JPH0690752A - 抗体産生 - Google Patents

抗体産生

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JPH0690752A
JPH0690752A JP3333868A JP33386891A JPH0690752A JP H0690752 A JPH0690752 A JP H0690752A JP 3333868 A JP3333868 A JP 3333868A JP 33386891 A JP33386891 A JP 33386891A JP H0690752 A JPH0690752 A JP H0690752A
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Abstract

(57)【要約】 【目的】 ヒト抗体または変容抗体を産生できるＣＨＯ
細胞系、それが産生する抗体、およびその抗体の使用 【構成】 抗体の軽鎖を発現できるベクターおよび抗体
の重鎖を発現ベクターでＣＨＯ細胞系をコトランスフェ
クトして、この場合、両ベクターは独立に選択可能なマ
ーカーを含有させることにより、ヒト抗体または変容抗
体を産生できるＣＨＯ細胞系が得られる。

Description

【発明の詳細な説明】
【０００１】本発明は、チャイニーズハムスター卵巣
（ＣＨＯ）細胞系、蛋白質とくに抗体のこの種の細胞系
からの産生、ならびにＣＨＯグリコシレーションを有す
る抗体に関する。
【０００２】抗体もしくは免疫グロブリンは、蛋白性の
二官能性分子である。各抗体間で著しく可変性の一領域
が、抗原、たとえば生体が遭遇する多くの様々な感染因
子への結合に関与し（Ｆａｂ領域）、一方、第二の定常
領域（またはＦｃ領域）は細胞のＦｃ受容体への結合に
関与し、また補体を活性化する。このようにして、抗体
は、異種微生物およびウイルスを破壊する哺乳動物の免
疫応答の生体成分としての役割を果たしている。
【０００３】抗体分子は２個の軽鎖と２個の重鎖から構
成され、これらは鎖間ジスルフィド結合によって結合し
ている。各軽鎖はジスルフィド結合によって１個の重鎖
に連結し、２個の重鎖はジスルフィド結合によって互い
に連結している。各重鎖はその一端に可変ドメインを有
し、それに続いて多数の定常ドメインがあり、各軽鎖は
その一端に可変ドメインを有し、他端に定常ドメインを
有する。軽鎖可変ドメインは重鎖の可変ドメインと線列
する。軽鎖定常ドメインは重鎖の第一の定常ドメインと
線列する。重鎖の残りの定常ドメインは互いに線列す
る。軽鎖および重鎖の定常ドメインは抗体の抗原への結
合には直接関与しない。
【０００４】軽鎖と重鎖の各対の可変ドメインは抗原結
合部位を形成する。これらのドメインは、４領域のフレ
ームワークからなる各ドメインと同じ一般構造を有し、
それらの配列は比較的保存されていて、３個の相補性決
定部位（ＣＤＲ）によって連結されている。４個のフレ
ームワーク領域は大部分β−シートコンホーメーション
をとり、ＣＤＲは、β−シート構造を連結するループを
形成し、また時にはβ−シート構造の一部となってい
る。ＣＤＲはフレームワーク領域によって近位に保持さ
れ、他のドメインからのＣＤＲと一緒に抗原結合部位の
形成に寄与する。
【０００５】動物を抗原で免疫すると、特異性および親
和性の異なる様々な抗体の産生が起こる。したがって、
免疫動物から得られた抗血清は不均質で、多くの様々な
リンパ球クローンによって産生された抗体のプールを含
有する。このようにして得られた抗体はポリクローナル
抗体と呼ばれるが、このポリクローナルな性質が、抗体
の診断アッセイや治療的応用への利用に際しては大きな
欠点になってきた。
【０００６】１９７５年、ＫｏｈｌｅｒとＭｉｌｓｔｅ
ｉｎ（Ｎａｔｕｒｅ，１９７５、２５６、４９５〜４９
７）の、抗原で免疫したマウスからの脾臓細胞をマウス
骨髄腫細胞細胞と融合させることにしたとの報告によ
り、大きな前進がもたらされたのである。ハイブリドー
マと命名された得られた雑種細胞は、脾細胞に由来する
抗体産生性と、骨髄腫細胞に由来する連続増殖性を有す
る。各ハイブリドーマは、元の抗原の特定の決定基に対
する単一の抗体を合成し、分泌する。培養液中の全細胞
が同一になるように、すなわちそれらが単一の抗体種の
合成に必要な遺伝情報を含むように、細胞融合で得られ
たハイブリドーマをクローニングし、サブクローニング
する。このようにして、クローン化したハイブリドーマ
は均一な、モノクローナル抗体を産生する。
【０００７】ハイブリドーマ技術の利点は測り知れない
ものがある。各脾臓から生じる多くの雑種細胞について
興味ある抗原に対する抗体を産生する可能性をスクリー
ニングしてわずか数個を選択すれば、不純な抗原で免疫
しても特異的な抗体を得ることができるからである。細
胞系の不死性は、均一な、特性の明確な抗体を、疾患の
特定な診断および免疫療法を含めた様々な用途に使用す
るために、無限に供給することを保証するものである。
【０００８】このようなモノクローナル抗体の臨床的環
境における使用は、残念ながら、治療を妨害したり、あ
るいはアレルギーもしくは免疫複合体過敏症を生じるヒ
ト抗−マウス抗体の発現、すなわち抗−グロプリン応答
により著しく妨げられてきた。
【０００９】たとえば、マウス（またはラット）モノク
ローナル抗体をヒトの治療に使用すると、マウス起源の
定常ドメインおよび４個のフレームワーク領域により、
ヒト抗−マウス抗体応答が誘導される。したがって、こ
の問題は、２種の基本的なタイプの抗体の開発によって
対応されてきた。キメラ抗体と呼ばれる第一のタイプ
は、マウスの定常ドメインのみが相当するヒト起源のド
メインによって置換されている（Ｍｏｒｒｉｓｏｎら：
ＰＮＡＳ，１９８４，８１，６８５１〜６８５５；Ｂｏ
ｕｌｉａｎｎｅら：Ｎａｔｕｒｅ，１９８５，３１４，
２６８〜２７０；およびＮｅｕｂｅｒｇｅｒら：Ｎａｔ
ｕｒｅ，１９８５，３１４，２６８〜２７０）。第二の
タイプはマウス定常ドメインおよびマウスフレームワー
ク領域のすべてがヒト起源の相当するドメインおよび領
域で置換されている。この第二のタイプの抗体は、人体
化またはＣＤＲグラフト抗体と呼ばれる（Ｊｏｎｅｓ
ら：Ｎａｔｕｒｅ，１９８６，３２１，５２２〜５２
５；およびＲｉｅｃｈｍａｎｎら：Ｎａｔｕｒｅ，１９
８８，３３２，３２３〜３２７）。ヒト抗体であればも
ちろん、人体化の必要はないが、ヒト抗体を分泌する細
胞系はきわめて不安定で、一般に、工業的な大規模生産
に不適当なことが明らかにされている。
【００１０】臨床的使用に十分な量の抗体を生成させる
ためには、効率的な組換え発現系の採用が望ましい。骨
髄腫細胞は、抗体産生と分泌が特定された天然の宿主を
提供するので、これらに由来する細胞系が組換え抗体の
発現に用いられてきた。多くの場合、免疫グロブリン遺
伝子調節要素に関連して複雑なベクター設計が必要で、
最終的な発現レベルは著しく変動することが報告されて
いる（Ｗｉｎｔｅｒら：Ｎａｔｕｒｅ，１９８８，３３
２，３２３〜３２７；Ｗｅｉｄｌｅら：Ｇｅｎｅ，１９
８９，６０，２０５〜２１６；Ｎａｋａｔａｎｉら：Ｂ
ｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，１９８９，７，８０５〜
８１０；およびＧｉｌｌｉｅｒｓら：Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈ
ｎｏｌｏｇｙ，１９８９，７，７９９〜８０９）。
【００１１】別の哺乳動物発現系として、ジヒドロ葉酸
レダクターゼ（ｄｈｆｒ）欠損チャイニーズハムスター
卵巣（ＣＨＯ）細胞の使用が提案されている。これらの
細胞の使用は、研究または臨床用に数種の治療用蛋白質
の大量生産を可能にしてきた（Ｋａｕｆｍａｎら：Ｍｏ
ｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．，１９８５，５，１７５０〜
１７５９；およびＺｅｔｔｌｅｍｅｉｓｓｌら：Ｂｉｏ
／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，１９８７，５，７２０〜７２
５）。しかしながら、抗体の発現にこれらの細胞を使用
した例はきわめて稀で、現在までマウス抗体の発現レベ
ルは０．０１〜０．１μｇ／ｍｌのオーダーといった低
い値しか報告されていない（Ｗｅｉｄｌｅら：Ｇｅｎ
ｅ，１９８７，５１，２１〜２９；およびＦｅｙｓら：
Ｉｎｔ．Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ，１９８８，２，２６〜２
７）。
【００１２】ＣＨＯ細胞から軽鎖および重鎖のバランス
のとれた発現を可能にする方法が開発された。軽鎖と重
鎖は抗体分子中、等モル比で連結するので、バランスの
とれた発現が望ましい。この方法によれば、抗体が機能
型で得られ、好収率での分泌が可能になる。すなわち、
病理学的疾患の免疫療法に使用するのに十分な量の機能
性抗体の取得が可能になる。
【００１３】したがって、本発明は、抗体の軽鎖を発現
できるベクターと抗体の重鎖を発現できるベクターでコ
トランスフェクトされ、この場合、両ベクターは独立に
選択可能なマーカーを含有する、抗体の産生が可能なＣ
ＨＯ細胞系を提供する。
【００１４】本発明はさらに、抗体の軽鎖をコードする
ｃＤＮＡを含有するベクターと抗体の重鎖をコードする
ｃＤＮＡを含有するベクターでコトランスフェクトさ
れ、この場合、両ベクターは抗体の軽鎖および重鎖の発
現が可能な、ヒト固体または変容抗体を産生できるＣＨ
Ｏ細胞系を提供する。両ベクターは独立に選択可能なマ
ーカーを含有するのが有利である。以後、マーカーとい
った場合には、単数および複数の両者を包含する。
【００１５】本発明の細胞系は、一般に等モル比の軽鎖
および重鎖からなるあらゆる種類の抗体の産生が可能で
ある。したがって、本発明は、重鎖および軽鎖のアミノ
酸配列がヒトリンパ球によって産生される抗体のアミノ
酸配列と同種の、ｉｎ ｖｉｖｏまたはｉｎ ｖｉｔｒ
ｏでハイブリドーマによって産生される抗体を包含す
る。また、本発明は、重鎖および軽鎖は天然抗体と同種
であるが、天然にはない形で結合されているハイブリッ
ド抗体のような変容抗体も包含する。たとえば、２種以
上の抗原に対して特異的な抗原結合部位を有する二特異
的抗体である。抗体の定常領域は、抗原結合領域の一方
もしくは他方に関連するものでもよく、またさらに他の
抗体からのものでもよい。キメラ抗体のような変容抗体
は、一方の抗体からの可変領域と他方の抗体からの定常
領域を有する。すなわち、キメラ抗体は種／種キメラで
も綱／綱キメラでもよい。このようなキメラ抗体は、抗
原結合能を改良するため、またはエフェクター機能を変
えるため、さらに１または２以上の修飾が行われてもよ
い。他の形の変容抗体には、ＣＤＲに加えて超可変領域
の一部がヒトフレームワークに移入された混成抗体を包
含する人体化抗体またはＣＤＲグラフト抗体がある。こ
のような抗体はフレームワークおよび定常領域における
付加的アミノ酸の変化かあってもよい。変容抗体の定義
には、重鎖および軽鎖のＹブランチ部にほぼ等しいＦａ
ｂフラグメントが包含される。これらには、不完全フラ
グメントまたはＦｃ領域の一部を含むフラグメントが包
含される。すなわち、本発明の範囲には、アミノ酸配列
が天然に存在するものではない任意の変容抗体が包含さ
れる。
【００１６】本発明の細胞系は、好ましくは変容抗体、
とくに好ましくはキメラ抗体もしくはＣＤＲグラフト抗
体の産生に用いられる。これらの例としては、とくにＣ
Ｄ２，ＣＤ３，ＣＤ４，ＣＤ５，ＣＤ７，ＣＤ８，ＣＤ
１１ａ，ＣＤ１１ｂ，ＣＤ１８，ＣＤ１９，ＣＤ２５，
ＣＤ４５およびＣＤｗ５２のようなＴ−細胞マーカーに
対する抗体、とくにＣＤｗ５２抗原に対するＣＤＲグラ
フト抗体、たとえばＥＰ ３２８４０４に記載されてい
るＣａｍｐａｔｈ−１Ｈ（ＣａｍｐａｔｈはＷｅｌｌｃ
ｏｍｅ Ｆｏｕｎｄａｔｉｏｎ Ｌｔｄの商標である）
がある。その他の例には、各種の癌細胞マーカー抗原た
とえばＣＤ３３およびＣＤ３８に対するＣＤＲグラフト
抗体がある。
【００１７】レシピエントのＣＨＯ細胞にコトランスフ
ェクション後、得られたコロニーを両マーカーを用いて
選択する。二相性表現型を示すコロニーは一般に、軽鎖
および重鎖の両者を共発現できる。選択可能なマーカー
は優性のものでもそうでなくてもよい。コトランスフェ
クションに使用される選択マーカーの例には、アデノシ
ンデアミナーゼ（Ｋａｕｆｍａｎら：ＰＮＡＳ，１９８
９，８３，３１３６〜４０）、アスパラギンシンテター
ゼ（Ｃａｒｔｉｅｒら：Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏ
ｌ．，１９８７，７，１６２３〜２８）、大腸菌ｔｒｐ
Ｂ遺伝子およびサルモネラｈｉｓＤ遺伝子（Ｈａｒｔｍ
ａｎら：ＰＮＡＳ，１９８８，８５，８４０７〜５
１）、Ｍ２マウスリボヌクレオチドレダクターゼ（Ｔｈ
ｅｌａｎｄｅｒら：ＥＭＢＯ Ｊ．，１９８９，８，２
４７５〜７９）、ヒト多薬剤抵抗性遺伝子（Ｋａｎｅ
ら：Ｇｅｎｅ，１９８９，８４，４３９〜４４６）、グ
ルタミンシンテターゼ（Ｂｅｂｂｉｎｇｔｏｎら：ＤＮ
Ａ Ｃｌｏｎｉｎｇ，ＩＩＩ巻、１９８７，Ｄ．Ｍ．Ｇ
ｌｏｖｅｒ編、１６３〜１８８、ＩＲＬ Ｐｒｅｓ
ｓ）、キサンチングアニンホスホリボシルトランスフェ
ラーゼ（ｇｐｔ）（Ｍｕｌｌｉｇａｎら：Ｓｃｉｅｎｃ
ｅ，１９８０，２０９，１４２２〜２７）、ハイグロマ
イシンＢ（Ｓａｎｔｅｒｒｅら：Ｇｅｎｅ，１９８４，
３０，１４７〜１５６）、ネオマイシン遺伝子（Ｓｏｕ
ｔｈｅｒｎら：Ｊ．Ｍｏｌ．Ａｐｐｌ．Ｇｅｎｅｔ．，
１９８２，１，３２７〜３４１）およびジヒドロ葉酸レ
ダクターゼ（Ｓｕｂｒａｍａｎｉら：Ｍｏｌ．Ｃｅｌ
ｌ．Ｂｉｏｌ．，１９８１，１，８５４〜８６４）があ
る。とくに好ましい選択可能マーカーはｄｈｆｒで、こ
れは通常ｄｈｆｒ−表現型の親ＣＨＯ細胞系（Ｕｒｌａ
ｕｂら：ＰＮＡＳ，１９８０，７７，４２１６〜４２２
０）とともに用いられる。コトランフェクションに成功
したＣＨＯ細胞はｄｈｆｒ＋表現型を有し、チミジンと
ヒポキサンチンを欠き、メトトレキセート（ＭＴＸ）を
任意に添加した培地上でコロニーを培養することにより
容易に選択できる。他方のベクターとの使用が好ましい
選択マーカーは優性の抵抗性マーカー、たとえばネオマ
イシン（ｎｅｏ）である。このマーカーによってトラン
スフェクトされたＣＨＯ細胞は、ゲンタマイシンとも呼
ばれる構成物質Ｇ４１８を含有する培地上でコロニーを
選択することにより、容易に選択できる。
【００１８】選択および増幅に好ましい第二の系には、
グルタミンシンテターゼ選択可能マーカー、ＧＳ系で、
ＷＯ８７／０４４６２に記載されている。ＧＳ酵素をコ
ードする遺伝子と所望の抗体遺伝子でトランスフェクト
されたＣＨＯ細胞は、ＰＣＴ公告出願第ＷＯ８７／０４
４６２に記載されているように、グルタミンを欠く培地
中でコロニーを培養することにより選択できる。
【００１９】少なくとも一方の選択可能マーカーはま
た、軽鎖および重鎖をコードする遺伝子が増幅される基
板を提供することが好ましい。ＣＨＯ細胞系のコトラン
スフェクションでは、ベクターＤＮＡは多くの場合、同
じ遺伝子座で細胞の染色体に挿入される。したがって、
一方の選択可能マーカーのみを増幅の基礎で使用すれば
通常、両遺伝子のコピー数の平行した増加が起こる。こ
の方法で使用するのにとくに好ましい選択可能マーカー
は、ＭＴＸの濃度を上げることにより所望の増幅の達成
が可能になるｄｈｆｒである。第二の好ましい選択可能
マーカーは、メチオニンスルホキシイミン（ＭＳＸ）の
添加により増幅が可能なＧＳである。
【００２０】選択可能マーカーはもちろん、それらの発
現に適当なＤＮＡの調節要素の制御下にある。ｄｈｆｒ
を選択可能マーカーとして使用する場合には、調節要素
はウイルス起源のもの、たとえばＤＮＡ腫瘍ウイルスの
ものであることが好ましい。とくに、ＳＶ４０またはア
デノウイルス腫瘍後期プロモーターが好ましい。この場
合、プロモーターからエンハンサー要素を除去して、そ
れを効果的に「クリプリング」することがとくに有利で
ある。この修飾によって、メトトレキセートの各選択濃
度での遺伝子増幅レベルは、強力なプロモーターを使用
した場合に期待される以上に増大する。選択マーカーと
してｎｅｏを用いた場合に適当なプロモーターの例はマ
ウスメタロチオネインプロモーターである。
【００２１】軽鎖および重鎖遺伝子はゲノムＤＮＡでも
よいが、ｃＤＮＡが好ましく、本技術分野で知られてい
る操作（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌ
ａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，第２版、Ｍａｎｉ
ａｔｉｓら編、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏ
ｒ）を用いてクローン化される。遺伝子もその発現に適
当なＤＮＡの調節要素の制御下に置かれる。両鎖の発現
がほぼ均衡がとれるように、両鎖に同じ調節要素を使用
することが好ましい。調節要素はウイルス起源のもので
よく、その例には選択マーカーとしてのｄｈｆｒの発現
に関連して上述したものが包含される。他の例にはβ−
アクチンプロモーターの使用があり、β−アクチンポリ
アデニル化シグナルが連結される。
【００２２】ベクターの一方または両者には、また、ベ
クターを迅速な瞬間的アッセイでチェックできるように
構築するため、ＳＶ起源の複製を含有させることもでき
る。
【００２３】発現ベクターの構築は本技術分野で知られ
た操作（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌ
ａｖｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，第２版、Ｍａｎｉ
ａｔｉｓら編、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏ
ｒ）に従って実施できる。
【００２４】ＣＨＯ細胞系の発現ベクターによるコトラ
ンスフェクションは、等モル量の両ベクターと標準的ト
ランスフェクション操作、たとえばリン酸カルシウム沈
殿またはリポフェクションを用いて簡単に実施できる。
所望のコトランスフェクトさりた細胞系の選択は、特定
の選択可能マーカーについて知られている標準操作に従
って実施できる。
【００２５】本発明はまた、本発明のＣＨＯ細胞系を培
養することからなる抗体の産生方法を提供する。ＣＨＯ
細胞の培養は、血清含有または、好ましくは無血清、無
蛋白質培地中で行われる。ＣＨＯ細胞系がｄｈｆｒ＋ト
ランスフォーマントである好ましい例においては、培地
はヒポキサンチンおよび／またはチミジンを欠き、所望
によりＭＴＸを添加されたものが好ましい。選択可能マ
ーカーがグルタミンシンテターゼの場合には、培地はグ
ルタミンを欠き、所望によりＭＳＸを含むものが好まし
い。ほぼ等モル比での両鎖の発現により、得られる機能
性抗体の至適収率が達成される。２つの鎖は細胞内で組
立てられ、培地中に機能性抗体として分泌される。得ら
れた抗体は標準操作に従って、精製、処方化される。
【００２６】抗体は、炭水化物含量３〜１２％の糖蛋白
質である。炭水化物単位は重鎖および軽鎖が結合したの
ちに、抗体鎖上のアクセプター部位に移入される。主要
な炭水化物単位は、抗体の定常領域のアミノ酸残基に結
合する。炭水化物はまた、一部の抗体では抗原結合部位
に結合し、抗原の抗体結合部位への接近を限定すること
により抗体の結合特性に影響を与えることも知られてい
る。炭水化物単位には多くの役割がある。それらは抗体
の総溶解性および異化速度に影響する。炭水化物は、一
部の抗体鎖の細胞性分泌に必要なことも知られている。
定常領域のグリコシレーションは抗体のエフェクター機
能に重要な役割を果たすことも明らかにされている。こ
のグリコシレーションがなくてもその正しいコンフィギ
ュレーションでは、抗体は抗原に結合することはできる
が、それが結合した細胞の遮断または溶解の機能を発揮
するための、たとえばマクロファージ、ヘルパーおよび
サプレッサー細胞、または補体への結合ができなくな
る。
【００２７】ＣＨＯ細胞によってグリコシル化された抗
体は、抗原結合能とエフェクター機能を維持することが
明らかにされている。これは、ｉｎ ｖｉｔｒｏの補体
分解アッセイおよびｉｎ ｖｉｖｏでヒト患者により明
らかにされた。
【００２８】本発明したがって、ＣＨＯグリコシレーシ
ョンを有する抗体を提供する。このような抗体は、天然
のたとえばヒト抗体、変容抗体たとえばハイブリッド抗
体もしくは二特異性抗体、キメラもしくはＣＤＲグラフ
ト抗体があり、Ｆａｂフラグメントも包含される。
【００２９】ＣＨＯグリコシレーションは抗原結合部位
または可変ドメインの他の部分に関連して起こる。また
はあるいはさらに、定常領域にも起こる。グリコシル化
抗体は、適当に操作されたＣＨＯ細胞中での抗体遺伝子
の発現によって製造され、ついで細胞培養培地から回収
され、必要に応じて精製される。
【００３０】ＣＨＯグリコシル化抗体は、多くのヒト疾
患の治療に、一般的には免疫抑制剤として、とくにたと
えばＴ−細胞関連疾患、重症血管炎、慢性関節リウマ
チ、全身性ループス、さらには自己免疫疾患たとえば多
発性硬化症、移植片対宿主病、乾癬、若年性糖尿病、シ
ェーグレン病、甲状腺疾患、重症筋無力症、移植拒絶反
応および喘息に有用である。これらの抗体はまた、癌た
とえば非ホジキン病性リンパ腫、多発性骨髄腫、および
感染疾患たとえばＨＩＶおよびヘルペスにも有用であ
る。
【００３１】本発明はしたがって、上述の疾患の治療用
の医薬を製造するためのＣＨＯグリコシル化抗体を提供
する。また、上述の疾患を有するヒト患者に、ＣＨＯグ
リコシル化抗体の治療有効量を投与することからなる、
ヒト患者の治療方法を提供する。
【００３２】この種の抗体の用量は、処置すべき状態お
よび処置のレシピエントによって変動するが成人の場
合、１〜約１００ｍｇの範囲であり、通常１〜１０ｍｇ
を毎日、１〜３０日の期間、投与することが好ましい。
２区分投与基準も好ましく、この場合にはたとえば５〜
１０日間１〜５ｍｇ、ついでさらに５〜１０日間６〜１
５ｍｇが投与される。本発明はまた、ＣＨＯグリコシル
化抗体を含有する組成物を包含する。このような組成物
は抗体のほかに、生理的に許容される希釈剤または担
体、また所望により他の成分たとえば他の抗体もしくは
抗生物質を混合して添加してもよい。適当な担体として
は、生理食塩水、リン酸緩衝食塩溶液、リン酸緩衝食塩
グルコース溶液および緩衝食塩溶液があるが、これらに
限定されるものではない。別法として、抗体を凍結乾燥
し、用時に上述の緩衝水溶液を添加して再構築してもよ
い。投与経路は、静脈内、筋肉内および腹腔内注射また
は注入を包含する定常的な非経口経路である。図面の説明 図１ （ａ）「クリップリング」ｄｈｆｒ選択／増幅マーカー
およびＣａｍｐａｔｈ−１Ｈ軽鎖ｃＤＮＡの発現カセッ
トを含むｐＬＤ９構築体。点線の矢印を付した小さい四
角は弱化されたＳＶ４０プロモーターであり、矢印を付
した大きな点を打った四角はβ−アクチンプロモーター
であり、ポリＡはそれぞれの起源のポリアデニル化およ
び停止シグナルを示し、ｏｒｉと記入した小さな四角は
ＳＶ４０起源の複製を含有する。 （ｂ）ネオマイシン選択マーカーとＣａｍｐａｔｈ−１
Ｈ重鎖ｃＤＮＡの発現カセットを含むｐＮＨ３１６構築
体。矢印を付しＭＴと記入した四角はマウスメタロチオ
ネインプロモーターを示す。指示された制限部位：Ｈ，
Ｈｉｎｄ ＩＩＩ；Ｂｇ，Ｂｇ１ ＩＩ；Ｂ，ＢａｍＨ
Ｉ；Ｒ１，ＥｃｏＲ１図２ コンフルーエントＡ３９細胞における４連続日にわたる
Ｃａｍｐａｔｈ−１Ｈ合成速度の比較定量。〔３５Ｓ〕
メチオニンパルス期に続いて、等量の細胞（Ｃ）および
培養培地（Ｍ）を免疫沈殿させ、ＳＤＳ−ＰＡＧＥで分
離した。Ｃａｍｐａｔｈ−１Ｈ重鎖および軽鎖の位置を
指示する（ＨおよびＬの矢印）。日３の細胞サンプルに
はいくらかの物質ロスがあった。図３ Ａ３９細胞での放射標識Ｃａｍｐａｔｈ−１Ｈの分泌速
度および分布を決定するためのパルス−チェイス実験。
コンフルーエント細胞を〔３５Ｓ〕メチオニンで６時間
パルス標識し、非標識メチオニンの過剰を含有する新鮮
培地を添加した。等量の細胞および培養培地を指示され
た時点（パレス期終了後の時間）で採取し、図２の説明
に記載したように処理した。４８および７２時間の時点
での培地サンプルを別のゲル上で６および２４時間の時
点まで流し、トラックは重（Ｈ）鎖の位置に対してのみ
並べられる。図４ １リットルのファーメンター中、９０日にわたって細胞
数／ｍｌで測定したＷＣＭ５（無蛋白質培地）中Ｃ１Ｈ
３Ｄ１１＊の増殖を示す。図５ １リットルのファーメンター中、８０日にわたって抗体
μｇ／ｍｌで測定したＷＣＭ５中Ｃ１Ｈ ３Ｄ＊４４か
らの抗体産生を示す。
【００３３】以下の実施例は本発明を単に例示するもの
である。例１：Ｃａｍｐａｔｈ−１Ｈの重鎖および軽鎖ｃＤＮＡ
のクローニング ラットＣａｍｐａｔｈ−１Ｇモノクローナルからの相補
性決定領域をはじめに、ゲノムヒト重鎖および軽鎖フレ
ームワーク中に直接グラフトした（Ｗｉｎｔｅｒら：Ｎ
ａｔｕｒｅ，１９８８，３２２，３２３〜３２７）。こ
れらの構築体を骨髄腫細胞系ＹＯ中での発現用に操作し
て、１０〜１４日間培養するとＣａｍｐａｔｈ−１Ｈ
５０μｇ／ｍｌまでの収率で得られた（Ｈａｌｅら：Ｔ
ｉｓｓｕＡｎｔｉｇｅｎｓ，１９９０，３５，１１８〜
１２７およびＷｉｎｔｅｒら、Ｎａｔｕｒｅ，１９８
８，３２２，３２３〜３２７）。骨髄腫細胞系ＴＦ５７
（Ｈａｌｅら、前出）を用いて、それぞれ軽鎖および重
鎖の０．９〜１．２ｋｂおよび１．４〜１．７ｋｂのサ
イズ選択ｃＤＮＡ分画を生成させた。これらを用いてλ
ｇｔ１０中にＥｃｏＲ１連結ｃＤＮＡライブラリーを作
成した。操作はすべてＨｕｙｎｔｈら（ＤＮＡ Ｃｌｏ
ｎｉｎｇ，Ｉ巻、Ａ ＰｒａｃｔｉｃａｌＡｐｐｒｏａ
ｃｈ，１９８４，Ｇｌｏｖｅｒ，Ｄ，編、ＩＲＬ Ｐｒ
ｅｓｓ Ｏｘｆｏｒｄ）の記載に従った。可変領域に特
異的な〔３２Ｐ〕ニックトランスレーション・プローブ
を用いてライブラリーをスクリーニングして、完全長ｃ
ＤＮＡクローンを単離した。軽鎖ｃＤＮＡについては、
Ｂａｌ−３１エキソヌクレアーゼを用いて−３２の位置
まで５’非翻訳リーダーを除去し、ＨｉｎｄＩＩＩリン
カーを添加した。３’末端については、停止コドンの４
７ｂｐ上流に唯一のＳａｃＩ部位の作成に用いた。Ｓａ
ｃＩ−ＨｉｎｄＩＩＩオリゴヌクレオチド対を用いてこ
の配列を発生させ、停止コドンの直後にＨｉｎｄＩＩＩ
部位を位置させた。重鎖ＣＤＮＡの５’末端について
は、ＡＴＧ開始コドンに重なる唯一のＮｃｏＩ部位を用
い、ＨｉｎｄＩＩＩ−ＮｃｏＩオリゴヌクレオチド対を
使用して軽鎖の場合と同じ２９ｂｐ非翻訳リーダーを再
構築した。３’末端では、停止コドの１２ｂｐ下流の唯
一のＮａｅＩ部位を、リンカーを使用してＨｉｎｄＩＩ
Ｉ部位に変換した。
【００３４】例２：ベクターの構築 ヒトβ−アクチンプロモーターは、ｐＨβＡＰｒ−３−
ｎｅｏ〔これは、ＳＶ４０ポリアデニル化／停止シグナ
ルが相当するヒトβ−アクチンシグナルで置換されてい
るほかはｐＨβＡＰｒ−１−ｎｅｏ（Ｇｕｎｎｉｎｇ
ら：ＰＮＡＳ，１９８７，８４，４８３〜３５）に相当
する〕から２８６０ｂｐ ＰｒｕＩＩ−ＨｉｎｄＩＩＩ
フラグメントとして切り出し、この中のＰｒｕＩＩ部位
はついでリンカーを用いてＢｇｌＩＩ部位に変換した。
ｐＨβＡＰｒ−３−ｎｅｏからヒトβ−アクチンポリア
デニル化および停止シグナルを単離するためには、唯一
のＨｉｎｄＩＩＩ部位の１．４ｋｂ下流のＳｐｈＩ部位
を、リンカーを使用してＢａｍＨＩ部位に変換した。ｐ
Ｉ０４と呼ばれる基礎ｄｈｆｒベクターは次のようにし
て構築された。ｐＳＶ２ｄｈｆｒ（Ｓｕｂｒａｍａｎｉ
ら：Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．，１９８１，１，８
５４〜８６４）中ＳＶ４０プロモーターの位置−１２８
におけるＳｐｈＩ部位をＳａｌＩ部位に変換し、プロモ
ーターからすべてのエンハンサー要素を除去した。次に
弱化ｄｈｆｒ発現単位をｐＳＶＯｄ（Ｍｏｌｌｏｎら：
Ｃｅｌｌ，１９８１，２７，２７９〜２８８）の同種部
位中にＳａｌＩ−ＢａｍＨＩフラグメントとしてサブク
ローニングした。
【００３５】例３：Ｃａｍｐａｔｈ−１ＨのＣＨＯ細胞
中発現 ｄｈｆｒ−ＣＨＯ細胞ＤＵＫ−Ｂ１１（Ｕｒｌａｕｂ
ら：ＰＮＡＳ，１９８０，７７，４２１６〜４２２０）
を、１０％牛胎仔血清ならびに各４μｇ／ｍｌのヒポキ
サンチンおよびチミジンを補給したＩｓｃｏｖｅのＭＥ
Ｍ中で増殖させた。細胞上にリン酸カルシウム法（Ｇｏ
ｒｍａｎら：ＤＮＡ Ｃｌｏｎｉｎｇ，１９８５，ＩＩ
巻、１４３〜１９０，Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，
Ｎ．Ｙ．）を用いてｐＬＤ９およびｐＮＨ３１６，１０
μｇを共沈殿させ、１０％透析血清を用い、ヒポキサン
チン／チミジンを省き、Ｇ４１８（Ｇｉｂｃｏ）５００
μｇ／ｍｌを加えた他は上述と同じ培地を使用してｄｈ
ｆｒ＋／ｎｅｏ抵抗性の二重表現型で選択した。一部の
実験では、初回のｄｈｆｒ＋トランスホーマントの選択
にＭＴＸを直接添加した。数百個の抵抗性コロニーをプ
ールし、培養培地中におけるＣａｍｐａｔｈ−１Ｈ抗体
の産生を検定した。非増幅初回トランスホーマントの平
均収率は０．５μｇ／ｍｌであった。
【００３６】それぞれプールされた細胞集団を次に１０
−７Ｍ ＭＴＸの存在下に培養し、２週後に抵抗性コロ
ニーを再びプールし、Ｃａｍｐａｔｈ−１Ｈの産生を滴
定した。８０倍までのかなりの収率の上昇が認められた
（表１）。これらの細胞を希釈クローン化し、Ｃａｍｐ
ａｔｈ−１Ｈの収率をスクリーニングし、２つの高産生
系を単離し、Ａ３７および３Ｄ９と命名した（表１）。
これらをいずれも１０−６Ｍ ＭＴＸの存在下にさらに
増幅させ、ついで希釈クローン化し、上述のようにスク
リーニングした。この第二、および最終増幅段階での発
現の増大は最初に認められた程劇的ではなかったが、コ
ンフルーエンスで再供給しさらに４日間放置すると、細
胞系Ａ３９および３Ｄ１１は２００μｇ／ｍｌまでのＣ
ａｍｐａｔｈ−１Ｈの産生が可能であった。
【表１】 （表の説明）細胞をＴ−１７５組織培養フラスコ中コン
フルーエンスに到達させ、新鮮な組織培養培地５０ｍｌ
を再供給し、さらに４日間放置した。この期間に培地中
に蓄積したＣａｍｐａｔｈ−１Ｈ抗体をＥＬＩＳＡによ
って測定した。検定日における総細胞数は通常２．５×
１０７であった。３Ｄ１１細胞系からの収率は、１００
μｇ／１０６細胞／日の産生率を示している。
【００３７】コトランスフェクションベクターｐＬＤ９
およびｐＮＨ３１６をさらに使用し、上述の戦略と別の
増幅戦略で評価した。ｄｈｆｒ−ＣＨＯ細胞を常法によ
ってコトランスフェクトし、２日後に、Ｇ４１８（ネオ
マイシン選択）を含有し、ＭＴＸ濃度を３×１０−９Ｍ
から１０−７Ｍに増加させた一連のフラスコに直接分割
した。この選択の２週後に、抵抗性コロニーの数を計数
し、各フラスコにプールした。細胞集団が安定化したと
き、Ｃａｍｐａｔｈ−１Ｈ抗体力価を検定し、結果を表
２に示した。ＭＴＸレベルの上昇に従い、生存ｄｈｆｒ
＋コロニーの数は著しく低下したが、比例してＣａｍｐ
ａｔｈ−１Ｈの発現は増大した。すなわち、高濃度のＭ
ＴＸにおける１工程直接選択において、基礎ｄｈｆｒレ
ベルで選択された細胞集団に比べて抗体収率が６０倍ま
で上昇した細胞集団の単離が可能である。
【表２】 （図の説明）各ＭＴＸ選択段階におけるコロニーをプー
ルし表１の説明の記載と同様にして検定した。
【００３８】細胞の他のコトランスフェクション後にこ
の操作を反復し、この場合は、全集団をＧ４１８および
３×１０−８Ｍ ＭＴＸ含有培地中で選択した。これは
より大量の抵抗性コロニーを生成し、これをついでプー
ルし、さらに２回、濃度６×１０−７Ｍ、ついで３×１
０−６ＭのＭＴＸを使用して再増幅した。この段階で、
細胞を希釈クローン化し、Ｃａｍｐａｔｈ−１Ｈレベル
をスクリーニングした。２個の最高細胞系を単離した。
これらは１００〜１５０μｇ／ｍｌまでの抗体レベルの
産生が可能で、４Ｆ１１および５Ｅ１０と命名した。
【００３９】これらの細胞系および上述のＡ３９／３Ｄ
１１細胞系の増殖速度は、親の非形質転換ｄｈｆｒ−Ｃ
ＨＯ細胞よりかなり遅かった。これは、遺伝子生成物の
発現量が高まるように操作された細胞に、通常、共通の
特徴である。５Ｅ１０および４Ｆ１１細胞系からの収率
は時間によってかなり変動し、後者は限られた継代寿命
しか示さないように思われ、約３週で転換期おび死に到
達した。この不安定性は他の細胞系には全く認められな
かったが、一般的には、第二の増幅操作から単離された
細胞系は、５Ｅ１０を含めて、通常、培養は一定しなか
った。全細胞系中、３Ｄ１１が良好な増殖と安定性およ
びＣａｍｐａｔｈ−１Ｈの高収率を合わせもっていた。
これらの増幅の特徴を保証するため、３Ｄ１１細胞系を
もう一回希釈クローン化して３Ｄ１１＊細胞系を生成さ
せたところ、これは同様にＣａｍｐａｔｈ−１Ｈを２０
０μｇ／ｍｌまでの収率で生成した。
【００４０】例４：ＷＣＭ４中ＣｌＨ３Ｄ１１＊の増殖
と産生 ａ）Ｉｓｃｏｖｅｓ＋１０％ＦＢＳ Ｆｌｏｗ，非必須
アミノ酸、１０−６Ｍメトトレキセートおよび抗生物質
中単層として増殖するＣ１Ｈ ３Ｄ１１＊は約９０％コ
ンフルーエントであった。これらの細胞をプラスチック
からトリプシン／ベルセンで除去し、補充物のないＩｓ
ｃｏｖｅｓ培地で洗浄し、遠心分離し、ＷＣＭ４培地
（表３、０．２５％ペプトン＋０．１％ポリエチレング
リコール（ＰＥＧ）１０，０００＋０．５％牛胎仔血清
（ＦＢＳ）を含みメトトレキセート（ＭＴＸ）を含まな
い）中５×１０４／ｍｌに再懸濁した。
【表３】ＷＣＭ４培地の処方 ＢＳＡ、トランスフェリンおよびレシチンを含まないＩ
ｓｃｏｖｅｓ改良ＤＭＥＭ．Ｇｉｂｃｏ Ｌｔｄ．，Ｕ
ｎｉｔ ４，Ｃｏｗｌｅｙ Ｍｉｌｌ Ｔｄ，Ｅｓｔ，
Ｕｘｂｒｉｄｇｅ ＵＢ８ ２７Ｇから入手できる。牛
血清アルブミン、純粋ヒトトランスフェリンまたは大豆
レシチンを含まない公表されている培地（Ｉｓｃｏｖｅ
ｓ ＆ Ｍｅｌｃｈｅｒ，１９７８，Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅ
ｄ．１，４７，９２３）に類似している。 ＋５ｍｌ／リットル ２００ｍＭ Ｌ−
グルタミン ＋５０ｍｇ／リットル Ｌ−プロリン ＋５０ｍｇ／リットル Ｌ−スレオニン ＋５０ｍｇ／リットル Ｌ−メチオニン ＋５０ｍｇ／リットル Ｌ−システイン ＋５０ｍｇ／リットル Ｌ−チロシン ＋２５ｍｇ／リットル アスコルビン酸 ＋０．０６２ｍｇ／リットル ビタミンＢ６ ＋１．３６ｍｇ／リットル ビタミンＢ１２ ＋０．２ｍｇ／リットル リポ酸 ＋０．０８８ｍｇ／リットル メチルリノーレエ
ート ＋１μＭ メトトレキセート ＋１ｍｇ／リットル ＦｅＳＯ４ ＋１ｍｇ／リットル ＺｎＳＯ４ ＋０．００２５ｍｇ／リットル ＣｕＳＯ４ ＋５ｍｇ／リットル 組換えインスリン
（Ｎｕｃｅｌｌｉｎ） ＋５０，０００ＩＵ／リットル ポリミキシン ＋２０，０００ＩＵ／リットル ネオマイシン ＋０．１６ｍｇ／リットル プトレサイン−２
ＨＣｌ ３個の２５ｃｍ２フラスコに１０ｍｌの細胞懸濁液＋ヒ
ポキサンチン（Ｈ）、チミジン（Ｔ）またはＨＴを加え
た。これらのフラスコを５％ＣＯ２インキュベーター中
３６．５℃でインキュベートした。６日後、フラスコの
内容を集め、等容量のＷＣＭ４＋ＭＴＸ（ペプトンまた
はＰＥＧを含まない）に添加し、７５ｃｍ２フラスコに
移した。
【００４１】これらの細胞を用いて５００ｍｌのＴｅｃ
ｈｎｅｒスピナーに接種し、４０ｒｐｍで回転しながら
３６．５℃でインキユベートした。細胞は無血清で５カ
月以上にわたって増殖を続け、細胞は適合期間を要する
が、増殖速度および生存度は徐々に改良されることが明
らかにされた。集団の倍加時間は約７週にわたり７３．
１時間と計算された。これは次の２０日間で４７．４時
間に低下し、ついで安定化された。抗体の分泌は６０μ
ｇ／ｍｌ以上の高レベルに維持された。これらの細胞に
おける遺伝子のコピー数は、ノザンブロット分析を用い
たバンド強度により、低下しないことが明らかにされ
た。ファーメンター中で、これらの細胞は７０μｇ／ｍ
ｌ以上の抗体を産生し、規則的に１００μｇ／ｍｌまた
はそれ以上のレベルが達成された。これらの細胞はＣ１
Ｈ ３Ｄ１１＊４４と命名された。
【００４２】ｂ）無血清で２カ月以上にわたり増殖させ
た上記ａ）からの細胞を、７０ｒｐｍで回転するステン
レス鋼傾斜パドルを付したＳＧｉ １リットル ファー
メンターに移した。温度は３７℃にセットし、ｄＯ２は
１０％、ｐＨは７〜７．２に制御した。ファーメンター
に日０において０．１％ポリエチレングリコール（ＰＥ
Ｇ）１０，０００および０．２５％大豆ペプトン添加Ｗ
ＣＭ４（表３）中、表面にＯ２を供給しながら、０．２
２×１０６細胞／ｍｌを接種した。細胞は、新鮮培地と
通常１〜２と１〜４の間の分裂速度で定常的に継代させ
た。日３３に表面への気体供給を、細胞にもっと物理的
傷害を生じることが期待できる深部への供給に変えた。
日５０以降はＷＣＭ４に代えて、ＷＣＭ５（表４）をペ
プトンおよびＰＥＧとともに使用した。
【表４】培地ＷＣＭ５の処方 ＢＳＡ、トランフェリンまたはレシチンを含まないＩｓ
ｃｏｖｅｓ改良ＤＭＥＭ（表３参照） ＋５ｍｇ／リットル ２００ｍＭ Ｌ−
グルタミン ＋５０ｍｇ／リットル Ｌ−プロリン ＋５０ｍｇ／リットル Ｌ−スレオニン ＋５０ｍｇ／リットル Ｌ−メチオニン ＋５０ｍｇ／リットル Ｌ−システイン ＋５０ｍｇ／リットル Ｌ−チロシン ＋２５ｍｇ／リットル Ｌ−アスコルビン
酸 ＋０．０６２ｍｇ／リットル ビタミンＢ６ ＋１．３６ｍｇ／リットル ヒタミンＢ１２ ＋２ｍｇ／リットル クエン酸第二鉄 ＋１ｍｇ／リットル 硫酸亜鉛 ＋０．００２５ｍｇ／リットル 硫酸銅 ＋５０，０００ＩＵ／リットル ポリミキシン ＋２０，０００ＩＵ／リットル ネオマイシン ＋３μ１／リットル エタノールアミン ＋０．１６ｍｇ／リットル プトレセイン ＋５ｍｇ／リットル 組換えインスリン
（Ｎｕｃｅｌｌｉｎ） 日５３にＰＥＧを０．１％プルロニックＦ６８に変え
た。生じた増殖および達成された抗体レベルを図４およ
び５に示す。本発明の能力はファーメンター中１００μ
ｇ／ｍｌ以上の抗体の無蛋白質産生を可能にすることが
明らかにされた。
【００４３】例５：Ｃａｍｐａｔｈ−１Ｈの合成および
ＣＨＯ細胞からの分泌速度の分析 例３のＣａｍｐａｔｈ−１Ｈ産生ＣＨＯ細胞の培養過程
において、それらがコンフルーエンスに達しても、抗体
レベルは培養培地中に時間とともに蓄積を続けることが
明らかにされた。これが、細胞内蓄積と遅い分泌が組合
さった結果によるものか否かを決定するため、Ａ３９細
胞を用いてＣａｍｐａｔｈ−１Ｈの合成および分泌速度
を測定した。これらの分析は３〜４連続日にわたり、増
殖期かまたはコンフルーエント静止期のいずれかの細胞
について実施した。いずれの増殖状態にある細胞でも結
果は同じで、データは静止期細胞が産生された免疫沈
殿、放射標識Ｃａｍｐａｔｈ−１Ｈについてのもののみ
を示す。
【００４４】抗体合成の速度は、各４連続日に、細胞を
短期間〔３５Ｓ〕−メチオニンでパルス標識し、ついで
免疫沈殿物質の量および分布を調べた。図２から明らか
なように、合成速度は、測定された全時点で同様に高か
った。さらに、各場合ともこの短いパルスの終わりまで
でも、新たに合成されたＣａｍｐａｔｈ−１Ｈの半分以
上が既に培地中に存在し、迅速な分泌が示唆された。こ
れは、平行した細胞を同様にパルス標識し、３日の期間
にわたり放射標識Ｃａｍｐａｔｈ−１Ｈの分布を追跡し
た図３のデータによっても確認された。２４時間以内
に、実際、すべての放射標識抗体が培地中に追い出さ
れ、実験期間中安定に維持された。これは、祖換えＣＨ
Ｏ細胞が長期間静止期に維持されていも、Ｃａｍｐａｔ
ｈ−１Ｈの合成および分泌速度は低下しないことを示し
ている。
【００４５】Ｃａｍｐａｔｈ−１Ｈ ＥＬＩＳＡ検定 マイクロタイタープレートを抗−ヒトＩｇＧでコート
し、検定サンプル（培養培地中）とともインキュベート
した。抗体の検出は、抗−ヒトガンマー鎖特異的ペルオ
キシダーゼ接合体を用いる可視化によった。
【００４６】Ｃａｍｐａｔｈ−１Ｈ合成および分泌速度
の分析 例３からの細胞を３ｃｍの組織培養ウエル中コンフルー
エンスに達するまで増殖させ、ついで１０％牛胎仔血清
含有、無メチオニンＤｕｌｂｅｃｃｏｓ ＭＥＭ中で３
０分間インキュベートした。これに続いて、細胞を１２
０μＣｉ／ｍｌの〔３５Ｓ〕のメチオニン（＞８００Ｃ
ｉ／ｍｍｏｌ，Ａｍｅｒｓｈａｍ）の存在下に適当な時
間、標識し、ついで収穫してＮＰ−４０分解緩衝液５０
０μｌ中で分解するか、またはさらに正常増殖培地中で
インキュベートした。次に細胞分解液または培養培地の
サンプル１２５μｌを取り、ヤギ抗−ヒトＩｇＧ（重鎖
特異的；Ｓｉｇｍａ）および１０％プロテインＡセファ
ロース（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）を用いて免疫沈殿させ
た。次にサンプルを１０％ＳＤＳ−ＰＡＧＥ還元ゲル
上、Ｌａｅｍｍｌｉの方法に従って分離し、シグナルを
Ｅｎｈａｎｃｅ（ＮＥＮ−ＤｕＰｏｎｔ）で増殖した。
乾燥ゲルをついで一夜オートラジオグラフィーに付し
た。
【００４７】機能性ＣＨＯ−グリコシル化Ｃａｍｐａｔ
ｈ−１Ｈの生物検定 Ｃａｍｐａｔｈ−１Ｈの補体分解検定 補体分解検定は、既知の濃度のＣＨＯ−グリカシル化抗
体が既定数の細胞に結合し、細胞を分解させる能力によ
って測定され、比活性として表現される抗体機能の指標
である。検定は、Ｋａｒｐａｓ ４２２細胞（Ｂ−細胞
非ホジキンリンパ腫細胞系から確立；Ｄｙｅｒら、Ｂｌ
ｏｏｄ，７５，７０４〜７１４）の表面に発現するＣａ
ｍｐｔｈ抗原を用い、例４からのＣａｍｐａｔｈ−１Ｈ
について実施する。１．２×１０７細胞をＣＯ２インキ
ュベーター中、６００μＣｉの５１Ｃｒ（クロム酸ナト
リウム）の存在下、３７℃で２時間インキュベートして
放射標識を負荷した。培地（総容量２３．５ｍｌ）中負
荷細胞５．３ｍｌを正常ヒト血清１２．５ｍｌに加え、
その混合物１５０μｌをピペットでマイクロタイタープ
レートのウエルに移した。
【００４８】３回の精製試行からの最終溶出液のサンプ
ル５０μｌを細胞と混合し、４℃で３０分間、ついで３
７℃で９０分間インキュベートした。培養液を２０００
ｒｐｍで５分間遠心分離し、１００μｌの細胞上清中の
放射能をガンマーカウンターで計数した。補体分解活性
（キロ単位／ｍｌ）は対照プレパレーション（１０００
単位／ｍｌ）の標準曲線から計算した。結果は表５に示
す。
【００４９】最終溶出液のサンプル５０μｌ中のＣａｍ
ｐａｔｈ−１Ｈの濃度は、分光光度計により２８０ｎｍ
で読み取ったＰＢＳ，ｐＨ７．２中のサンプルを用いて
評価した。結果は表３に光学濃度（ｍｇ／ｍｌ）として
表現する。このデータから、比活性：ＫＵ／ｍｌを決定
する。
【表５】 結果はＣＨＯ−グリコシル化Ｃａｍｐａｔｈ−１Ｈが機
能性であることを示している。
【００５０】ＣＨＯ−グリコシル化Ｃａｍｐａｔｈ−１
Ｈによる患者の処置 重篤なＴ−細胞関連の関節炎症（固定化多関節炎、胸膜
通、腹部痛）を有すると診断され、５年以上の長期にわ
たって入院している患者を、以下の投与基準を用いて、
例４からのＣＨＯ由来Ｃａｍｐａｔｈ−１Ｈで処置し
た。 ６日間にわたり２ｍｇ／日の静脈内注射 以後の６日間、１０ｍｇ／日の静脈内注射 第２回目の６日間処置の間に、症状の有意な改善が認め
られた。第２期間の末までに関節の炎症は著しく改善さ
れ、皮膚の膿傷は抗生物質投与により消失した。処置終
了後３０日で患者は退院した。初期の処置後約９カ月
で、患者は多関節で症状が再発した。低用量での初期の
感受性試験後に、患者に１０ｍｇ／日のＣａｍｐａｔｈ
１Ｈ、１０日間の処置を更に行ったところ、有意な改
善を示した。
【００５１】例６ ＣＨＯ細胞からの人体化抗−ＣＤ４抗体の発現 発現ベクターｐＢａｎｌの構築：ｐ３４２−１２の改変 ヒトＣＤ４に対して励起されたラットＩｇＧ２ｂからの
相補性決定領域（Ｎ．Ｅｎｇ．Ｊ．Ｍｅｄ．，１９９
０，３２３：２５０〜２５４）をヒト重鎖および軽鎖フ
レームワークにグラフトした（Ｗｉｎｔｅｒら、Ｎａｔ
ｕｒｅ，１９８８，３２２，３２３〜３２７）。人体化
ＣＤ４軽鎖をコードするｃＤＮＡをｐＬＤ９（Ｐａｇｅ
＆ Ｓｙｄｅｎｈａｍ，Ｍ．Ａ．：１９１１，Ｂｉｏ
ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，９，６４〜６８）中にクローン
化した。得られたプラスミドはｐ２１１０と命名した。
人体化ＣＤ４重鎖は配列決定され、プラスミドｐ３４２
−１２の改良体中にクローン化された（ＬａＷ，Ｍ−
Ｆ．，Ｂｙｒｎｅ，Ｊ．Ｃ．＆ Ｈｉｎｌｅｙ，Ｐ．
Ｍ．：１９８３，Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．，３，
２１１０〜２１１５）。プラスミドｐ３４２−１２は
ＢａｍＨＩで消化してＢＰＶ−１ゲノムの一部を含有す
る７．４ｋｂｐフラグメントを除去した。β−ラクタマ
ーゼ遺伝子およびネオマイシン抵抗性遺伝子をマウスメ
タロチオニンプロモーターの制御下に含有する骨格を精
製し、ＢａｍＨＩ部位で再連結した。このプラスミドを
ＨｉｎｄＩＩＩで消化し、ＤＮＡポリメラーゼＩの大フ
ラグメントとインキュベートしてＨｉｎｄＩＩＩ部位を
除去し、ついで再連結した。唯一のＨｉｎｄＩＩＩ部位
の直ぐ上流にβ−アクチンブロモーターを含有し、ポリ
アデニル化シグナルが続くβ−アクチン発現カセット
を、改良ｐ３４２−１２プラスミドのＢａｍＨＩ部位に
クローン化してｐＢａｎＩ作成した。
【００５２】プラスミドｐＢａｎｌはしたがって、ネオ
マイシン抵抗性遺伝子、β−ラクタマーゼ遺伝子ならび
に唯一のＨｉｎｄＩＩＩ部位を含むβ−アクチン発現カ
セットから構成されていた。人体化重鎖をコードするＣ
ＤＮＡをこの部位にクローン化し、得られた、正しい方
向に挿入体を含むプラスミドをｐＢａｎＣＤ４Ｈと命名
した。すなわち、ｐ２１１０とｐＢａｎＣＤ４Ｈは異な
る選択可能マーカーを含有し、レシピエントのｄｈｆｒ
−ＣＨＯ細胞にコトランスフェクトすると、ｄｈｆｒ＋
／ｎｅｏｒコロニーの直接選択および単離が可能にな
る。この表現型を示す細胞は機能性抗ＣＤ４抗体を発現
し、抗体力価を上昇させるために増幅させることが可能
である。
【００５３】ＣＨＯ細胞中での抗−ＣＤ４抗体の発現 ａ）細胞培養法 ｄｈｆｒ−ＣＨＯ細胞系ＤＵＫ−Ｂ１１（Ｕｒｌａｕ
ｂ，Ｇ．＆ Ｃｈａｓｉｎ，Ｌ．Ａ．：１９８０，ＰＮ
ＡＳ，７７，４２１６〜４２２０）を１０％牛胎仔血清
と各４μｇのヒポキサンチンとチミジン（すべてＦｌｏ
ｗ）を補充したＩｓｃｏｖｅｓ ＭＥＭ培地中で増殖さ
せた。トランスフェクション後、ヒポキサンチン／チミ
ジンを省き牛胎仔血清を透析した他は上述と同じ培地を
用いて、トランスホーマントを選択した。さらに、Ｇ４
１８を５００μｇ／ｍｌ添加した。ｄｈｆｒ遺伝子を含
有する配列および隣接配列の自然増幅を誘発するため
に、ＭＴＸは０．１μＭの濃度加えた。
【００５４】ｂ）トランスフェクションと増幅 ｄｈｆｒ−ＣＨＯ細胞系、ＤＵＫ−Ｂ１１を、５μｇの
ｐ２１１０および５μｇのｐＢａｎＣＤ４Ｈで、トラン
スフェクタム試薬を製造業者の推薦する条件下に用いて
コトランスフェクトさせた。トランスホーマントは上述
のように、ｄｈｆｒ＋／ｎｅｏｒ表現型で選択した。数
百個のトンスホーマントが観察され、これをプールし
た。初期力価は、初回基礎トランスホーマントが約０．
１μｇ／ｍｌ／日を分泌していることを示した。このプ
ールされた集団を次に、０．１μＭＭＴＸの存在下に約
１４日間培養した。抵抗性コロニーを再びプールし、検
定した。発現は約１００倍増加し、プールされた増幅さ
れたコロニーは約１０〜１２μｇ／ｍｌ／日の産生を示
した。安定な、高い抗体力価を与えるクローン細胞系を
得るために、抵抗性プールを９６−ウエルプレート中、
限界希釈によってクローン化した。５０個の単一コロニ
ーを同定し、最高の力価を与えた４つの細胞系を増殖さ
せた。抵抗性集団内の高発現クローンを同定するこの過
程で、抗−ＣＤ４抗体を約２０μｇ／ｍｌ／日で発現す
る細胞系が得られ、Ｄ４１９と命名した。
【００５５】ｄｈｆｒ＋／ｎｅｏｒセルラインの特徴付
け ｉ）ＤＮＡ及びＲＮＡのスロットプロット分析によるコ
ピー数および定常状態の転写レベルの決定 Ｍａｎｉａｔｉｓ ｅｔ ａｌ．〔１９８２ Ｍｏｌｅ
ｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ，Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒ
ｙ Ｍａｎｕａｌ．Ｃｏｌｄ ＳｐｒｉｎｇＨａｒｂｏ
ｕｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ
Ｈａｒｂｏｕｒ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ〕に記載された方
法に従い、各種の増幅段階の細胞から全細胞ＲＮＡおよ
びＤＮＡを調製した。ニトロセルロースフィルター上に
固定化後に、重鎖、ｄｈｆｒ遺伝子およびβ−アクチン
遺伝子の〔３２−Ｐ〕−αＡＴＰラベル化ＤＮＡ配列を
用いて核酸をプローブした。β−アクチン遺伝子は、ロ
ーディングエラーによる人為物を除去するためのコント
ロール“ハウスキーピング”遺伝子として用いた。
【００５６】最初に、上記したプロープを用いて、非ク
ローン化０．１μＭ ＭＴＸ増幅プールを最初の非増幅
形質転換体および非形質転換Ｂ１１親細胞と比較した。
従って、重鎖でプローブした時には、親セルラインでは
ＤＮＡシグナルは検出されなかったが、ｄｈｆｒについ
ては弱いシグナルが検出された。これは、Ｂ１１セルラ
イン中のシングル非機能性ｄｈｆｒ対立遺伝子によるも
のである。
【００５７】いずれのプローブを用いた場合でも、結果
的には、ＲＮＡシグナルは検出されなかった。これに対
して、発現の開始に影響するプライマリー形質転換体の
ＲＮＡおよびＤＮＡに対して両者のプローブを用いた場
合には強いシグナルが検出された。非クローン化増幅プ
ールについては、重鎖およびｄｈｆｒのＲＡＮの定常状
態レベル並びにコピー数が有意に増加することが観察さ
れた。これは、観察された発現上昇と正確に関連してい
る。β−アクチンＲＮＡの定常状態レベルは、３つの全
てのセルラインで一致していた。
【００５８】４つの最高発現クローン化セルラインにつ
いても同様の比較を行った。ＲＮＡブロット及びＤＮＡ
ブロットの両者で強いシグナルが観察された。しかしな
がら、ＤＡ１９セルラインは、セルラインＤ４２３より
２倍多い抗体を発現したが、この相違はコピー数あるい
はＲＮＡの定常状態レベルのいずれにも観察されなかっ
た。この観察されたことについては２つの説明が可能で
ある。その１つは、ＤＡ１９セルライン中のＤＮＡは、
ゲノム中のエンハンサーの影響下にある部位に組込まれ
たことである。しかしながら、この推論はＲＮＡの上昇
したレベルによって影響を受ける。
【００５９】より可能姓の高い説明は次の通りである。
Ｄ４２３セルライン中の複製およびタンデムアレイの重
複において、ｄｈｆｒ／抗体カセットのコピーのいくつ
かは再調整を受けており、非機能的で先端が欠失してい
ることである。異種遺伝子の組込み部位はしばしばテレ
マーなどのクロモゾームのブレイクポイントにおいて生
じるので、この推定は一般的でない。このブレイクポイ
ントは、再調整のための“ホットスポット”として知ら
れている。これはノーザン及びサザーン分析によって解
決できるであろう。
【００６０】ｉｉ）Ｄ４９系での抗ＣＤ４抗体の蛋白質
合成と分泌 クローンＤ４１９細胞系を３５Ｓ−メチオニンとシステ
インでラベル化し、細胞内の分泌抗体を、適当な抗体を
用いた免疫沈降法により抽出した。還元ＳＤＳ−ＰＡＧ
Ｅゲルで電気泳動し、次いでゲルを乾燥し、オートラジ
オグラフィーでシグナルを検出した。
【００６１】重鎖及び軽鎖の両者が有効に合成されたこ
とは結果から明らかであった。細胞内では両者は分泌オ
ルガネラを通過する際に関連しているので、重鎖と軽鎖
との間の化学量論性は必要ない。しかしながら、分泌物
については密接な化学量論性が観察された。
【図面の簡単な説明】
【図１】（ａ）Ｃａｍｐａｔｈ−１Ｈ軽鎖ｃＤＮＡの発
現カセットを含むｐＬＤ９構築体および（ｂ）Ｃａｍｐ
ａｔｈ−１Ｈ重鎖ｃＤＮＡの発現カセットを含むｐＮＨ
３１６構築体
【図２】Ａ３９細胞におけるＣａｍｐａｔｈ−１Ｈ合成
速度の比較試験結果を示す泳動図
【図３】Ａ３９細胞におけるＣａｍｐａｔｈ−１Ｈ分泌
速度および分布を決定するためのパルスーチェイス実験
の泳動図
【図４】ＷＣＭ５中Ｃ１Ｈ３Ｄ１１’の増殖を示すグラ
フ
【図５】ＷＣＭ５中Ｃ１Ｈ３Ｄ＊４４細胞の抗体産生を
示すグラフ
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.5 識別記号 庁内整理番号 ＦＩ 技術表示箇所 Ａ６１Ｋ 39/395 ＡＢＧ Ｎ 9284−4Ｃ ＡＢＪ 9284−4Ｃ ＡＣＤ 9284−4Ｃ ＡＤＡ 9284−4Ｃ ＡＤＰ 9284−4Ｃ ＡＤＵ 9284−4Ｃ ＡＤＺ 9284−4Ｃ Ｃ１２Ｐ 21/08 8214−4Ｂ //(Ｃ１２Ｎ 5/10 Ｃ１２Ｒ 1:91） (Ｃ１２Ｐ 21/08 Ｃ１２Ｒ 1:91）

Claims (23)

    【特許請求の範囲】
  1. 【請求項１】 抗体の軽鎖を発現できるベクターと抗体
    の重鎖を発現できるベクターでコトランスフェクトさ
    れ、この場合、両ベクターは独立に選択可能なマーカー
    を含有している、抗体の産生が可能なＣＨＯ細胞系
  2. 【請求項２】 抗体の軽鎖をコードするｃＤＮＡを含有
    するベクターと抗体の重鎖をコードするｃＤＮＡを含有
    するベクターでコトランスフェクトされ、この場合、両
    ベクターは重鎖および軽鎖を発現できる、ヒト抗体また
    は変容抗体の産生が可能なＣＨＯ細胞系
  3. 【請求項３】 両ベクターは独立に選択可能なマーカー
    を含有する「請求項２」記載ＣＨＯ細胞系
  4. 【請求項４】 マーカーの一方はドミナントである「請
    求項１〜３」のいずれかに記載のＣＨＯ細胞系
  5. 【請求項５】 マーカーは、アデノシンデアミナーゼ、
    アスパラギンシンターゼ、大腸菌ｔｒｐＢｇｅｎｅ，サ
    ルモネラｈｉｓＤｇｅｎｅ，Ｍ２マウスリボヌクレオチ
    ドレダクターゼ、ヒト多剤抵抗性遺伝子、グルタミンシ
    ンターゼ、キサンチングアニンホスホリボシルトランス
    フェラーゼ、ハイグロマイシンＢ、ネオマイシン遺伝
    子、ジヒドロ葉酸レダクターゼおよびネオマイシンから
    選ばれる「請求項１〜４」のいずれかに記載のＣＨＯ細
    胞系
  6. 【請求項６】 両マーカーの一方が増幅の基礎を提供す
    る「請求項１〜５」のいずれかに記載のＣＨＯ細胞系
  7. 【請求項７】 細胞系はｄｈｆｒ−表現型であり、マー
    カーの一方はｄｈｆｒである「請求項１〜６」のいずれ
    かに記載のＣＨＯ細胞系
  8. 【請求項８】 第二のマーカーはネオマイシンである
    「請求項７」記載のＣＨＯ細胞系
  9. 【請求項９】 抗体はキメラ抗体またはＣＤＲグラフト
    抗体である「請求項１または２」記載のＣＨＯ細胞系
  10. 【請求項１０】 Ｔ−細胞マーカーまたは腫瘍細胞マー
    カーに対する抗体の産生が可能な「請求項１または２」
    のいずれかに記載のＣＨＯ細胞系
  11. 【請求項１１】 抗体は、ＣＤ２，ＣＤ３，ＣＤ４，Ｃ
    Ｄ５，ＣＤ７，ＣＤ８，ＣＤ１１ａ，ＣＤ１１ｂ，ＣＤ
    １８，ＣＤ１９，ＣＤ２５，ＣＤ３３，ＣＤ３８，ＣＤ
    ｗ５２およびＣＤ５４から選択される抗原に対して励起
    される抗体である「請求項１０」記載のＣＨＯ細胞系
  12. 【請求項１２】 抗−ＣＤｗ５２抗体を産生できる「請
    求項１１」記載のＣＨＯ細胞系
  13. 【請求項１３】 ＣＨＯグリコシレーションを有するＣ
    ＤＲ−グラフト抗−ＣＤ４抗体を除くヒト抗体または変
    容抗体
  14. 【請求項１４】 変容抗体はキメラ抗体またはＣＤＲグ
    ラフト抗体である「請求項１３」記載の抗体
  15. 【請求項１５】 抗−ＣＤｗ５２抗体である「請求項１
    ４」記載の抗体
  16. 【請求項１６】 抗体を発現するように操作したＣＨＯ
    細胞を培養し、培養培地から抗体を回収する「請求項１
    ３〜１５」のいずれかに記載の抗体の製造方法
  17. 【請求項１７】 治療用である「請求項１３〜１５」の
    いずれかに記載の抗体
  18. 【請求項１８】 「請求項１３〜１５」のいずれかに記
    載の抗体の、免疫抑制用医薬の製造のための使用
  19. 【請求項１９】 Ｔ−細胞関連疾患、重症血管炎、慢性
    関節リウマチ、全身性ループス、多発性硬化症、移植片
    対宿主病、乾癬、若年性糖尿病、シェーグレン病、甲状
    腺疾患、重症筋無力症、移植拒絶反応または喘息の処置
    のための、抗体の「請求項１８」記載の使用
  20. 【請求項２０】 「請求項１３〜１５」のいずれかに記
    載の抗体の、癌の処置用医薬の製造のための使用
  21. 【請求項２１】 抗体は抗−ＣＤｗ５２抗体である「請
    求項１８〜２０」のいずれかに記載の抗体の使用
  22. 【請求項２２】 「請求項１３〜１５」のいずれかに記
    載の抗体の、感染疾患処置用医薬の製造のための使用
  23. 【請求項２３】 「請求項１３〜１５」のいずれかに
    記載のＣＨＯ−グリコシル化抗体と生理的に許容される
    希釈剤または担体を含有する組成物
JP3333868A 1990-10-17 1991-10-17 抗体産生 Pending JPH0690752A (ja)

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