミド誘導体の製造〔（SO₂-NH-CH₂CH₂-COO-t-butyl）₂batho〕および〔（S
O₃Na）（SO₂NHCH₂CH₂COO-t-butyl）‐batho〕 β‐アラニンt-ブチルエステル1.32gとトリエチルアミ
ン10.5mlをクロロホルム50mlに溶解する。この溶液を激
しく撹拌しながら10分間以内に固体バソフエナンスロリ
ンジスルホクロリド2.0gを加える。室温で５時間撹拌し
たのち、反応混合物を暗所に４日間放置する。次に、溶
媒およびトリエチルアミンを真空中40〜50℃で除去す
る。トリエチルアミンを完全に除去するため、残留物を
クロロホルム200mlで処理し、これを再び真空中で除去
する。この操作を、生成物にトリエチルアミンの臭気が
なくなるまで、計５回くり返す。

残留物をSiO₂上クロマトグラフイーによつて精製すると
２種の生成物が得られる。

ａ）ジスルホンアミドの単離〔（SO₂NHCH₂CH₂COO-t-butyl）₂batho〕８のアセトンを用いて溶出すると、まず実用上純粋な
ジスルホンアミドが得られる。収量:900mg。

ｂ）モノスルホンアミドの単離〔（SO₃Na）（SO₂NH-CH₂CH₂-COO-t-butyl）batho〕クロロホルム／メタノール／水（7/3/0.5）の混合物３
を用い、その螢光性からフエナンスロリン誘導体と考
えられる第２のゾーンを溶出する。NMRによれば、反応
中のバソフエナンスロリンジスルホスクロリドの部分加
水分解によつて生じたと思われるモノスルホンアミドで
ある（粗生成物の収量:1.2g）。

さらに精製するため、粗生成物をクロロホルム150mlに
溶解し、この溶液を各回100mlの水と計３回振盪する。
次に、モノスルホンアミドを２回再沈殿する。このため
には、化合物をメタノール／クロロホルム（3/1）50ml
に溶解し、エーテル200mlを徐々に滴加して再沈殿させ
る。収量:360mg。

ルテニウムコンプレツクス（RC-1）の製造 Ru〔（SO₃Na）（SO₂NHCH₂CH₂COOH）₂batho〕₃-（PF₆）
_２ペンタクロロアクオルテニウム酸カリウム（K₂RuCl₅・H
₂O）18.7mgを、あらかじめ6N HCl1滴を加えた水2mlに6
0℃で溶解する。この溶液に、化学量論量の３倍のリガ
ンド（ｂ）におけるt-ブチルエステル95.8mgをDMF 1ml
に溶解）を加え、混合物を窒素気流下に2.5時間、還流
加熱する。

反応溶液を冷却後、生成したRu³⁺コンプレツクスをNaH₂
PO₂ 1モル溶液250μで相当するRu²⁺コンプレツクスに
還元し、ついでさらに２時間、還流煮沸する。

次に、溶液をろ過し、10％ヘキサフルオロリン酸アンモ
ニウム水溶液900μを加え、一夜40℃に放置する。コ
ンプレツクスが沈殿する。

吸引ろ過後、コンプレツクスを製造薄層クロマトグラフ
イー〔シリカゲル板４枚、溶出剤CH₂Cl₂/MeOH/H₂O（7:
3:0.5）〕により精製する。

前面の赤いゾーンを単離し（純生成物50mg）、加水分解
のため室温においてトリフルオロ酢酸5mlで処理する。
１時間後、水流ポンプ真空下にトリフルオロ酢酸を除去
する。

例２ Ru〔（SO₃Na）₂batho〕₂Cl₂の製造 RuCl₃・3H₂O627mg、LiCl568mgおよびバソフエナンスロ
リンジスルホン酸ニナトリウム塩〔フルカ（Fluka）〕
2.36gをDMF 8ml中で６時間還流煮沸する。室温に冷却し
たのち、反応液にアセトン60mlを徐々に加え、ついで４
℃に20時間放置する。紫色の粗生成物が沈殿する。これ
を吸引ろ過し、アセトンで十分洗浄する。次に再沈殿に
より最初の精製を行う。すなわち、粗生成物をメタノー
ル50mlに溶解し、ついでアセトン／エーテル（1/1）500
mlで再沈殿させる。さらに精製するにはSiO₂上クロマト
グラフイーに付す。クロロホルム／メタノール／アセト
ン（4/3/3）５で溶出すると、実用上純粋な生成物600
mgが得られる（収量:600mg）。

混合コンプレツクスRu〔（SO₃Na）₂batho〕_２〔（SO₂-N
H-CH₂-CH₂-COO-t-butyl）₂batho〕Cl₂の製造 Ru〔（SO₃Na）₂batho〕₂Cl₂76.2mgを水1mlとメタノール
4mlの混合物に溶解し、〔（SO₂-NH-CH₂-CH₂-COO-t-buty
l）₂batho〕（例1a）参照）41.0mg（クロロホルム3mlに
溶解して）と混合する。この反応混合物を窒素気流下に
３時間還流加熱すると、橙赤色の溶液を生じる。窒素を
通じながらわずかに加温して溶媒を約90％まで留去す
る。室温に冷却すると、生成物の一部が析出する。精製
には、生成物をメタノール1.5mlとDMF0.5mlに溶解し
て、SiO₂上、溶出剤としてクロロホルム／メタノール／
水（7/3/0.5）を用いクロマトグラフイーに付す（収量:
75mg）。

ルテニウムコンプレツクス（RC-2）の製造 Ru〔（SO₃Na）₂batho〕_２〔SO₂-NH-CH₂-CH₂-COOH）₂bat
ho〕Cl₂ t-ブチルエステルを加水分解する。すなわち、Ru〔（SO
₃Na）₂batho〕_２〔SO₂-NH-CH₂-CH₂-COO-t-butyl）₂bath
o〕Cl₂55mgをトリフルオロ酢酸5mlに溶解する。反応混
合物を室温に１時間放置し、ついで水流ポンプ真空下40
℃でトリフルオロ酢酸を除去する。

粗生成物をまず、SiO₂上クロマトグラフイーによつて精
製する。溶出剤は次のとおりである。

クロロホルム／アセトン／メタノール（4/3/3） 300ml クロロホルム／メタノール／水（50/50/2） 500ml クロロホルム／メタノール／水（50/50/5） 500ml クロロホルム／メタノール／水（50/50/10） 250ml メタノール／水（10/1） 100ml メタノール／水（1/1） 100ml 最終的精製は製造薄層クロマトグラフイーによる。すな
わち、ルテニウムコンプレツクス40mgを水700μに溶
解し、４個のPSCプレート〔SiO₂プレート、メルク（mer
ck）に適用する。60℃で一夜乾燥したのち、溶出剤とし
てクロロホルム／メタノール／水（50/50/2）を用いク
ロマトグラフイーを行う。主ゾーンをかき取り、各回40
mlの水で３回抽出する（シリカゲルは遠心分離によつて
分離する）。濃縮後、生成物を少量のメタノールに溶か
して遠心分離し、不溶の痕跡のシリカゲルを除去する
（収量:38mg）。

例３バソフエナンスロリンとグリシンt-ブチルエステルのジ
スルホンアミドの製造〔（SO₂NHCH₂COO-t-butyl）₂batho〕このスルホンアミドは例１に記載したと同様にして合成
された。

原料：グリシン‐t-ブチルエステルジベンゼンスルフイ
ミド塩（10.3g）、トリエチルアミン（28ml）およびバ
ソフエナンスロリンジスルホクロリド（4.2g）収量：〔（SO₂NH-CH₂COO-t-ブチル）₂batho〕4.9g 混合コンプレツクスの製造 Ru〔（SO₃Na）₂batho〕_２〔（SO₂NHCH₂COO-t-butyl）₂b
atho〕Cl₂ Ru〔（SO₃Na）₂batho〕Cl₂（例２参照）3.6gをメタノー
ル160mlと水100mlの混合物に溶解し、〔（SO₂NH-CH₂COO
-t-butyl〕（メタノール80mlに溶解）2.01gと混合す
る。

この反応混合物を窒素気流下に５時間還流煮沸すると、
深赤色の溶液を生じる。冷却後、反応溶液を真空中で約
70mlに濃縮し、ついでアセトン1.4を徐に滴加すると
混合ルテニウムコンプレツクスが沈殿する。

さらに精製するため、吸引ろ過した粗生成物を２回再沈
殿される。すなわち、沈殿を約150mlのMeOH/H₂O/CH₂Cl₂
（2:1:0.3）に溶解し、アセトン1.5を徐々に滴加して
再沈殿させる。

最後に、生成物をシリカゲル上、溶出剤としてCH₂Cl₂/M
eOH/H₂O（7:3:0.5）を用い、２回クロマトグラフイーに
付す。上述したと同様にしてさらに再沈殿させると、純
粋な生成物が得られる。収量:3.0g、赤色粉末。

標識〔RC-3〕:Ru〔（SO₃Na）₂batho〕_２〔SO₂NH-CH₂COO
H）₂batho〕Cl₂へのt-ブチルエステルの加水分解 Ru〔（SO₃Na）₂batho〕_２〔（SO₂NHCH₂COO-t-butyl）₂b
atho〕Cl₂500mgをトリフルオロ酢酸40ml中に分散させ
る。室温で2.5時間撹拌したのち、トリフルオロ酢酸を
真空中で除去する。残留物をDFM1mlと水3mlの混合物に
溶解する。この溶液にアセトン／メタノール（8:2）を
徐々に滴加して、コンプレツクスを再び沈殿させる。

この再沈殿操作をさらに２回くり返し、赤色粉末を真空
中70℃で乾燥させる。収量:420mg。

例４バソフエナンスロリンと4-アミノ酪酸t-ブチルエステル
とのジスルホンアミドの製造〔（SO₂NHCH₂CH₂CH₂COO-t-butyl）₂batho〕このスルホンアミドは、例１に記載したと同様の方法で
合成された。

原料:4-アミノ酪酸t-ブチルエステル（1.57g）、トリエ
チルアミン（17ml）およびバソフエナンスロリンジスル
ホクロリド（2.1g）収量：〔（SO₂NHCH₂CH₂CH₂COO-t-butyl）₂batho〕1.3g 混合コンプレツクスの製造 Ru〔（SO₃Na）₂batho〕_２〔（SO₂NHCH₂CH₂CH₂-COO-t-bu
tyl）₂batho〕Cl₂ この合成は、例３に記載の指示と同様にして実施され
た。

原料:Ru〔（SO₃Na）₂batho〕₂Cl₂1.28gおよび〔（SO₂NH
CH₂CH₂CH₂COO-t-butyl）₂batho〕0.775g 収量：赤色粉末1.65g 標識〔RC-4〕:Ru〔（SO₃Na）₂batho〕₂-〔（SO₂NH-CH₂C
H₂CH₂COOH）₂batho〕Cl₂へのt-ブチルエステルの加水分
解操作:Ru〔（SO₃Na）₂batho〕_２〔（SO₂NHCH₂CH₂CH₂-COO
-t-butyl）₂batho〕Clで示されるt-ブチルエステル誘導
体70mgを例３に記載した指示と同様にして加水分解収量:50mg 例５バソフエナンスロリンと6-アミノカプロン酸t-ブチルエ
ステルとのジスルホンアミドの製造〔（SO₂NHCH₂CH₂CH₂CH₂CH₂COO-t-butyl）₂-batho〕このスルホンアミドの合成は、例１に記載したと同様の
方法で実施した。

原料:6-アミノカプロン酸t-ブチルエステル（2.27g）、
トリエチルアミン（17ml）およびバソフエナンスロリン
ジスルホクロリド（2.1g）収量：〔（SO₂NHCH₂CH₂CH₂CH₂CH₂COO-t-butyl）₂bath
o〕1.8g 混合コンプレツクスの製造 Ru〔（SO₃Na）₂batho〕_２〔（SO₂NHCH₂CH₂CH₂CH₂CH₂-CO
O-t-butyl）₂batho〕Cl₂ この合成は、例３に記載の指示と同様の方法で実施し
た。

原料:Ru〔（SO₃Na）₂batho〕₂Cl₂2.3gおよび〔（SO₂NHC
H₂CH₂CH₂CH₂CH₂COO-t-butyl）₂batho〕1.49g 収量：赤色粉末2.8g 標識〔RC-5〕:Ru〔（SO₃Na）₂batho〕_２〔（SO₂NHCH₂-C
H₂CH₂CH₂CH₂-COOH）₂batho〕Cl₂へのt-ブチルエステル
の加水分解操作:t-ブチルエステル誘導体、Ru〔SO₃Na）₂batho〕_２
〔（SO₂NHCH₂CH₂CH₂CH₂CH₂-COO-t-butyl）₂batho〕Cl₂1
00mgを例３に記載の指示と同様の方法で加水分解収量:85mg 例６混合コンプレツクスの製造 Ru〔（SO₃Na）₂batho〕_２〔（SO₃Na）（SO₂NH-CH₂CH₂CO
O-t-butyl）batho〕Cl₂ この合成は、例３に記載した指示と同様の方法で実施し
た。

原料:Ru〔（SO₃Na）₂batho〕Cl₂102mgおよび〔（SO₃N
a）（SO₂NHCH₂CH₂COO-t-butyl）batho〕（例１参照）51
mg 収量：赤色粉末105mg 標識〔RC-6〕:Ru〔（SO₃Na）₂batho〕_２〔SO₃Na）‐（S
O₂NHCH₂CH₂COOH）batho〕Clへのt-ブチルエステルの加
水分解操作:t-ブチルエステル誘導体、Ru〔（SO₃Na）₂-bath
o〕_２〔（SO₃Na）（SO₂NHCH₂CH₂COO-t-butyl）batho〕C
l₂105mgを例３に記載した指示と同様の方法で加水分
解。精製は製造薄層クロマトグラフイー〔シリカゲルプ
レート、溶出剤:CHCl₃/MeOH/アセトン（4:3:3）〕によ
る。

収量:32mg 例７ p-〔β‐クロロプロピオニル〕‐5-フエニル吉草酸メチ
ルエステルの合成 AlCl₃9.3g、CS₂10mlおよびβ‐クロロプロピオニルクロ
リド1.98mlを、還流冷却器を付したフラスコにとり、撹
拌する。この混合物に、室温で、５分以内に5-フエニル
吉草酸3.61gを滴加する（CS₂2mlでリンスする）。反応
混合物をさらに15分間撹拌し、わずかに温め、ついで冷
却する。

氷、水およびエーテルの混合物を撹拌しながら、これに
反応混合物をピペツトで注ぐ。有機相を重炭酸塩溶液お
よび水で中性になるまで洗浄する。MgSO₄上で乾燥した
のち、溶媒を除去する。かくして、結晶性生成物5.03g
が得られる。

5-〔p-（7-フエニル‐1,10-フエナンスロリン‐4-イ
ル）フエニル〕ペンタン酸の合成〔（CH₂CH₂CH₂CH₂COOH）batho〕 4-フエニル‐8-アミノキノリン2.54g、H₃PO₄（85％）1
1.5mlおよびヒ酸溶液（80％H₃AsO₄）をアルゴン気流
下、フラスコ中で撹拌する。この混合物を120℃に加熱
してキノリンを溶解させる。ついで、p-（β‐クロロプ
ロピオニル）‐5-フエニル吉草酸メチルエステル4.56g
を５分以内に加える。反応混合物を撹拌しながら10分以
内に140℃まで加熱し、この温度にさらに１時間放置す
る。

後処理は、反応混合物を冷却し、氷で十分冷却した水50
mlとCH₂Cl₂125mlの混合物を撹拌した中にピペツトで注
ぐことにより行う。水酸化ナトリウム溶液を加えてpHを
５に調整する。これにより、生成物は有機相に移る。

溶媒を蒸発させると、メチルエステルのほかに遊離酸
（この反応条件で加水分解される）も含む粗生成物が得
られる。ジアゾメタン（エーテル／メタノール中）で混
合物を処理し、再び完全にメチルエステルに変換する。

アロツクス（Alox）III上に、酢酸エチルを用いて二重
クロマトグラフイーに付すと（1.5％H₂Oでさらに不活性
化）、メチルエステル3.022gが得られる。

加水分解するためには、これを20mlのエタノールに溶解
し、この溶液に水酸化ナトリウム溶液（NaOH0.950gをH₂
O5mlに溶解）を加え、アルゴン気流下、80℃に２時間加
熱する。この溶液を冷却してCH₂Cl₂/H₂O混合物に加え、
85％H₃PO₄でpHを４〜５に調整し、ついで生成物を抽出
する。

CH₂Cl₂抽出液を濃縮し、ベンゼンから再結晶すると、生
成物1.35gが得られる。濃縮母液をエタノールから再結
晶して、さらに生成物0.338gを得る。

総収量：酸1.688g（溶媒和なく結晶化）、融点234〜235
℃ ルテニウムコンプレツクス〔RC-7〕の製造 Ru〔（SO₃Na）₂batho〕_２〔（CH₂CH₂CH₂CH₂-COOH）bath
o〕Cl₂ 5-〔p-（7-フエニル‐1,10-フエナンスロリン‐4-イ
ル）フエニル〕ペンタン酸34.6mgをメタノール2mlに溶
解し、Ru〔（SO₃Na）₂-batho〕₂Cl₂・2H₂O102.4mgをメ
タノール4mlと水8ml中に溶解した液に加える。この混合
物を窒素気流下に３時間還流加熱すると、橙赤色の溶液
が生じる。

次に、窒素を吹き込みながら溶媒の大部分を除去する。
残つた溶媒はロータリーエバポレーターで完全に除く。

粗生成物の精製は製造的薄層クロマトグラフイーにより
実施する。すなわち、コンプレツクスを少量の水に溶解
し、６枚のPSCプレート（メルク製SiO₂板）に適用す
る。プレートを70℃で乾燥したのち、溶出剤としてクロ
ロホルム／アセトン／メタノール（4/3/3）を用いクロ
マトグラフイーを行う。

主領域の生成物を水で抽出し、さらに３回、溶出剤とし
てアセトン／水（9/1）、次にアセトン／水（8.5/1.
5）、最後にクロロホルム／メタノール／水（50/50/2）
を用いて製造薄層クロマトグラフイーを行つた。

痕跡のSiO₂を除去するためには、抽出した生成物を少量
のメタノールに溶解し、不溶のシリカゲルを遠心分離し
た。次に生成物をメタノール1ml溶液からアセトン50ml
で沈殿させた。収量:42.6mg（赤色粉末）。

例８ p-（β‐クロロプロピオニル）‐6-フエニルカプロン酸
メチルエステルの合成 AlCl₃17.2g、CS₂18.5mlおよびβ‐クロロプロピオニル
クロリド3.6mlを、還流冷却器を付したフラスコにと
り、撹拌する。6-フエニルカプロン酸メチルエステル7.
06gを、この混合物中に、室温、10分以内に滴加する（C
S₂4mlですすぐ）。反応混合物をさらに15分間撹拌し、
わずかに温め、ついで冷却する。

氷、水およびエーテルの混合物を撹拌しながら、これに
反応混合物をピペツトで注ぐ。有機層を重炭酸塩溶液お
よび水で中性になるまで洗浄する。MgSO₄上で乾燥した
のち、溶媒を除去すると、結晶性の生成物10.2gが得ら
れる。

6-〔p-（7-フエニル‐1,10-フエナンスロリン‐4-イ
ル）フエニル〕ヘキサン酸の合成〔（CH₂CH₂CH₂CH₂CH₂COOH）batho〕 4-フエニル‐8-アミノキノリン5.90g、H₃PO₄（85％）27
mlおよびヒ酸溶液（80％H₃AsO₄）5.35mlを、アルゴン気
流下、撹拌フラスコにとる。混合物を120℃に加熱して
キノリンを溶解させる。ついで、p-（β‐クロロプロピ
オニル‐6-フエニルカプロン酸11.15gを５分以内に加え
る。次に、反応混合物を撹拌しながら、10分以内に140
℃まで加熱し、この温度にさらに１時間放置する。

後処理は、反応混合物を冷却し、氷で十分に冷却した水
100mlとCH₂Cl₂250mlの混合物を撹拌しながらこの中に反
応混合物をピペツトで注いでいくことにより行う。水酸
化ナトリウム溶液（NaOH45gを水200mlに溶かした液の約
2/3）を加えてpHを５に調整する。この操作により、生
成物は有機相に移る。

溶媒を蒸発させると、メチルエステルのほかに遊離酸
（この反応条件で加水分解されたもの）も含む粘稠な油
状物15.76gが得られる。ジアゾメタン（エーテル／メタ
ノール中）で処理して、混合物を再び完全なメチルエス
テルに変換する。これを、アロツクス（Alox）III350g
上、酢酸エチルによる（１％H₂Oでさらに不活性化）ク
ロマトグラフイーに付す（分画120ml）。分画５〜９が
純粋を生成物を含有する。

一方、分画３、４および10にはまだ夾雑物が含まれてい
る。これを前述したと同様、酸化アルミニウム上、酢酸
エチルを用い、再びクロマトグラフイーで分離する。両
クロマトグラフイーの純粋な分画から溶媒を除去する
と、メチルエステル6.979gが得られる。

加水分解は、エステルをエタノール45mlに溶解し、この
溶液に水酸化ナトリウム溶液（NaOH2.24gをH₂O11mlに溶
解）を加え、アルゴン気流下80℃に２時間加熱して行
う。次に、エタノールをロータリーエバポレーターで除
去し、残留物をCH₂Cl₂/水の混合物にとる。85％H₃PO₄3.
75mlでpHを約３に調整し、生成物を抽出する。

抽出液を中性になるまで洗浄し、乾燥し、300mlに濃縮
する。計3.5gのノーリツト（Norit）SX-3を加えたの
ち、溶液を40分間撹拌し、ろ過し、少量のCH₂Cl₂が残る
まで濃縮する。ベンゼン20mlを加え、室温に48時間放置
すると生成物が析出する。

吸引ろ過し、ベンゼンで洗浄し、乾燥器中で乾燥する
と、結晶中にまだベンゼンを含んでいる生成物5.393gが
得られる。

ベンゼンを含まない生成物を融点195℃を示す。

ルテニウムコンプレツクス〔RC-8〕の製造 Ru〔（SO₃Na）₂batho〕_２〔（CH₂CH₂CH₂CH₂CH₂-COOH）b
atho〕Cl₂ 6-〔p-（7-フエニル‐1,10-フエナスロリン‐4-イル）
フエニル〕ヘキサン酸134.2mgをメタノール5.7mlに溶解
し、これをRu〔（SO₃Na）₂batho〕₂Cl₂・2H₂O384mgのメ
タノール20mlおよび水5ml中溶液に加える。この混合物
を窒素気流下に３時間還流加熱すると、橙赤色の溶液を
生じる。

窒素を吹き込みながら溶液の大部分を除去する。残つた
溶媒はロータリーエバポレーターで完全に除去する。

生成物の精製はまず、シリカゲル上、溶出剤としてクロ
ロホルム／メタノール／水（7/3/0.5）を用いた二重カ
ラムクロマトグラフイーによつて行う。このコンプレツ
クスはさらに製造薄層クロマトグラフイー（メルク製Si
O₂プレート）によつて精製する。溶出剤としては、クロ
ロホルム／メタノール／水（7/3/0.5）を使用する。

主領域をかきとり、メタノールで抽出する。

収量:162mg（赤色粉末）。

例９ベンゾバソフエナンスロリニル‐ペンタン酸の製造〔（CH₂CH₂CH₂CH₂COOH）benzobatho〕この化合物の合成は、例７における〔（CH₂CH₂-CH₂CH₂C
OOH）batho〕の製造の場合と同様に操作し、2-アミノ‐
3-ナフトエ酸からスクラウプの反応によつて行われた。
総収量:1.07g ルテニウムコンプレツクス〔RC-9〕の製造 Ru〔（SO₃Na）₂batho〕_２〔（CH₂CH₂CH₂CH₂COOH）benzo
batho〕Cl₂ この合成は例３に記載したと同様の方法で行われた。

原料:Ru〔（SO₃Na）₂batho〕₂Cl₂1.28gおよび〔（CH₂CH
₂CH₂CH₂COOH）benzobatho〕0.561g 収量：赤色粉末1.1g 例10 ルテニウルコンプレツクス（RC-10）の製造 Ru〔（SO₃Na）₂batho〕_２〔（COOH）₂bpy〕Cl₂ この合成は例３に記載したと同様の方法で行われた。

原料:Ru〔（SO₃Na）₂batho〕₂Cl₂256mg、4,4′‐ジカル
ボキシ‐2,2′‐ビピリジン49mgおよびNaHCO₃（ビピリ
ジンの溶解のため）60mgをMeOH/H₂O（1:2）35ml中で反
応させる。

収量：赤色粉末290mg 例11 ルテニウムコンプレツクス〔RC-2〕による抗‐CEAの標
識混合ルテニウムコンプレツクス（RC-2）の抗‐CEAへの
カツプリングは水溶性カルボジイミド誘導体、N-シクロ
ヘキシル‐Ｎ′‐（2-モルホリノエチル）カルボジイミ
ド‐メチル‐p-トルエンスルホネートを用いて実施し
た。このコンプレツクスは１分子につき２個の反応性基
をもつので、２倍モル量のカルボジイミドが使用され
る。

カツプリング反応用に以下の保存溶液を調製する。

（１）ルテニウムコンプレツクス（RC-2）4.00mg/ml
水の溶液、pH4.5 （２）ウサギからの抗‐CEA（DAKO,コード番号A115、
ロツト112B）2.17mg/ml200mM NaHCO₃、pH8.5 保存溶液（１）136μをpH4.5の水（HClで調整）264μ
で希釈する。これに、N-シクロヘキシル‐Ｎ′‐（2-
モルホリノエチル）カルボジイミド‐メチル‐p-トルエ
ンスルホネート0.27mgを加え、この混合物を短時間ボル
テツクス（vortex）中で混合する。２分後に抗‐CEA保
存溶液（２）400μを加え、混合物を再びボルテツク
ス中で十分混合する。少量の1N HClを加えてpHを8.5に
調整する。反応混合物をついで室温、暗所に17時間放置
する。

標識抗血清の分離には、反応混合物500μをアクリル
アミドゲルAcA-54（LKB製）のカラム上（長さ30cm、径9
mm）クロマトグラフイーに付した（溶出剤:150mM NaC
l、10mMリン酸ナトリウム、0.02％NaN₃,pH7.0）。標識
抗‐CEAが最も高い含量を示す分画、計5.2mlを合した。
抗‐CEAおよびルテニウムコンプレツクスのこの溶液中
の含量は紫外部分光スペクトルによつて測定した（278n
mにおける光学密度‐抗‐CEAおよびルテニウムコンプレ
ツクスの吸収、ならびに445nmにおける光学密度‐ルテ
ニウムコンプレツクス単独の吸収から）。次の濃度が得
られた。

0.66×10^-6M/ルテニウムコンプレツクス 0.58×10^-6M/抗‐CEA これは標識度1.1に相当する。

例12 CEA標準による螢光免疫定量法 CEA標準の定量には、次のように、モノクロナールCEA抗
体およびポリクロナールCEA抗体（DAKO製標識抗体）を
用いサンドウイツチ法によつて実施した。

ａ）必要数の試験管（10×75mm）それぞれにCEA標準溶
液（150mM NaCl、10mMリン酸ナトリウムおよび20g/ウ
シ血清アルブミン中0ng/ml CEA:2.5ng/ml CEA;5ng/ml C
EA;10ng/ml CEAおよび20ng/ml CEA）0.250mlをピペツト
でとり、それぞれにモノクローナル抗‐CEAで感作した
ポリスチレンビーズ（径6.5mm）を加え、37℃で24時間
インキユベートする。次に、ポリスチレンビーズを、各
回２〜5mlの蒸留水で３回洗浄し、緩衝液0.250mlと１×
10^-8M/の標識ウサギ抗‐CEA（標識度1.1）を含む試験
管に移す。

37℃で24時間インキユベートしたのち、ビーズを再び各
回２〜5mlの蒸留水で３回洗浄し、ついで各2mlの硫酸
（0.09N）を含む試験管に移す。30分後に硫酸溶液をピ
ペツトで測定キユベツトにとり、ルテニウムコンプレツ
クスの含量を螢光分光法で測定する（励起波長453nm、
発光波長612nm）。

測定は前述の装置で、バルザーズ（Balzers）製エツジ
フイルターB610、螢光測定の周期的遅延（励起パルスに
基づいて）２μsec、測定アパーチヤーの開口３μsecを
用いて実施した。

第１表には、ロツシユ（Roche）の一連のCEA標準を用い
て行つたCEAの定量値を示す。

この２工程試験の場合、感度はCEA60pg/mlである。

CEA試験は以下の方法に従い、ワンポツト操作でも実施
できる。

ｂ）必要数の試験管（10×75mm）それぞれに、CEA標準
溶液（ウシ胎仔血清中0ng/ml CEA;2.5ng/ml CEA;5ng;ml
CEA;10ng/ml CEA;20ng/ml CEA）0.125mlならびにルテ
ニウムコンプレツクスで標識した２×10^-8M/ウサギ抗
CEA溶液（標識度1.25;希釈緩衝液pH7.1、0.1M/ Tri
s、20％ウシ胎仔血清、0.05％チメロサールおよび0.02
％Tween20含有）0.125mlを加える。次にそれぞれにポリ
スチレンビーズ（径6.5mm、モノクロナール抗CEAで感
作）を加え、37℃で24時間インキユベートする。

ついでビーズを各回２〜5mlの蒸留水で３回洗浄し、そ
れぞれ2mlの硫酸（0.09N）を含む試験官に移す。30分
後、硫酸溶液をピペツトで測定キユベツトに移し、ルテ
ニウムコンプレツクスの含量を螢光分光法で測定する
（測定条件はａ）において述べた条件と同一である）。

このCEA測定結果を第２表に示す。ワンポツト操作の場
合の感度は430pg/ml CEAである。

例13 抗‐HCGの標識抗‐HCGのルテニウムコンプレツクス〔RC-2〕による標
識は、例11における抗‐CEAの場合と同様の方法で実施
した。

カツプリング反応のために、次の保存溶液を調製した。

（１）水pH4.5中4.00mg/mlルテニウムコンプレツクス
〔RC-2〕（２） 200mM NaHCO₃、pH8.5中10.83mg/mlウサギ抗‐H
CG（DAKOコード番号A231、ロツト032A）保存溶液（１）150μをpH4.5（HClで調整）の水250μ
で希釈する。この溶液にN-シクロヘキシル‐Ｎ′‐
（2-モルホリノエチル）‐カルボジイミド‐メチル‐p-
トルエンスルホネート0.30mgを加え、混合物をボルテツ
クス中で短時間混合する。２分後、これに抗‐HCG溶液
（保存溶液（２）222μを178μの200mMNaHCO₃溶
液、pH8.5で希釈）を加え、混合物をボルテツクス中で
十分混合する。少量のHClでpHを8.5に調整する。反応混
合物をついで、室温暗所に17時間放置する。

標識抗‐HCGの分離には、反応混合物500μをアクリル
アミドゲルAcA-54（KLB製）カラム（長さ30cm、径9mm）
上クロマトグラフイーに付す（溶出剤:150mM NaCl、10m
Mリン酸ナトリウム、0.02％NaN₃、pH7.0）。標識抗‐HC
Gが最大含量を示す分画、計5.2mlを合する。抗‐HCGお
よびルテニウムコンプレツクスのこの溶液中の含量を紫
外部分光法で測定する。以下の濃度が得られる。

2.01×10^-6M/ルテニウムコンプレツクス 2.04×10^-6M/抗‐HCG これは標識度1.0に相当する。

例14 β‐HCGによる螢光免疫定量法の実行 β‐HCG標準の定量は、以下のように、モノクローナル
β‐HCG抗体およびポリクローナルHCG抗体（DAKO製標識
抗体）を用いたサンドウイツチ試験によつて行つた。

必要数の試験管（10×75mm）それぞれにβ‐HCG標準溶
液（0mIU/ml;10mIU/ml;25mIU/ml;50mIU/ml;100mIU/ml;2
00mIU/ml）0.050ml、ルテニウムコンプレツクスで標識
した5.12×10^-8M/抗‐HCG溶液（標識度1.0;希釈緩衝
液pH7.1、0.1M/Tris、20％胎仔ウシ血清、0.05％チメ
ロサールおよび0.02％Tween20含有）0.050mlならびにそ
れぞれ緩衝液（150mM NaCl、10mMリン酸ナトリウム、20
g/ウシ血清アルブミン）0.150mlを加える。ついでこ
れに、それぞれ、ポリスチレンビーズ（径6.5mm、モノ
クロナール抗‐β‐HCGで感作）を加え、37℃で16時間
インキユベートする。

次にビーズを各回２〜5mlの蒸留水で３回洗浄し、つい
でそれぞれ2mlの硫酸（0.09N）を含む試験管に移す。30
分後、硫酸溶液をピペツトで測定キユベツトにとり、ル
テニウムコンプレツクス含量を螢光分光法で測定する
（測定条件は例12における条件と同一である）。

このβ‐HCG定量の結果を第３表にまとめる。このワン
ポツト操作での感度は2.2mIU/mlβ‐HCGである。

例15 抗α‐インターフエロンの標識モノクロナール抗‐α‐インターフエロン〔ロツシユ‐
デイアグノステイカ（Roch Diagnostica）製〕のルテニ
ウムコンプレツクスによる標識は、例11における抗‐CE
Aの場合と同様の方法で実施した。

カツプリング反応用に以下の保存溶液を調製した。

（１）水、pH4.5中、ルテニウムコンプレツクス〔RC-
2〕3.75mg/ml （２） 200mM NaHCO₃、pH8.5中モノクロナール抗‐α
‐インターフエロン6.0mg/ml保存溶液（１）400μに
水溶性カルボジイミド誘導体0.81mgを加え、ボルテツク
ス中で短時間混合する。

２分後、これに抗‐α‐インターフエロン保存溶液
（２）400μを加え、混合物をボルテツクス中で再び
短時間混合する。反応混合物を室温、暗所に17時間放置
する。

標識抗‐α‐インターフエロンの分離は、反応混合物50
0μをアクリルアミドゲルAcA-54（LKB製）カラム（長
さ30cm、径9mm）上クロマトグラフイーにより行う（溶
出剤:150mM NaCl、10mMリン酸ナトリウム、0.02％Na
N₃、pH7.0）。

標識抗‐α‐インターフエロンの最大含量を示す分画、
計5.2mlを合する。この溶液中の抗‐α‐インターフエ
ロンおよびルテニウムコンプレツクスの含量は紫外部ス
ペクトルによつて定量する。以下の濃度が得られる。

11.5×10^-6M/ルテニウムコンプレツクス 1.8×10^-6M/抗‐α‐インターフエロン（モノクロー
ナル）これは標識度6.4に相当する。

例16 α‐インターフエロン標識の螢光免疫定量法の実行インターフエロン‐ｒαＡ標準（組換え白血球インター
フエロン）の定量は、ロツシユ・デイアグノステイカに
よつてEIAとして開発されたサンドウイツチ試験法を用
いる。しかしながら、酵素標識第２抗体の代わりに、ル
テニウムコンプレツクス〔RC-2〕で標識したモノクロナ
ール抗‐インターフエロン（標識度:6.4）を用いる。

各種インターフエロン‐ｒαＡ標準の定量は、以下の操
作（ワンポツト試験）により実施した。

必要数の試験管（10×75mm）それぞれに、インターフエ
ロン‐ｒαＡ標準溶液（チメロサールを含む正常ヒト血
清中、0U/ml rIFNαA;25U/ml rIFNαA;50U/ml rIFNαA;
100U/ml rIFNαA;150U/ml rIFNαA;200U/ml rIFNαＡ）
0.100mlならびにルテニウムコンプレツクス〔RC-2〕で
標識したモノクローナル抗‐α‐インターフエロン5.26
×10^-10M/溶液（標識度6.4;緩衝システム:150mM NaC
l、10mMリン酸ナトリウム、pH7.5）0.500mlをとる。こ
れに、それぞ、ポリスチレンビーズ（径6.5mm;モノクロ
ナール抗‐インターフエロンで感作）を加え、室温（26
℃）で24時間インキユベートする。

ついでビーズを各回２〜5mlの蒸留水で３回洗浄したの
ち、それぞれ2mlの硫酸（0.09N）を含む試験官に移す。
30分後に硫酸溶液をピペツトで測定キユベツトにとり、
ルテニウムコンプレツクス含量を螢光分光法で測定する
（測定条件は例12における条件と同一である）。

rIFNαＡの定量結果は第４表に示す。

０〜200U/mlの範囲では螢光強度とrIFNαＡ濃度の間に
ほぼ直線の関係が認められる。感度は0.46U/ml rIFNα
Ａである。

例17 ポリクローナル抗‐HCGのルテニウムコンプレツクス〔R
C-7〕による標識カツプリング反応のために次の保存溶液を調製する。

（１）水、pH4.5中、5.4mg/mlのルテニウムコンプレ
ツクス〔RC-7〕（２） 200mM NaHCO₃、pH8.5中、6.0mg/mlのポリクロ
ナールウサギ抗‐HCG（DAKO製、コード番号A231、ロツ
ト032A）カツプリング反応は例11に記載の操作に従つて実施す
る。この場合、保存溶液（１）および（２）それぞれ40
0μと水溶性カルボジイミド0.56mgを使用する。

標識抗体は、例11に記載のようにゲルクロマトグラフイ
ーによつて、過剰のルテニウムコンプレツクス〔RC-7〕
と分離した。

抗‐HCGおよびルテニウムコンプレツクスの含量は紫外
部スペクトルによつて定量し、以下の結果を得た。

3.81×10^-6M/ルテニウムコンプレツクス 1.87×10^-6M/抗‐HCG（ポリクロナール）これは標識度に2.0に相当する。

例18 ポリクロナール抗‐CEAのルテニウムコンプレツクス〔R
C-8〕による標識カツプリング反応のために次の保存溶液を調製する。

（１）水、pH4.5中1.71mg/mlルテニウムコンプレツク
ス溶液（２） 200mM NaHCO₃、pH8.5中、2.17mg/mlポリクロナ
ールウサギ抗‐CEA（DAKO製、コード番号A115、ロツト1
12B）溶液カツプリング反応は例11に記載の操作に従つて実施す
る。この場合、保存溶液（１）および（２）それぞれ40
0μと水溶性カルボジイミド0.19mgを使用する。

標識抗体は、例11に記載のようにゲルクロマトグラフイ
ーによつて、過剰のルテニウムコンプレツクス〔RC-8〕
と分離した。

抗‐CEAおよびルテニウムコンプレツクスの含量は紫外
部吸収スペクトルによつて定量し、以下の結果を得た。

0.43×10^-6M/ルテニウムコンプレツクス 0.94×10^-6M/抗‐CEA これは標識度0.5に相当する。

例19 h-IgGのルテニウムコンプレツクス〔RC-6〕による標識カツプリング反応のために次の保存溶液を調製する（１）水、pH4.5中3.6mg/mlルテニウムコンプレツク
ス〔RC-6〕溶液（２） 200mM NaHCO₃、pH8.5中6.0mg/mlのhIgG溶液カツプリング反応は例11に記載の操作に従つて実施す
る。この場合、保存溶液（１）および（２）それぞれ40
0μと水溶性カルボジイミド0.37mgを使用する。

標識抗体は、例11に記載のようにゲルクロマトグラフイ
ーによつて、過剰のルテニウムコンプレツクス〔RC-6〕
と分離する。

h-IgGおよびルテニウムコンプレツクスの含量は紫外部
吸収スペクトルによつて定量し、以下の結果を得た。

2.31×10^-6M/ルテニウムコンプレツクス 1.62×10^-6M/h-IgG これは標識度1.4に相当する。

例20 h-IgGのルテニウムコンプレツクス〔RC-1〕による標識カツプリング反応のために次の保存溶液を調製する。

（１）水、pH4.5中、4.0mg/mlのルテニウムコンプレ
ツクス〔RC-1〕溶液（２） 200mM NaHCO₃、pH8.5中、6.0mg/mlのh-IgG溶液カップリング反応は例11に記載の操作に従つて実施す
る。この場合、保存溶液（１）および（２）それぞれ40
0μと水溶性カルボジイミド1.11mgを使用する。

標識抗体は、例11に記載のようにゲルクロマトグラフイ
ーによつて、過剰のルテニウムコンプレツクス〔RC-1〕
と分離する。

10.4×10^-6M/ルテニウムコンプレツクス 1.8×10^-6M/h-IgG これは標識度5.8に相当する。

例21 h-IgGのルテニウムコンプレツクス〔RC-10〕による標識カツプリング反応のために次の保存溶液を調製する。

（１）水、pH4.5中、29.0mg/mlのルテニウムコンプレ
ツクス溶液（２） 200mM NaHCO₃、pH8.5中、6.0mg/mlのh-IgG溶液カップリング反応は、例11に記載の操作に従つて実施す
る。この場合、保存溶液（１）526μと保存溶液
（２）400μ、ならびに水溶性カルボジイミド7.45mg
を使用する。

標識抗体は、例11に記載のようにゲルクロマトグラフイ
ーによつて、過剰のルテニウムコンプレツクス〔RC-1
0〕と分離する。

0.81×10^-6M/ルテニウムコンプレツクス 0.78×10^-6M/h-IgG これは標識度1.0に相当する。

例22 h-IgGのルテニウムコンプレツクス〔RC-3〕による標識カツプリング反応のために次の保存溶液を調製する。

（１）水、pH4.5中、3.7mg/mlのルテニウムコンプレ
ツクス〔RC-3〕溶液（２） 200mM NaHCO₃、pH8.5中、6.0mg/mlのh-IgG溶液カツプリング反応は、例11に記載の操作に従つて実施す
る。この場合、保存溶液（１）および（２）はそれぞれ
400μ、ならびに水溶性カルボジイミド0.75mgを使用
する。

標識抗体は、例11に記載のようにゲルクロマトグラフイ
ーによつて、過剰のルテニウムコンプレツクス〔RC-3〕
と分離する。

4.41×10^-6M/ルテニウムコンプレツクス 1.21×10^-6M/h-IgG これは標識度3.6に相当する。

例23 h-IgGのルテニウムコンプレツクス〔RC-4〕による標識カツプリング反応のために次の保存溶液を調製する。

（１）水、pH4.5中、3.81mg/mlルテニウムコンプレツ
クス〔RC-4〕溶液（２） 200mM NaHCO₃、pH8.5中、6.0mg/mlのh-IgG溶液カツプリング反応は、例11に記載の操作に従つて実施す
る。この場合、保存溶液（１）および（２）はそれぞれ
400μ、ならびに水溶性カルボジイミド0.75mgを使用
する。

標識抗体は、例11に記載のようにゲルクロマトグラフイ
ーによつて、過剰のルテニウムコンプレツクス〔RC-4〕
と分離する。

5.51×10^-6M/ルテニウムコンプレツクス 1.17×10^-6M/h-IgG これは標識度4.70に相当する。

例24 h-IgGのルテニウムコンプレツクス〔RC-5〕による標識カツプリング反応のために次の保存溶液を調製する。

（１）水、pH4.5中、3.87mg/mlのルテニウムコンプレ
ツクス〔RC-5〕溶液（２） 200mM NaHCO₃、pH8.5中、6.0mg/mlのh-IgG溶液カツプリング反応は例11に記載の操作に従つて実施す
る。この場合、保存溶液（１）および（２）はそれぞれ
400μ、水溶性カルボジイミドは0.75mgを使用する。

標識抗体は、例11に記載のようにゲルクロマトグラフイ
ーによつて、過剰のルテニウムコンプレツクス〔RC-5〕
と分離する。

11.7×10^-6M/ルテニウムコンプレツクス 1.04×10^-6M/h-IgG これは標識度11.2に相当する。

例25 h-IgGのルテニウムコンプレツクス〔RC-9〕による標識カツプリング反応のために次の保存溶液を調製する。

（１）水、pH4.5中、3.45mg/mlのルテニウムコンプレ
ツクス〔RC-9〕溶液（２） 200mM NaHCO₃、pH8.5中、6.0mg/mlのh-IgG溶液カツプリング反応は例11に記載の操作に従つて実施す
る。この場合、保存溶液（１）および（２）それぞれ40
0μ、水溶性カルボジイミド0.375mgを使用する。

標識抗体は、例11の記載のようにゲルクロマトグラフイ
ーによつて、過剰のルテニウムコンプレツクス〔RC-9〕
と分離する。

5.69×10^-6M/ルテニウムコンプレツクス 0.45×10^-6M/h-IgG これは標識度12.8に相当する。

【図面の簡単な説明】

第１図は、本発明のルテニウムコンプレツクスを用いる
螢光免疫定量法の実施に際し、使用できる測定装置の構
成の一例を図式的に示した図である。１……光源、2:石英板、3:サンプル、4:凹レンズ、5:エ
ツジ・フイルター、6:集束レンズ、7:光電子増幅管、8:
増幅器、9:検波装置、10:カウンター、11:フオトダイオ
ード、12:ゲート回路、13:励起閃光、14:螢光、15:ゲー
ト回路制御用閃光（制御器）

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (56)参考文献米国特許4293310（ＵＳ，Ａ) ＣＬＩＮＩＣＡＬＣＨＥＭＩＳＴＲＹ，Ｖｏｌ．29，Ｎｏ．９（1983）Ｐ. 1665−1672

Claims

【特許請求の範囲】

【請求項１】一般式 RU²⁺L₁L₂L₃ （Ｉ）（式中、L₁およびL₂は同一または異なり、水溶性付与基
としてスルホン酸基で置換されているバソフェナンスロ
リンまたはベンゾバソフェナンスロリン基であり、そし
てL₃は、最大８個の炭素原子を有するアルキレン基で
置換されているバソフェナンスロリンまたはベンゾバソ
フェナンスロリン基であって、このアルキレン基は末端
が−COOH、−NH₂、−NCS、−Ｉまたは−SO₂Hal基で置換
されており、そして−SO₂NH−、−Ｓ−、−Ｏ−、−COO
−または−CO−NH−基を含んでいてもよい）で示され、免疫学的に活性な素材がカップリングされて
いるルテニウムコンプレックス。
【請求項２】リガンドL₃は、基−SO₂−NH（CH₂）nCOOH
（式中ｎは１−５の整数である）で置換されている、特
許請求の範囲第１項記載のルテニウムコンプレックス。
【請求項３】リガンドL₃は、基−（CH₂）₄COOHで置換さ
れている、特許請求の範囲第１項記載のルテニウムコン
プレックス。
【請求項４】リガンドL₃は、基−（CH₂）₅COOHで置換さ
れている、特許請求の範囲第１項記載のルテニウムコン
プレックス。
【請求項５】免疫学的に活性な素材は、抗原またはハプ
テンである、特許請求の範囲第１項から第４項までのい
づれか一つに記載のルテニウムコンプレックス。
【請求項６】免疫学的に活性な素材は抗体である、特許
請求の範囲第１項から第４項までのいづれか一つに記載
のルテニウムコンプレックス。
【請求項７】免疫学的に活性な素材は、がん胎児性抗
原、ヒトコリオゴナドトロピンまたはα−インターフェ
ロンに対する抗体である特許請求の範囲第６項記載のル
テニウムコンプレックス。
【請求項８】一般式 Ru²⁺L₁L₂L₃ （Ｉ）（式中、L₁およびL₂は同一または異なり、水溶性付与基
としてスルホン酸基で置換されているバソフェナンスロ
リンまたはベンゾバソフェナンスロリン基であり、そし
てL₃は、最大８個の炭素原子を有するアルキレン基で
置換されているバソフェナンスロリンまたはベンゾバソ
フェナンスロリン基であって、このアルキレン基は末端
が−COOH、−NH₂、−NCS、−Ｉまたは−SO₂Hal基で置換
されており、そして−SO₂NH−、−Ｓ−、−Ｏ−、−COO
−または−CO−NH−基を含んでいてもよい）で示され、免疫学的に活性な素材がカップリングされて
いるルテニウムコンプレックスの製造方法であって、上
記一般式Ｉのルテニウムコンプレックスを免疫学的に活
性な素材とそれ自体公知の方法でカップリングさせるこ
とからなる、上記ルテニウムコンプレックスの製造方
法。
【請求項９】カップリング剤として、Ｎ−シクロヘキシ
ル−Ｎ′−（２−モルホリノエチル）メチル−カルボジ
イミド−ｐ−トルエンスルホンアミドを使用する、特許
請求の範囲第８項記載の製造方法。
【請求項１０】免疫学的に活性な素材として、がん胎児
性抗原、ヒトコリオゴナドトロピンまたはα−インター
フェロンに対する抗体を用いる、特許請求の範囲第８項
または第９項のいづれか一項に記載の製造方法。
【請求項１１】一般式 Ru²⁺L₁L₂L₃ （Ｉ）（式中、L₁およびL₂は同一または異なり、水溶性付与基
としてスルホン酸基で置換されているバソフェナンスロ
リンまたはベンゾバソフェナンスロリン基であり、そし
てL₃は、最大８個の炭素原子を有するアルキレン基で
置換されているバソフェナンスロリンまたはベンゾバソ
フェナンスロリン基であって、このアルキレン基は末端
が−COOH、−NH₂、−NCS、−Ｉまたは−SO₂Hal基で置換
されており、そして−SO₂NH−、−Ｓ−、−Ｏ−、−COO
−または−CO−NH−基を含んでいてもよい）で表わされるルテニウムコンプレックス。