JPH02180893A - １，２−ジオキセタン化合物及びそれを用いた発光方法 - Google Patents

１，２−ジオキセタン化合物及びそれを用いた発光方法

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JPH02180893A
JPH02180893A JP63243760A JP24376088A JPH02180893A JP H02180893 A JPH02180893 A JP H02180893A JP 63243760 A JP63243760 A JP 63243760A JP 24376088 A JP24376088 A JP 24376088A JP H02180893 A JPH02180893 A JP H02180893A
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Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 （産業上の利用分野） 本発明は、１．２−ジオキセタン分子中の酵素によって
切断しうる基の酵素性分解によってもたらされる光学的
に検出可能な反応を用いて特異的結合対の一員を検出し
且つ定量化しうる検定法及びそれに用いる有用な１．２
−ジオキセタン化金物に関する。
（従来の技術） １．２−ジオキセタンとして知られる４員環の有機ペル
オキシドは既知化合物であるが、これまでめったに利用
されたことのない化合物群であるそれらの化合物固有の
化学的不安定性ゆえに、いくつかの１，２−ジオキセタ
ンはある種の条件下で（例えば酵素の作用により）化学
発光分解を示し、このことは”ジオキセタンの酵素性分
解を用。
いる物質の検出法”と題する係属中の米国特許出願第８
８９８２３号に開示されている（これらの技術内容は参
照によりここに引用される。）このような化学発光の間
に放出される光線の量は発光物質の濃度の尺度であり、
ひいてはその前駆物質（すなわち１．２−ジオキセタン
）の濃度の尺度である。従って、発光の強度および持続
時間を測定することによって、１．２−ジオキセタンの
濃度を求めることができる。　　１．２−ジオキセタン
環の置換基を適当に選択すると、その分子の化学的安定
性を調節することができ、ひいては化学発光の開始をコ
ントロールすることができ、それにより実施目的のため
の、例えば上記出願明細書中にある化学発光イムノアッ
セイにおける、この種の化合物の化学発光作用の有用性
を高めることができる。
発光を用いた従来の検定方法として代表的なものは、■
標識酵素としてＰＯＤを用い、基質としてＨＡ及びルミ
ノールを用いるＥｒＡ法、■アクリジンエステルを標識
体として用い、Ｈ２Ｏ２で発光させるＣＬＩＡ法が知ら
れている。
（発明が解決しようとする課題） しかしながら、従来の方法の■の場合、低濃度のリガン
ド測定に対して定量性がなく、■の場合はラベル体自体
の増幅ができない等の欠点を有していた。そのため、高
感度の測定を目指すにはより多（の光量をもった測定法
の開発が望まれていた。
本発明は上述の如き従来方法の欠点を克服し得た。
すなわち、本発明の目的は、１．２−ジオキセタンの化
学発光に基づく検定法および該検定法において有用な新
規１．２−ジオキセタン化合物を提供することである。
他の目的は、光学的に検出しうる反応において酵素によ
り分解されるある種の１．　２−ジオキセタンの合成前
駆物質として有用な新規化合物を提供することである。
本発明のこれらの目的および他の目的並びにそれらの利
点は、以後の説明および特許請求の範囲を参照すること
により十分に理解されるであろう。
（課題を解決するための手段） 前記の目的は、次式で表される１、２−ジオキセタン化
合物類の製法によって本発明に従って達成される： Ｑｌ、１１Ｍ 式中、Ｔはポリシクロアルキリデン基であり；Ｙは螢光
発色団であり；ＲはＣ１−Ｃ２０のアルキル基、アルア
ルキル基またはシクロアルキル基である（例えばメチル
基、イソブチル基、ベンジル基、ビニ　ルベンジル基、
ナフチルメチル基、シクロヘキシル基、およびポリアル
キレンオキシ基やカルボ−Ｎ−スクシンイミドオキシベ
ンジル基のようなＮ、ＯおよびＳヘテロ原子を含む基）
であり；さらにＹはいかなる発色団でもよい、一般的に
は、感度を増加させるために量子収量を最大とする発色
団を使用することが好ましい。
適当な発色団の例には下記のものが含まれる：１）フェ
ニレン及びフェニレン誘導体、例、フェノキシ； ２）ナフタレンおよびナフタレン誘導体、例、５−ジメ
チルアミノナフタレン−１−スルホン酸およびヒドロキ
シナフタレン； ３）アントラセンおよびアントラセン誘導体、例、９．
１０−ジフェニルアントラセン、９−メチル、アントラ
セン、９−アントラセンカルボキシアルデヒド、アント
リルアルコール類および９−フェニルアントラセン； ４）ローダミンおよびローダミン誘導体、びり、ロドー
ル類、テトラメチルローダミン、テトラエチルローダミ
ン、ジフェニルジメチルローダミン、ジフェニルジエチ
ルローダミン、およびジナフチルローダミン； ５）フルオレセインおよびフルオレセイン誘導体、例、
５−ヨードアセトアミドフルオレセイン、６−ヨードア
セトアミドフルオレセイン、およびフルオレセイン−５
−マレイミド； ６）エオシンおよびエオシン誘導体、例、ヒドロキシエ
オシン類、エオシン−５−ヨードアセトアミド、および
エオシン−５−マレイミドニア）クマリンおよびクマリ
ン誘導体、例、７−ジアルキルアミノ−４−メチルクマ
リン、４−ブロモメチル−７−メチルクマリン、および
４−ブロモメチル−７−ヒドロキシクマリン；８）エリ
スロシンおよびエリスロシン誘導体、例、ヒドロキシエ
リスロシン類、エリスロシン−５−ヨードアセトアミド
およびエリスロシン−５−マレイミド； ９）アクリジンおよびアクリジン誘導体、例、ヒドロキ
シアクリジン類および９−メチルアクリジン； １０）ピレンおよびピレン誘導体、例、Ｎ−（１−ピレ
ン）ヨードアセトアミド、ヒドロキシピレン類、および
１−ピレンメチルヨードアセテート；１１）スチルベン
およびスチルベン誘導体、例、６゜６°−ジブロモスチ
ルベンおよびヒドロキシスチルベン類； １２）ニトロベンゾオキサジアゾール類およびニトロベ
ンゾオキサジアゾール誘導体、例、ヒドロキシニトロベ
ンゾオキサジアゾール類、４−クロロ−７−ニドロベン
ズー２−オキサ−１，３−ジアゾール、２−（７−ニド
ロベンズー２−オキサ−１，３−ジアゾール−４−イル
）メチルアミノアセトアルテヒド、および６−（７−ニ
ドロベンズー２−オキサ−１，３−ジアゾール−４−イ
ル）−アミノヘキサン酸； １３）キノリンおよびキノリン誘導体、例、６−ヒドロ
キシキノリンおよび６−アミノキノリン；１４）アクリ
ジンおよびアクリジン誘導体、例、Ｎ−メチルアクリジ
ンおよびＮ−フェニルアクリジン； １５）アシンドアクリジンおよびアシッドアクリジン誘
導体、例、９−メチルアシフトアクリジンおよびヒドロ
キシ−９−メチルアシッドアクリジン１９）ピリジニウ
ム塩、例、４−（４−ジアルキルジ アミノスチリル）Ｎ−メチルビリジニウムイオデートお
よびヒドロキシ−置換ピリジニウム塩；２０）オキソノ
ール類；および ２１）レゾルフィン類およびヒドロキシレゾルフィン類
。
最も好適な発色団Ｙは １６）カルバゾールおよびカルバゾール誘導体、例、Ｎ
−メチルカルバゾールおよびヒドロキシ−Ｎ−メチルカ
ルバゾール； １７）螢光性シアニン類、例、ＤＣＭ　（レーザー色素
）、ヒドロキシシアニン類、１，６−ジフェニル−１，
３，５−ヘキサトリエン、１−（４−ジメチルアミノフ
ェニル）−６−フェニルヘキサトリエン、および対応す
る１、３−ブタジェン類；１８）カルボシアニンおよび
カルボシアニン誘導体、例、フェニルカルボシアニンお
よびヒドロキシカルボシアニン類； フェニレン　　　　　　　ナフチレン ヒドロキシ誘導体である。
本発明により得られる化合物を水溶系における発光方法
に利用するには、Ｔ、ＸまたはＹ基の１つもしくはそれ
以上は可溶化置換基（例、カルボン酸、スルホン酸もし
くは４級アミン塩）であることが好ましい。
本発明の前記一般式（１）で表される１、２−ジオキセ
クン化合物は、一般式 （式中、Ｔ、ＲおよびＹは前記と同じである）で表され
る化合物とハロゲン化ガラクトピラノシドと反応させ、
更に、光照射下、酸化することにより製造することがで
きる。
前記一般式（ＩＩ）で表される化合物は、以下の反応式
に従い製造することができる。
（ＩＩ） （式中、Ｔ“はポリシクロアルキル基であり、−は低級
アルキル基である。ＴＳＲ及びＹは前記と同じである。
） 又、ハロゲン化ガラクトピラノシドは、水酸基を保護し
て用いることができるが、好ましくはアセチル基で保護
した化合物が好適に用いられる。
この化合物は、ＲｏＷ、　Ｊｅａｎｌｏｚらの方法（Ｍ
ｅｔｈ−ｏｄｓ　Ｃａｒｂｏｈｙｄｒ、　Ｃｈｅｗ、、
　　１　　（１９６２）　２２１−２２７参照）により
容易に製造することができる化合物であって、α体、β
体又それらの０体あるいはＬ体であっても差し支えない
。
前記一般式（■）で表される化合物とハロゲン化ガラク
トピラノシドとの反応は、−ｉ式（Ｉｆ）で表される化
合物を塩基処理しておき、次いでハロゲン化ガラクトピ
ラノシドを反応させることにより行われる０反応は、−
１０℃〜４０℃で円滑に進行する。
つづいて脱保護反応に付し、一般式 を用いて得られる一般式（ＩＩＩ）で表される具体的な
化合物はそれぞれ以下の化合物である。
（式中、Ｔ、Ｒ及びＹは前記と同じである。）で表され
る化合物を得、このものを前記したごとく光照射下、酸
化を行い前記一般式（Ｉ）で表される１、２−ジオキセ
タン化合物を製造するものである。
因に、前記した原料化合物 Ｂ　ｒ−Ｙ−ＯＲ’ として３−ブロモアニソールあるいは２−ブロモ−６−
メドキシナフタレンを用い、 一般式 で表される化合物として２−シアノアダマンタン上述の
光照射下の酸化はオレフィンを一重項酸素（０□）で処
理することによって光化学的に実施するものである。ｉ
ｏ□　は二重結合して１．　２−ジオキセタンを形成す
ることができる。
反応は例えば−７８℃、ハロゲン化溶媒（例、塩化メチ
レン）中で実施することができる。′ＯＬは光増感剤を
用いて発生させることができる。光増感剤としては、５
，１０．１５．２０−テトラフェニル−２ＬＨ，２３Ｈ
−ポルフィン（ＴＰＰ）高分子結合ローズベンガル、メ
チレンブルー（有名な色素且つｐＨ指示薬）などを使用
することができる。好適な光増感剤はＴＰＰである。
更に本発明は光の発生方法を提供するものである。この
方法は試料中の特定の物質の存在または濃度を求めるた
めに光化学的検定法として利用すすることができる。上
記の１．２−ジオキセタン化合物はこれらの検定法のい
ずれにも使用しうる。
こうした検定法の例には、抗体（抗ＨＩＶ抗体、抗ＨＩ
Ｖ抗体）または抗原（例、αまたはβ−ｈＣＧＳＴＳＨ
ＳＬＨ等のホルモン、ＡＦＰ、ＣＥＡの様な癌関連抗原
）を検出する免疫検定法（酵素免疫測定法）；酵素検定
法（例、β−ガラクトシダーゼ）；およびウィルス（例
、Ｈ３Ｖ　Ｉ、Ｈｒ■もしくはサイトメガロウィルス）
または細菌（例、大腸菌）などを検出するヌクレオチド
ブロー・ブ法が含まれる。　検出される物質が抗体、抗
原または核酸である場合には、１．２−ジオキセタン化
合物のガラクトシル基を切断可能な酵素（例えば、α−
ガラクトシダーゼ、またはβ−ガラクトシダーゼ）が検
出される物質に特異的な親和性を有する物質（すなわち
検出される物質に特異的に結合する物質）（例、それぞ
れ抗原、抗体、または核酸プローブ）に結合することが
好ましい。
酵素を特異的親和性物質に結合させるために常法（例、
ヘテロ二価性架橋剤、σ１１えばＣＨＭＳ）が使用され
る；結合はアミド結合及びチオール−マレイミド結合を
介することが好ましい。
一般的に検定法は下記のように実施することができる。
検出される物質を含む試料と、検出される物質（例えば
抗原）に特異的親和性を存する物質（例えば抗体）を結
合した酵素を含む緩衝液に接触させ、更に特異的親和性
を有するもう一つの物質（例えば抗体）を結合した固相
（例えば抗体結合のビーズ）に接触させる。一定時間イ
ンキエベーションした後、過剰の特異的親和性を有する
物質に結合した酵素を洗い流し、その酵素部分によって
切断されうるガラクトシル基を有するｌ。
２−ジオキセタン類（基質）を添加する。固相に結合し
た酵素はガラクトシル基を切断してジオキセタンを２つ
のケトン及びエステルに分解する；ケトンの１つに結合
している発色団Ｙはこうして励起されて発光する。この
発光はキュベントまたはカメラルミノメータ−などを用
いて、試料中に検出される物質が存在することの指標と
して検出される。その物質の濃度を求めるために発光強
度を測定することができる。
検出される物質が酵素である場合には、特異的親和性物
質（例えば抗体）は不必要である。その代わりに検出さ
れる酵素によって切断されうるガラクトシル基を有する
１、２−ジオキセタン化合物（その酵素の基質）を使用
する。そこで、酵素の検出方法は、酵素−含有試料への
１．２−ジオキセタン化合物の添加、および酵素の存在
と濃度の指標として得られる発光の検出を含むものであ
る。
（実施例） 以下に本発明の詳細な説明するために参考例及び実施例
が記載されるが、本発明は何らそれらに限定されずその
要旨を通説しない範囲での修飾および変法を含むものと
思われる。
釡ｔｌ 上」ク マグネシウム削り屑（１，６４ｇ、０．０６７モル）を
アルゴン雰囲気下で火炎乾燥フラスコに入れた。
ヨウ素の小さい結晶及び乾燥テトラヒドロフラン（ＴＨ
Ｆ）（水素化アルミニウムリチウム上で新たに蒸留した
もの）７ｍｊ！を加えた。一定量（７ｗａｌｌＳ０．０
５５モル）の３−ブロモアニソールを注射器から穏やか
に攪拌した金Ｎ懸濁液に加えた。５０℃で短時間加熱後
、発熱反応が始まった。
フラスコを室温の水浴に入れ、その間ＴＨＦ（３３１１
１）を滴下ロートから細流として添加した０発熱反応が
おさまった後、この混合物を４５分間還流した。その還
流しつつあるグリニヤール試薬へ乾燥ＴＨＦ５０ａ＋ｊ
！中の２−シアノアダマンクン（８，７ｇ　、　０．０
５４モル；”Ｏｒｇａｎｉｃ　５ｙｎｔｈｅｓｉｓ　”
５７、　８　（Ｗｉｌｅ７　、１９７７）又はｖａｎ　
Ｌｅｕｓｅｎ、　Ａ、　ＦＩ。
ら、Ｊ、　Ｏｒｇ、　Ｃｈｅｗ、、　４２．３１１４　
　（１９７７）を参照されたい）の溶液を１．５時間に
わたって滴下した。
この反応混合物を還流温度で一晩加熱した後、黄色の懸
濁液を得た。フラスコとその内容物を水浴中で冷却して
いる間に、エーテル（５０ｍｌ）を加えた。濃塩酸（８
ａｌｌ、０．０９６モルトＩＣ１）を激しく攪拌しなが
ら２０分間にわたり滴下した。沈澱物を濾過により分離
し、エーテルで洗い、乾燥してケテンイミン塩２９ｇを
若干の残留マグネシウムを含む淡黄色の非吸湿性粉末と
して得た。
この塩をエタノール９０ｍ１！と濃塩酸９０ｍ１との混
合物中に懸濁し、３時間還流した。その間に混合物はか
なり薄くなった。水浴で冷却後、得られた固形物を砕き
、濾過により分離し、中性になるまで洗浄し、乾燥して
薄い灰色のケトン１３゜６５ｇ（２−シアノアダマンク
ンに基づいて収率９３％）を得た（融点１１１〜１１４
℃）。薄層クロマトグラフィー（Ｔ　Ｌ　Ｃ”）はこの
生成物がその後の操作によって十分な純度であることを
示した（Ｒｆ＝０．４５；　Ｋ　５　Ｆ−ＣＭ　ＣＩ　
：ヘキサン５０：５０）、ヘキサンから再結晶してプリ
ズム晶として表題化合物を得た（融点１１３〜１１５℃
）。
ＩＲ（Ｃ１ｌ、Ｃ１よ）　：　２９００ｃａ＋　、１６
７０ｃｍ＋−’（Ｃ−０）、１５９０ｃｍ　　　１５７
５ｃｍ　　により生成物の構造が次式の通りであること
を確認した。
参考例１に従って製造した一定１ｔ（１１，３ｇ。
０．０４２モル）の３−メトキシフェニルアダマント−
２−イルケトンをモレキエラーシーブ乾燥（３人）ジメ
チルスルホキシド ■ｌに懸濁した．懸濁固体を熔解するために加熱した．
攪拌しながら室温へ冷却すると、微細な懸濁液が得られ
た．カリウムｔ−ブトキシド（８。
５ｇ，０．０７０モル）をアルゴン雰囲気下に加えた。
５分後、はとんど均質な橙色の溶液が得られ、これを５
０℃の水浴に入れた．硫酸ジメチル（４ｍｌ、０．０４
２モル）を注射器から１０分間にわたって滴下した。さ
らに１５分攪拌した後、追加の硫酸ジメチル（３．　　
３　　ｍｌ、０．０３４モル）を同じやり方で加えた後
、無色の溶液を室温で一晩攪岸した．水浴で冷却後、Ｋ
，Ｃｏ，　Ｑ，　　５　　ｇ及び氷水１２５＋＋ｊ！を
加え、この混合物を５０■ｌずつの酢酸エチルで３回抽
出した．合わせた有機画分を水で３回、飽和ＮａＣｌ水
溶５０ｍｊ！で１回洗い、に２ＣＯ，上で乾燥した。溶
媒を真空除去して油状物を得た．その油状物をヘキサン
に溶かし、得られた溶液をセライトを通して濾過し、真
空濃縮して粘稠性のある淡黄色の油状物１１５ｇ（収率
９６％）を得た，ＴＬＣは微量のケトン出発物質を含む
エノールエーテル（Ｒｆ−０．　　６　８　；Ｅ。
Ｍｅｒｃｋ社製＾１，０，−Ｃ）Ｉ，ＣＩ２：　ヘキサ
ン５０：５０）へのきれいな転化を示していた。
Ｉ　Ｒ　（Ｃｌ，Ｃ１２）　：　２　９　０　０　ｃｍ
　、　１　６　０　０　ｃｏ＋−’１　５　９　０　ｃ
ｍ−’　、　　１　５　８　０　ｃｔａ−’　、　　１
　５　７　０　ｃｖａ−’１　０　９　５　ｃａ＋　　
、　　１　０　８　０　ｃｍ−’Ｈ−　ＮＭＲ　　（Ｃ
ＤＣＩ，　）　　：　δ　１．５−２　（１２８，　ｏ
ｎ）２、５５（ＩＩｌ．　　ｓ）　　、　　３．２　　
（ＩＩＩ，　　ｓ）　　、　　３．２５（３１１，　　
ｓ）、　３．７５　（３Ｈ，　ｓ　）および６．７−７
、３　　（４１１，　ｍ　）これらのデータにより、こ
の生成物の構造が次式の通りであることを確認した。
ヱグルシし乙 モレキエラーシーブ乾燥（３人）ジメチルホルムアミド て製造したメトキシ（３−メトキシフェニル）メチレン
アダマンクン（１４ｇ，０．０４９モル）の溶液を、ア
ルゴン雰囲気下で同じ溶媒中のナトリウムチオエトキシ
ド（７．４ｇ．０．８８モル）の溶液に加えた．この混
合物を３時間還流した。
攪拌しながら水浴の冷却後、この反応を水２００ｍｌ中
の８１１やＣＩ　　６２ｇで停止させた．酢酸エチル（
１２０ｍｌ）および小量の氷水を加えた．水層を分離し
、酢酸エチル７５ｍｌで抽出した．有機抽出物を１００
ｍｌずつの水で４回、次に飽和ＮａＣｌ　（１　０　０
ｍｌ）で洗い、すばや（　Ｎａ，ＳＯ４上で乾燥させた
．この溶液を濾過し、濃縮して油状物を得、それをヘキ
サン５Ｑｍｌで摩砕した．エバポレーターで溶媒を除去
すると固体が残り、それを冷ヘキサンで洗った．粗製の
灰白色フェノール系生成物（１３ｇ）は５％ＭｅＯＨ−
　Ｃ）ｌ　ＣＮから再結晶して無色プリズム状結晶１０
ｇを得た（ｉｌＪ点１３１〜１３３℃）　、　　ＩＲ　
（ＣＨｌＣｌ，）　　：３５８０ｃ　ｍ−’、３　３　
２　０　ｃｍ−’、２　９　１　０　ｃｍ＋−’　　１
　５　９　０　ｃ５１　５　８　０　ｃａ　　　ｌ　４
　４　０　ｃｒａ−’、により生成物の構造が次式の通
りであることを確認した。
実歴上り一［ モレキュラーシープ（３Ａ）で乾燥させたＮ。
Ｎｏ　−ジメチルホルムアミド２Ｑｍｌ中にメトキシ（
３−ヒドロキシフェニル）メチレンアダマンクン（１，
２１ｇ、４．４８ミリモル）を熔かした溶液にアルゴン
ガス雰囲気下室塩で６０％水素化ナトリウム（アルドリ
ッチ社製Ｎｏ、　１８８．４．　７ミリモル）を攪拌し
ながらゆっくりと加えた。水素ガスが発生し、淡黄色の
フェノキシナトリウムの沈澱を生じた。室温で３０分間
攪拌後、Ｒ，Ｗ、ＪｅａｎｏｌｏｚとＰ、Ｊ、５Ｌｏｆ
ｆｙｎの方法（Ｍｅｔｈｏｄｓ　　Ｃａｒｂｏ−ｈｙｄ
ｒ、　Ｃｈｅｍ、、１　　（１９６２）　２２１−２２
７　）によって得られた２、３，４．６−テトラ−０−
アセチルーβ−Ｄ−ガラクトピラノシルプロミド（１，
９８７ｇ、４．８ミリモル）をこのサスペンション溶液
の加えたた、ここで得られたオレンジ色の均一な溶液を
室温で３日間攪拌し、それから４００ｍ１の水の中へ流
し込んだ。この混合液を３０％ｋｍエチルを含むヘキサ
ン（１２０ｍ　ｌ）で３回抽出し、乾燥後、溶媒を除去
し、２．９６ｇの粗生成物を得た。この粗生成物を２５
〜４０％酢酸エチル−ヘキサンをン容出液とするシリカ
ゲルカラムクロマトグラフィーに付し、２つの分画を得
た。極性の低い混合物（１，０５ｇ）は主に出発原料の
エノールエーテルおよび少量のメトキシ（３−アセトキ
シフェニル）メチレンアダマンクンを含んでいた。ＴＬ
Ｃ（Ｋ５Ｆ：３０％酢酸エチル−ヘキサン）のＲｆ値は
、０．７６と０．６４であった。この混合物をメタノー
ル中ナトリウムメトキシドで処理し、出発原料を回収で
き、リサイクルして使用した。
一方のより極性の高い混合物（１，０６ｇ）は目的のア
リールグリコシド（Ｒｆ−０，４０）とアセトブロモガ
ラクトースのβ転移した生成物（ガラフタル、Ｒ（−０
，３６）でありこの了り−ルグリコシドはひきつづいて
精製せず、つぎの脱アセチル化反応に用いた。分取用の
ＴＬＣから得られたガム状のアリール　β−Ｄ−ガラク
トピラノシドテトラアセテート（純度８５％以上）の分
光学的データは以下のとうりであった。
Ｉ　Ｒ（ＣＨＣＬ３）　：　３０２０ｃｍ＋−’　、　
２９０８ｃｍ’　、　２８４２ｃｍ　。
１７４８ｃｏ＋　（ａｃｅｔａｔｅ　）　、　１５９６
ｃｍ　　、　１５７５ｃａ＋　　、　１３６８ｃｎ＋　
　、　１２３０ｃｍ　　＋　　ＬＯ７８ｃＩＩＩ；Ｈ−
Ｎ　Ｍ　Ｒ（４００ＭＩＩｚ、　ｃｏｃｔ、　）　　：
６１．７−２．０　　（ｉ２Ｈ。
ｒａ、　ａｄａｌｌａｎＬａｎｅ）　＋２．０１　　（
３）１＋　Ｓｒ　０Ａｃ）　＋２．０７（３Ｈ，ｓ、Ｏ
Ａｃ　）　、２．１８　　（３１１，Ｓ、　０Ａｃ）　
、２．６４　　（ＩＨ。
ｂｒ、ｓ、　Ｈ−１’ｂ　）　、３．２４　　（１）１
．　ｂｒ、ｓ、　Ｈ−１’ａ　）　＋３．２８（３Ｈ，
ｓ、　ＯＭｅ）　、４．０７　　（ＩＬ　ｔ、　　Ｊ　
−３，２Ｈｚ、　Ｉｆ−４）　。
５．５０　（１）１．　ｄｄ、　Ｊ　−１０，６，３，
２１１ｚ、　Ｈ−３）　、５．４６（ＩＨ，ｄ、　Ｊ＝
３．２ｔｌｚ、　Ｈ−４）　、５．５０　　（ｉｌｌ、
　ｄｄ、　、１−１０．６．７．６Ｈｚ、　Ｈ−２）　
、６．９２　　（１）１．　ｂｒ、ｄ、、Ｊ　＝８１１
ｚ。
ト４　”　ｏｒ　　Ｈ−６”　）　＋６．９７　　（Ｉ
ｌｌ、　ｂｒ、ｓ、　Ｈ−２”）。
７．０２　（１８，ｂｒ、ｄ、　Ｊ　＝７．８１１ｚ、
　Ｈ−６”　　ｏｒ　Ｈ−４”）ａｎｄ　７．２６　ｐ
ｐｔａ　（ＩＨ，ｄｄ、　Ｊ　−８，Ｑｉｌｚ、　１（
−５”　）　。
Ｊ　ｃｌ、２）の７．６Ｈｚのカップリング定数は、β
−構造を有するグリコシドを示している。
これらのデータから生成物の構造は、下式であると確認
した。
前記反応より得られた極性混合物１．０６ｇをメタノー
ルｌＱｍｌに溶かした溶液にアルゴンガス雰囲気下０．
７５ｍ１のメタノールに溶かした過剰のナトリウムメチ
ラートを加えた。室温で一晩攪拌したのち、室温で塩化
アンモニウム０．　７ｇを加えさらに３０分間攪拌した
。メタノールを留去したのち、残渣にクロロホルムを加
え、固形物を摩砕し、不溶物を濾過により除いた。ＴＬ
Ｃで生成物の吸収がなくなるまでクロロホルムによる抽
出を繰り返した。得られたクロロホルムを合わせ、濃縮
して黄色油状物を得たのち、５〜１０％メタノール−ク
ロロホルムを溶出液としてシリカゲルクロマトグラフィ
ーに付し、メトキシ（３−ヒドロフェニル）メチレンア
ダマンクンから全収率１７〜２０％で目的物を０．３８
３ｇ得た（Ｒｆ−０，２５；　Ｋ５Ｆ　：　１０％Ｍｅ
ＯＨ−ＣＩＩＣＩ、　）　。
ＩＲ（Ｃ）ＩｃＩ、　）　　：　３０１０　（０１１）
　、　２９９６．２９０４．２８２０゜１５９５、１５
７４．１０７８　ｅ♂；　　Ｈ−ＮＭＲ（４００ＭＨｚ
、　ＣＤＣＩ）：６１．８５−１．９５　　（１２）１
．　ｍ、　ａｄａｍａｎｔａｎｅ）　、２．６１（１８
，ｂｒ、ｓ、　Ｈ−１’ｂ　）　、３．１８　　（ＩＩ
Ｉ、　ｂｒ、ｓ、　Ｈ−１’ａ）　　、３．２３　　　
（３１１，ｓ、　　ＯＭｅ）　　、　　３．６２　　（
ＬＨ，ｍ、　　Ｉｆ−５）３．８１　（３１１，ｔａ、
　Ｈ−３ａｎｄ　ＩＩ−６）　、　４．０３　（ＩＩＩ
、　ｄｄ、　Ｊ−９ｔ　８．３Ｈｚ、　Ｈ−２）　＋　
４．１９　（ＩＨ，ｂｒ、ｓ、　ｌｌ−４）　＋４．８
９　（１８，ｄ、　Ｊ−１，６Ｈｚ　、　Ｈ−１）　、
　６．８８−６．９５　　（２Ｈ，ｍ、　Ｈ−４″　ａ
ｎｄ　Ｈ−６”　）　＋　６．９９　（ＩＩＬ　３１　
Ｈ−２’）　＋　７７−１５ｐｐ＋　　（１１１，ｔ、
Ｊ＝１．８Ｈｚ　＋　１１−５−　）　　：ａｌｐ：　
　５０〜５５℃（シンター）、８９℃（半透明）９６〜
９９℃（はぼ透明）、１０５℃（透明）、１１７〜１２
０℃（分解）。
これらのデータから生成物の構造は下式であることを確
認した。
実施例　３ 培養管中で、前記反応より得られたガラクトシドエノー
ルエーテル７５．１ｍｇ　（０，１７ミリモル）を５％
エタノール−クロロホルム１２ｍ！にン容かした。５．
１０，１５．２０−テ［・ラフユニルー２１Ｈ，２３Ｈ
−ポルフイン（ＴＰＰＯ，６ｍｇ）は光増感剤として加
えた。混合物は乾燥酸素で飽和し、２５０　Ｗ高圧ナト
リウム灯をもつジュワーフラスコ中においた。カプトン
（商品名Ｋａｐｔｏｎ、　ｎｕ　Ｐｏｎｔ社製）をＵＶ
フィルターとして容器の内側においた。１０℃以下の試
料温度を保持するために前記装置にポンプを用いて氷水
を流した。溶液は一定の酸素流入下ＵＶで出発物質由来
の２６１　ｎｍの吸収が消失し、２７８　ｎｍの肩を伴
った２７２ｎｍの新たなピークが生じる間の１０分間照
射した。溶媒を除き残渣に３０％のア七ト二トリルを含
む水を加え摩砕した。その水溶性の物質は、０．４５ミ
クロンナイロンフィルターで濾過し、水−ア七ト二トリ
ル展開剤を用いＨＰＬＣカラムにかけた。凍結乾燥後、
そのジオキセタンを収率よく白色の綿状粉末として得た
、生成物は９７℃でシンターしはじめ明らかに容積の減
少下１０２〜１０７℃でとけはじめ、１００℃で湿気を
おび最終的に１１８℃で粉状物となった。
Ｉ　Ｒ（Ｃ）ＩＣＩ、　）　　：　３３９０　（ＯＨ）
　　、　３０００．２９１４．２８５４゜１５Ｂ２．　
１２８４．　１２７２．　１０６８　ｃｒａ’　；　　
ＩＩ−ＮＭＲ（４００Ｍｌｌｚ。
ＣＤＣｌ、）：δ　０．９５＝２．’０７　（１３０，
ｍ）　　、　２．９７　（Ｉｌｌ。
ｂｒ、ｓ）　、　３．１１および３．１３　（３Ｈ，２
ｓ、　ＯＭｅ）　、　３．６５（ＩＨ，ｂｒ、ｓ）　　
、　　３．８２　（３Ｈ，ｂｒ、ｓ）　　、　　４．０
５　（ＬＨ，Ｌ。
Ｊ　　＝７．２２１（ｚ）　　、　　４．２２←０１．
　　ｂｒ、ｓ）　　、　　４．８９　（ｌｔｌ、　　ｄ
。
Ｊ　＝７．３１１ｚ　）　　＋７．０１−７．２８ｐｐ
Ｈ（４１１，ｍ）これらのデータからジオキセクン生成
物は下図に示される構造を有し、２つのＣ−４位のジア
ステレオマーの混合物であることを確認した。
夾籏−例一」工 β−Ｄ−ガラクトシダーゼの検定は次の方法で実施した
。
成分 緩衝液：０．０１Ｍ　　リン酸塩、１ｍＭ　　ＭｇＣ１
，，６、７ｍＭ　　ＮａＣｌ　（ｐＨ７，３）基質：０
．４ｍＭの３−（２°　−スピロアダマンクン）−４−
メトキシ−４−（３”−β−Ｄ−ガラクトシル）フェニ
ル−１，２−ジオキセタン（ＡＭＣ；ＰＤ） β−Ｄ−ガラクトシダーゼ：緩衝液中１．０ｍｇ／ｍｌ
のβ−Ｄ−ガラクトシダーゼ原液の段階的希釈は試験管
内で次の最終酵素濃度となるように行ったニ ア ２　　ｘｌＯＭ　　　　　６．４ｘｌＯＭｙ　　　　　
　　　　　　−ｔｌ ４　　ＸＩＯＭ　　　　　１．３Ｘ１０　　Ｍｇ　　ｘ
ｌＯ−’Ｍ　　　　　２．６ｘｌＯＭ１．６ｘｌＯＭ　
　　　５．２ｘｌＯＭ３．２ｘｌＯＭ　　　　１．０ｘ
ｌＯＭ手順：上記濃度のβ−Ｄ−ガラクトシダーゼを含
みさらに０．４ｍＭ　　ＡＭＧＰＤを含む２通りの試験
管は３７℃で６０分インキエベートした。−方の試験管
に直ちに１００μ！のＩＮ　　ＮａＯＨを添加しｐ　Ｈ
を１２とし、ターナ−２０Ｅルミノメータ−で３０分間
の発光積分量を測定した。もう一方の試験管は、アルカ
リを加えず直ちにカウントした０、第１図には、０．４
ｍＭ　　ＡＭＧＰＤを用いたβ−Ｄ−ガラクトシダーゼ
の検出データを示す、ｌＮＮａＯＨ添加での発光は、５
Ｘｌθ　〜２Ｘ１０　　Ｍ酵素の間で増大した。−方、
未添加（ｐＨ７，３）の系での発光は６．４×ｌＯ〜４
Ｘ１０　　Ｍ酵素の間で増大した。
物質： １／８インチビーズを被検体捕獲用のマウスモノクロー
ナル抗ＣＥＡ抗体（ＲＩＣ７）で被覆した。マウスモノ
クローナル抗ＣＥＡ抗体ＣＦＩＢ２）はβ−Ｄ−ガラク
トシグーゼと結合させて、検出用抗体（抗体酵素コンジ
ュゲート）として使用した。
ＣＥＡはＫＡＴＯＩＩＩｃｅｌｌの培養上清から得られ
、ＢＳＡ　（ｖ型−脂肪酸不合）はＳｉｇｍａ社カタロ
グ番号Ａ６００３から得られた。
被検液および抗体酵素コンジュゲートに用いた緩衝液は
０．１Ｍ　　リン酸、１　ｍ　Ｍ　　ＭｇＣＩＬおよび
２ｉ！１％ＢＳＡ　（ｐＨ７，２）である。基質緩衛液
は０．０５Ｍ　　リン酸、１　ｍＭ　　ＭｇＣｌ、（ｐ
　Ｈ７，３）および基質ＡＭＧＰＤ　（１（ｌｃｒｇ／
ｍｌ）を含んでいた。
手１１ｉ： ＣＥＡ含有被検溶液（１５μｌ）は抗体酵素コンジュゲ
ート溶液１３５μｍと混合した。この溶液に上記のよう
に被覆した１／８インチビーズ１個を加え、３７℃で３
時間インキエベートした。
その後、ビーズを蒸留水で４回洗い、反応試験管へ移し
た。上記の基質を含む緩衝液２００μｍを加えた。６０
分インキュベーシッン後、４ＮＮａＯＨ水溶液４００μ
ｌを添加し、ベルトールド・クリニルマント・ルミネッ
センス・アナライザー（Ｂｅｒｔｈｏｌｄ　Ｃ１ｉＣ１
１ｎｉｌｕ　Ｌｕｍ１ｎｅｓｃｅｎｃｅＡｎａｌｙｚｅ
ｒ）を使って１０秒間のカウント数として発光量を記録
した０表１は所定のＣＩＥ　Ａ　？ｘｉ度に対する発光
強度を示す＊Ｏｎｇ／ｍ＋と２０ｎｇ／ｍｌのＣＥＡの
間で直線性を示した。
ＣＥＡ濃度 （ｎｇ／ｍｌ） 炎−Ｌ （カウント数／１秒×１０ １．２ ２．０ ２．８ ６、０ １０．２
【図面の簡単な説明】 第１図は０．４ａＭ　Ａ　Ｍ　Ｇ　Ｐ　Ｄを使用して［
３−Ｄ−ガラクトシダーゼを検出したデータを示すグラ
フである。図中・−口−−−はｐＩ１７．３におけるデ
ータを示し、−１−はｐ　Ｉ−１１２１こおけるデータ
を示す。 手 続 袖 正 書 ６補正の内容 平成≠−元年 月 日 明細書１ ３頁６行ないし下から５行目の記載全 体を次のように訂正する。 ２、発明の名称 ３、補正をする者 事件との関係

Claims (10)

    【特許請求の範囲】
  1. （１）次式 ▲数式、化学式、表等があります▼ （式中、Ｔはポリシクロアルキリデン基であり；Ｙは螢
    光発色団であり；ＲはＣ１〜Ｃ２０のアルキル基、アル
    アルキル基またはシクロアルキル基である）で表される
    １，２−ジオキセタン化合物。
  2. （２）Ｔはアダマント−２−イリデン、Ｒはメチルそし
    てＹはフェニレン、ナフチレン、アントラセン、ローダ
    ミン、フルオレセイン、エオシン、クマリン、エリトロ
    シン、アクリジン、ピレン、スチルベン、ニトロベンゾ
    オキサンアゾール、キノリン、アクリジン、アシッドア
    クリジン、カルバゾール、螢光シアニン、カルボシアニ
    ン、ピリジニウム塩、オキソノールまたはレゾルフィン
    基の残基、もしくはこのような基の誘導体の残基である
    請求項１記載の１，２−ジオキセタン化合物。
  3. （３）Ｔはアダマント−２−イリデン、Ｒはメチル、そ
    してＹは ▲数式、化学式、表等があります▼または▲数式、化学
    式、表等があります▼ である、請求項１記載の化合物。
  4. （４）次式 ▲数式、化学式、表等があります▼ で表される化合物。
  5. （５）次式 ▲数式、化学式、表等があります▼ で表される化合物。
  6. （６）（ａ）次式 ▲数式、化学式、表等があります▼ （式中、Ｔはポリシクロアルキリデン基であり；Ｙは螢
    光発色団であり；ＲはＣ１〜Ｃ２０のアルキル基、アル
    アルキル基またはシクロアルキル基である）で表され、
    酵素と反応して光学的に検出可能なエネルギーを放出し
    得る１，２−ジオキセタン化合物を用意し； （ｂ）その安定な１，２−ジオキセタンを酵素により分
    解する； ことから成る光の発生方法。
  7. （７）酵素がガラクトシダーゼである請求項６の方法。
  8. （８）抗原抗体反応に用いる請求項６の方法。
  9. （９）酵素免疫測定法に用いる請求項８の方法。
  10. （１０）ポリヌクレオチドプローブ法に用いる請求項６
    の方法。
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