ES2242823T3 - Procedimiento de preparacion de composiciones de aerosol. - Google Patents

Abstract

Un procedimiento para la preparación de una formulación farmacéutica de aerosol para uso en el tratamiento de asma por inhalación caracterizado porque está constituido esencialmente por sulfato de salbutamol particulado como medicamento, y 1, 1, 1, 2-tetrafluoroetano como propelente, y porque la formulación carece de tensioactivo, en el que dicho medicamento está presente en una cantidad de 0, 01% a 1% p/p prespecto al peso total de la formulación, cuyo procedimiento comprende la dispersión del medicamento en el propelente.

Description

Procedimiento de preparación de composiciones de aerosol.

La presente invención se refiere a anticuerpos que tienen glucosilación por células OHC para su uso en la terapia médica humana, y las formulaciones que contienen dichos anticuerpos.

Los anticuerpos o inmunoglobulinas son moléculas proteicas bifuncionales. Una región que es muy variable entre diferentes anticuerpos es responsable de la unión al antígeno (región Fab), por ejemplo los muchos agentes infecciosos diferentes con los que puede entrar en contacto el cuerpo, mientras que la segunda región, la región constante (o región Fc), es responsable de la unión a los receptores para la Fc de las células y también activa el complemento. De esta manera, los anticuerpos representan un componente vital de la respuesta inmunitaria de los mamíferos para la destrucción de microorganismos extraños y virus.

Una molécula de anticuerpo está formada por dos cadenas ligeras y dos cadenas pesadas que se mantienen unidas entre sí por puentes disulfuro entre las cadenas. Cada cadena ligera está unida a una cadena pesada mediante puentes disulfuro y las dos cadenas pesadas están unidas entre sí por puentes disulfuro. Cada cadena pesada tiene en un extremo un dominio variable seguido por varios dominios constantes, y cada cadena ligera tiene un dominio variable en un extremo y un dominio constante en el otro extremo. El dominio variable de la cadena ligera está alineado con el dominio variable de la cadena pesada. El dominio constante de la cadena ligera está alineado con el primer dominio constante de la cadena pesada. Los demás dominios constantes de las cadenas pesadas están alineados entre sí. Los dominios constantes de las cadenas ligera y pesada no participan directamente en la unión del anticuerpo al antígeno.

Los dominios variables de cada par de cadenas ligera y pesada forman el sitio de unión al antígeno. Tienen la misma estructura general, de modo que cada dominio comprende un marco de cuatro regiones, cuyas secuencias están relativamente conservadas, conectadas por tres regiones determinantes de la complementariedad (RDC). Las cuatro regiones del marco adoptan principalmente una conformación en lámina plegada beta y las RDC forman bucles que conectan la estructura en lámina beta y que a veces comprenden parte de la misma. Las RDC se mantienen próximas entre sí por las regiones del marco y, con las RDC del otro dominio, contribuyen a la formación del sitio de unión al antígeno.

La inmunización de un animal con un antígeno da lugar a la producción de diferentes anticuerpos con diferentes especificidades y afinidades. Por lo tanto, un antisuero que se obtenga del animal inmunizado será heterogéneo y contendrá una mezcla de anticuerpos producidos por muchos clones diferentes de linfocitos. Los anticuerpos que se obtienen de esta manera se denominan anticuerpos policlonales, y esta naturaleza policlonal ha sido un inconveniente importante para el uso de los anticuerpos en ensayos diagnósticos y en aplicaciones terapéuticas.

Se dio un importante paso hacia adelante en 1975, cuando Kohler y Milstein (Nature, 1975, 256, 495-497) describieron la fusión con éxito de células esplénicas de ratones inmunizados con un antígeno con células de una línea de mieloma murino. Las células híbridas resultantes, denominadas hibridomas, tienen las propiedades de producción de anticuerpos derivadas de las células esplénicas y de crecimiento continuo derivadas de las células del mieloma. Cada hibridoma sintetiza y secreta un solo anticuerpo frente a un determinante particular del antígeno original. Para garantizar que todas las células de un cultivo son idénticas, es decir, que contienen la información genética necesaria para la síntesis de una única especie de anticuerpos, los hibridomas que se producen por la fusión celular se clonan y subclonan. De esta manera, los hibridomas clonados producen anticuerpos homogéneos o monoclonales.

Las ventajas de la tecnología de los hibridomas son importantes. Como se hace analizando muchos híbridos que se originan en cada bazo para detectar su capacidad de producir anticuerpos frente al antígeno de interés y sólo se seleccionan unos pocos, es posible inmunizar con antígenos impuros y a pesar de todo obtener anticuerpos específicos. La inmortalidad de la línea celular garantiza que se dispone de un suministro ilimitado de un anticuerpo homogéneo y bien caracterizado para su uso en diversas aplicaciones que incluyen en particular el diagnóstico y la inmunoterapia de trastornos patológicos.

Lamentablemente, la utilidad de esos anticuerpos monoclonales en un contexto clínico puede estar gravemente dificultada por la aparición de anticuerpos humanos anti-ratón, una respuesta antiglobulina, que puede interferir con el tratamiento o puede producir hipersensibilidad alérgica o por inmunocomplejos.

Cuando, por ejemplo, se usan anticuerpos monoclonales murinos en la terapia humana, la inducción de una respuesta mediada por anticuerpos humanos anti-ratón se debe al origen murino de los dominios constantes y de las cuatro regiones marco. Por lo tanto, este problema se ha abordado mediante el desarrollo de anticuerpos de dos tipos básicos. El primer tipo, que se denomina anticuerpos quiméricos, se refiere a que sólo los dominios constantes murinos son sustituidos por dominios equivalentes de origen humano (Morrison y col., P.N.A.S., 1984, 81, 6851-6855; Boulianne y col., Nature, 1985, 314, 268-270; y Neuberger y col., Nature, 1985, 314, 268- 270). El segundo tipo se obtiene cuando los dominios constantes murinos y las regiones marco murinas son sustituidas por dominios y regiones equivalentes de origen humano. Este segundo tipo de anticuerpo se denomina anticuerpo humanizado o injertado con RDC (Jones y col., Nature, 1986, 321, 522-525; y Riechmann y col., Nature, 1988, 332, 323-327). Por supuesto, un anticuerpo humano evitaría la necesidad de "humanización", aunque las líneas celulares que secretan anticuerpos humanos son muy inestables y en general han resultado no ser adecuadas para la producción a escala comercial.

Para generar cantidades suficientes de anticuerpos para su uso clínico completo es deseable emplear un sistema de expresión recombinante eficiente. Como las células del mieloma representan un huésped natural especializado en la producción y secreción de anticuerpos, las líneas celulares derivadas de éstas se han usado para la expresión de anticuerpos recombinantes. Con frecuencia es necesario un diseño de vectores complejos que se basa en los elementos reguladores del gen de las inmunoglobulinas, y se han descrito niveles finales de expresión que son muy variables (Winter y col., Nature, 1988, 332, 323-327; Weidle y col., Gene, 1987, 60, 205-216; Nakatani y col., Bio/Technology, 1989, 7, 805-810; y Gillies y col., Bio/Technology, 1989, 7, 799-804).

Un sistema expresión alternativo en mamíferos es el que ofrece el uso de células de ovario de hámster chino (OHC) deficitarias en dihidrofolato reductasa (dhfr). El uso de estas células ha permitido la producción de grandes cantidades de diversas proteínas terapéuticas para su uso clínico y de investigación (Kaufman y col., Mol. Cell. Biol., 1985, 5, 1750-1759; y Zettlmeissl y col., Bio/Technology, 1987, 5, 720-725). Sin embargo, hay pocos ejemplos del uso de estas células para la expresión de anticuerpos.

El documento WO 89/01783 y Colcher y col., Cancer Research 49:1738 (1989), describen la producción de una forma recombinante de B72.3, un anticuerpo anticanceroso, en células OHC. En estas dos referencias se describe la producción con éxito, y se muestra que el anticuerpo resultante se localiza en tumores en modelos animales. Sin embargo, hasta ahora no se ha sabido si los anticuerpos que producen las células OHC conservan su capacidad de unión y su funcionalidad y, en el caso de que lo hicieran, si esto se podría equiparar con la utilidad terapéutica en seres humanos.

Los anticuerpos son glucoproteínas que contienen entre un 3% y un 12% de carbohidratos. Estas unidades de carbohidratos se transfieren a los sitios aceptadores de las cadenas de anticuerpo después de la combinación de las cadenas pesadas y ligeras. Las mayores unidades de carbohidrato están unidas a residuos de aminoácidos de la región constante del anticuerpo. También se sabe que los carbohidratos se unen a los sitios de unión al antígeno de algunos anticuerpos y pueden afectar a las características de unión al anticuerpo reduciendo el acceso del antígeno al sitio de unión del anticuerpo. Hay diferentes funciones que se asocian a las unidades de carbohidratos. Pueden afectar a la solubilidad global y a la velocidad del catabolismo de anticuerpo. También se sabe que los carbohidratos son necesarios para la secreción celular de algunas cadenas de anticuerpos. Se ha demostrado que la glucosilación de la región constante tiene una función vital en la función efectora de un anticuerpo; sin esta glucosilación en la configuración correcta, el anticuerpo puede ser capaz de unirse al antígeno, aunque puede no ser capaz de unirse, por ejemplo, a los macrófagos, a los linfocitos cooperadores y supresores o al complemento para llevar a cabo su función de bloqueo o lisis de la célula a la que está unido.

Ahora se ha encontrado que el anticuerpo glucosilado por las células OHC mantiene la capacidad de unión al antígeno y la funcionalidad efectora. Esto se ha demostrado en análisis in vitro de lisis del complemento e in vivo en un paciente humano.

Por lo tanto, la invención proporciona un anticuerpo que tiene glucosilación por las OHC. Esos anticuerpos pueden ser naturales, como los anticuerpos humanos, anticuerpos alterados, por ejemplo anticuerpos híbridos, o anticuerpos biespecíficos, anticuerpos quiméricos o injertados con RDC.

La glucosilación por las células OHC se puede asociar al sitio de unión al antígeno o a otras partes del dominio variable. De manera adicional o alternativa se puede asociar a la región constante. El anticuerpo glucosilado se prepara mediante la expresión de los genes del anticuerpo en una célula OHC diseñada mediante ingeniería genética de manera adecuada y seguida de la recuperación y, si es necesario, de la purificación del anticuerpo desde el medio de cultivo celular.

Los anticuerpos glucosilados por las células OHC son útiles en terapia médica para tratar numerosos trastornos humanos, generalmente como inmunosupresores, más particularmente, por ejemplo, trastornos mediados por linfocitos T, que incluyen vasculitis grave, artritis reumatoide, lupus sistémico, también trastornos autoinmunitarios como esclerosis múltiple, enfermedad del injerto frente al huésped, psoriasis, diabetes de inicio en la juventud, enfermedad de Sjögren, enfermedades tiroideas, miastenia gravis, rechazo de los transplantes y asma. Estos anticuerpos también son útiles para tratar tumores como el linfoma no hodgkiniano, el mieloma múltiple, y enfermedades infecciosas como el VIH y el herpes.

Por lo tanto, la invención proporciona el uso de anticuerpos glucosilados por las células OHC para la fabricación de un medicamento para el tratamiento de cualquiera de los trastornos ya mencionados. También se proporciona un procedimiento para tratar a un ser humano que tenga cualquier trastorno de este tipo que comprende la administración a dicho paciente de una cantidad terapéuticamente eficaz de un anticuerpo glucosilado por las células OHC.

Las dosis de esos anticuerpos variarán con la dolencia que se trata y con el receptor del tratamiento, aunque estarán en el intervalo de 1 a aproximadamente 100 mg para un paciente adulto, preferentemente 1-10 mg, administrados a diario durante un período de entre 1 y 30 días. Puede ser preferible un régimen posológico en dos partes en el que se administran 1-5 mg durante 5-10 días, seguidos por 6-15 mg durante otros 5-10 días.

También se incluyen en la invención formulaciones que contienen un anticuerpo glucosilado por las células OHC. Estas formulaciones preferentemente incluyen, además del anticuerpo, un diluyente o vehículo fisiológicamente aceptable, posiblemente mezclado con otros agentes como otros anticuerpos o un antibiótico. Los vehículos adecuados incluyen, aunque no se limitan a ellos, suero salino fisiológico, suero salino tamponado con fosfato, suero glucosalino tamponado con fosfato y suero salino tamponado. De manera alternativa, el anticuerpo puede ser liofilizado (secado mediante congelación) y reconstituido para su uso cuando sea necesario mediante la adición de una solución tamponada acuosa, como se ha descrito más arriba. Las vías de administración son de manera sistemática parenterales, incluyendo la inyección o administración intravenosa, intramuscular, subcutánea e intraperitoneal.

Se ha desarrollado un procedimiento que permite la expresión equilibrada de las cadenas ligeras y pesadas de un anticuerpo a partir de células OHC. Es deseable la expresión equilibrada dado que las cadenas ligeras y pesadas están unidas entre sí en la molécula del anticuerpo en proporciones equimolares. Este procedimiento permite obtener el anticuerpo en su forma funcional, y que se secrete con buenos rendimientos. Por lo tanto, el procedimiento permite obtener cantidades suficientes de anticuerpo funcional para su uso en la inmunoterapia de trastornos
patológicos.

Una línea celular OHC, como se describe en esta solicitud, es capaz de producir todos los tipos de anticuerpos que generalmente comprenden proporciones equimolares de cadenas ligeras y pesadas. Por lo tanto, la invención incluye anticuerpos humanos en los que las secuencias de aminoácidos de las cadenas pesadas y ligeras son homólogas a las secuencias de los anticuerpos que producen los linfocitos humanos in vivo o in vitro mediante hibridomas. También se incluyen en la invención anticuerpos alterados, como anticuerpos híbridos, en los que en las cadenas pesadas y ligeras son homólogas a un anticuerpo natural, aunque están combinadas de una manera que no se produciría de manera natural. Por ejemplo, un anticuerpo biespecífico tiene sitios de unión a antígenos específicos para más de un antígeno. La región constante del anticuerpo se puede relacionar con una u otra de las regiones de unión al antígeno o puede proceder de otro anticuerpo. Los anticuerpos alterados, como los anticuerpos quiméricos, tienen regiones variables que proceden de un anticuerpo y regiones constantes de otro. Por lo tanto, los anticuerpos pueden ser quimeras especie/especie o quimeras clase/clase. Estos anticuerpos quiméricos pueden tener una o más modificaciones adicionales para mejorar su capacidad de unión al antígeno o para alterar el funcionamiento de los efectores. Otra forma de anticuerpo alterado es un anticuerpo humanizado o injertado con RDC que incluye un anticuerpo compuesto, en el que partes de las regiones hipervariables además de las RDC se transfieren al marco humano. Se pueden alterar otros aminoácidos del marco o de las regiones constantes de sus anticuerpos. Así, se incluye en el ámbito de la invención cualquier anticuerpo alterado cuya secuencia de aminoácidos no existe en la naturaleza.

Una línea celular OHC, como se describe en esta solicitud, se puede emplear para la producción de anticuerpos alterados, más preferentemente anticuerpos quiméricos o anticuerpos injertados con RDC. Ejemplos particulares de éstos incluyen anticuerpos frente a marcadores de linfocitos T tales como CD2, CD3, CD4, CD5, CD7, CD8, CD11a, CD11b, CD18, CD19, CD25, CD45 y CDw52, y especialmente anticuerpos injertados con RDC frente al antígeno CDw52, tales como Campath-1H (Campath es una marca comercial de Wellcome Foundation Ltd), que se describe en la patente EP-328404. Otros ejemplos incluyen anticuerpos injertados con RDC frente a diversos antígenos marcadores de células cancerosas, como CD33 y CD38.

Después de la cotransfección en el interior de las células OHC receptoras, las colonias resultantes se pueden seleccionar utilizando ambos marcadores. Las colonias que exhiben el fenotipo dual generalmente son capaces de coexpresar las cadenas ligeras y pesadas. Los marcadores seleccionables pueden ser o no de naturaleza dominante. Los ejemplos de marcadores seleccionables para su uso en la cotransfección incluyen adenosina desaminasa (Kaufman y col., P.N.A.S., 1989, 83, 3136-40), asparagina sintasa (Cartier y col., Mol. Cell Biol., 1987, 7, 1623-28), gen trpB de E. coli y gen hisD de Salmonella (Hartman y col., P.N.A.S., 1988, 85, 8407-51), ribonucleótido reductasa M2 de ratón (Thelander y col., EMBO J., 1989, 8, 2475-79), gen humano de resistencia múltiple a fármacos (Kane y col., Gene, 1989, 84, 439-446), glutamina sintasa (Bebbington y col., DNA Cloning, Vol III, 1987, Ed. D.M. Glover, 163-188, IRL Press), xantina guanina fosforribosil transferasa (gpt) (Mulligan y col., Science, 1980, 209, 1422-27), gen de la resistencia a la higromicina B (Santerre y col., Gene, 1984, 30, 147-156), gen de la resistencia a la neomicina (Southern y col., J. Mol. Appl. Genet., 1982, 1, 327-341) y dihidrofolato reductasa (Subramani y col., Mol. Cell Biol., 1981, 1, 854-864). Un marcador seleccionable preferido particularmente es la dhfr, que habitualmente se emplea con una línea celular OHC parental del fenotipo dhfr^{-} (Urlaub y col., P.N.A.S., 1980, 77, 4216-4220). Las células OHC cotransfectadas con éxito poseerán el fenotipo dhfr^{+} y se pueden seleccionar fácilmente cultivando las colonias en un medio desprovisto de timidina y de hipoxantina y que de manera opcional contenga metotrexato (MTX). Un marcador seleccionable preferido para su uso con los demás vectores es un marcador de resistencia dominante, como el gen de la resistencia a la neomicina (neo). Las células OHC cotransfectadas con éxito con este marcador se pueden seleccionar fácilmente cultivando las colonias en un medio que contenga el antibiótico, G418, conocido por lo demás como Geneticin.

Un segundo sistema de selección y amplificación lo proporciona el marcador seleccionable de la glutamina sintasa o sistema GS, que se describe en el documento WO 87/04462. Las células OHC que han sido transfectadas con éxito con el gen que codifica el enzima GS y con el gen del anticuerpo deseado se pueden seleccionar cultivando las colonias en un medio desprovisto de glutamina, como se describe en la solicitud publicada por el TCP número WO 87/04462.

Al menos uno de los marcadores seleccionables preferentemente también proporciona la base según la cual se pueden amplificar los genes que codifican las cadenas ligeras y pesadas. Cuando se cotransfecta una línea celular OHC, los ADN del vector con frecuencia se integran en el cromosoma de la célula en el mismo locus.

Así, el uso de sólo uno de los marcadores seleccionables como la base para la amplificación normalmente del lugar a un aumento paralelo del número de copias de ambos genes. Un marcador seleccionable particular para su uso de esta manera es dhfr, que permite obtener la amplificación deseada mediante el uso de concentraciones crecientes de MTX. Un segundo marcador seleccionable preferido es GS, que permite la amplificación mediante la adición de metionina sulfoximina (MSX).

Por supuesto, los marcadores seleccionables están bajo el control de los elementos reguladores del ADN, para mantener su expresión. En el caso del uso de dhfr como marcador seleccionable, los elementos reguladores proceden preferentemente de una fuente vírica, como virus tumorales de ADN. Se prefiere particularmente el uso de un promotor tardío principal de un virus SV40 o de un adenovirus. En este sentido, es particularmente ventajoso separar el elemento potenciador del promotor, "inutilizándolo" de manera eficaz. Esta modificación permite obtener niveles aumentados de amplificación génica con cada concentración de metotrexato, selección que de otra manera se produciría si se utilizara un promotor potente. En el caso del uso de neo como marcador seleccionable, un ejemplo de un promotor adecuado es el promotor de la metalotioneína de ratón.

Los genes de las cadenas ligeras y pesadas pueden constituir ADN genómico o, más preferentemente, ADNc, y se clonan usando procedimientos conocidos en la materia (Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Second Edition, Maniatis y col., Cold Spring Harbor). Los genes también están bajo el control de elementos reguladores del ADN, que permiten mantener su expresión. Se prefiere el uso de los mismos elementos reguladores para ambas cadenas, de modo que su expresión esté sustancialmente equilibrada. Los elementos reguladores pueden ser de origen vírico y los ejemplos incluyen los que se han mencionado más arriba junto a la expresión de dhfr como marcador seleccionable. Otro ejemplo es el uso del promotor de \beta-actina y del cognato de la señal de poliadenilación de
\beta-actina.

Uno o los dos vectores también pueden contener un origen de replicación SV40 para permitir verificar las construcciones del vector mediante un ensayo transitorio rápido.

La construcción de los vectores de expresión se puede llevar a cabo según procedimientos conocidos en la materia (Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Second Edition, Maniatis y col., Cold Spring Harbor).

La cotransfección de la línea celular OHC con los vectores de expresión se puede llevar a cabo simplemente usando cantidades equimolares de ambos vectores y procedimientos de transfección estándar, como precipitación con fosfato cálcico o con lipofectina. La selección de la línea celular cotransfectada deseada se puede llevar a cabo según procedimientos estándar conocidos para los marcadores seleccionables particulares.

El cultivo de la línea celular OHC se puede llevar a cabo en un medio que contiene suero o preferentemente en un medio sin suero ni proteínas. En un ejemplo preferido en el que la línea celular OHC es una transformante dhfr^{+}, el medio preferentemente no tiene hipoxantina y/o timidina y opcionalmente contiene MTX. Cuando el marcador seleccionable es la glutamina sintasa el medio preferentemente carece de glutamina y opcionalmente contiene MSX. La expresión de ambas cadenas en proporciones sustancialmente equimolares permite obtener rendimientos óptimos de anticuerpo funcional. Las dos cadenas se ensamblan en el interior de la célula y después se secretan hacia el medio de cultivo en forma de anticuerpo funcional. El anticuerpo resultante se puede purificar y formular según procedimientos estándar.

Los gráficos acompañantes muestran:

Figura 1

(a) La construcción pLD9 que contiene casetes de expresión para el marcador de selección/amplificación dhfr "inactivado" y el ADNc de cadenas ligeras Campath-1H. El pequeño recuadro que tiene una flecha discontinua es el promotor SV40 debilitado; el recuadro punteado de mayor tamaño que tiene una flecha es el promotor de la \beta-actina; polyA se refiere a las señales de poliadenilación y terminación asociadas a sus fuentes respectivas; el pequeño recuadro señalado con ori contiene el origen de replicación SV40;

(b) La construcción pNH316 que contiene casetes de expresión para el marcador de selección de neomicina y el ADNc de cadenas pesadas Campath-1H. El recuadro que tiene una flecha y MT se refiere al promotor de la metalotioneína de ratón. Los sitios de restricción que se indican son: H, HindIII; Bg, BglII; B, BamHI; R1 y EcoR1.

Figura 2

Determinaciones comparativas de la velocidad de síntesis de Campath-1H en células A39 confluentes durante 4 días consecutivos. Después del período de coincubación rápida con [^{35}S] metionina se sometieron a inmunoprecipitación alícuotas iguales de células (C) y de medio de cultivo (M) y se separaron mediante SDS-PAGE. Se indica la posición de las cadenas pesadas y ligeras de Campath-1H (flechas H y L). Hubo cierta pérdida de material en la muestra celular del día 3.

\newpage

Figura 3

Un experimento de marcaje radiactivo rápido y seguimiento para determinar la velocidad de secreción y distribución del Campath-1H radiomarcado en células A39. Las células confluentes se sometieron a pulsos de marcaje radiactivo con [^{35}S] metionina durante 6 horas, y después se añadió un medio de cultivo limpio que contenía un exceso de metionina no marcada. Se obtuvieron alícuotas iguales de células en el medio de cultivo en los puntos de tiempo indicados (en horas después de finalizar el periodo de pulsos de marcado radiactivo) y se trataron como se describe en la leyenda de la Figura 2. Las muestras del medio de cultivo de los puntos de tiempo de 48 y 72 horas se analizaron en un gel diferente a las de los puntos de seis y 24 horas, y los trazados sólo se alinearon en relación con la posición de la cadena pesada (H).

Figura 4

Muestra el crecimiento de C1H 3D11^{*} 44 en medio WCM5 (medio sin proteínas) en un fermentador de 1 litro medido como recuento celular/ml a lo largo de 90 días.

Figura 5

Muestra la producción de anticuerpos por las células C1H 3D* 44 en medio WCM5 en un fermentador de 1 litro medido como \mug de anticuerpo/ml a lo largo de 80 días.

Los siguientes ejemplos se presentan únicamente para ilustrar la presente invención.

Ejemplo 1 Clonación de los ADNc de las cadenas pesadas y ligeras de Campath-1H

Originalmente se insertaron las regiones determinantes de la complementariedad del anticuerpo monoclonal de rata Campath-1G directamente en los marcos genómicos de las cadenas pesadas y ligeras humanas (Winter y col., Nature, 1988, 322, 323-327). Estas construcciones se elaboraron mediante ingeniería genética para su expresión en la línea de células del mieloma YO y dieron lugar a rendimientos de Campath-1H de hasta 5 \mug/ml después de 10-14 días de cultivo (Hale y col., Tissue Antigens, 1990, 35, 118-127 y Winter y col., Nature, 1988, 322, 323-327). La línea de células del mieloma TF57 (Hale y col., ibid.) se usó para generar fracciones de ADNc seleccionadas por el tamaño de 0,9-1,2 kb y 1, 4-1, 7 kb para los ADNc de las cadenas ligeras y pesadas, respectivamente. Estas se usaron para hacer bibliotecas de ADNc asociado a EcoR1 en un vector \lambdagt10. Todos los procedimientos se realizaron como describieron Huynh y col. (DNA Cloning, Vol. I: A Practical Approach, 1984, Glover, D (Editor), IRL Press, Oxford). Se hizo selección de las bibliotecas usando sondas de hibridación [^{32}P] específicas para las regiones variables para aislar clones de ADNc completos. Para el ADNc de la cadena ligera, el promotor no traducido 5' se eliminó hasta la posición 32 usando una exonucleasa Bal-31 y una secuencia de enlace HindIII añadida. Para el extremo 3' se uso un sitio SacI exclusivo que estaba a 47 pb secuencia arriba del codón de terminación. Se usó un par de oligonucleótidos Sacl-HindlIl para regenerar esta secuencia y para colocar el sitio HindlIl inmediatamente después del codón de terminación. Para el extremo 5' del ADNc de las cadenas pesadas, se usó el sitio Ncol exclusivo que se solapaba con el codón de inicio ATG para reconstruir un promotor no traducido de 29 pb, idéntico al de la cadena ligera, usando un par de oligonucleótidos HindIII-NcoI. En el extremo 3' el sitio exclusivo Nael de 12 pb que estaba situado secuencia abajo del codón de terminación se convirtió en un sitio HindIIl usando secuencias de enlace.

Ejemplo 2 Construcción de vectores

El promotor de la \beta-actina humana se escindió del vector pH\betaAPr-3- neo (que corresponde a pH\betaAPr-1-neo (Gunning y col., P.N.A.S., 1987, 84, 483-35), excepto porque la señal de poliadenilación/terminación de SV40 ha sido sustituida por las señales de la \beta-actina humana respectivas) como un fragmento PvuII-HindIII de 2860 pb, en el que el sitio PvuII se convirtió posteriormente en un sitio BglII usando secuencias de enlace. Para aislar las señales de poliadenilación y terminación de la \beta-actina humana del vector pH\betaAPr-3-neo, un sitio SphI que estaba a 1,4 kb secuencia abajo del sitio exclusivo HindIII se convirtió en un sitio BamlI usando secuencias de enlace. El vector dhfr basal denominado p104, se construyó como se señala a continuación. El sitio Sphl en la posición -128 del promotor SV40 del vector pSV2dhfr (Subramani y col., Mol. Cell. Biol., 1981, 1, 854-864) se convirtió en un sitio SalI para eliminar del promotor todos los elementos potenciadores. La unidad de expresión dhfr debilitada se subclonó después como un fragmento SalI-BamHl en los sitios homólogos del vector pSVOd (Hellon y col., Cell, 1981, 27, 279-288).

Para construir el vector pLD9, el vector p104 se digirió con BamHI, se digirió con fosfatasa y se ligó con otros tres fragmentos que estaban formados por el promotor de \beta-actina BglII-HindIII, el ADNc de las cadenas ligeras Hindlll Campath-1H y las señales de poliA/terminación Hindlll-BamHI de la \beta- actina. Para construir el vector pNH316, se digirió la construcción pdBPV-MMTheo (Law y col., Mol. Cell. Biol., 1983, 3, 2110-2115) con BamHI, se dirigió con fosfatasa, y el fragmento que contenía el gen de neomicina se aisló después de la separación sobre gel de agarosa. Éste se ligó con los dos fragmentos de \beta-actina y con el ADNc de la cadena pesada de Campath-lH. Los constructos pLD9 y pNH316 se representan en la Figura 1.

Ejemplo 3 Expresión de Campath-1H en células OHC

La línea celular dhfr^{-} de OHC DUK-B11 (Urlaub y col., P.N.A.S., 1980, 77, 4216-4220) se cultivó en medio MEM de Iscove suplementado con suero bovino fetal al 10%, y 4 \mug/ml de hipoxantina y 4 \mug/ml de timidina. Se coprecipitaron 10 \mug de pLD9 y de pNH316 en células usando el procedimiento de fosfato cálcico (Gorman y col., DNA Cloning, 1985, Vol II, 143-190, Academic Press, N.Y.) y se seleccionaron por el doble fenotipo de dhfr^{+}/resistencia a neomicina usando el medio que se señala más arriba excepto que se usó suero dializado al 10%, se omitió la hipoxantina/timidina y se incluyó G418 (Gibco) a 500 \mug/ml. En algunos experimentos se incluyó directamente MTX en la primera tanda de selección de transformantes dhfr^{+}. Se mezclaron varios cientos de colonias resistentes y se estudió la producción del anticuerpo Campath-1H en el medio de cultivo. El rendimiento medio fue de 0,5 \mug/ml para las transformantes no amplificadas de la primera tanda.

Después se cultivaron todas las poblaciones de células mezcladas en presencia de MTX 10^{-7} M, y después de dos semanas se mezclaron de nuevo las colonias resistentes y se estudió la producción de Campath-1H. Hubo un aumento considerable del rendimiento de hasta 80 veces (Tabla 1). Estas células se clonaron mediante dilución, se hizo selección del rendimiento de Campath-1H, y se aislaron dos líneas de elevada producción, denominadas A37 y 3D9 (Tabla 1). Estas dos líneas se amplificaron aún más en presencia de MTX 10^{-6} M, después se clonaron mediante dilución y se hizo la selección como se señala más arriba. El aumento de la expresión en esta segunda y última etapa de amplificación no fue tan marcado como el que se había visto previamente; sin embargo, cuando se las volvió a cultivar hasta que alcanzaron la confluencia y se las dejó otros 4 días, las líneas celulares A39 y 3D11 eran capaces de producir hasta 200 \mug/ml de Campath-1H.

TABLA 1 Niveles de expresión de Campath-1H usando amplificación por etapas

Construcción	Etapa de selección	Campath-1H (\mug/ml) acumulado
pLD9 + pNH316	Mezcla basal dhfr^{+}/neo	0,5
	Mezcla amplificada con MTX 10^{-7} M	18-40
	Líneas celulares A37 y 3D9	40
	Mezcla amplificada con MTX 10^{-6} M	60-90
	Línea celular A39	100
	Línea celular 3D11	150-200
Leyenda de la tabla
\begin{minipage}[t]{157mm} Se permitió que las células alcanzaran la confluencia en una botella de cultivo tisular T-175, después se volvió a llenar con 50 ml de medio de cultivo recién preparado y se dejó otros cuatro días. El anticuerpo Campath-1H que se había acumulado en el medio durante este periodo se midió mediante ELISA. Los recuentos celulares totales el día del ensayo eran habitualmente de 2,5 x 10^{7}. El rendimiento de la línea celular 3D11 refleja una productividad de 100 \mu g/10^{6} células/día.\end{minipage}

Los vectores de cotransfección pLD9 y pNH316 se emplearon además para evaluar la estrategia de amplificación alternativa a la que se ha descrito más arriba. Las células OHC dhfr^{-} se cotransfectaron de la manera habitual, y dos días después se separaron directamente en una serie de botellas que contenían medio G418 para la selección por la neomicina) y concentraciones crecientes de MTX que iban desde 3 x 10^{-9} M a 10^{-7} M. Después de dos semanas de esta selección se hizo recuento del número de colonias resistentes para cada botella y se mezclaron. Cuando las poblaciones celulares se habían estabilizado, se estudiaron para medir los títulos del anticuerpo Campath-1H, y los resultados se muestran en la Tabla 2. A medida que se aumentaba la concentración de MTX, había una reducción marcada del número de colonias dhfr^{+} supervivientes, aunque expresaban proporcionalmente más Campath-1H. Así, en una selección directa en una etapa con concentraciones elevadas de MTX es posible aislar poblaciones celulares que produzcan aumentos de hasta 60 veces de la producción del anticuerpo en comparación con poblaciones que se seleccionan por su concentración basal de dhfr.

TABLA 2 Niveles de expresión de Campath-1H usando selección directa

	Selección (M de MTX)	Colonias dhfr^{+}	Campath-1H (\mug/ml) acumulado
	Sin MTX	500	0,5
	3 x 10^{-9}	40 \;	2 \;
	10^{-8}	5 \; \;	7 \;
	3 x 10^{-8}	5 \; \;	30
	10^{-7}	- \; \;	- \;
	Leyenda de la tabla
	\begin{minipage}[t]{145mm}Se mezclaron y ensayaron las colonias de todas las etapas de selección con MTX como se ha descrito en la leyenda de la Tabla 1.\end{minipage}

Este procedimiento de selección se repitió después de otra cotransfección de las células, y en este caso se seleccionó toda la población en un medio que contenía G418 y MTX 3 x 10^{-8} M. Esto generó una mayor mezcla de colonias resistentes, que posteriormente se mezclaron y se volvieron a amplificar dos veces más usando concentraciones de MTX de 6 x 10^{-7} M, y después 3 x 10^{-6} M. En esta etapa las células se clonaron mediante dilución y se hizo selección de los niveles de Campath-1H. Las dos líneas celulares aisladas que producían mayores concentraciones eran capaces de producir concentraciones de anticuerpos de hasta 100-150 \mug/ml y se denominaron líneas 4F11 y
5E10.

Las velocidades de crecimiento de estas líneas celulares, y de las líneas A39/3D11 que se han descrito más arriba, eran considerablemente menores que las de las líneas OHC dhfr^{-} parentales no transformadas. Esto habitualmente es una característica común de estas células una vez que se han diseñado mediante ingeniería genética para expresar cantidades elevadas de un gen de un producto. Los rendimientos de las líneas celulares 5E10 y 4F11 resultaron ser bastante variables a lo largo del tiempo, y la última parece tener sólo una vida en número de etapas limitada que duraba aproximadamente tres semanas antes de entrar en crisis y muerte. Esta inestabilidad no fue evidente en absoluto en las demás líneas celulares, aunque en general las líneas que se habían aislado en el segundo procedimiento de amplificación, incluyendo 5E10, habitualmente eran más difíciles de cultivar por su inestabilidad. De todas las líneas, la línea 3D11 aunaba un buen crecimiento y estabilidad con elevados rendimientos de Campath-1H. Para garantizar la propagación de estas características, la línea celular 3D11 se clonó mediante dilución una vez más para generar la línea 3D11*, y ésta producía de manera similar rendimientos de Campath-1H de hasta
200 \mug/ml.

Ejemplo 4 Crecimiento de la línea celular C1H 3D11* 44 y producción por la misma en medio WCH4

a) Las células C1H 3D11* que crecían como una monocapa en medio de Iscoves + SBF al 10% de Flow, aminoácidos no esenciales, metotrexato 10^{-6} M y antibióticos tenían una confluencia de aproximadamente 90%. Éstas células se separaron del plástico con tripsina/verseno, se lavaron con medio de Iscoves sin suplementos, se centrifugaron y se volvieron a suspender a una concentración 5 x 10^{4}/ml en el medio WCM4 de la Tabla 3 + peptona al 0,25% + polietilenglicol (PEG) 10.000 al 0,1% + suero bovino fetal (SBF) al 0,5% sin metotrexato (MTX).

TABLA 3 Formulación del medio WCM4

Modificación de Iscoves del medio DMEM sin BSA, transferrina ni lecitina. Disponible de GIBCO Ltd., Unidad 4, Cowley Mill Td. Est., Uxbridge UB 27G. Similar al medio publicado (Iscoves y Meleher (1978) J. Exp. Med. 1, 47, 923) sin la albúmina sérica bovina, la transferrina humana pura ni la lecitina de soja.

\dotable{\tabskip\tabcolsep#\hfil\+#\hfil\+#\hfil\+#\hfil\+#\hfil\tabskip0ptplus1fil\dddarstrut\cr}{
 + \+  \hskip0.7cm  \+ 5 ml/litro \+  \hskip2cm 
\+ de L  -  glutamina 200 mM\cr  + \+ \+ 50 mg/litro \+
\+ de L  -  prolina\cr  + \+ \+ 50 mg/litro \+ \+  de
L  -  treonina\cr  + \+ \+ 50 mg/litro  \+ \+  de
L  -  metionina\cr  + \+ \+ 50 mg/litro \+ \+ de
L  -  cisteína\cr  + \+ \+ 50 mg/litro \+ \+  de
L  -  tirosina\cr  + \+ \+ 25 mg/litro \+ \+  de ácido
ascórbico\cr  + \+ \+ 0,062 mg/litro \+ \+  de vitamina
B6\cr}

TABLA 3 (continuación)

\dotable{\tabskip\tabcolsep#\hfil\+#\hfil\+#\hfil\+#\hfil\+#\hfil\tabskip0ptplus1fil\dddarstrut\cr}{
 + \+  \hskip0.7cm  \+ 1,36 mg/litro \+
 \hskip2cm  \+ de vitamina B12\cr  + \+ \+ 0,2 mg/litro \+
\+ de ácido lipoico\cr  + \+  \+ 0,0 88 mg/litro \+  \+ de linoleato
de metilo\cr  + \+ \+ 1  \mu M  \+ \+ de metotrexato\cr  + \+ \+ 1
mg/litro \+ \+ de FeSO _{4} \cr  + \+ \+ 1 mg/litro \+ \+ de
ZnSO _{4} \cr  + \+ \+ 0,0025 mg/litro  \+ \+ de CuSO _{4} \cr  + \+
\+ 5 mg/litro \+ \+ de insulina recombinante (Nucellin)\cr  + \+ \+
50.000 UI/litro  \+ \+ de polimixina\cr  + \+ \+ 20.000 UI/litro \+
\+ de neomicina\cr  + \+ \+ 0,16 mg/litro \+ \+  de
putrescina  -  2
HCl\cr}

Se prepararon tres botellas de 25 cm^{2} con 10 ml de suspensión celular + hipoxantina (H), timidina (T) o HT. Estas botellas se incubaron a 36,5ºC en una incubadora con CO_{2} al 5%.

Después de seis días se mezclaron las botellas y se añadieron a un volumen igual de WCM4 + MTX sin peptona ni PEG, y se transfirieron a una botella de 75 cm^{2}.

Estas células se usaron para sembrar una centrifugadora Techner de 500 ml, y se incubaron a 36,5ºC girando a 40 rpm. Las células siguieron creciendo sin suero durante un periodo de más de cinco meses, y aunque se encontró que las células precisaban un período de adaptación, hubo un aumento constante de la velocidad de crecimiento y de la viabilidad. Se calculó que el tiempo de duplicación de la población era de 73,1 horas a lo largo de aproximadamente siete semanas; disminuyó a 47,4 horas en los 20 días siguientes y posteriormente se estabilizó. La secreción de anticuerpos permaneció elevada a concentraciones mayores de 60 \mug/ml. Se determinó que el número de copias del gen en estas células no disminuía según la intensidad de las bandas utilizando análisis de inmunotransferencia
Northern.

En los fermentadores éstas células producían anticuerpos en cantidades mayores de 70 \mug/ml y de manera regular alcanzaban concentraciones de 100 \mug/ml o más. Estas células se denominan C1H 3011* 44.

b) Células procedentes de a), más arriba, que habían estado creciendo sin suero durante más de dos meses, se transfirieron a un fermentador SGi de 1 l con una pala angulada de acero inoxidable que giraba a 70 rpm. Se ajustó la temperatura a 37,0ºC, la d0_{2} al 10% y el control de pH a 7-7, 2. El fermentador se sembró el día 0 con 0,22 x 10^{6} células/ml en medio WCM4 (Tabla 3) con polietilenglicol (PEG) 10.000 al 0,1% y peptona de soja a 0,25%, y se gaseó con O_{2} sobre la parte superior. Se hicieron pases de las células de manera sistemática usando medio limpio y una tasa de división típicamente entre 1 a 2 y 2 a 4.

El día 33 la gasificación sobre la parte superior se sustituyó por una aspersión profunda que se espera que produzca más lesión física de las células.

Del día 50 en adelante se usó el medio WCM5 (Tabla 4) junto a peptona, y PEG en lugar de WCM4.

TABLA 4 Formulación del medio WCM5

Modificación de Iscoves del medio DMEM sin BSA, transferrina ni lecitina (véase la Tabla 3).

\dotable{\tabskip\tabcolsep#\hfil\+#\hfil\+#\hfil\+#\hfil\+#\hfil\tabskip0ptplus1fil\dddarstrut\cr}{
 + \+  \hskip0.7cm  \+ 5 ml/litro \+  \hskip2cm 
\+  de L  -  glutamina 200 mM\cr  + \+ \+ 50 mg/litro \+
\+ de L  -  prolina\cr  + \+ \+  50 mg/litro \+ \+  de
L  -  treonina\cr  + \+ \+ 50 mg/litro \+ \+  de
L  -  metionina\cr  + \+ \+ 50 mg/litro \+ \+  de
L  -  cisteína\cr  + \+ \+ 50 mg/litro \+ \+  de
L  -  tirosina\cr  + \+ \+ 25 mg/litro \+ \+  de ácido
ascórbico\cr  + \+ \+ 0,062 mg/litro \+ \+ de vitamina B6\cr  + \+
\+ 1,36 mg/litro \+ \+  de vitamina B12\cr  + \+ \+ 2 mg/litro \+ \+
 de citrato férrico\cr  + \+ \+ 1 mg/litro \+ \+  de sulfato de
cinc\cr  + \+ \+ 0,0025 mg/litro \+ \+ de sulfato de
cobre\cr}

TABLA 4 (continuación)

\dotable{\tabskip\tabcolsep#\hfil\+#\hfil\+#\hfil\+#\hfil\+#\hfil\tabskip0ptplus1fil\dddarstrut\cr}{
 + \+  \hskip0.7cm  \+ 50.000 UI/litro \+
 \hskip2cm  \+ de polimixina\cr  + \+ \+ 20.000 UI/litro 
\+ \+de neomicina\cr  + \+ \+ 3  \mu g/litro \+ \+  de
etanolamina\cr  + \+ \+ 0,16 mg/litro \+ \+  de putrescina\cr  + \+
\+ 5 mg/litro \+ \+ de insulina recombinante
(Nucellin)\cr}

El día 53 se sustituyó el PEG por Pluronic F68 a 0,1%. En los gráficos adjuntos (Figuras 4 y 5) se muestra el crecimiento y las concentraciones de anticuerpos resultantes que se consiguieron, y demuestran la capacidad de la invención de permitir la producción de anticuerpos sin contaminación por otras proteínas a concentraciones mayores de 100 \mug/ml en fermentadores.

Ejemplo 5 Análisis de la velocidad de síntesis y secreción de Campath-1H por las células OHC

Durante el transcurso del cultivo de las células OHC productoras de Campath-1H del Ejemplo 3 se hizo evidente que incluso cuando se alcanzaba la confluencia, las concentraciones de anticuerpos seguían acumulándose con el tiempo en el medio de cultivo. Para determinar si esto posiblemente se debía a la acumulación intracelular junto a una secreción lenta, se midieron las velocidades de síntesis y secreción de Campath-1H usando células A39. Estos análisis se realizaron a lo largo de 3-4 días consecutivos en células que estaban en fase de crecimiento o en fase de confluencia estacionaria. Para las células que estaban en cualquiera de los dos estados de crecimiento los resultados fueron idénticos, y sólo se presentan los datos para el Campath-1H radiomarcado e inmunoprecipitado que se produjo a partir de las células estacionarias.

La velocidad de síntesis del anticuerpo se midió administrando a las células, pulsos de marcaje radiactivo durante un breve período con [S^{35}] metionina en cada uno de cuatro días consecutivos, y posteriormente se examinó la cantidad y la distribución del material inmunoprecipitado. En la Figura 2 es evidente que la velocidad de síntesis es elevada por igual en todos los puntos de tiempo que se midieron. Además, incluso hacia el final de este breve pulso, en todos los casos ya está presente en el medio más de la mitad del Campath-1H de nueva síntesis, lo que indica una secreción rápida. Esto se confirmó con los otros que se muestran en la Figura 3, en la que se administraron pulsos de manera similar a células paralelas, y se hizo seguimiento de la distribución del Campath-1H radiomarcado durante un período de tres días. En un plazo de 24 horas prácticamente todo el anticuerpo radiomarcado había sido detectado hacia el medio, donde permaneció estable durante toda la duración del experimento. Esto demuestra que incluso cuando las células OHC recombinantes permanecen estacionarías durante períodos largos, no hay disminución de las velocidades de síntesis y secreción de Campath-1H.

Ensayo de Campath-1H mediante ELISA. Se recubrieron placas de microvaloración con anticuerpos anti-IgG humana y se incubaron con la muestra del ensayo (en medio de cultivo). La detección de anticuerpos se visualizó usando un conjugado de peroxidasa específica anti-cadenas gamma humanas.

Análisis de las velocidades de síntesis y secreción de Campath-1H. Las células del Ejemplo 3 se cultivaron hasta alcanzar la confluencia en pocillos de cultivo tisular de 3 cm y después se incubaron durante 30 minutos en medio MEM 4 de Dulbecco sin metionina que contenía suero de ternera fetal al 10%. Después de esto se marcaron las células en presencia de 120 \muCi/ml de [^{35}S] metionina (>800 Ci/mmol; Amersham) durante el período temporal adecuado, y después se recogieron y lisaron en 500 \mul de tampón de lisis NP-40, o se siguieron incubando en un medio de cultivo normal. Posteriormente se sometieron a inmunoprecipitación alícuotas de 125 \mul de lisado celular o de medio de cultivo usando IgG de cabra anti-humana (especifica para las cadenas pesadas; Sigma) y Sepharose proteína A al 10% (Pharmacia). Posteriormente se separaron las muestras sobre geles reductores de SDS-PAGE al 10% según Laemmli, y las señales se amplificaron con Enhance (NW-Dupont). Posteriormente los geles secos se autorradiografiaron durante una noche.

Ensayos biológicos de Campath 1H glucosilado por las células OHC Ensayo de lisis del complemento para Campath 1H

El ensayo de lisis del complemento es una medida de la función de los anticuerpos que se expresa como actividad específica y que se determina por la capacidad de un anticuerpo glucosilado por las células OHC de una concentración conocida para unirse a un número predeterminado de células y de efectuar la lisis celular.

El ensayo se realizó con el Campath 1H del Ejemplo 4 usando células Karpas 422 (establecidas a partir de una línea celular de linfoma no hodgkiniano de linfocitos B - Dyer y col., (1990) Blood, 75, 704-714) que expresaban el antígeno Campath sobre la superficie celular. Se cargaron 1,2 x 10^{7} con radiomarcaje mediante incubación durante 2 horas a 37ºC en una incubadora de CO_{2} en presencia de 600 \muCi de ^{51}Cr (cromato sódico).

Se añadieron 5,3 ml de las células cargadas en medio (volumen total 23,5 ml) a 12,5 ml de suero humano normal, y se pipetearon 150 \mul de la mezcla en los pocillos de una placa de microtítulo.

Muestras de 50 \mul del eluido final procedente de tres tandas de purificación se mezclaron con las células y se incubaron durante 30 minutos a 4ºC, seguido por 90 minutos a 37ºC. El cultivo se centrifugó a 2000 rpm durante cinco minutos y se hizo recuento de la radioactividad de 100 \mul del sobrenadante celular en una gammacámara. La actividad de lisis del complemento en kilounidades/ml se calculó a partir de una curva estándar de una preparación de referencia (1000 unidades/ml).

Los resultados se presentan en la Tabla 5.

Se estimó la concentración de Campath 1H en las muestras de 50 \mul del eluato final usando muestras en STF a pH 7,2 que se leyeron en un espectrofotómetro a 280 nm. Los resultados se expresan en la Tabla 3 en forma de densidad óptica en mg/ml.

A partir de estos datos se determina la actividad específica, KU/ml / DO.

TABLA 5

Muestra	Lisis del complemento KU/ml	Conc. de proteína mg/ml	Actividad especifica
A	11,2	11,1	1,0
B	14,8	14,2	1,0
C	13,7	13,6	1,0

Los resultados indican que el anticuerpo Campath 1H glucosilado por las células OHC es funcional.

Tratamiento de un paciente con Campath 1H glucosilado por las células OHC

A un paciente diagnosticado de inflamación articular grave mediada por linfocitos T (poliartritis inmovilizante, pleuritis y dolor abdominal) durante cinco años y que precisaba períodos prolongados de ingreso hospitalario se le trató con el Campath 1H procedente de las células OHC del Ejemplo 4 usando el siguiente régimen:

2 mg al día durante 6 días mediante inyección intravenosa

10 mg al día los 6 días siguientes mediante inyección intravenosa.

Durante el segundo tratamiento de 6 días hubo una mejoría sintomática significativa. Al final del segundo período la inflamación articular había mejorado mucho y los abscesos cutáneos se habían resuelto con tratamiento antibiótico. Treinta días después del final del tratamiento se dio de alta al paciente.

Aproximadamente nueve meses después del tratamiento inicial el paciente presentó una recaída con afectación de múltiples articulaciones. Después de las pruebas iniciales de sensibilidad con una dosis baja, se administró al paciente otro ciclo de tratamiento con 10 mg/día de Campath 1H durante 10 días con una mejoría significativa.

Ejemplo 6 Expresión de un anticuerpo anti-CD4 humanizado procedente de células OHC Construcción del vector de expresión pBan1; modificación de p342-12

Las regiones determinantes de la complementariedad de una IgG2b de rata que se había generado frente al antígeno CD4 humano (The New England Journal of Medicine 1990; 323: 250-254) se insertaron en los marcos de las cadenas pesada y ligera humanas (Winter y col., Nature, 1988, 322, 323-327).

Se clonó el ADNc que codificaba la cadena ligera humanizada frente a CD4 en el plásmido pLD9 [Page y Sydenham, M.A., 1991, Biotechnology, 9, 64-69). El plásmido resultante se denominó p2110. La cadena pesada humanizada frente a CD4 se secuenció y se clonó en una versión modificada del plásmido p342-12 (Law M-F., Byrne, J.C. y Hinley, P.M. 1983, Mol. Cell. Biol. 3, 2110-2115). El plásmido p342-12 se digirió con BamH1 para eliminar el fragmento de 7,4 kpb que contenía parte del genoma de BPV-1. La estructura molecular que contenía el gen de la \beta-lactamasa y el gen de la resistencia a la neomicina bajo el control del promotor de la metalotioneína de ratón se purifico y se volvió a ligar en el sitio BamH1. Este plásmido se digirió con HinDIII, se incubó con el fragmento grande de la ADN polimerasa I para eliminar el sitio HinDIII y después se volvió a ligar. La casete de expresión de la \beta-actina, que contenía el promotor de la \beta-actina inmediatamente secuencia arriba de un sitio exclusivo HinDIII seguido de la señal de poliadenilación, se clonó en el sitio BamHI del plásmido p342-12 modificado para generar el plásmido pBan1.

Por lo tanto, el plásmido pBan1 estaba formado por el gen de la resistencia a la neomicina, el gen de la \beta-lactamasa y la casete de expresión de la \beta-actina que contenía el sitio exclusivo HinDIII. El ADNc que codificaba la cadena pesada humanizada se clonó en este sitio y el plásmido resultante que contenía el inserto orientado correctamente se denominó pBanCD4H. Así, los plásmidos p2110 y pBanCD4H contenían un marcador seleccionable diferente, y su cotransfección en células receptoras OHC dhfr^{-} permitiría la selección directa y el aislamiento de colonias dhfr^{+}/neo^{r}. Las células que muestran este fenotipo deberían expresar anticuerpos funcionales anti-CD4 y se podrían amplificar para elevar los títulos de anticuerpos.

Expresión del anticuerpo anti-CD4 en células OHC a) Procedimientos de cultivo celular

La línea celular OHC dhfr^{-} DUK-B11 (Urlaub, G. y Chasin, L.A., 1980, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 77, 4216-4220) se propagó en medio de Iscoves suplementado con suero bovino fetal al 10% y con 4 \mug de hipoxantina y 4 \mug de timidina (todos de Flow). Después de la transfección se seleccionaron las transformantes en el medio que se ha descrito más arriba excepto que se omitió la hipoxantina/timidina y se utilizó suero bovino fetal dializado. Además, se incluyó G418 a una concentración de 500 \mug/ml. Para inducir la amplificación espontánea de las secuencias que contenían el gen dhfr y que lo flanqueaban, se añadió MTX a una concentración de 0,1 \muM.

b) Transfección y amplificación

La línea celular OHC dhfr^{-} DUX-B11 se cotransfectó con 5 \mug de p2110 y con 5 \mug de pBanCD4R usando el reactivo Transfectam en las condiciones que recomienda el fabricante. Se seleccionaron las transformantes según el fenotipo dhfr^{+}/neo^{r} como se ha descrito más arriba. Se observaron y mezclaron varios cientos de transformantes. Los títulos iniciales indicaron que las transformantes basales de la primera tanda secretaban aproximadamente 0,1 \mug/ml/día. Esta población mezclada se cultivó después en presencia de MTX 0,1 \muM durante aproximadamente 14 días. Una vez más se mezclaron y ensayaron las colonias resistentes. La expresión había aumentado unas 100 veces, de modo que las colonias mezcladas y amplificadas producían aproximadamente 10-12 \mug/ml/día. A fin de obtener líneas celulares clonales estables que dieran títulos de anticuerpos elevados, se clonaron las mezclas resistentes mediante dilución limitante en placas de 96 pocillos. Se identificaron y ensayaron 50 colonias únicas, y se propagaron las cuatro líneas que daban los títulos más elevados. Este procedimiento de identificación de clones de expresión elevada en el interior de la población resistente dio lugar a una línea denominada D419, que expresaba el anticuerpo anti-CD4 a aproximadamente 20 \mug/ml/día.

Caracterización de las líneas celulares dhfr^{+}/neo^{r} i) Determinación del número de copias y de los niveles de transcripción en estado estable mediante análisis de transferencia en hendidura del ADN y del ARN

Se preparó ARN y ADN entero procedentes de diversas etapas de amplificación, como han descrito Maniatis y col. (1982, Molecular Cloning. A Laboratory Manual. Cold Spring Harbour Laboratory, Cold Spring Harbour, Nueva York). Después de fijarlos sobre filtros de nitrocelulosa, los ácidos nucleicos se marcaron con secuencias de ADN de la cadena pesada marcadas con [^{32}P]-aATP, el gen dhfr y el gen de la \beta-actina como gen de mantenimiento para eliminar los artefactos que se deben a errores de carga.

Inicialmente la mezcla no clonada y amplificada con MTX 0,1 \muM se comparó con las transformantes no amplificadas de la primera tanda y con las células parentales 811 no transformadas, con las sondas que se han descrito. En consecuencia, no se detectó ninguna señal de ADN en la línea parental cuando se marcó con sondas de la cadena pesada, aunque se detectó una señal débil para dhfr. Esto se debe al único alelo dhfr no funcional de toda la línea celular. En consecuencia, no se detectó ninguna señal de ARN con ninguna de las sondas. Por el contrario, se detectó una señal intensa con ambas sondas con el ARN y el ADN de las transformantes primarias, lo que refleja el inicio de la expresión. En la mezcla amplificada no clonada se observa un aumento muy significativo del número de copias y de la concentración en estado estable del ARN de la cadena pesada y de la dhfr. Esto se correlaciona exactamente con el aumento observado de la expresión. Las concentraciones en estado estable del ARN de la \beta-actina fueron constantes en las tres líneas que se examinaron.

Se hizo una comparación similar entre las cuatro líneas celulares que tenían los máximos niveles de expresión. Se detectó una señal intensa en las transferencias de ARN y de ADN. Sin embargo, aunque la línea DA19 expresaba el doble de anticuerpos que una línea denominada D423, esta diferencia no se debía ni al número de copias ni a la concentración de ARN en estado estable. Hay dos posibles explicaciones para esta observación; la primera es que el ADN de la línea DA19 se ha integrado en un punto del genoma en el que está bajo la influencia de un potenciador. Sin embargo, esto probablemente se reflejaría por una concentración elevada de ARN. La explicación más probable es que en la replicación y duplicación de las matrices en tandem de la línea D423, algunas copias de la casete dhfr/anticuerpo han experimentado reorganización y no son funcionales y están truncadas. Esto no es infrecuente porque el sitio de integración de los genes heterólogos con frecuencia está en sitios de rotura de los cromosomas, como los telómeros, que se sabe que son "puntos calientes" para esas reorganizaciones. Esto se podría resolver mediante inmunotransferencia Northern y Southern.

ii) Síntesis proteica y secreción del anticuerpo anti-CD4 en la línea D419

La línea clonal D419 se marcó con ^{35}S-metionina y cisteína, y el anticuerpo intracelular y secretado se extrajo mediante inmunoprecipitación con anticuerpos adecuados. Después de la electroforesis sobre geles reductores de SDS-PAGE, los geles se secaron y la señal se detectó mediante autorradiografía.

A partir de estos resultados era evidente que se sintetizan de manera eficaz tanto las cadenas pesadas como las ligeras. A nivel intracelular no es necesario que haya estequiometría entre las cadenas pesadas y ligeras porque las dos se asocian cuando pasan a través de los orgánulos secretores. Sin embargo, se observa una estequiometría estricta en el material secretado.

Claims (7)

1. Un procedimiento para la producción de una composición farmacéutica que comprende un anticuerpo capaz de activar el complemento in vitro, anticuerpo que es eficaz en la terapia de seres humanos, procedimiento que comprende las etapas de:

(a)

el cultivo mediante suspensión de una célula OHC recombinante en un medio sin suero la cual secreta en el medio un anticuerpo glucosilado que comprende una cadena ligera y pesada;

(b)

la recuperación de dicha inmunoglobulina de la etapa (a);

(c)

la incorporación de dicha inmunoglobulina de la etapa (b) a dicha composición.

2. El procedimiento de la reivindicación 1 en el que el anticuerpo se selecciona entre el grupo formado por: humano, quimérico o injertado con RDC.

3. El procedimiento de la reivindicación 1 ó 2 en el que dicha célula es cotransfectada con un primer vector de expresión. vector que codifica dicha cadena pesada, y un segundo vector que codifica dicha cadena ligera.

4. El procedimiento de las reivindicaciones 1 a 3 en el que el pH de los medios sin suero es de 7-7,2.

5. El procedimiento de las reivindicaciones 1 a 4 en el que el medio es suplementado con insulina recombinante.

6. El procedimiento de las reivindicaciones 1 a 5 en el que el medio es suplementado con Pluronic F-68.

7. El procedimiento de cualquiera de las reivindicaciones precedentes en el que los medios están en un cultivo giratorio.