JPH0690787A - エプスタイン−バールウイルスに関連するペプチド及び核酸配列 - Google Patents
エプスタイン−バールウイルスに関連するペプチド及び核酸配列Info
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Abstract
(57)【要約】 （修正有）
【目的】 ＥＢＶ抗体または抗−ＥＢＶ抗体を検出する
ための免疫試薬及び方法、並びにエプスタイン−バール
ウイルス核酸の増幅及び検出方法の提供。 【構成】 エプスタイン−バーウイルス（ＥＢＶ）に対
する抗体と免疫化学的に反応性のペプチドであって、Ｅ
ＢＶ読取枠ＢＦＲＦ３及びＢｄＲＦ１の内部に夫々コー
ドされたＶＣＡ−ｐ１８またはＶＣＡ−ｐ４０タンパク
質の少なくとも一部を含むペプチドまたはその機能性変
種、これらのペプチドをコードする核酸配列、これらの
ペプチドに対するモノクローナル抗体、モノクローナル
抗体及び抗イディオタイプ抗体を産生し得る細胞系、該
核酸配列を含む組換えベクター分子、これらのベクター
分子によって形質転換もしくはトランスフェクトされた
宿主細胞。
ための免疫試薬及び方法、並びにエプスタイン−バール
ウイルス核酸の増幅及び検出方法の提供。 【構成】 エプスタイン−バーウイルス（ＥＢＶ）に対
する抗体と免疫化学的に反応性のペプチドであって、Ｅ
ＢＶ読取枠ＢＦＲＦ３及びＢｄＲＦ１の内部に夫々コー
ドされたＶＣＡ−ｐ１８またはＶＣＡ−ｐ４０タンパク
質の少なくとも一部を含むペプチドまたはその機能性変
種、これらのペプチドをコードする核酸配列、これらの
ペプチドに対するモノクローナル抗体、モノクローナル
抗体及び抗イディオタイプ抗体を産生し得る細胞系、該
核酸配列を含む組換えベクター分子、これらのベクター
分子によって形質転換もしくはトランスフェクトされた
宿主細胞。
Description
【０００１】
【産業上の利用分野】本発明は、抗エプスタイン−バー
ルウイルス（ＥＢＶ）抗体に対して免疫化学的に反応性
のペプチド、これらのペプチドをコードする核酸配列、
これらのペプチドに対するモノクローナル抗体、モノク
ローナル抗体を産生することが可能な細胞系及び抗イデ
ィオタイプ抗体に係る。本発明は更に、本発明の核酸配
列を含む組換ベクター分子及びこれらのベクター分子で
形質転換又はトランスフェクトされた宿主細胞に係る。
本発明は更に、ＥＢＶ又は抗ＥＢＶ抗体を検出するため
の免疫学的試薬及び方法、並びにエプスタイン−バール
ウイルス核酸の増幅及び検出方法にも係る。
ルウイルス（ＥＢＶ）抗体に対して免疫化学的に反応性
のペプチド、これらのペプチドをコードする核酸配列、
これらのペプチドに対するモノクローナル抗体、モノク
ローナル抗体を産生することが可能な細胞系及び抗イデ
ィオタイプ抗体に係る。本発明は更に、本発明の核酸配
列を含む組換ベクター分子及びこれらのベクター分子で
形質転換又はトランスフェクトされた宿主細胞に係る。
本発明は更に、ＥＢＶ又は抗ＥＢＶ抗体を検出するため
の免疫学的試薬及び方法、並びにエプスタイン−バール
ウイルス核酸の増幅及び検出方法にも係る。
【０００２】
【従来の技術及び発明が解決しようとする課題】ＥＢＶ
は、アフリカ（地方病性即ちｅ）形のバーキットリンパ
腫（ＢＬ）に関して最初に発見された偏在性ヒトヘルペ
スウイルスである。その後、該ウイルスは上咽頭癌（Ｎ
ＰＣ）に関連することも発見され、感染性単核症（Ｉ
Ｍ）の原因物質であることが示された。感染は通常、幼
時期に行われ、一般には無症状であるが、軽度の症状を
伴う場合もある。しかしながら、青年期又は成人期に感
染すると、末梢における異型リンパ球の存在により特徴
付けられるＩＭを生じる恐れがある。これらのリンパ球
の大半はＴリンパ球であるが、ＥＢＶに感染した少数の
Ｂリンパ球も含まれる。Ｂリンパ球の感染は、ｉｎ ｖ
ｉｔｒｏでも行われ得る。このような細胞は形質転換さ
れて培養により無限に増殖し、「不滅化」、「潜伏感
染」又は「増殖形質転換」細胞などと呼称されている。
従来知られている限りでは、ＥＢＶに感染した全個体は
一生潜伏感染したままである。これは、循環末梢血液リ
ンパ球中に少数のＥＢＶ−ゲノム陽性形質転換Ｂ細胞が
一生持続的に存在することと、ウイルスが中咽頭に連続
的且つ周期的に放出されることにより立証された。
は、アフリカ（地方病性即ちｅ）形のバーキットリンパ
腫（ＢＬ）に関して最初に発見された偏在性ヒトヘルペ
スウイルスである。その後、該ウイルスは上咽頭癌（Ｎ
ＰＣ）に関連することも発見され、感染性単核症（Ｉ
Ｍ）の原因物質であることが示された。感染は通常、幼
時期に行われ、一般には無症状であるが、軽度の症状を
伴う場合もある。しかしながら、青年期又は成人期に感
染すると、末梢における異型リンパ球の存在により特徴
付けられるＩＭを生じる恐れがある。これらのリンパ球
の大半はＴリンパ球であるが、ＥＢＶに感染した少数の
Ｂリンパ球も含まれる。Ｂリンパ球の感染は、ｉｎ ｖ
ｉｔｒｏでも行われ得る。このような細胞は形質転換さ
れて培養により無限に増殖し、「不滅化」、「潜伏感
染」又は「増殖形質転換」細胞などと呼称されている。
従来知られている限りでは、ＥＢＶに感染した全個体は
一生潜伏感染したままである。これは、循環末梢血液リ
ンパ球中に少数のＥＢＶ−ゲノム陽性形質転換Ｂ細胞が
一生持続的に存在することと、ウイルスが中咽頭に連続
的且つ周期的に放出されることにより立証された。
【０００３】大部分の症例ではＥＢＶ感染の結果、一時
的に衰弱性であり得るが、常に良性且つ自己限定性なリ
ンパ増殖性疾患を生じる。しかしながら、免疫抑制され
た個体では結果が完全に悪性になる場合もある。故意に
免疫抑制した個体、特にシクロスポリンＡで治療した臓
器移植幼児、このごろではＨＩＶ感染個体の場合、又は
昔からみられるような遺伝的にＸＬＰ（ｘ連関増殖症候
群）遺伝子を有する疾患男子の場合のような個体がこれ
に該当する。これらの場合、悪性結果はＥＢＶ感染Ｂ細
胞のポリクローナル増殖に起因する。更に、このような
患者では口腔白斑症の病変部にウイルスの無制御な上皮
複製を検出することができる。従って、免疫応答はＥＢ
Ｖ感染の制御に中枢的な役割を果たす。
的に衰弱性であり得るが、常に良性且つ自己限定性なリ
ンパ増殖性疾患を生じる。しかしながら、免疫抑制され
た個体では結果が完全に悪性になる場合もある。故意に
免疫抑制した個体、特にシクロスポリンＡで治療した臓
器移植幼児、このごろではＨＩＶ感染個体の場合、又は
昔からみられるような遺伝的にＸＬＰ（ｘ連関増殖症候
群）遺伝子を有する疾患男子の場合のような個体がこれ
に該当する。これらの場合、悪性結果はＥＢＶ感染Ｂ細
胞のポリクローナル増殖に起因する。更に、このような
患者では口腔白斑症の病変部にウイルスの無制御な上皮
複製を検出することができる。従って、免疫応答はＥＢ
Ｖ感染の制御に中枢的な役割を果たす。
【０００４】上述のように、ＥＢＶはヘルペスウイルス
の１員である。ＥＢＶは以下の構造特性を有する。
の１員である。ＥＢＶは以下の構造特性を有する。
【０００５】−ＥＢＶゲノムは直鎖状二重鎖ＤＮＡ分子
（１７３０００塩基対）から構成される。
（１７３０００塩基対）から構成される。
【０００６】−ビリオンは２０面体キャプシドに包囲さ
れたコア（タンパク質及びＤＮＡ）とキャプシドを包囲
する膜エンベロープとから構成される。２０面体キャプ
シドは６量体又は５量体キャプソメアから構成される。
膜エンベロープは外側表面にスパイクを有するタンパク
質／脂質２重膜から構成される。キャプシドシェルとエ
ンベロープとの間のスペースは、テグメントと呼称され
るアモルファスタンパク質で充填されている。
れたコア（タンパク質及びＤＮＡ）とキャプシドを包囲
する膜エンベロープとから構成される。２０面体キャプ
シドは６量体又は５量体キャプソメアから構成される。
膜エンベロープは外側表面にスパイクを有するタンパク
質／脂質２重膜から構成される。キャプシドシェルとエ
ンベロープとの間のスペースは、テグメントと呼称され
るアモルファスタンパク質で充填されている。
【０００７】−全ヘルペスウイルスと同様に、ＥＢＶは
一次感染後に宿主中で一生潜伏感染を生じ得る。この潜
伏は、ＥＢＶとそのヒト宿主との間で宿主免疫系により
制御される完全な平衡を意味する。
一次感染後に宿主中で一生潜伏感染を生じ得る。この潜
伏は、ＥＢＶとそのヒト宿主との間で宿主免疫系により
制御される完全な平衡を意味する。
【０００８】従来、ほとんどの生化学的及び生物学的研
究は３種のＥＢＶ原型株、即ちＢ９５−８（マーモセッ
ト細胞系で産生された形質転換ウイルス）、Ｐ３ＨＲ１
（バーキットリンパ腫細胞系により産生された非形質転
換ウイルス）及びＲａｊｉ（バーキットリンパ腫細胞系
における潜伏ウイルス）で実施されている。
究は３種のＥＢＶ原型株、即ちＢ９５−８（マーモセッ
ト細胞系で産生された形質転換ウイルス）、Ｐ３ＨＲ１
（バーキットリンパ腫細胞系により産生された非形質転
換ウイルス）及びＲａｊｉ（バーキットリンパ腫細胞系
における潜伏ウイルス）で実施されている。
【０００９】ここ数年間に原型ウイルス株Ｂ９５−８の
完全ＤＮＡ配列が決定された。この配列の解析の結果、
８０以上のオープンリーディングフレームが同定された
（Ｂａｅｒら， １９８４， Ｎａｔｕｒｅ ３１０，
ｐ．２０７−２１１）。
完全ＤＮＡ配列が決定された。この配列の解析の結果、
８０以上のオープンリーディングフレームが同定された
（Ｂａｅｒら， １９８４， Ｎａｔｕｒｅ ３１０，
ｐ．２０７−２１１）。
【００１０】ＥＢＶはその生物学的特性（潜伏感染）が
従来のウイルス解析に適していないため、生物学的研究
に特に問題がある。更に、細胞及び宿主範囲は一般にｉ
ｎｖｉｔｒｏで培養することができないヒト（及び少数
の高等霊長類）Ｂリンパ球及び上皮細胞に事実上制限さ
れる。更に、ウイルスが溶菌複製する完全に許容可能な
細胞型が存在しないため、大量のウイルスの製造能力は
非常に制限されている。
従来のウイルス解析に適していないため、生物学的研究
に特に問題がある。更に、細胞及び宿主範囲は一般にｉ
ｎｖｉｔｒｏで培養することができないヒト（及び少数
の高等霊長類）Ｂリンパ球及び上皮細胞に事実上制限さ
れる。更に、ウイルスが溶菌複製する完全に許容可能な
細胞型が存在しないため、大量のウイルスの製造能力は
非常に制限されている。
【００１１】Ｂ９５−８，Ｐ３ＨＲ１及びＲａｊｉ単離
株のＤＮＡ分子は従来、詳細な制限エンドヌクレアーゼ
マッピング、大腸菌プラスミド及びバクテリオファージ
λへのクローニング、並びにヌクレオチド配列決定のた
めの原型であった。
株のＤＮＡ分子は従来、詳細な制限エンドヌクレアーゼ
マッピング、大腸菌プラスミド及びバクテリオファージ
λへのクローニング、並びにヌクレオチド配列決定のた
めの原型であった。
【００１２】ＥＢＶ−ゲノムは、ユニークなタンデムに
反復するＤＮＡ成分から構成される単一の二重鎖ＤＮＡ
分子から構成される。ＤＮＡ分子の各末端は、ゲノムの
共有結合及び循環を可能にする多重末端配列を含む。ウ
イルス粒子内では、ＥＢＶゲノムは直鎖形でしか検出す
ることができない。他方、潜伏感染細胞の核の内側では
円形エピソームとして存在する。
反復するＤＮＡ成分から構成される単一の二重鎖ＤＮＡ
分子から構成される。ＤＮＡ分子の各末端は、ゲノムの
共有結合及び循環を可能にする多重末端配列を含む。ウ
イルス粒子内では、ＥＢＶゲノムは直鎖形でしか検出す
ることができない。他方、潜伏感染細胞の核の内側では
円形エピソームとして存在する。
【００１３】内部反復配列ＩＲ１〜ＩＲ４は、ＥＢＶゲ
ノムを５つのユニーク領域に分離する。Ｕ２及びＵ３領
域はＥＢＶ単離株によって著しく異なり、Ｕ２はＥＢＶ
のＰ３ＨＲ−１株ではほぼ完全に欠失されている。
ノムを５つのユニーク領域に分離する。Ｕ２及びＵ３領
域はＥＢＶ単離株によって著しく異なり、Ｕ２はＥＢＶ
のＰ３ＨＲ−１株ではほぼ完全に欠失されている。
【００１４】ＥＢＶリーディングフレームの名称はウイ
ルスゲノムにおけるその位置に基づく。名称は、発現が
開始されるＢａｍＨ１又はＥｃｏＲ１制限フラグメント
の頭文字で始まる。名称の３番目の文字は、発現が標準
地図上で左向きであるか右向きであるかに依存してＬ又
はＲである（例えば、ＢＬＬＦ２はＢａｍＨ１制限フラ
グメントＬで開始する第２番目の左向きのリーディング
フレームである）。
ルスゲノムにおけるその位置に基づく。名称は、発現が
開始されるＢａｍＨ１又はＥｃｏＲ１制限フラグメント
の頭文字で始まる。名称の３番目の文字は、発現が標準
地図上で左向きであるか右向きであるかに依存してＬ又
はＲである（例えば、ＢＬＬＦ２はＢａｍＨ１制限フラ
グメントＬで開始する第２番目の左向きのリーディング
フレームである）。
【００１５】ＥＢＶの産生サイクルにおけるウイルス抗
原の血清学的分類は、種々の蛍光法により行われる。
原の血清学的分類は、種々の蛍光法により行われる。
【００１６】固定した潜伏感染Ｂ細胞（例えばＲａｊｉ
細胞）の核中で抗補体免疫蛍光法により特異的に検出さ
れた抗原は、エプスタイン−バール核抗原（ＥＢＮＡ）
として分類される。
細胞）の核中で抗補体免疫蛍光法により特異的に検出さ
れた抗原は、エプスタイン−バール核抗原（ＥＢＮＡ）
として分類される。
【００１７】化学的因子又はウイルス因子によるウイル
ス遺伝子発現の活性化後、ウイルスＤＮＡ合成の阻害に
より合成が阻止されるような初期抗原（ＥＡ）の類が検
出される。使用される固定液の型（メタノール又はアセ
トン）に応じて２種の異なるＥＡ組即ちＥＡR及びＥＡD
が検出可能である。ＥＡは誘導細胞の細胞質及び核中で
間接免疫蛍光法により検出可能である。ウイルスＤＮＡ
合成の開始後（この合成に依存して）、ウイルス産生細
胞（例えばＰ3ＨＲ1細胞）の細胞質及び核中で間接免疫
蛍光法により検出可能なウイルス構造タンパク質（ＶＣ
Ａ）が合成される。ウイルス産生のために誘導された生
存可能な感染細胞の表面には、１組の抗原（ＭＡ）が間
接的免疫蛍光法により検出可能である。これらの抗原は
ウイルスエンベロープ上にも検出することができ、ウイ
ルス中和のための重要なターゲットである。ヒト血清中
におけるＥＢＶ特異抗原の検出は、Ｍｅｎｋｅ及びＨｅ
ｎｌｅ（Ｈｕｍａｎ Ｐａｔｈｏｌｏｇｙ， ５， ５
５１−５６５， １９７４）により記載されているよう
な血清学的方法により定型的に実施することができる。
ス遺伝子発現の活性化後、ウイルスＤＮＡ合成の阻害に
より合成が阻止されるような初期抗原（ＥＡ）の類が検
出される。使用される固定液の型（メタノール又はアセ
トン）に応じて２種の異なるＥＡ組即ちＥＡR及びＥＡD
が検出可能である。ＥＡは誘導細胞の細胞質及び核中で
間接免疫蛍光法により検出可能である。ウイルスＤＮＡ
合成の開始後（この合成に依存して）、ウイルス産生細
胞（例えばＰ3ＨＲ1細胞）の細胞質及び核中で間接免疫
蛍光法により検出可能なウイルス構造タンパク質（ＶＣ
Ａ）が合成される。ウイルス産生のために誘導された生
存可能な感染細胞の表面には、１組の抗原（ＭＡ）が間
接的免疫蛍光法により検出可能である。これらの抗原は
ウイルスエンベロープ上にも検出することができ、ウイ
ルス中和のための重要なターゲットである。ヒト血清中
におけるＥＢＶ特異抗原の検出は、Ｍｅｎｋｅ及びＨｅ
ｎｌｅ（Ｈｕｍａｎ Ｐａｔｈｏｌｏｇｙ， ５， ５
５１−５６５， １９７４）により記載されているよう
な血清学的方法により定型的に実施することができる。
【００１８】生化学及び免疫蛍光データに基づき、５種
の異なる抗原分子の型を区別することができる。種々の
ウイルスポリペプチドはその分子量により命名され、ウ
イルスエンベロープタンパク質以外は共通名称がついて
いない。５種の異なる抗原グループは以下の通りであ
る。
の異なる抗原分子の型を区別することができる。種々の
ウイルスポリペプチドはその分子量により命名され、ウ
イルスエンベロープタンパク質以外は共通名称がついて
いない。５種の異なる抗原グループは以下の通りであ
る。
【００１９】Ａ．潜伏状態中に発現される抗原グループ
（ＥＢＮＡ及びＬＭＰ）。
（ＥＢＮＡ及びＬＭＰ）。
【００２０】Ｂ．ゲノム活性化及びウイルス増殖の初期
誘導に関与する抗原グループ（ＩＥＡ）。
誘導に関与する抗原グループ（ＩＥＡ）。
【００２１】Ｃ．ＩＥＡ遺伝子産物により誘導され、ウ
イルスＤＮＡの複製に必要な抗原グループ。これらの抗
原は大部分がウイルス酵素である（ＥＡ）。
イルスＤＮＡの複製に必要な抗原グループ。これらの抗
原は大部分がウイルス酵素である（ＥＡ）。
【００２２】Ｄ．ウイルス粒子の構造成分であり、ウイ
ルスＤＮＡ合成の開始後にウイルス増殖サイクルで後期
に発現される抗原グループ（ＶＣＡ）。
ルスＤＮＡ合成の開始後にウイルス増殖サイクルで後期
に発現される抗原グループ（ＶＣＡ）。
【００２３】Ｅ．感染細胞の細胞膜中で発現される抗原
グループ（ＭＡ）。
グループ（ＭＡ）。
【００２４】ＥＢＶのウイルスキャプシド抗原（ＶＣ
Ａ）。
Ａ）。
【００２５】この抗原複合体については、使用されるポ
リアクリルアミドゲル系、細胞系及び化学的インデュー
サ並びに使用される血清が異なるため、種々の研究で同
定されたＥＢＶ特異的タンパク質を比較するのは困難で
あるという問題もある。
リアクリルアミドゲル系、細胞系及び化学的インデュー
サ並びに使用される血清が異なるため、種々の研究で同
定されたＥＢＶ特異的タンパク質を比較するのは困難で
あるという問題もある。
【００２６】Ｄｏｌｙｎｉｕｋら（１９７９）は、精製
ビリオンに関連する合計３３個のタンパク質について記
載している。洗浄剤による示差可溶化によると、ヌクレ
オキャプシドは少なくとも７個のタンパク質から構成さ
れると考えられる。ＶＣＡ複合体の主要成分は主要キャ
プシドタンパク質（ＭＣＰ）である。ＥＢＶ−ＭＣＰは
ウイルスゲノムのＢｃＬＦ１リーディングフレームの内
側でコードされ（Ｂｅａｒら， １９８４）、７．５〜
９．０のｐＩを有するＥＢＶ産生細胞系で１５３〜１６
０ｋＤａ非グリコシル化タンパク質として発現される。
このタンパク質は細胞質中で可溶形態で合成された後、
核に輸送され、キャプシドに封入され、もはや洗浄剤に
より可溶化されない。別の主要ＶＣＡ成分は１２５ｋＤ
ａの分子量を有しており、グリコシル化されている。こ
のタンパク質はウイルスゲノムのＢＡＬＦ４リーディン
グフレームの内側でコードされる。この糖タンパク質は
最初はＶＣＡ成分として分類されたが、最近の知見によ
ると、実際には細胞質及び核膜構造に関連するものと思
われる。
ビリオンに関連する合計３３個のタンパク質について記
載している。洗浄剤による示差可溶化によると、ヌクレ
オキャプシドは少なくとも７個のタンパク質から構成さ
れると考えられる。ＶＣＡ複合体の主要成分は主要キャ
プシドタンパク質（ＭＣＰ）である。ＥＢＶ−ＭＣＰは
ウイルスゲノムのＢｃＬＦ１リーディングフレームの内
側でコードされ（Ｂｅａｒら， １９８４）、７．５〜
９．０のｐＩを有するＥＢＶ産生細胞系で１５３〜１６
０ｋＤａ非グリコシル化タンパク質として発現される。
このタンパク質は細胞質中で可溶形態で合成された後、
核に輸送され、キャプシドに封入され、もはや洗浄剤に
より可溶化されない。別の主要ＶＣＡ成分は１２５ｋＤ
ａの分子量を有しており、グリコシル化されている。こ
のタンパク質はウイルスゲノムのＢＡＬＦ４リーディン
グフレームの内側でコードされる。この糖タンパク質は
最初はＶＣＡ成分として分類されたが、最近の知見によ
ると、実際には細胞質及び核膜構造に関連するものと思
われる。
【００２７】従来記載されている実験（Ｊ．Ｍ．Ｍｉｄ
ｄｅｌｄｏｒｐ及びＰ．Ｈｅｒｂｒｉｎｋ， Ｊ．Ｖｉ
ｒｏｌ．Ｍｅｔｈ．， ２１， １３３−１４６， １
９８８）は、種々のＥＢＶ疾患に関して診断上関連する
ＥＢＶマーカータンパク質の同定及び特徴付けを目的と
している。
ｄｅｌｄｏｒｐ及びＰ．Ｈｅｒｂｒｉｎｋ， Ｊ．Ｖｉ
ｒｏｌ．Ｍｅｔｈ．， ２１， １３３−１４６， １
９８８）は、種々のＥＢＶ疾患に関して診断上関連する
ＥＢＶマーカータンパク質の同定及び特徴付けを目的と
している。
【００２８】これは、ＶＣＡ／ＥＡ又はＥＡの発現のた
めに誘導されたウイルス産生細胞系ＨＨ５１４−Ｃ１６
（Ｐ３ＨＲ１の超誘導体）、並びにＥＢＶ陰性細胞系Ｒ
ａｍｏｓ及びＢｊａｂから調製された抗原を含むイムノ
ブロットストリップを使用することにより実施された。
（完全な）潜伏状態でＥＢＶゲノムを担持する細胞系即
ちＸ５０−７及びＪＣ−５を使用して詳しくＥＢＮＡ／
ＬＭＰを研究することができる。
めに誘導されたウイルス産生細胞系ＨＨ５１４−Ｃ１６
（Ｐ３ＨＲ１の超誘導体）、並びにＥＢＶ陰性細胞系Ｒ
ａｍｏｓ及びＢｊａｂから調製された抗原を含むイムノ
ブロットストリップを使用することにより実施された。
（完全な）潜伏状態でＥＢＶゲノムを担持する細胞系即
ちＸ５０−７及びＪＣ−５を使用して詳しくＥＢＮＡ／
ＬＭＰを研究することができる。
【００２９】健康な血清陽性供血者の血清と、ＩＭ患者
及び慢性ＩＭ患者又は上咽頭癌のようなＥＢＶ関連腫瘍
患者の血清とでＥＢＶ抗体応答のパターンが研究され
た。定義されたＥＢＶゲノム産物に対して反応性のポリ
クローナル及びモノクローナル抗体を使用し、この実験
系で検出されたタンパク質バンドのいくつかを特徴付け
ることができる。しかしながら、これらの研究は所定の
分子量を有するポリペプチドのタンパク質についてしか
記載していない。これらのタンパクのＥＢＶゲノム上の
コーディング配列については何ら記載されていない。イ
ムノブロット上の免疫反応バンドが同一分子量の単一タ
ンパク質との反応によるのか又は複数タンパクとの反応
によるのかについては不明である。
及び慢性ＩＭ患者又は上咽頭癌のようなＥＢＶ関連腫瘍
患者の血清とでＥＢＶ抗体応答のパターンが研究され
た。定義されたＥＢＶゲノム産物に対して反応性のポリ
クローナル及びモノクローナル抗体を使用し、この実験
系で検出されたタンパク質バンドのいくつかを特徴付け
ることができる。しかしながら、これらの研究は所定の
分子量を有するポリペプチドのタンパク質についてしか
記載していない。これらのタンパクのＥＢＶゲノム上の
コーディング配列については何ら記載されていない。イ
ムノブロット上の免疫反応バンドが同一分子量の単一タ
ンパク質との反応によるのか又は複数タンパクとの反応
によるのかについては不明である。
【００３０】イムノブロット法を使用すると、１８ｋＤ
ａの分子量を有するＥＢＶ抗原を検出することが可能で
ある。このタンパク質はウイルスＤＮＡ合成を阻止する
ためにホスホノ酢酸（ＰＡＡ）を使用する場合には発現
されず、抗ＶＣＡ抗体を含む全血清により検出されるこ
とから、ＶＣＡ関連成分であると考えられる。別のＶＣ
Ａ成分は４０ｋＤａの分子量を有するタンパク質であ
る。ウイルスキャプシド抗原の多くは核ペレットに関連
している。
ａの分子量を有するＥＢＶ抗原を検出することが可能で
ある。このタンパク質はウイルスＤＮＡ合成を阻止する
ためにホスホノ酢酸（ＰＡＡ）を使用する場合には発現
されず、抗ＶＣＡ抗体を含む全血清により検出されるこ
とから、ＶＣＡ関連成分であると考えられる。別のＶＣ
Ａ成分は４０ｋＤａの分子量を有するタンパク質であ
る。ウイルスキャプシド抗原の多くは核ペレットに関連
している。
【００３１】現在、ＥＢＶ特異的血清診断は、かなり主
観的な免疫蛍光試験により行われている。標準ウイルス
産生細胞系を使用してウイルス抗原を大量生産及び精製
することはできないので、より簡単で均質な診断法（例
えばＥＬＩＳＡ）への発展は妨げられている。これを実
現するための唯一の手段は、代替的に製造されたＥＢＶ
抗原を使用することであると思われる。これらのＥＢＶ
抗原は遺伝子工学法又は合成ペプチド法により製造する
ことができる。
観的な免疫蛍光試験により行われている。標準ウイルス
産生細胞系を使用してウイルス抗原を大量生産及び精製
することはできないので、より簡単で均質な診断法（例
えばＥＬＩＳＡ）への発展は妨げられている。これを実
現するための唯一の手段は、代替的に製造されたＥＢＶ
抗原を使用することであると思われる。これらのＥＢＶ
抗原は遺伝子工学法又は合成ペプチド法により製造する
ことができる。
【００３２】ＥＢＶ感染の種々の段階で確実な診断を実
施できるように特異的且つ高感度の方法を開発するため
には、免疫優性ウイルスタンパク質及びそのエピトープ
を同定することが極めて重要である。
施できるように特異的且つ高感度の方法を開発するため
には、免疫優性ウイルスタンパク質及びそのエピトープ
を同定することが極めて重要である。
【００３３】
【課題を解決するための手段】本発明は、夫々エプスタ
イン−バールウイルス（ＥＢＶ）オープンリーディング
フレームＢＦＲＦ３及びＢｄＲＦ１の内側でコードされ
たＶＣＡ−ｐ１８又はＶＣＡ−ｐ４０タンパク質の少な
くとも一部を含み、抗エプスタイン−バールウイルス抗
体に対して免疫化学的に反応性のペプチド又はそのフラ
グメントを提供する。従って、夫々１７６及び３４５個
のアミノ酸、並びにＥＢＶ抗体に対して免疫化学的に反
応性である配列番号２及び４に示すアミノ酸配列を有す
るペプチドが本発明に含まれる。
イン−バールウイルス（ＥＢＶ）オープンリーディング
フレームＢＦＲＦ３及びＢｄＲＦ１の内側でコードされ
たＶＣＡ−ｐ１８又はＶＣＡ−ｐ４０タンパク質の少な
くとも一部を含み、抗エプスタイン−バールウイルス抗
体に対して免疫化学的に反応性のペプチド又はそのフラ
グメントを提供する。従って、夫々１７６及び３４５個
のアミノ酸、並びにＥＢＶ抗体に対して免疫化学的に反
応性である配列番号２及び４に示すアミノ酸配列を有す
るペプチドが本発明に含まれる。
【００３４】本発明のペプチドは、試料中のＥＢＶ又は
ＥＢＶ抗体の存在を決定するための診断方法で使用する
のに特に適しているも判明した。更に、本発明のペプチ
ドのうちには、ＥＢＶ関連疾患の治療に適切な製薬形態
で使用できるものもある。こうして得られ、ペプチド又
はそのフラグメントを有効成分として含有するワクチン
の製造は当業者に公知である。
ＥＢＶ抗体の存在を決定するための診断方法で使用する
のに特に適しているも判明した。更に、本発明のペプチ
ドのうちには、ＥＢＶ関連疾患の治療に適切な製薬形態
で使用できるものもある。こうして得られ、ペプチド又
はそのフラグメントを有効成分として含有するワクチン
の製造は当業者に公知である。
【００３５】天然ＥＢＶとは対照的に、本発明のペプチ
ドは安全な非感染起源であるという大きな利点を有す
る。
ドは安全な非感染起源であるという大きな利点を有す
る。
【００３６】本発明は更に、抗エプスタイン−バールウ
イルス抗体に対して同様に免疫化学的に反応性である該
ペプチドのフラグメントも包含する。
イルス抗体に対して同様に免疫化学的に反応性である該
ペプチドのフラグメントも包含する。
【００３７】本明細書で使用される「ペプチド」なる用
語は、生物学的活性を有するアミノ酸の分子鎖を意味
し、産物の特定長を表すものではない。従って、特にタ
ンパク質、融合タンパク質又は融合ペプチド、オリゴペ
プチド及びポリペプチドが含まれる。必要に応じて本発
明のペプチドは、例えばグリコシル化、アミド化、カル
ボキシル化又はリン酸化によりｉｎ ｖｉｖｏ又はｉｎ
ｖｉｔｒｏで修飾することができる。従って、本発明
のペプチドの機能的変異体、例えば酸付加塩、アミド、
エステル（特にＣ末端エステル）及びＮ−アシル誘導体
も本発明の一部とみなされる。本発明に含まれる個々の
タンパク質又はポリペプチドには天然（通常の）変異が
存在するものと理解されよう。これらの変異は、例えば
配列全体のアミノ酸変異又は該配列におけるアミノ酸の
欠失、置換、挿入、逆位もしくは付加により表される。
生物学的及び免疫学的活性を本質的に変えないことが期
待できるようなアミノ酸置換については既に報告されて
いる。関連アミノ酸間のアミノ酸置換、又はしばしば進
化中に生じた置換としては、特にＳｅｒ／Ａｌａ、Ｓｅ
ｒ／Ｇｌｙ、Ａｓｐ／Ｇｌｙ、Ａｓｐ／Ａｓｎ、Ｉｌｅ
／Ｖａｌが挙げられる（Ｄａｙｈｏｆ，Ｍ．Ｄ， Ａｔ
ｌａｓ ｏｆ ｐｒｏｔｅｉｎ ｓｅｑｕｅｎｃｅ ａ
ｎｄ ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ， Ｎａｔ．Ｂｉｏｍｅｄ．
Ｒｅｓ．Ｆｏｕｎｄ．， Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ Ｄ．
Ｃ．， １９７８， ｖｏｌ．５， ｓｕｐｐｌ．３参
照）。この情報に基づき、Ｌｉｐｍａｎ及びＰｅａｒｓ
ｏｎは迅速且つ高感度でタンパク質を比較し（Ｓｃｉｅ
ｎｃｅ ２２７， １４３５−１４４１， １９８
５）、相同タンパク質間の機能的類似性を決定するため
の方法を開発した。
語は、生物学的活性を有するアミノ酸の分子鎖を意味
し、産物の特定長を表すものではない。従って、特にタ
ンパク質、融合タンパク質又は融合ペプチド、オリゴペ
プチド及びポリペプチドが含まれる。必要に応じて本発
明のペプチドは、例えばグリコシル化、アミド化、カル
ボキシル化又はリン酸化によりｉｎ ｖｉｖｏ又はｉｎ
ｖｉｔｒｏで修飾することができる。従って、本発明
のペプチドの機能的変異体、例えば酸付加塩、アミド、
エステル（特にＣ末端エステル）及びＮ−アシル誘導体
も本発明の一部とみなされる。本発明に含まれる個々の
タンパク質又はポリペプチドには天然（通常の）変異が
存在するものと理解されよう。これらの変異は、例えば
配列全体のアミノ酸変異又は該配列におけるアミノ酸の
欠失、置換、挿入、逆位もしくは付加により表される。
生物学的及び免疫学的活性を本質的に変えないことが期
待できるようなアミノ酸置換については既に報告されて
いる。関連アミノ酸間のアミノ酸置換、又はしばしば進
化中に生じた置換としては、特にＳｅｒ／Ａｌａ、Ｓｅ
ｒ／Ｇｌｙ、Ａｓｐ／Ｇｌｙ、Ａｓｐ／Ａｓｎ、Ｉｌｅ
／Ｖａｌが挙げられる（Ｄａｙｈｏｆ，Ｍ．Ｄ， Ａｔ
ｌａｓ ｏｆ ｐｒｏｔｅｉｎ ｓｅｑｕｅｎｃｅ ａ
ｎｄ ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ， Ｎａｔ．Ｂｉｏｍｅｄ．
Ｒｅｓ．Ｆｏｕｎｄ．， Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ Ｄ．
Ｃ．， １９７８， ｖｏｌ．５， ｓｕｐｐｌ．３参
照）。この情報に基づき、Ｌｉｐｍａｎ及びＰｅａｒｓ
ｏｎは迅速且つ高感度でタンパク質を比較し（Ｓｃｉｅ
ｎｃｅ ２２７， １４３５−１４４１， １９８
５）、相同タンパク質間の機能的類似性を決定するため
の方法を開発した。
【００３８】本明細書で使用される「フラグメント」な
る用語は、本発明のペプチドのサブ配列を含むアミノ酸
配列を意味する。該フラグメントは、ＶＣＡ−ｐ１８又
はＶＣＡ−ｐ４０タンパク質の１種以上の抗原決定基を
有するペプチドである。フラグメントは特に、ＤＮＡの
場合には制限エンドヌクレアーゼを使用し、ポリペプチ
ドの場合にはプロテアーゼを使用して前駆物質分子の酵
素切断により製造することができる。他の方法として
は、フラグメントの化学的合成及びＤＮＡフラグメント
によるペプチドフラグメントの発現などがある。
る用語は、本発明のペプチドのサブ配列を含むアミノ酸
配列を意味する。該フラグメントは、ＶＣＡ−ｐ１８又
はＶＣＡ−ｐ４０タンパク質の１種以上の抗原決定基を
有するペプチドである。フラグメントは特に、ＤＮＡの
場合には制限エンドヌクレアーゼを使用し、ポリペプチ
ドの場合にはプロテアーゼを使用して前駆物質分子の酵
素切断により製造することができる。他の方法として
は、フラグメントの化学的合成及びＤＮＡフラグメント
によるペプチドフラグメントの発現などがある。
【００３９】１つ以上のエピトープを含む本発明のペプ
チドの適当な免疫原フラグメントは、いわゆるペプスキ
ャン（ｐｅｐｓｃｓａｎ）方法、即ち問題の完全ポリペ
プチドの部分的配列に対応する部分的に重複した一連の
ペプチドを合成し、抗体に対するこれらペプチドの反応
性を調べる方法に基づく、特許出願ＷＯ８６／０６４８
７号、Ｇｅｙｓｅｎ、Ｈ．Ｍ．ら（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ
ｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．８１，３３９８−４００２，１
９８４）、Ｇｅｙｓｅｎ，Ｈ．Ｍ．ら（Ｊ．Ｉｍｍｕｎ
ｏｌ．Ｍｅｔｈ．１０２，２５９−２７４，１９８７）
の方法によって検出できる。また、これらペプチドの多
くの領域は、理論的考察（これらの理論的考察の予測の
価値（ｐｒｅｄｉｃｔｉｖｅ ｖａｌｕｅ）は限定られ
ているが）に基づく指定されたエピトープであり得る。
これらの領域の決定は、Ｈｏｐｐ及びＷｏｏｄｓの親水
性基準（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．７
８，３８２４−３８２８，１９８１）とＣｈｏｕ及びＦ
ａｓｍａｎの二次構造アスペクト（Ａｄｖａｎｃｅｓ
ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ ４７，４５−１４８，１
９８７）との組合わせに基づく。
チドの適当な免疫原フラグメントは、いわゆるペプスキ
ャン（ｐｅｐｓｃｓａｎ）方法、即ち問題の完全ポリペ
プチドの部分的配列に対応する部分的に重複した一連の
ペプチドを合成し、抗体に対するこれらペプチドの反応
性を調べる方法に基づく、特許出願ＷＯ８６／０６４８
７号、Ｇｅｙｓｅｎ、Ｈ．Ｍ．ら（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ
ｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．８１，３３９８−４００２，１
９８４）、Ｇｅｙｓｅｎ，Ｈ．Ｍ．ら（Ｊ．Ｉｍｍｕｎ
ｏｌ．Ｍｅｔｈ．１０２，２５９−２７４，１９８７）
の方法によって検出できる。また、これらペプチドの多
くの領域は、理論的考察（これらの理論的考察の予測の
価値（ｐｒｅｄｉｃｔｉｖｅ ｖａｌｕｅ）は限定られ
ているが）に基づく指定されたエピトープであり得る。
これらの領域の決定は、Ｈｏｐｐ及びＷｏｏｄｓの親水
性基準（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．７
８，３８２４−３８２８，１９８１）とＣｈｏｕ及びＦ
ａｓｍａｎの二次構造アスペクト（Ａｄｖａｎｃｅｓ
ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ ４７，４５−１４８，１
９８７）との組合わせに基づく。
【００４０】本発明の好ましいペプチドは、ＳＥＱ Ｉ
Ｄ ＮＯ：５及びＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：６に示すような
アミノ酸配列のうちの少なくとも１つを含むペプチドで
ある。最も好ましいのは、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：６に示
すようなアミノ酸配列に連結したＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：
５に示すようなアミノ酸を含むペプチドである。このよ
うなコンビペプチド（ｃｏｍｂｉ−ｐｅｐｔｉｄｅ）
は、ＥＢＶ−ＶＣＡに対するＩｇＧ、ＩｇＡ、ＩｇＭ抗
体の特異的検出に極めて有用であり、標準的な血清学的
方法と同等かそれ以上の感度を有することが判明した。
このようなＩｇＭ−ＥＢＶが急性一次ＥＢＶ感染の有用
な診断マーカー（ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｍａｒｋｅｒ）
であるのに対し、ＥＢＶに対するＩｇＡは上咽頭癌の診
断及び予後に有用である。ＥＢＶ−ＩｇＧは総てのヒト
ＥＢＶキャリヤーでは陽性であり、該ウイルスに感染し
ていない個体では陰性である。また、特定のサブクラス
の各抗体に関する抗体力価の変化も診断上の価値（ｄｉ
ａｇｎｏｓｔｉｃ ｖａｌｕｅ）を有し得る。種々のサ
ブクラスの抗体はＥＢＶ感染の種々の段階で特異的な診
断価値を有するため、本発明のコンビペプチドを例えば
ＥＬＩＳＡのような診断テストで使用すれば極めて有利
であり得る。
Ｄ ＮＯ：５及びＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：６に示すような
アミノ酸配列のうちの少なくとも１つを含むペプチドで
ある。最も好ましいのは、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：６に示
すようなアミノ酸配列に連結したＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：
５に示すようなアミノ酸を含むペプチドである。このよ
うなコンビペプチド（ｃｏｍｂｉ−ｐｅｐｔｉｄｅ）
は、ＥＢＶ−ＶＣＡに対するＩｇＧ、ＩｇＡ、ＩｇＭ抗
体の特異的検出に極めて有用であり、標準的な血清学的
方法と同等かそれ以上の感度を有することが判明した。
このようなＩｇＭ−ＥＢＶが急性一次ＥＢＶ感染の有用
な診断マーカー（ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｍａｒｋｅｒ）
であるのに対し、ＥＢＶに対するＩｇＡは上咽頭癌の診
断及び予後に有用である。ＥＢＶ−ＩｇＧは総てのヒト
ＥＢＶキャリヤーでは陽性であり、該ウイルスに感染し
ていない個体では陰性である。また、特定のサブクラス
の各抗体に関する抗体力価の変化も診断上の価値（ｄｉ
ａｇｎｏｓｔｉｃ ｖａｌｕｅ）を有し得る。種々のサ
ブクラスの抗体はＥＢＶ感染の種々の段階で特異的な診
断価値を有するため、本発明のコンビペプチドを例えば
ＥＬＩＳＡのような診断テストで使用すれば極めて有利
であり得る。
【００４１】本発明のペプチド又はそのフラグメントの
製造は、公知の有機化学的ペプチド合成方法の１つ又は
組換えＤＮＡ技術を用いて行う。
製造は、公知の有機化学的ペプチド合成方法の１つ又は
組換えＤＮＡ技術を用いて行う。
【００４２】有機化学的ペプチド合成方法は、均質相中
での又はいわゆる固相を用いる縮合反応による必要なア
ミノ酸の結合を含むとみなされる。前記縮合反応は下記
のように実施し得る： ａ）遊離カルボキシル基と別の保護された反応基とを有
する化合物（アミノ酸、ペプチド）を、縮合剤の存在下
で、遊離アミノ基と別の保護された反応基とを含む化合
物（アミノ酸、ペプチド）と縮合させる； ｂ）活性化カルボキシル基と別の遊離もしくは保護され
た反応基とを含む化合物（アミノ酸、ペプチド）を、遊
離アミノ基と別の遊離もしくは保護された反応基とを含
む化合物（アミノ酸、ペプチド）と縮合させる。
での又はいわゆる固相を用いる縮合反応による必要なア
ミノ酸の結合を含むとみなされる。前記縮合反応は下記
のように実施し得る： ａ）遊離カルボキシル基と別の保護された反応基とを有
する化合物（アミノ酸、ペプチド）を、縮合剤の存在下
で、遊離アミノ基と別の保護された反応基とを含む化合
物（アミノ酸、ペプチド）と縮合させる； ｂ）活性化カルボキシル基と別の遊離もしくは保護され
た反応基とを含む化合物（アミノ酸、ペプチド）を、遊
離アミノ基と別の遊離もしくは保護された反応基とを含
む化合物（アミノ酸、ペプチド）と縮合させる。
【００４３】カルボキシル基の活性化は特に、カルボキ
シル基を、酸ハロゲン化物、アジ化物、無水物、イミダ
ゾリド（ｉｍｉｄａｚｏｌｉｄｅ）又は活性化エステ
ル、例えばＮ−ヒドロキシ−スクシンイミド、ｎ−ヒド
ロキシ−ベンゾトリアゾールもしくはｐ−ニトロフェニ
ルエステルに変換することによって実施し得る。
シル基を、酸ハロゲン化物、アジ化物、無水物、イミダ
ゾリド（ｉｍｉｄａｚｏｌｉｄｅ）又は活性化エステ
ル、例えばＮ−ヒドロキシ−スクシンイミド、ｎ−ヒド
ロキシ−ベンゾトリアゾールもしくはｐ−ニトロフェニ
ルエステルに変換することによって実施し得る。
【００４４】前記縮合反応の最も一般的な方法は、カル
ボジイミド法、アジド法、混合無水物法、及び活性化エ
ステルを用いる方法である。これらの方法は例えばＰｅ
ｐｔｉｄｅｓ，Ａｎａｌｙｓｉｓ，Ｓｙｎｔｈｅｓｉ
ｓ，Ｂｉｏｌｏｇｙ Ｖｏｌ．１−３（Ｇｒｏｓｓ，
Ｅ．及びＭｅｉｅｎｈｏｆｅｒ，Ｊ．編）１９７９，１
９８０，１９８１（Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，Ｉ
ｎｃ．）に記載されている。
ボジイミド法、アジド法、混合無水物法、及び活性化エ
ステルを用いる方法である。これらの方法は例えばＰｅ
ｐｔｉｄｅｓ，Ａｎａｌｙｓｉｓ，Ｓｙｎｔｈｅｓｉ
ｓ，Ｂｉｏｌｏｇｙ Ｖｏｌ．１−３（Ｇｒｏｓｓ，
Ｅ．及びＭｅｉｅｎｈｏｆｅｒ，Ｊ．編）１９７９，１
９８０，１９８１（Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，Ｉ
ｎｃ．）に記載されている。
【００４５】前述のような本発明のペプチドの適当なフ
ラグメントを「固相」を用いて製造する方法は、例えば
Ｊ．Ａｍｅｒ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．８５，２１４９（１
９６３）及びＩｎｔ．Ｊ．Ｐｅｐｔｉｄｅ Ｐｒｏｔｅ
ｉｎ Ｒｅｓ．３５，１６１−２１４（１９９０）に記
述されている。製造すべきペプチドのアミノ酸の結合は
通常カルボキシル末端側から始まる。
ラグメントを「固相」を用いて製造する方法は、例えば
Ｊ．Ａｍｅｒ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．８５，２１４９（１
９６３）及びＩｎｔ．Ｊ．Ｐｅｐｔｉｄｅ Ｐｒｏｔｅ
ｉｎ Ｒｅｓ．３５，１６１−２１４（１９９０）に記
述されている。製造すべきペプチドのアミノ酸の結合は
通常カルボキシル末端側から始まる。
【００４６】この方法には、反応基を担持しているか又
は反応基の導入が可能な固相が必要とされる。これは例
えば、反応性クロロメチル基を有するベンゼンとジビニ
ルベンゼンとのコポリマー、又はヒドロキシメチルもし
くはアミン官能基と反応するようにしたポリマー固相で
あり得る。特に適当な固相は例えば、Ｗａｎｇ（１９７
４），Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．９５，１３２８に
記述されているｐ−アルコキシベンジルアルコール樹脂
（４−ヒドロキシ−メチル−フェノキシ−メチル−コポ
リスチレン−１％ジビニルベンゼン樹脂）である。ペプ
チドは合成後に緩和条件下で前記固相から分離し得る。
は反応基の導入が可能な固相が必要とされる。これは例
えば、反応性クロロメチル基を有するベンゼンとジビニ
ルベンゼンとのコポリマー、又はヒドロキシメチルもし
くはアミン官能基と反応するようにしたポリマー固相で
あり得る。特に適当な固相は例えば、Ｗａｎｇ（１９７
４），Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．９５，１３２８に
記述されているｐ−アルコキシベンジルアルコール樹脂
（４−ヒドロキシ−メチル−フェノキシ−メチル−コポ
リスチレン−１％ジビニルベンゼン樹脂）である。ペプ
チドは合成後に緩和条件下で前記固相から分離し得る。
【００４７】所望のアミノ酸配列の合成後は、例えばト
リフルオロメタンスルホン酸を用いて、又はトリフルオ
ロ酢酸に溶解したメタンスルホン酸を用いて、樹脂から
ペプチドを分離する。ペプチドはまた、低級アルコー
ル、好ましくはメタノール又はエタノールでのエステル
交換（ｔｒａｎｓｅｓｔｅｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ）によ
り担体から除去することができる。この場合は、ペプチ
ドの低級アルキルエステルが直接形成される。また、ア
ンモニアを用いて分離すると本発明のペプチドのアミド
が得られる。
リフルオロメタンスルホン酸を用いて、又はトリフルオ
ロ酢酸に溶解したメタンスルホン酸を用いて、樹脂から
ペプチドを分離する。ペプチドはまた、低級アルコー
ル、好ましくはメタノール又はエタノールでのエステル
交換（ｔｒａｎｓｅｓｔｅｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ）によ
り担体から除去することができる。この場合は、ペプチ
ドの低級アルキルエステルが直接形成される。また、ア
ンモニアを用いて分離すると本発明のペプチドのアミド
が得られる。
【００４８】前記縮合反応に参加し得ない反応基は、既
述のように、酸もしくは塩基を用いる加水分解又は還元
によって極めて容易に再除去できる基により効果的に保
護される。例えばカルボキシル基は、例えばメタノー
ル、エタノール、第三ブタノール、ベンジルアルコール
又はｐ−ニトロベンジルアルコール及び固体支持体に結
合したアミンでのエステル化により効果的に保護するこ
とができる。
述のように、酸もしくは塩基を用いる加水分解又は還元
によって極めて容易に再除去できる基により効果的に保
護される。例えばカルボキシル基は、例えばメタノー
ル、エタノール、第三ブタノール、ベンジルアルコール
又はｐ−ニトロベンジルアルコール及び固体支持体に結
合したアミンでのエステル化により効果的に保護するこ
とができる。
【００４９】アミノ基を効果的に保護できる基として
は、エトキシカルボニル、ベンジルオキシカルボニル、
ｔ−ブトキシ−カルボニル（ｔ−ｂｏｃ）もしくはｐ−
メトキシ−ベンジルオキシカルボニル基、又はスルホン
酸から誘導された酸基、例えばベンゼンスルホニルもし
くはｐ−トルエン−スルホニル基が挙げられるが、その
他に、置換もしくは未置換アリールもしくはアラルキル
基のような基、例えばベンジル及びトリフェニルメチ
ル、又はオルト−ニトロフェニルスルフェニル及び２−
ベンゾイル−１−メチル−ビニルのような基も使用でき
る。特に適当なα−アミノ保護基は例えば、塩基に敏感
な９−フルオレニル−メトキシカルボニル（Ｆｍｏｃ）
基［Ｃａｒｐｉｎｏ ＆ Ｈａｎ（１９７０），Ｊ．Ａ
ｍｅｒ．Ｃｅｈｍ．Ｓｏｃ．９２，５７４８］である。
は、エトキシカルボニル、ベンジルオキシカルボニル、
ｔ−ブトキシ−カルボニル（ｔ−ｂｏｃ）もしくはｐ−
メトキシ−ベンジルオキシカルボニル基、又はスルホン
酸から誘導された酸基、例えばベンゼンスルホニルもし
くはｐ−トルエン−スルホニル基が挙げられるが、その
他に、置換もしくは未置換アリールもしくはアラルキル
基のような基、例えばベンジル及びトリフェニルメチ
ル、又はオルト−ニトロフェニルスルフェニル及び２−
ベンゾイル−１−メチル−ビニルのような基も使用でき
る。特に適当なα−アミノ保護基は例えば、塩基に敏感
な９−フルオレニル−メトキシカルボニル（Ｆｍｏｃ）
基［Ｃａｒｐｉｎｏ ＆ Ｈａｎ（１９７０），Ｊ．Ａ
ｍｅｒ．Ｃｅｈｍ．Ｓｏｃ．９２，５７４８］である。
【００５０】使用可能な保護基は例えばＴｈｅ Ｐｅｐ
ｔｉｄｅｓ，Ａｎａｌｙｓｉｓ，Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ，
Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｖｏｌ．１−９（Ｇｒｏｓｓ，Ｕｄｅ
ｎｆｒｉｅｎｄ及びＭｅｉｅｎｈｏｆｅｒ編）１９７９
−１９８７（Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ Ｉｎ
ｃ．）に詳述されている。
ｔｉｄｅｓ，Ａｎａｌｙｓｉｓ，Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ，
Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｖｏｌ．１−９（Ｇｒｏｓｓ，Ｕｄｅ
ｎｆｒｉｅｎｄ及びＭｅｉｅｎｈｏｆｅｒ編）１９７９
−１９８７（Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ Ｉｎ
ｃ．）に詳述されている。
【００５１】また、リシンのε−アミノ基を保護するこ
とも必要であり、アルギニンのグアニジン基に関しては
適切なことである。この場合の一般的な保護基は、リシ
ンの場合にはＢｏｃ基、アルギニンの場合にはＰｍｃ
基、Ｐｍｓ基、Ｍｂｓ基又はＭｔｒ基である。
とも必要であり、アルギニンのグアニジン基に関しては
適切なことである。この場合の一般的な保護基は、リシ
ンの場合にはＢｏｃ基、アルギニンの場合にはＰｍｃ
基、Ｐｍｓ基、Ｍｂｓ基又はＭｔｒ基である。
【００５２】これらの保護基は、例えばトリフルオロ酢
酸を用いて、又は例えば水素とパラジウムのような触媒
もしくは氷酢酸中のＨＢｒを用いる緩和還元により、個
々の基の種類に応じて種々の一般的方法で除去できる。
酸を用いて、又は例えば水素とパラジウムのような触媒
もしくは氷酢酸中のＨＢｒを用いる緩和還元により、個
々の基の種類に応じて種々の一般的方法で除去できる。
【００５３】既述のように、本発明のペプチドは組換え
ＤＮＡ技術によって製造することもできる。この可能性
は、ペプチドを反復配列に組込む（“ｉｎ ｔａｎｄｅ
ｍ”）場合、又はペプチドが（遥かに大きい）タンパク
質もしくはポリペプチドの構成要素として、あるいは例
えばβ−ガラクトシダーゼ（の一部分）との融合タンパ
ク質として製造され得る場合には特に重要である。従っ
て、この種のペプチドも本発明の範囲内に含まれる。そ
のためには、組換えＤＮＡの構成要素として、本発明の
ペプチドをコードし且つ核酸セグメントを実質的に含ま
ない核酸配列を使用する。前記核酸セグメントは天然の
ＥＢＶゲノム中で前記核酸配列の側方に位置するもので
ある。
ＤＮＡ技術によって製造することもできる。この可能性
は、ペプチドを反復配列に組込む（“ｉｎ ｔａｎｄｅ
ｍ”）場合、又はペプチドが（遥かに大きい）タンパク
質もしくはポリペプチドの構成要素として、あるいは例
えばβ−ガラクトシダーゼ（の一部分）との融合タンパ
ク質として製造され得る場合には特に重要である。従っ
て、この種のペプチドも本発明の範囲内に含まれる。そ
のためには、組換えＤＮＡの構成要素として、本発明の
ペプチドをコードし且つ核酸セグメントを実質的に含ま
ない核酸配列を使用する。前記核酸セグメントは天然の
ＥＢＶゲノム中で前記核酸配列の側方に位置するもので
ある。
【００５４】この方法は、宿主として適当な微生物中
で、問題の１つ以上のペプチドをコードする核酸配列を
含む組換えポリヌクレオチドを発現させることにより、
所望のペプチドを製造する操作を含む。
で、問題の１つ以上のペプチドをコードする核酸配列を
含む組換えポリヌクレオチドを発現させることにより、
所望のペプチドを製造する操作を含む。
【００５５】従って本発明は、本発明のペプチドをコー
ドする核酸配列も包含する。この核酸配列は、ＳＥＱ
ＩＤ ＮＯ：１及び／又は３に示すような核酸配列の少
なくとも一部分を含むのが好ましい。
ドする核酸配列も包含する。この核酸配列は、ＳＥＱ
ＩＤ ＮＯ：１及び／又は３に示すような核酸配列の少
なくとも一部分を含むのが好ましい。
【００５６】本明細書中の「核酸配列」は、任意の長さ
のポリマー形態のヌクレオチドを意味し、リボ核酸配列
及びデオキシリボ核酸配列の両方にかかわる。原則とし
て、この用語は分子の一次構造にかかわる。従ってこの
用語には、二本鎖及び一本鎖ＤＮＡと、二本鎖及び一本
鎖ＲＮＡと、これらを修飾したものとが含まれる。本発
明の核酸配列は、天然の状態では該核酸配列と結合しな
い種々の複製実行ＤＮＡに連結でき、その結果適当な宿
主の形質転換又はトランスフェクションに使用し得るい
わゆる組換えベクター分子が得られる。有用な組換えベ
クター分子は、好ましくは、例えばプラスミド、バクテ
リオファージ、コスミド又はウイルスに由来する。本発
明の核酸配列をクローンするのに使用できる特定のベク
ター又はクローニングビヒクルは当業者には公知であ
り、その具体例としては特にｐＢＲ３２２のようなプラ
スミドベクター、種々のｐＵＣ、ｐＧＥＭ及びＢｌｕｅ
ｓｃｒｉｐｔプラスミド、バクテリオファージ、例えば
ｋｇｔ−Ｗｅｓ、Ｃｈａｒｏｎ ２８及びＭ１３由来フ
ァージ又はウイルスベクター、例えばＳＶ４０、アデノ
ウイルス又はポリオーマウイルスが挙げられる（Ｒｏｄ
ｒｉｑｕｅｚ，Ｒ．Ｌ．及びＤ．Ｔ．Ｄｅｎｈａｒｄｔ
編，Ｖｅｃｔｏｒｓ：Ａ ｓｕｒｖｅｙ ｏｆｍｏｌｅ
ｃｕｌａｒ ｃｌｏｎｉｎｇ ｖｅｃｔｏｒ ａｎｄ
ｔｈｅｉｒｕｓｅｓ，Ｂｕｔｔｅｒｗｏｒｔｈｓ，１９
８８；Ｌｅｎｓｔｒａ，Ｊ．Ａ．ら，Ａｒｃｈ．ｖｉｒ
ｏｌ．１１０，１−２４，１９９０も参照のこと）。本
発明の組換えベクター分子の構築に使用される方法は当
業者には公知であり、特にＭａｎｉａｔｉｓ，Ｔ．らの
論文（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ Ａ Ｌａ
ｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，第２版；Ｃｏｌｄ
Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，
１９８９）に記述されている。例えば、本発明の核酸配
列をクローニングベクターに挿入する操作は、遺伝子及
び所望のクローニングビヒクルの両方を同じ制限酵素で
切断すると、相補ＤＮＡ末端が形成されるために容易に
実施できる。
のポリマー形態のヌクレオチドを意味し、リボ核酸配列
及びデオキシリボ核酸配列の両方にかかわる。原則とし
て、この用語は分子の一次構造にかかわる。従ってこの
用語には、二本鎖及び一本鎖ＤＮＡと、二本鎖及び一本
鎖ＲＮＡと、これらを修飾したものとが含まれる。本発
明の核酸配列は、天然の状態では該核酸配列と結合しな
い種々の複製実行ＤＮＡに連結でき、その結果適当な宿
主の形質転換又はトランスフェクションに使用し得るい
わゆる組換えベクター分子が得られる。有用な組換えベ
クター分子は、好ましくは、例えばプラスミド、バクテ
リオファージ、コスミド又はウイルスに由来する。本発
明の核酸配列をクローンするのに使用できる特定のベク
ター又はクローニングビヒクルは当業者には公知であ
り、その具体例としては特にｐＢＲ３２２のようなプラ
スミドベクター、種々のｐＵＣ、ｐＧＥＭ及びＢｌｕｅ
ｓｃｒｉｐｔプラスミド、バクテリオファージ、例えば
ｋｇｔ−Ｗｅｓ、Ｃｈａｒｏｎ ２８及びＭ１３由来フ
ァージ又はウイルスベクター、例えばＳＶ４０、アデノ
ウイルス又はポリオーマウイルスが挙げられる（Ｒｏｄ
ｒｉｑｕｅｚ，Ｒ．Ｌ．及びＤ．Ｔ．Ｄｅｎｈａｒｄｔ
編，Ｖｅｃｔｏｒｓ：Ａ ｓｕｒｖｅｙ ｏｆｍｏｌｅ
ｃｕｌａｒ ｃｌｏｎｉｎｇ ｖｅｃｔｏｒ ａｎｄ
ｔｈｅｉｒｕｓｅｓ，Ｂｕｔｔｅｒｗｏｒｔｈｓ，１９
８８；Ｌｅｎｓｔｒａ，Ｊ．Ａ．ら，Ａｒｃｈ．ｖｉｒ
ｏｌ．１１０，１−２４，１９９０も参照のこと）。本
発明の組換えベクター分子の構築に使用される方法は当
業者には公知であり、特にＭａｎｉａｔｉｓ，Ｔ．らの
論文（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ Ａ Ｌａ
ｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，第２版；Ｃｏｌｄ
Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，
１９８９）に記述されている。例えば、本発明の核酸配
列をクローニングベクターに挿入する操作は、遺伝子及
び所望のクローニングビヒクルの両方を同じ制限酵素で
切断すると、相補ＤＮＡ末端が形成されるために容易に
実施できる。
【００５７】本発明の組換えベクター分子は更に、所望
の形質転換体の選択に使用し得る１つ以上のマーカー活
性、例えばｐＢＲ３２２中のアンピシリン及びテトラサ
イクリン耐性、例えばｐＵＣ８におけるアンピシリン耐
性及びβ−ガラクトシダーゼのα−ペプチドを含み得
る。
の形質転換体の選択に使用し得る１つ以上のマーカー活
性、例えばｐＢＲ３２２中のアンピシリン及びテトラサ
イクリン耐性、例えばｐＵＣ８におけるアンピシリン耐
性及びβ−ガラクトシダーゼのα−ペプチドを含み得
る。
【００５８】本発明は、対応する核酸配列の発現によっ
て本発明のペプチドを産生することができる、核酸配列
又は前述の組換え発現ベクター分子で形質転換又はトラ
ンフェクションした宿主細胞も包含する。適当な宿主細
胞は、ペプチドをコードする核酸配列によって、又はこ
のような核酸配列を含み且つ所望であれば前述の核酸配
列によりコードされる前記ペプチドの発現に使用し得る
組換えベクター分子によって形質転換できる微生物又は
細胞である。この宿主細胞は原核生物由来のもの、例え
ば大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）、Ｂａ
ｃｉｌｌｕｓｓｕｂｔｉｌｉｓ及びＰｓｅｕｄｏｍｏｎ
ａｓ種のような細菌に由来するもの；又は真核生物由来
のもの、例えばＳａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅ
ｖｉｓｉａｅのような酵母あるいはより高等な真核細
胞、例えば昆虫細胞、植物細胞、もしくはＨｅＬａ細胞
及びチャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞を含む
哺乳動物細胞に由来するものであり得る。一般的には、
本発明で有用な組換えベクター分子の構築には真核細胞
の方が好ましい。発現のためには、本発明の核酸配列を
発現ベクター中に導入する。即ち、前記配列を発現制御
配列に操作可能なように結合する。このような制御配列
はプロモーター、エンハンサー、オペレーター、インデ
ューサー、リボソーム結合部位等を含み得る。従って本
発明は、形質転換又はトランフェクションした宿主細胞
中で自分が含んでいるＤＮＡ配列を発現することができ
る、発現制御配列に作用可能なように結合し前述の特定
したペプチドをコードする核酸配列を含む組換えベクタ
ー分子を提供する。勿論、クローニングベクターの選択
された部位に挿入されるヌクレオチド配列は、形質転換
又はトランフェクションされた宿主が少なくとも１つの
免疫原性決定基を有するポリペプチドを産生する限り、
本発明のペプチドをコードする完全核酸配列のフラグメ
ントだけを含み得る。
て本発明のペプチドを産生することができる、核酸配列
又は前述の組換え発現ベクター分子で形質転換又はトラ
ンフェクションした宿主細胞も包含する。適当な宿主細
胞は、ペプチドをコードする核酸配列によって、又はこ
のような核酸配列を含み且つ所望であれば前述の核酸配
列によりコードされる前記ペプチドの発現に使用し得る
組換えベクター分子によって形質転換できる微生物又は
細胞である。この宿主細胞は原核生物由来のもの、例え
ば大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）、Ｂａ
ｃｉｌｌｕｓｓｕｂｔｉｌｉｓ及びＰｓｅｕｄｏｍｏｎ
ａｓ種のような細菌に由来するもの；又は真核生物由来
のもの、例えばＳａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅ
ｖｉｓｉａｅのような酵母あるいはより高等な真核細
胞、例えば昆虫細胞、植物細胞、もしくはＨｅＬａ細胞
及びチャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞を含む
哺乳動物細胞に由来するものであり得る。一般的には、
本発明で有用な組換えベクター分子の構築には真核細胞
の方が好ましい。発現のためには、本発明の核酸配列を
発現ベクター中に導入する。即ち、前記配列を発現制御
配列に操作可能なように結合する。このような制御配列
はプロモーター、エンハンサー、オペレーター、インデ
ューサー、リボソーム結合部位等を含み得る。従って本
発明は、形質転換又はトランフェクションした宿主細胞
中で自分が含んでいるＤＮＡ配列を発現することができ
る、発現制御配列に作用可能なように結合し前述の特定
したペプチドをコードする核酸配列を含む組換えベクタ
ー分子を提供する。勿論、クローニングベクターの選択
された部位に挿入されるヌクレオチド配列は、形質転換
又はトランフェクションされた宿主が少なくとも１つの
免疫原性決定基を有するポリペプチドを産生する限り、
本発明のペプチドをコードする完全核酸配列のフラグメ
ントだけを含み得る。
【００５９】本発明のペプチドに対する抗体も本発明の
範囲に含まれる。前述の方法で形成されたペプチド又は
そのフラグメントはポリクローナル抗体及びモノクロー
ナル抗体を産生するのに使用される。本発明のペプチド
に対するモノクローナル抗体は当業者によって容易に産
生できる。本発明のＶＣＡ−ｐ１８タンパク質の種々の
エピトープに対する好ましい抗体は、Ｐｏｒｔｏｎ Ｄ
ｏｗｎ（ＵＫ）のＥｕｒｏｐｅａｎ Ｃｕｌｔｕｒｅ
ｏｆ Ａｎｉｍａｌ Ｃｅｌｌ Ｃｕｌｔｕｒｅｓ（Ｅ
ＣＡＣＣ）に寄託番号９３０２０４１３又は９３０２０
４１２で寄託去れたラット−マウスハイブリドーマ細胞
系によって産生した抗体と同様の反応性をＶＣＡ−ｐ１
８に対して示す抗体である。ＶＣＡ−ｐ４０タンパク質
のエピトープに対する好ましい抗体は、Ｐｏｒｔｏｎ
Ｄｏｗｎ（ＵＫ）のＥｕｒｏｐｅａｎ Ｃｕｌｔｕｒｅ
ｏｆ Ａｎｉｍａｌ Ｃｅｌｌ Ｃｕｌｔｕｒｅｓ
（ＥＣＡＣＣ）に暫定的寄託番号９３０２０４１４で寄
託されたマウス−マウスハイブリドーマ細胞系によって
産生した抗体と同様の反応性をＶＣＡ−ｐ４０に対して
示す抗体である。
範囲に含まれる。前述の方法で形成されたペプチド又は
そのフラグメントはポリクローナル抗体及びモノクロー
ナル抗体を産生するのに使用される。本発明のペプチド
に対するモノクローナル抗体は当業者によって容易に産
生できる。本発明のＶＣＡ−ｐ１８タンパク質の種々の
エピトープに対する好ましい抗体は、Ｐｏｒｔｏｎ Ｄ
ｏｗｎ（ＵＫ）のＥｕｒｏｐｅａｎ Ｃｕｌｔｕｒｅ
ｏｆ Ａｎｉｍａｌ Ｃｅｌｌ Ｃｕｌｔｕｒｅｓ（Ｅ
ＣＡＣＣ）に寄託番号９３０２０４１３又は９３０２０
４１２で寄託去れたラット−マウスハイブリドーマ細胞
系によって産生した抗体と同様の反応性をＶＣＡ−ｐ１
８に対して示す抗体である。ＶＣＡ−ｐ４０タンパク質
のエピトープに対する好ましい抗体は、Ｐｏｒｔｏｎ
Ｄｏｗｎ（ＵＫ）のＥｕｒｏｐｅａｎ Ｃｕｌｔｕｒｅ
ｏｆ Ａｎｉｍａｌ Ｃｅｌｌ Ｃｕｌｔｕｒｅｓ
（ＥＣＡＣＣ）に暫定的寄託番号９３０２０４１４で寄
託されたマウス−マウスハイブリドーマ細胞系によって
産生した抗体と同様の反応性をＶＣＡ−ｐ４０に対して
示す抗体である。
【００６０】本発明のモノクローナル抗体を分泌できる
無限増殖性化した細胞系も本発明の範囲に含まれる。モ
ノクローナル抗体を産生する細胞系の形成は、例えばＫ
ｏｈｌｅｒ及びＭｉｌｓｔｅｉｎの方法（Ｋｏｈｌｅｒ
及びＭｉｌｓｔｅｉｎはモノクローナル抗体産生ハイブ
リドーマを形成する技術を創案した（Ｇ．Ｋｏｈｌｅｒ
及びＣ．Ｍｉｌｓｔｅｉｎ，１９７５，Ｎａｔｕｒｅ
２５６：４９５−４９７；１９７６，Ｅｕｒ．Ｊ．Ｉｍ
ｍｕｎｏｌ．６：５１１−５１９））、Ｅｐｓｔｅｉｎ
−Ｂａｒｒウイルスでの形質転換、腫瘍形成性ＤＮＡに
よるＢリンパ球の直接形質転換方法、ヒトもしくはマウ
ス−ヒトハイブリッド骨髄腫細胞系を融合相手とするヒ
トＢリンパ球の直接融合、又はＥＢＶ形質転換Ｂ細胞と
前記骨髄腫細胞系との直接融合によって実施し得る。
無限増殖性化した細胞系も本発明の範囲に含まれる。モ
ノクローナル抗体を産生する細胞系の形成は、例えばＫ
ｏｈｌｅｒ及びＭｉｌｓｔｅｉｎの方法（Ｋｏｈｌｅｒ
及びＭｉｌｓｔｅｉｎはモノクローナル抗体産生ハイブ
リドーマを形成する技術を創案した（Ｇ．Ｋｏｈｌｅｒ
及びＣ．Ｍｉｌｓｔｅｉｎ，１９７５，Ｎａｔｕｒｅ
２５６：４９５−４９７；１９７６，Ｅｕｒ．Ｊ．Ｉｍ
ｍｕｎｏｌ．６：５１１−５１９））、Ｅｐｓｔｅｉｎ
−Ｂａｒｒウイルスでの形質転換、腫瘍形成性ＤＮＡに
よるＢリンパ球の直接形質転換方法、ヒトもしくはマウ
ス−ヒトハイブリッド骨髄腫細胞系を融合相手とするヒ
トＢリンパ球の直接融合、又はＥＢＶ形質転換Ｂ細胞と
前記骨髄腫細胞系との直接融合によって実施し得る。
【００６１】本発明の好ましい細胞系は、Ｐｏｒｔｏｎ
Ｄｏｗｎ（ＵＫ）のＥｕｒｏｐｅａｎ Ｃｏｌｌｅｃ
ｔｉｏｎ ｏｆ Ａｎｉｍａｌ Ｃｅｌｌ Ｃｕｌｔｕ
ｒｅｓ（ＥＣＡＣＣ）に寄託番号９３０２０４１３、９
３０２０４１２、９３０２０４１４で寄託された細胞系
である。これらの細胞系は、１９７７年のブダペスト条
約の条件に従い、１９９３年２月４日にＥＣＡＣＣに寄
託された。
Ｄｏｗｎ（ＵＫ）のＥｕｒｏｐｅａｎ Ｃｏｌｌｅｃ
ｔｉｏｎ ｏｆ Ａｎｉｍａｌ Ｃｅｌｌ Ｃｕｌｔｕ
ｒｅｓ（ＥＣＡＣＣ）に寄託番号９３０２０４１３、９
３０２０４１２、９３０２０４１４で寄託された細胞系
である。これらの細胞系は、１９７７年のブダペスト条
約の条件に従い、１９９３年２月４日にＥＣＡＣＣに寄
託された。
【００６２】寄託番号９３０２０４１３及び９３０２０
４１２の細胞系はどちらも、ＶＣＡ−ｐ１８タンパク質
の２つのエピトープに対するモノクローナル抗体（それ
ぞれＥＢＶ．ＯＴ１５Ｅ及びＥＢＶ．ＯＴ１５１）を産
生することができる。これらの細胞系はラット−マウス
ハイブリドーマ細胞系である。暫定的寄託番号９３０２
０４１４の細胞系は、ＶＣＡ−ｐ４０タンパク質のエピ
トープに対する抗体を産生することができ、マウス−マ
ウスハイブリドーマ細胞系である。これらの細胞系によ
って産生された抗体は、それぞれのタンパク質のエピト
ープを同定するのに使用した（後述の実施例で説明す
る）。
４１２の細胞系はどちらも、ＶＣＡ−ｐ１８タンパク質
の２つのエピトープに対するモノクローナル抗体（それ
ぞれＥＢＶ．ＯＴ１５Ｅ及びＥＢＶ．ＯＴ１５１）を産
生することができる。これらの細胞系はラット−マウス
ハイブリドーマ細胞系である。暫定的寄託番号９３０２
０４１４の細胞系は、ＶＣＡ−ｐ４０タンパク質のエピ
トープに対する抗体を産生することができ、マウス−マ
ウスハイブリドーマ細胞系である。これらの細胞系によ
って産生された抗体は、それぞれのタンパク質のエピト
ープを同定するのに使用した（後述の実施例で説明す
る）。
【００６３】本発明のペプチドに対する抗体はモノクロ
ーナルでもポリクローナルでも、組織試料中でその場で
検出するための診断及び免疫細胞化学で極めて有用であ
り、ニュートラライズしている抗体は受動免疫療法で極
めて有用である。特にモノクローナル抗体は抗イディオ
タイプ抗体の産生に使用し得る。抗イディオタイプ抗体
の産生方法は当業者には公知である。本発明のモノクロ
ーナル抗体と反応する抗イディオタイプ抗体は既述のよ
うに本発明の範囲に含まれる。
ーナルでもポリクローナルでも、組織試料中でその場で
検出するための診断及び免疫細胞化学で極めて有用であ
り、ニュートラライズしている抗体は受動免疫療法で極
めて有用である。特にモノクローナル抗体は抗イディオ
タイプ抗体の産生に使用し得る。抗イディオタイプ抗体
の産生方法は当業者には公知である。本発明のモノクロ
ーナル抗体と反応する抗イディオタイプ抗体は既述のよ
うに本発明の範囲に含まれる。
【００６４】抗-イディオタイプ抗体は、免疫グロブリ
ンの種々の部分に対する抗体である。抗-イディオタイ
プ抗体の亜集団は、「抗-イディオタイプβ」または
「内部像」として公知である。これらの抗-イディオタ
イプβ抗体は、抗原と構造的または三次元的に酷似して
いる（Uytdehaag,F.G.C.Mら，Immunol.Rev；90；93-11
3；1986）。この種の抗-イディオタイプ抗体は、動物モ
デルでの感染病に特異的なワクチンとして広く使用され
ている（Hiernaux J.R.；Infect.Immun.；56；1407-141
3；1988，Kennedy,R.C.ら：Science 232；220-223；198
6）。アッセイで使用する場合には、抗-イディオタイプ
抗体は多量に産生され得る。
ンの種々の部分に対する抗体である。抗-イディオタイ
プ抗体の亜集団は、「抗-イディオタイプβ」または
「内部像」として公知である。これらの抗-イディオタ
イプβ抗体は、抗原と構造的または三次元的に酷似して
いる（Uytdehaag,F.G.C.Mら，Immunol.Rev；90；93-11
3；1986）。この種の抗-イディオタイプ抗体は、動物モ
デルでの感染病に特異的なワクチンとして広く使用され
ている（Hiernaux J.R.；Infect.Immun.；56；1407-141
3；1988，Kennedy,R.C.ら：Science 232；220-223；198
6）。アッセイで使用する場合には、抗-イディオタイプ
抗体は多量に産生され得る。
【００６５】抗-イディオタイプ抗体の産生方法は当業
界で公知である。例えば、本発明の抗-イディオタイプ
抗体は、モノクローナル抗体でBALB/cマウスを免疫感作
し、標準文献方法に従ってグルタルアルデヒドを用いて
KLHに結合させ、フロイント完全アジュバントと混合す
ることにより得られる。これらのマウスの脾臓細胞を不
死化し、このようして得られたハイブリドーマを抗-イ
ディオタイプ抗体産生に関してスクリーニングし得る。
ハイブリドーマのスクリーニングは、例えば、本発明の
モノクローナル抗体を固相（マイクロタイタープレート
のウエル）に結合させ、次いで固相を生長ハイブリドー
マの培養上清とインキュベートすることにより実施し得
る。西洋ワサビペルオキシダーゼ（HRP）に結合させたE
BVペプチドを添加してもよい。培養上清中の抗-イディ
オタイプ抗体の存在は、このペプチド結合体と、固相上
にコートしたモノクローナル抗体との結合阻害により示
される。
界で公知である。例えば、本発明の抗-イディオタイプ
抗体は、モノクローナル抗体でBALB/cマウスを免疫感作
し、標準文献方法に従ってグルタルアルデヒドを用いて
KLHに結合させ、フロイント完全アジュバントと混合す
ることにより得られる。これらのマウスの脾臓細胞を不
死化し、このようして得られたハイブリドーマを抗-イ
ディオタイプ抗体産生に関してスクリーニングし得る。
ハイブリドーマのスクリーニングは、例えば、本発明の
モノクローナル抗体を固相（マイクロタイタープレート
のウエル）に結合させ、次いで固相を生長ハイブリドー
マの培養上清とインキュベートすることにより実施し得
る。西洋ワサビペルオキシダーゼ（HRP）に結合させたE
BVペプチドを添加してもよい。培養上清中の抗-イディ
オタイプ抗体の存在は、このペプチド結合体と、固相上
にコートしたモノクローナル抗体との結合阻害により示
される。
【００６６】抗-イディオタイプ抗体は、例えば、EBV-
抗体を使用する免疫アッセイに於けるヒト及び/または
動物EBV-抗原の結合を阻害するために使用し得る。ある
いは、抗-イディオタイプ抗体は、以後記載する免疫試
薬の模擬薬として使用してもよい。前記抗-イディオタ
イプ抗体は、EBVの診断及び治療並びに、EBV-抗原の重
要なエピトープ領域の解明にも有用である。本発明の１
種以上のペプチドまたは抗体を含む免疫化学試薬は、本
発明の一部である。
抗体を使用する免疫アッセイに於けるヒト及び/または
動物EBV-抗原の結合を阻害するために使用し得る。ある
いは、抗-イディオタイプ抗体は、以後記載する免疫試
薬の模擬薬として使用してもよい。前記抗-イディオタ
イプ抗体は、EBVの診断及び治療並びに、EBV-抗原の重
要なエピトープ領域の解明にも有用である。本発明の１
種以上のペプチドまたは抗体を含む免疫化学試薬は、本
発明の一部である。
【００６７】本発明の「免疫化学試薬」という用語は、
通常本発明の１種以上のペプチド及び標識物質または好
適な支持体からなる。本明細書中で使用し得る「支持
体」という用語は、ミクロ試験ウエル若しくはキュベッ
ト、チューブ若しくはキャピラリー、膜、フィルタ、試
験片の内壁、または、例えば、ラテックス粒子、赤血
球、染料ゾル、金属ゾル若しくは、ゾル粒子などの金属
化合物、キャリヤ蛋白質（例えば、BSAまたはKLHなど）
の表面を指す。本明細書中で使用し得る「標識物質」と
は、中でも、放射性同位体、蛍光性化合物、酵素、染料
ゾル、金属ゾル、またはゾル粒子としての金属化合物を
指す。サンプル中のEBVに対する抗体の検出方法に於い
ては、本発明の免疫化学試薬をサンプルと接触させる。
その後、サンプル中のペプチドと抗体との間に形成した
免疫複合体の存在を検出し、このように検出することに
よりサンプル中のEBV抗体の存在が知られ、定量的に測
定され得る。
通常本発明の１種以上のペプチド及び標識物質または好
適な支持体からなる。本明細書中で使用し得る「支持
体」という用語は、ミクロ試験ウエル若しくはキュベッ
ト、チューブ若しくはキャピラリー、膜、フィルタ、試
験片の内壁、または、例えば、ラテックス粒子、赤血
球、染料ゾル、金属ゾル若しくは、ゾル粒子などの金属
化合物、キャリヤ蛋白質（例えば、BSAまたはKLHなど）
の表面を指す。本明細書中で使用し得る「標識物質」と
は、中でも、放射性同位体、蛍光性化合物、酵素、染料
ゾル、金属ゾル、またはゾル粒子としての金属化合物を
指す。サンプル中のEBVに対する抗体の検出方法に於い
ては、本発明の免疫化学試薬をサンプルと接触させる。
その後、サンプル中のペプチドと抗体との間に形成した
免疫複合体の存在を検出し、このように検出することに
よりサンプル中のEBV抗体の存在が知られ、定量的に測
定され得る。
【００６８】免疫化学試薬の性質及び特徴に依存して、
生起する免疫化学反応は、所謂サンドイッチ反応、凝集
反応、拮抗反応または阻害反応である。
生起する免疫化学反応は、所謂サンドイッチ反応、凝集
反応、拮抗反応または阻害反応である。
【００６９】サンプル中のEBVを検出するために、本発
明の１種以上のペプチドを含む本発明の免疫化学試薬を
サンプル及び抗-EBVと接触させ、その後、形成した免疫
複合体の存在を検出し、次いでこれから、サンプル中の
EBVの存在を決定し得る。
明の１種以上のペプチドを含む本発明の免疫化学試薬を
サンプル及び抗-EBVと接触させ、その後、形成した免疫
複合体の存在を検出し、次いでこれから、サンプル中の
EBVの存在を決定し得る。
【００７０】サンプル中のEBVを検出するための特に好
適な方法は、標識物質のついた本発明のペプチドとEBV
抗原（サンプル中に存在する）との間の拮抗反応に基づ
いており、これによりペプチド及び抗原は、固体支持体
に結合したEBVに対する抗体と競合する。
適な方法は、標識物質のついた本発明のペプチドとEBV
抗原（サンプル中に存在する）との間の拮抗反応に基づ
いており、これによりペプチド及び抗原は、固体支持体
に結合したEBVに対する抗体と競合する。
【００７１】本発明は、さらに、本発明の抗体をサンプ
ルと接触させ、その後、サンプル中のエプスタイン-バ
ーウイルスの存在の尺度である形成された免疫複合体の
存在を検出することを特徴とする、サンプル中のエプス
タイン-バーウイルスの検出方法も含む。本発明の試験
キットは、必須の構成成分として上記記載の免疫化学試
薬を含む。EBV抗体を検出するためにサンドイッチ反応
を実施する場合、試験キットは、例えば、固体支持体
（例えば、ミクロ試験ウエルの内壁）にコートされた本
発明のペプチド及び本発明の標識ペプチドまたは標識抗
-抗体のいずれかを含み得る。拮抗反応を実施する場合
には、試験キットは、固体支持体にコートした本発明の
ペプチド及びEBVに対する標識抗体、好ましくは前記ペ
プチドに対するモノクローナル抗体を含み得る。凝集反
応に於いては、試験キットは、粒子またはゾルにコート
した本発明のペプチドを含有する免疫化学試薬を含み得
る。試験キットのもう一つの態様としては、例えば、固
体支持体にコートされているEBVに対する抗体上の結合
部位を検出するためのEBVとの拮抗反応に於いて、免疫
化学試薬として本発明の標識ペプチドを使用することで
ある。
ルと接触させ、その後、サンプル中のエプスタイン-バ
ーウイルスの存在の尺度である形成された免疫複合体の
存在を検出することを特徴とする、サンプル中のエプス
タイン-バーウイルスの検出方法も含む。本発明の試験
キットは、必須の構成成分として上記記載の免疫化学試
薬を含む。EBV抗体を検出するためにサンドイッチ反応
を実施する場合、試験キットは、例えば、固体支持体
（例えば、ミクロ試験ウエルの内壁）にコートされた本
発明のペプチド及び本発明の標識ペプチドまたは標識抗
-抗体のいずれかを含み得る。拮抗反応を実施する場合
には、試験キットは、固体支持体にコートした本発明の
ペプチド及びEBVに対する標識抗体、好ましくは前記ペ
プチドに対するモノクローナル抗体を含み得る。凝集反
応に於いては、試験キットは、粒子またはゾルにコート
した本発明のペプチドを含有する免疫化学試薬を含み得
る。試験キットのもう一つの態様としては、例えば、固
体支持体にコートされているEBVに対する抗体上の結合
部位を検出するためのEBVとの拮抗反応に於いて、免疫
化学試薬として本発明の標識ペプチドを使用することで
ある。
【００７２】欧州特許第201,814号及び同第329,822号に
各々記載の、例えば、ポリメラーゼ連鎖反応（PCR）ま
たは核酸配列をベースとする増幅（NASBA）などの核酸
増幅方法によりEBV DNAまたはRNAを検出するために、試
験に於いて配列番号１及び/または３に示される新規ヌ
クレオチド配列を使用することも本発明の範囲内であ
る。前記エプスタイン-バールウイルス核酸配列の核酸
増幅を実施し、増幅された配列を検出するために、本発
明のプライマーの少なくとも１つの核酸配列またはその
フラグメントを使用する、サンプル中のエプスタイン-
バーウイルス核酸配列を増幅及び検出するための方法
は、本発明の一部である。上記記載の増幅方法を実施す
るための、本発明のヌクレオチド配列の少なくとも一部
に対応する少なくとも１セットのプライマーを含む試験
増幅キットも本発明の一部である。
各々記載の、例えば、ポリメラーゼ連鎖反応（PCR）ま
たは核酸配列をベースとする増幅（NASBA）などの核酸
増幅方法によりEBV DNAまたはRNAを検出するために、試
験に於いて配列番号１及び/または３に示される新規ヌ
クレオチド配列を使用することも本発明の範囲内であ
る。前記エプスタイン-バールウイルス核酸配列の核酸
増幅を実施し、増幅された配列を検出するために、本発
明のプライマーの少なくとも１つの核酸配列またはその
フラグメントを使用する、サンプル中のエプスタイン-
バーウイルス核酸配列を増幅及び検出するための方法
は、本発明の一部である。上記記載の増幅方法を実施す
るための、本発明のヌクレオチド配列の少なくとも一部
に対応する少なくとも１セットのプライマーを含む試験
増幅キットも本発明の一部である。
【００７３】
【実施例】本発明を、以下の実施例によりさらに説明す
る。
る。
【００７４】実施例１ EBV蛋白質をコードする新規DNA配列を単離且つ同定する
方法。
方法。
【００７５】新規EBVマーカー分子を同定するための通
常の方法は、以下の段階に細分され得る。
常の方法は、以下の段階に細分され得る。
【００７６】１．EBVマーカー分子と特異的に反応性の
抗体試薬の同定及び産生。
抗体試薬の同定及び産生。
【００７７】２．EBV発現細胞から単離されたポリ-A選
択mRNA若しくは全細胞mRNAからのc-DNAバンクの調製ま
たは、好ましくはλgt11ファージ中でのウイルスゲノム
のフラグメントからのゲノムDNA-バンクの調製、次いで
上記抗体試薬を用いる、ファージによって合成された蛋
白質のスクリーニング。
択mRNA若しくは全細胞mRNAからのc-DNAバンクの調製ま
たは、好ましくはλgt11ファージ中でのウイルスゲノム
のフラグメントからのゲノムDNA-バンクの調製、次いで
上記抗体試薬を用いる、ファージによって合成された蛋
白質のスクリーニング。
【００７８】３．反応性ファージの精製及び、ファージ
のゲノム内に含まれるEBV-特異的なインサート配列の同
定。
のゲノム内に含まれるEBV-特異的なインサート配列の同
定。
【００７９】４．対応するEBV-特異的読み取り枠を配置
するための、公知プロトタイプEBV-ゲノム配列と該イン
サート配列との相関。
するための、公知プロトタイプEBV-ゲノム配列と該イン
サート配列との相関。
【００８０】５．代替的宿主細胞（例えば、E.Coli、バ
キュロウイルス、酵母若しくは高等真核細胞）または代
替的発現、cq.産生システム中での同定した読み取り枠
のクローニング、発現及び産生。
キュロウイルス、酵母若しくは高等真核細胞）または代
替的発現、cq.産生システム中での同定した読み取り枠
のクローニング、発現及び産生。
【００８１】これらの方法は、以下詳細に概説され且つ
図１に記載のスキームに示されている。
図１に記載のスキームに示されている。
【００８２】（フェイズ１：）細胞培養及び細胞抽出物 P3HR1-誘導細胞系HH514.c16をローラーボトル内で懸濁
培養として増殖し、Middeldorp及びHerbrink（J.Virol.
Meth.，21，113-146，1988）により記載の如く正確に20
ng/ml 12-テトラデカノホルボール-13-アセテート（TP
A）及び3mM 酪酸ナトリウムを使用する、VCA-及びEA-発
現を誘導した。EA-抗原のみを選択的に発現するため
に、誘導した細胞培養に0.5mM ホスホノ酢酸を添加する
ことにより、ウイルス性DNAポリメラーゼをブロックし
た。
培養として増殖し、Middeldorp及びHerbrink（J.Virol.
Meth.，21，113-146，1988）により記載の如く正確に20
ng/ml 12-テトラデカノホルボール-13-アセテート（TP
A）及び3mM 酪酸ナトリウムを使用する、VCA-及びEA-発
現を誘導した。EA-抗原のみを選択的に発現するため
に、誘導した細胞培養に0.5mM ホスホノ酢酸を添加する
ことにより、ウイルス性DNAポリメラーゼをブロックし
た。
【００８３】モノクローナル抗体 モノクローナル抗体を産生するために、BALB/cマウスを
VCA-誘導HH514細胞の核画分（F.Wielaardら.，J.Virol.
Meth.，21，105-115，1988）または、これらの細胞若し
くは代替的発現系由来の十分に精製した蛋白質で免疫感
作した。ハイブリドーマが標準プロトコルにより産生
し、上清を標準EBV免疫蛍光試験及び、VCA-誘導HH514細
胞由来の抗原抽出物を含むイムノブロット片上で分析し
た（Middledorp及びHerbrink，J.Virol.Meth.，21，133
-146，1988）。
VCA-誘導HH514細胞の核画分（F.Wielaardら.，J.Virol.
Meth.，21，105-115，1988）または、これらの細胞若し
くは代替的発現系由来の十分に精製した蛋白質で免疫感
作した。ハイブリドーマが標準プロトコルにより産生
し、上清を標準EBV免疫蛍光試験及び、VCA-誘導HH514細
胞由来の抗原抽出物を含むイムノブロット片上で分析し
た（Middledorp及びHerbrink，J.Virol.Meth.，21，133
-146，1988）。
【００８４】抗VCA-p18抗体のアフィニティー精製 抗VCA-p18抗体を、Robinson及びMillerの方法（The her
pesviruses，vol.1，151-192，1991，Publ.Plenum Publ
ishing Corp.New York）を少し変形することによりヒト
EBV-陽性血清から精製した。概略すると、10%アクリル
アミドゲル中で電気泳動分離後、蛋白質をPVDF-膜（Mil
lipore Corporation，Bedford,USA）上にブロットし、V
CA-p18に対応するPVDF-膜上の領域を切り出し、アフィ
ニティーマトリックスとして使用した。ストリップへの
抗体の非特異的な結合は、ブロッキング溶液［リン酸緩
衝塩水pH7.4（PBS）中、5% 乾燥粉末ミルク、4% ウマ血
清］中で一晩インキュベーションすることにより防止し
た。その後、希釈したヒト血清（ブロッキング溶液中
１:25）中でストリップを２時間インキュベートした。
0.05% Tween-20を含むPBSで３回洗浄後、連続２回のイ
ンキュベーションに於ける結合抗体を0.1M グリシン、p
H2.7で溶離した。溶離液を1M Tris/HCl（pH9.0）の1/20
容量で中和した。最後に、溶離液をPBSに対して透析
し、アリコート中−20℃で貯蔵した。
pesviruses，vol.1，151-192，1991，Publ.Plenum Publ
ishing Corp.New York）を少し変形することによりヒト
EBV-陽性血清から精製した。概略すると、10%アクリル
アミドゲル中で電気泳動分離後、蛋白質をPVDF-膜（Mil
lipore Corporation，Bedford,USA）上にブロットし、V
CA-p18に対応するPVDF-膜上の領域を切り出し、アフィ
ニティーマトリックスとして使用した。ストリップへの
抗体の非特異的な結合は、ブロッキング溶液［リン酸緩
衝塩水pH7.4（PBS）中、5% 乾燥粉末ミルク、4% ウマ血
清］中で一晩インキュベーションすることにより防止し
た。その後、希釈したヒト血清（ブロッキング溶液中
１:25）中でストリップを２時間インキュベートした。
0.05% Tween-20を含むPBSで３回洗浄後、連続２回のイ
ンキュベーションに於ける結合抗体を0.1M グリシン、p
H2.7で溶離した。溶離液を1M Tris/HCl（pH9.0）の1/20
容量で中和した。最後に、溶離液をPBSに対して透析
し、アリコート中−20℃で貯蔵した。
【００８５】（フェイズ２：）HH514.c16細胞のRNA精製 Maniatisら（Molecular cloning：A laboratory manua
l；Cold Spring HarborLaboratory，New York，1982）
により記載の如く、グアニジニウム/CsCl法により誘導
したHH514.c16細胞から全RNAを単離した。ポリ（Ａ+）R
NAの精製を、Ausubelら［Current protocols in molecu
lar biology（1991）Greene Publishing Associates，J
ohn Wiely＆Sons，New York]に記載の如くオリゴ（dT）
クロマトグラフィー（Pharmacia,Inc.，Piscataway N.
Y.）で実施した。
l；Cold Spring HarborLaboratory，New York，1982）
により記載の如く、グアニジニウム/CsCl法により誘導
したHH514.c16細胞から全RNAを単離した。ポリ（Ａ+）R
NAの精製を、Ausubelら［Current protocols in molecu
lar biology（1991）Greene Publishing Associates，J
ohn Wiely＆Sons，New York]に記載の如くオリゴ（dT）
クロマトグラフィー（Pharmacia,Inc.，Piscataway N.
Y.）で実施した。
【００８６】ノーザンブロット分析 全RNA（10μg）をグリオキサール（P.S.Thomas，Method
s in Enzymology，100，255-266，1983）により変性
し、アガロースゲル上で電気泳動した。臭化エチジウム
染色後、分離したRNAをニトロセルロース上に真空-ブロ
ットした。３時間プレハイブリダイゼーション後、フィ
ルタを、［α-32P］-標識（Amersham，Bristol，UK）さ
れたランダムプライマー型の若しくはニックトランスレ
ーションされたDNAプローブと42℃で一晩ハイブリダイ
ズした。ハイブリダイゼーション溶液は、50%ホルムア
ミド、５×SSPE、５×Denhardts溶液［0.1%（w/v）ポリ
ビニルピロリドン、0.1%（w/v）BSA、0.1%（w/v）Ficol
l］、0.2mgの超音波処理サケ精子DNA/ml及び0.5% SDSか
らなる。続いて、ブロットを洗浄し、増感板を使用して
Ｘ線フィルム（Eastman Kodak Co.，Rochester，N.Y.，
USA）に対し露光した。
s in Enzymology，100，255-266，1983）により変性
し、アガロースゲル上で電気泳動した。臭化エチジウム
染色後、分離したRNAをニトロセルロース上に真空-ブロ
ットした。３時間プレハイブリダイゼーション後、フィ
ルタを、［α-32P］-標識（Amersham，Bristol，UK）さ
れたランダムプライマー型の若しくはニックトランスレ
ーションされたDNAプローブと42℃で一晩ハイブリダイ
ズした。ハイブリダイゼーション溶液は、50%ホルムア
ミド、５×SSPE、５×Denhardts溶液［0.1%（w/v）ポリ
ビニルピロリドン、0.1%（w/v）BSA、0.1%（w/v）Ficol
l］、0.2mgの超音波処理サケ精子DNA/ml及び0.5% SDSか
らなる。続いて、ブロットを洗浄し、増感板を使用して
Ｘ線フィルム（Eastman Kodak Co.，Rochester，N.Y.，
USA）に対し露光した。
【００８７】λ-gt11に於けるcDNAライブラリーの構築 ポリ（Ａ+）-選択RNA５μgを水酸化メチル水銀で変性し
た。cDNA合成ではオリゴ（dT）またはヘキサヌクレオチ
ドのいずれかでプライマー処理した。第１及び第２のス
トランド合成方法は、Gubler及びHoffman（Gene,25,263
-269,1983）に記載の方法と同一であった。EcoRI-メチ
ル化、EcoRI-リンカー付加及びEcoRI消化後、改質したc
DNAを、Maniatisらに記載のセファロースCL4B（Pharmac
ia製）クロマトグラフィーによりサイズ選択した。0.5k
B〜3.0kBの種々のサイズのcDNAを、ホスファターゼで処
理したλgt11-アームに結合し、次いで、Packageneキッ
ト（Promega,San Diego,USA）を使用するin vitroパッ
ケージングを実施した。
た。cDNA合成ではオリゴ（dT）またはヘキサヌクレオチ
ドのいずれかでプライマー処理した。第１及び第２のス
トランド合成方法は、Gubler及びHoffman（Gene,25,263
-269,1983）に記載の方法と同一であった。EcoRI-メチ
ル化、EcoRI-リンカー付加及びEcoRI消化後、改質したc
DNAを、Maniatisらに記載のセファロースCL4B（Pharmac
ia製）クロマトグラフィーによりサイズ選択した。0.5k
B〜3.0kBの種々のサイズのcDNAを、ホスファターゼで処
理したλgt11-アームに結合し、次いで、Packageneキッ
ト（Promega,San Diego,USA）を使用するin vitroパッ
ケージングを実施した。
【００８８】λgt11ライブラリーの免疫スクリーニング オリゴ（dT）プライマー処理ライブラリーの組換体ファ
ージを全部で１×104及びヘキサヌクレオチドプライマ
ー処理ライブラリーの組換体５×105を、アフィニティ
ー精製したヒト抗p18抗体またはモノクローナル抗体EB
V.OT41Aとの免疫学的反応性に関してスクリーニングし
た（Maniatisら参照）。免疫反応性のプラークを、製造
業者（Promega）により記載の如く、各々アルカリホス
ファターゼ結合抗ヒトまたは抗マウスIgGで検出した。
ージを全部で１×104及びヘキサヌクレオチドプライマ
ー処理ライブラリーの組換体５×105を、アフィニティ
ー精製したヒト抗p18抗体またはモノクローナル抗体EB
V.OT41Aとの免疫学的反応性に関してスクリーニングし
た（Maniatisら参照）。免疫反応性のプラークを、製造
業者（Promega）により記載の如く、各々アルカリホス
ファターゼ結合抗ヒトまたは抗マウスIgGで検出した。
【００８９】（フェイズ３：）ヌクレオチド配列分析 反復プラークリフティング及び免疫スクリーニングによ
り精製した陽性プラークのインサートDNAを、その5'-末
端に制限部位を含むλgt11フランキング配列のプライマ
ーを使用するポリメラーゼ連鎖反応（PCR）により増幅
した。好適な制限酵素で消化した後、DNA-フラグメント
をpGEM-4Z中にサブクローン化し、Sangerら（Proc.Nat
l.Acad.Sci.，USA，74，5463-5467，1977）の方法の変
形を使用する配列キット（Pharmacia，Uppsala，Swede
n）を使用して両側から配列決定した。
り精製した陽性プラークのインサートDNAを、その5'-末
端に制限部位を含むλgt11フランキング配列のプライマ
ーを使用するポリメラーゼ連鎖反応（PCR）により増幅
した。好適な制限酵素で消化した後、DNA-フラグメント
をpGEM-4Z中にサブクローン化し、Sangerら（Proc.Nat
l.Acad.Sci.，USA，74，5463-5467，1977）の方法の変
形を使用する配列キット（Pharmacia，Uppsala，Swede
n）を使用して両側から配列決定した。
【００９０】（フェイズ４：）配列の配置 Wisconsin大学、遺伝学コンピュータグループのソフト
ウエアプログラム（Gribshovら，Nucl.Acid res.，14．
327-334，1986）を使用して、配列を、EMBL-配列データ
ベースに寄託してあるEBV-B95-8プロトタイプ（Baer
ら.，Nature 310，207-211，1984）の公知配列と一直線
に配置した。
ウエアプログラム（Gribshovら，Nucl.Acid res.，14．
327-334，1986）を使用して、配列を、EMBL-配列データ
ベースに寄託してあるEBV-B95-8プロトタイプ（Baer
ら.，Nature 310，207-211，1984）の公知配列と一直線
に配置した。
【００９１】（フェイズ５：）E.coli中のBFRF3及びBdRF1のクローニング及び発現 EBVゲノムによってコードされる読み取り枠（ORFs）、B
FRF3及びBdRF1を、ターゲットとしてHH514.c16培養上清
から蔗糖密度勾配遠心分離により単離したウイルス粒子
から精製したウイルスDNAを使用するPCRにより増幅し
た。その5'-末端に制限部位を含むプライマーの各セッ
トを、LacZ遺伝子の5'末端の第５コドンに配置されてい
る発現ベクターpMLB1113（PBR322の誘導体）（Zagurski
及びBerman,Gene,27,183-101,1984）のEcoRI-HindIII部
位の増幅フラグメントをクローニングするために使用し
た。これらの構築物から発現した蛋白質は、β-ガラク
トシダーゼの最初の5アミノ酸、その後に続く、β-ガラ
クトシダーゼの残りにそのC-末端で結合した組換体蛋白
質からなる。非融合蛋白質を同様に構築したが、但し、
挿入物の3'末端に停止コドンを挿入した。
FRF3及びBdRF1を、ターゲットとしてHH514.c16培養上清
から蔗糖密度勾配遠心分離により単離したウイルス粒子
から精製したウイルスDNAを使用するPCRにより増幅し
た。その5'-末端に制限部位を含むプライマーの各セッ
トを、LacZ遺伝子の5'末端の第５コドンに配置されてい
る発現ベクターpMLB1113（PBR322の誘導体）（Zagurski
及びBerman,Gene,27,183-101,1984）のEcoRI-HindIII部
位の増幅フラグメントをクローニングするために使用し
た。これらの構築物から発現した蛋白質は、β-ガラク
トシダーゼの最初の5アミノ酸、その後に続く、β-ガラ
クトシダーゼの残りにそのC-末端で結合した組換体蛋白
質からなる。非融合蛋白質を同様に構築したが、但し、
挿入物の3'末端に停止コドンを挿入した。
【００９２】組換体蛋白質のE.coli発現 形質転換したE.coli培養物を、１mM IPTG（イソプロピ
ル-β-D-チオガラクトピラノシド）を添加して誘導し
た。２時間で、誘導後の細菌細胞を遠心分離により収集
し、SDS-PAGEサンプル緩衝液に懸濁させ、次いでイムノ
ブロッティングにより分析した。
ル-β-D-チオガラクトピラノシド）を添加して誘導し
た。２時間で、誘導後の細菌細胞を遠心分離により収集
し、SDS-PAGEサンプル緩衝液に懸濁させ、次いでイムノ
ブロッティングにより分析した。
【００９３】実施例２ ＶＣＡ−ｐ１８及びＶＣＡ−ｐ４０タンパク質の免疫反
応性 実施例１に概説した手順で得られたタンパク質の免疫反
応性をイムノブロット分析によって試験した。このため
に、ＶＣＡで誘導されたＨＨ５１４.ｃ１６細胞、ある
いは、ＢＦＲＦ３−もしくはＢｄＲＦ１−β−ガラクト
シダーゼ融合タンパク質またはβ−ガラクトシダーゼ単
独を発現する大腸菌の全細胞タンパク質を、ＳＤＳ−Ｐ
ＡＧＥによって分離し、ニトロセルロースにブロットし
た。これらのブロットから調製したストリップを個別の
血清及び抗体の調製物と共にインキュベートした。
応性 実施例１に概説した手順で得られたタンパク質の免疫反
応性をイムノブロット分析によって試験した。このため
に、ＶＣＡで誘導されたＨＨ５１４.ｃ１６細胞、ある
いは、ＢＦＲＦ３−もしくはＢｄＲＦ１−β−ガラクト
シダーゼ融合タンパク質またはβ−ガラクトシダーゼ単
独を発現する大腸菌の全細胞タンパク質を、ＳＤＳ−Ｐ
ＡＧＥによって分離し、ニトロセルロースにブロットし
た。これらのブロットから調製したストリップを個別の
血清及び抗体の調製物と共にインキュベートした。
【００９４】イムノブロット手順 イムノブロット手順は基本的に、Ｍｉｄｄｅｌｄｏｒｐ
及びＨｅｒｂｒｉｎｋ（Ｊ.Ｖｉｒｏｌ.Ｍｅｔｈ.、２
１、ｐ１３３〜１５９、１９８８）の記載の手順に従っ
て行なった。この手順を以下に要約する。ＳＤＳ−ＰＡ
ＧＥタンパク質をニトロセルロースフィルター（０.２
μ、Ｓｃｈｌｅｉｃｈｅｒ ＆ Ｓｃｈｕｅｌｌ、Ｄｅ
ｎ Ｂｏｓｃｈ、オランダ）に移した。ブロッキングバ
ッファ（Ｔｒｉｓ緩衝塩水（ＴＢＳ）中の４％粉末ドラ
イミルク、５％ウマ血清）と共に室温（ＲＴ）で少なく
とも１時間のインキュベーションを行なうことによっ
て、フィルターに対する抗体の非特異的結合を阻害し
た。ヒト血清をブロッキングバッファによって適当な希
釈度に希釈し、少なくとも１時間インキュベートした。
ブロットまたはストリップをＴＢＳ＋０.０５％ Ｔｗ
ｅｅｎ−２０（ＴＢＳｔ）で３回洗浄し、アルカリ性ホ
スファターゼ（ＡＰ）に結合した抗ヒトＩｇＧ抗体（Ｐ
ｒｏｍｅｇａ）、またはＨＲＰに結合した抗マウスＩｇ
Ｇもしくは抗ラットＩｇＧ（Ｏｒｇａｎｏｎ Ｔｅｋｎ
ｉｋａ Ｃａｐｐｅｌ、Ｂｏｘｔｅｌ、オランダ）をブ
ロッキングバッファ中に適当に希釈した溶液に添加し
た。更にインキュベーション及び洗浄処理した後、ＡＰ
の基質としてニトロブルーテトラゾリウム（ＮＢＴ）及
び５−ブロモ−４−クロロ−インドリルホスフェート
（ＢＣＩＰ）を用い、ＨＲＰの基質として４−クロロ−
ナフトールを用いて、ブロットを発色させた。
及びＨｅｒｂｒｉｎｋ（Ｊ.Ｖｉｒｏｌ.Ｍｅｔｈ.、２
１、ｐ１３３〜１５９、１９８８）の記載の手順に従っ
て行なった。この手順を以下に要約する。ＳＤＳ−ＰＡ
ＧＥタンパク質をニトロセルロースフィルター（０.２
μ、Ｓｃｈｌｅｉｃｈｅｒ ＆ Ｓｃｈｕｅｌｌ、Ｄｅ
ｎ Ｂｏｓｃｈ、オランダ）に移した。ブロッキングバ
ッファ（Ｔｒｉｓ緩衝塩水（ＴＢＳ）中の４％粉末ドラ
イミルク、５％ウマ血清）と共に室温（ＲＴ）で少なく
とも１時間のインキュベーションを行なうことによっ
て、フィルターに対する抗体の非特異的結合を阻害し
た。ヒト血清をブロッキングバッファによって適当な希
釈度に希釈し、少なくとも１時間インキュベートした。
ブロットまたはストリップをＴＢＳ＋０.０５％ Ｔｗ
ｅｅｎ−２０（ＴＢＳｔ）で３回洗浄し、アルカリ性ホ
スファターゼ（ＡＰ）に結合した抗ヒトＩｇＧ抗体（Ｐ
ｒｏｍｅｇａ）、またはＨＲＰに結合した抗マウスＩｇ
Ｇもしくは抗ラットＩｇＧ（Ｏｒｇａｎｏｎ Ｔｅｋｎ
ｉｋａ Ｃａｐｐｅｌ、Ｂｏｘｔｅｌ、オランダ）をブ
ロッキングバッファ中に適当に希釈した溶液に添加し
た。更にインキュベーション及び洗浄処理した後、ＡＰ
の基質としてニトロブルーテトラゾリウム（ＮＢＴ）及
び５−ブロモ−４−クロロ−インドリルホスフェート
（ＢＣＩＰ）を用い、ＨＲＰの基質として４−クロロ−
ナフトールを用いて、ブロットを発色させた。
【００９５】得られたブロットを図２のａ〜ｄに示す。
ブロットのレーン１〜１２では以下の血清を夫々使用し
た： １．β−Ｇａｌに対するマウスモノクローナル抗体（Ｐ
ｒｏｍｅｇａ）； ２．天然ウイルスキャプシドタンパク質（ＥＢＶ.ＯＴ
４１Ａ）で免疫感作することによって増強したＶＣＡ−
Ｐ４０に対するマウスモノクローナル抗体； ３．ウイルスＶＣＡ−Ｐ１８の特異的イムノアフィニテ
ィ精製によって得られたウイルスＶＣＡ−Ｐ１８に単一
特異性のヒト抗体； ４−５．ヒトＥＢＶ−血清陰性の血清； ６−１６．ウイルスＶＣＡ−Ｐ１８及びＶＣＡ−Ｐ４０
に対して異なる相対反応性を有するヒトＥＢＶ−血清陽
性の血清。
ブロットのレーン１〜１２では以下の血清を夫々使用し
た： １．β−Ｇａｌに対するマウスモノクローナル抗体（Ｐ
ｒｏｍｅｇａ）； ２．天然ウイルスキャプシドタンパク質（ＥＢＶ.ＯＴ
４１Ａ）で免疫感作することによって増強したＶＣＡ−
Ｐ４０に対するマウスモノクローナル抗体； ３．ウイルスＶＣＡ−Ｐ１８の特異的イムノアフィニテ
ィ精製によって得られたウイルスＶＣＡ−Ｐ１８に単一
特異性のヒト抗体； ４−５．ヒトＥＢＶ−血清陰性の血清； ６−１６．ウイルスＶＣＡ−Ｐ１８及びＶＣＡ−Ｐ４０
に対して異なる相対反応性を有するヒトＥＢＶ−血清陽
性の血清。
【００９６】図２のａは、１２.５％アクリルアミド中
の還元性ＳＤＳ−ＰＡＧＥによって分離した天然ウイル
スポリペプチドの免疫反応性を示す。抗β−ガラクトシ
ダーゼ抗体（１）は陰性であるが、ＶＣＡ−ｐ４０に特
異的な抗血清（２）及びＶＣＡ−ｐ１８に特異的な抗血
清（３）は夫々のウイルスタンパク質と反応する。ヒト
ＥＢＶ−陰性血清で染色したストリップ４及び５は反応
性を全く示さないが、健常な血清陽性血液のドナー（６
〜１５）または活性ＥＢＶ疾患患者（１６）中で観察し
たストリップ６〜１６は、ＥＢＶ−タンパク質に対して
種々の免疫反応性を示す。ＶＣＡ−ｐ１８及びＶＣＡ−
ｐ４０のバンドの位置を右側に示す。
の還元性ＳＤＳ−ＰＡＧＥによって分離した天然ウイル
スポリペプチドの免疫反応性を示す。抗β−ガラクトシ
ダーゼ抗体（１）は陰性であるが、ＶＣＡ−ｐ４０に特
異的な抗血清（２）及びＶＣＡ−ｐ１８に特異的な抗血
清（３）は夫々のウイルスタンパク質と反応する。ヒト
ＥＢＶ−陰性血清で染色したストリップ４及び５は反応
性を全く示さないが、健常な血清陽性血液のドナー（６
〜１５）または活性ＥＢＶ疾患患者（１６）中で観察し
たストリップ６〜１６は、ＥＢＶ−タンパク質に対して
種々の免疫反応性を示す。ＶＣＡ−ｐ１８及びＶＣＡ−
ｐ４０のバンドの位置を右側に示す。
【００９７】図２のｂは、１０％アクリルアミド中の還
元性ＳＤＳ−ＰＡＧＥによって分離されたＶＣＡ−ｐ１
８ β−ガラクトシダーゼ融合タンパク質（ＢＦＲＦ３
−ＬａｃＺ）を発現する大腸菌に由来の全細胞タンパク
質の免疫反応性を示す。抗β−ガラクトシダーゼ抗体
（１）及び抗ＶＣＡ−ｐ１８抗体（３）は、１３４ｋＤ
ａの出発融合タンパク質が大腸菌中でタンパク質分解に
よって断片化されることによって生じた複数のタンパク
質バンドと特異的に反応する。抗ＶＣＡ−ｐ４０モノク
ローナル抗体（２）は、ヒトＥＢＶ−陰性の血清（４−
５）と全く同様に陰性である。ウイルスＶＣＡ−ｐ１８
に対して種々の反応性を示すヒト血清は、融合タンパク
質に対しても同様の種々の反応性を示す。ここでも多数
のバンドの染色は大腸菌中の融合タンパク質のタンパク
質分解に起因する。
元性ＳＤＳ−ＰＡＧＥによって分離されたＶＣＡ−ｐ１
８ β−ガラクトシダーゼ融合タンパク質（ＢＦＲＦ３
−ＬａｃＺ）を発現する大腸菌に由来の全細胞タンパク
質の免疫反応性を示す。抗β−ガラクトシダーゼ抗体
（１）及び抗ＶＣＡ−ｐ１８抗体（３）は、１３４ｋＤ
ａの出発融合タンパク質が大腸菌中でタンパク質分解に
よって断片化されることによって生じた複数のタンパク
質バンドと特異的に反応する。抗ＶＣＡ−ｐ４０モノク
ローナル抗体（２）は、ヒトＥＢＶ−陰性の血清（４−
５）と全く同様に陰性である。ウイルスＶＣＡ−ｐ１８
に対して種々の反応性を示すヒト血清は、融合タンパク
質に対しても同様の種々の反応性を示す。ここでも多数
のバンドの染色は大腸菌中の融合タンパク質のタンパク
質分解に起因する。
【００９８】図２のｃは、大腸菌中のＶＣＡ−ｐ４０−
β−ガラクトシダーゼ融合タンパク質を同様に分析した
結果を示す。このタンパク質はタンパク質分解の作用を
受け難いので１５６ｋＤａに単一バンドを生じる。図２
のｃは図２のｂと同様に解釈できる。
β−ガラクトシダーゼ融合タンパク質を同様に分析した
結果を示す。このタンパク質はタンパク質分解の作用を
受け難いので１５６ｋＤａに単一バンドを生じる。図２
のｃは図２のｂと同様に解釈できる。
【００９９】図２のｄは、β−ガラクトシダーゼ単独を
発現する大腸菌を用いた対照ブロットを示す。
発現する大腸菌を用いた対照ブロットを示す。
【０１００】上記の試験より、個々の大腸菌構築物が夫
々の融合タンパク質を実際に発現することは明らかであ
る。ヒト血清は、発現されたタンパク質に対して天然ウ
イルスタンパク質に対するときと同じ反応性を示す。
々の融合タンパク質を実際に発現することは明らかであ
る。ヒト血清は、発現されたタンパク質に対して天然ウ
イルスタンパク質に対するときと同じ反応性を示す。
【０１０１】実施例３ 免疫吸着 本発明の代替ペプチド及び対応する天然ウイルスタンパ
ク質の免疫化学的一致は、（１種または複数の）天然ウ
イルスタンパク質を含むイムノブロットに反応性のヒト
血清に、種々の濃度の本発明のペプチドを予め吸収させ
ると、このブロットにおいて対応天然ウイルスタンパク
質に対する特異的抗体反応性が消失することによって証
明できる。この方法によれば、免疫化学的一致を証明で
きるだけでなく、イムノブロット上のウイルスタンパク
質の免疫反応性が単一種の（主要）タンパク質種に対す
る抗体結合によって媒介されるという確実な証拠も得ら
れる。
ク質の免疫化学的一致は、（１種または複数の）天然ウ
イルスタンパク質を含むイムノブロットに反応性のヒト
血清に、種々の濃度の本発明のペプチドを予め吸収させ
ると、このブロットにおいて対応天然ウイルスタンパク
質に対する特異的抗体反応性が消失することによって証
明できる。この方法によれば、免疫化学的一致を証明で
きるだけでなく、イムノブロット上のウイルスタンパク
質の免疫反応性が単一種の（主要）タンパク質種に対す
る抗体結合によって媒介されるという確実な証拠も得ら
れる。
【０１０２】上記のごとき実験をＶＣＡ−ｐ１８マーカ
ータンパク質に対して行なった。
ータンパク質に対して行なった。
【０１０３】即ち、３人の健康なＥＢＶ−血清陽性のド
ナーから得られたヒト血清（血清９２、血清２１４及び
血清２１９）の免疫反応性を、１０％アクリルアミドゲ
ル中の還元性ＳＤＳ−ＰＡＧＥによって分離したＶＣＡ
−誘導ＨＨ５１４細胞から得られた核抗原を含むニトロ
セルロースストリップ上のイムノブロット分析によって
試験した。イムノブロット分析の前に、漸増量の精製Ｂ
ＦＲＦ３−β−ガラクトシダーゼ融合タンパク質または
β−ガラクトシダーゼ単独を血清に予め吸収させるため
に、＋４℃で一夜維持した。Ｎ−クロロ−ナフトールを
沈降性基質として用い、ペルオキシダーゼ標識ヒツジ抗
ヒトＩｇＧを用いてＩｇＧ−反応性に関し染色した。
ナーから得られたヒト血清（血清９２、血清２１４及び
血清２１９）の免疫反応性を、１０％アクリルアミドゲ
ル中の還元性ＳＤＳ−ＰＡＧＥによって分離したＶＣＡ
−誘導ＨＨ５１４細胞から得られた核抗原を含むニトロ
セルロースストリップ上のイムノブロット分析によって
試験した。イムノブロット分析の前に、漸増量の精製Ｂ
ＦＲＦ３−β−ガラクトシダーゼ融合タンパク質または
β−ガラクトシダーゼ単独を血清に予め吸収させるため
に、＋４℃で一夜維持した。Ｎ−クロロ−ナフトールを
沈降性基質として用い、ペルオキシダーゼ標識ヒツジ抗
ヒトＩｇＧを用いてＩｇＧ−反応性に関し染色した。
【０１０４】この実験の結果を図３に示す。１：１００
に希釈した１ｍｌの血清に予め吸収させるために使用し
た精製ＢＦＲＦ３−β−ガラクトシダーゼ融合タンパク
質の量を、図３に示すようなイムノブロットの夫々のレ
ーンで分析すると以下の結果が得られた： レーン１：０μｇ ＢＦＲＦ３−β−ガラクトシダー
ゼ； レーン２：０.０１μｇ ＢＦＲＦ３−β−ガラクトシ
ダーゼ； レーン３：０.１μｇ ＢＦＲＦ３−β−ガラクトシダ
ーゼ； レーン４：０.５μｇ ＢＦＲＦ３−β−ガラクトシダ
ーゼ； レーン５：１μｇ ＢＦＲＦ３−β−ガラクトシダー
ゼ。
に希釈した１ｍｌの血清に予め吸収させるために使用し
た精製ＢＦＲＦ３−β−ガラクトシダーゼ融合タンパク
質の量を、図３に示すようなイムノブロットの夫々のレ
ーンで分析すると以下の結果が得られた： レーン１：０μｇ ＢＦＲＦ３−β−ガラクトシダー
ゼ； レーン２：０.０１μｇ ＢＦＲＦ３−β−ガラクトシ
ダーゼ； レーン３：０.１μｇ ＢＦＲＦ３−β−ガラクトシダ
ーゼ； レーン４：０.５μｇ ＢＦＲＦ３−β−ガラクトシダ
ーゼ； レーン５：１μｇ ＢＦＲＦ３−β−ガラクトシダー
ゼ。
【０１０５】β−ガラクトシダーゼ単独を予め吸収させ
たレーンをレーンβとして示す。
たレーンをレーンβとして示す。
【０１０６】図３より、予吸収処理中にＶＣＡ−ｐ１８
を示すバンド（矢印）の反応性が、ＢＦＲＦ３−β−ガ
ラクトシダーゼ融合タンパク質の濃度増加に伴って喪失
されることが理解されよう。β−ガラクトシダーゼ単独
を予め吸収させても全く効果がないこと、また、予吸収
処理が別のＥＢＶ−タンパク質との反応性にも全く影響
を与えないことが理解されよう。近縁でないタンパク質
（例えば７２ｋＤのＥＢＮＡまたは４０ｋＤのＶＣＡ−
ｐ４０）の染色は生じない。
を示すバンド（矢印）の反応性が、ＢＦＲＦ３−β−ガ
ラクトシダーゼ融合タンパク質の濃度増加に伴って喪失
されることが理解されよう。β−ガラクトシダーゼ単独
を予め吸収させても全く効果がないこと、また、予吸収
処理が別のＥＢＶ−タンパク質との反応性にも全く影響
を与えないことが理解されよう。近縁でないタンパク質
（例えば７２ｋＤのＥＢＮＡまたは４０ｋＤのＶＣＡ−
ｐ４０）の染色は生じない。
【０１０７】上記の実験から、ヒト血清抗体によるウイ
ルスＶＣＡ−ｐ１８の免疫染色はこれらの血清にＢＦＲ
Ｆ３融合タンパク質を予め吸収させることによって特異
的に阻害され、これがＶＣＡ−ｐ１８とＢＦＲＦ３読取
枠によってコードされるタンパク質との免疫化学的一致
を証明することが明らかである。これらの実験はまた、
ヒト血清とＶＣＡ−ｐ１８との反応性が単一ウイルスタ
ンパク質との相互作用によって生じることを示す。
ルスＶＣＡ−ｐ１８の免疫染色はこれらの血清にＢＦＲ
Ｆ３融合タンパク質を予め吸収させることによって特異
的に阻害され、これがＶＣＡ−ｐ１８とＢＦＲＦ３読取
枠によってコードされるタンパク質との免疫化学的一致
を証明することが明らかである。これらの実験はまた、
ヒト血清とＶＣＡ−ｐ１８との反応性が単一ウイルスタ
ンパク質との相互作用によって生じることを示す。
【０１０８】実施例４ ＰＥＰＳＣＡＮによる免疫反応性エピトープの局在ペプチド合成及びイムノスクリーニング（ＰＥＰＳＣＡ
Ｎ） １２個のアミノ酸（ＡＡ）の長さを有し且つＯＲＦ Ｂ
ＦＲＦ３及びＢｄＲＦ１のアミノ酸配列の１１個のアミ
ノ酸がオーバーラップしたペプチドを、Ｇｅｉｊｓｅｎ
らによって最初に記載された化学的に活性化したポリエ
チレンピン上に全自動固相ペプチド合成法（Ｐｒｏｃ.
Ｎａｔ.Ａｃａｄ.Ｓｃｉ.、アメリカ、８３、３９９８
〜４００２、１９８４）によって合成した。健康なＥＢ
Ｖ血清陽性のドナーから採取した１５の血清を用い、Ｅ
ＢＶ特異的抗体に対する免疫反応性を、Ｍｉｄｄｅｌｄ
ｏｒｐ及びＭｅｌｏｅｎによって記載された方法（Ｊ.
Ｖｉｒｏｌ.ｍｅｔｈ.、２１、１４７〜１５９、１９８
８）で決定した。ＶＣＡ−ｐ１８配列に由来の１２個の
アミノ酸から成るペプチドのＰＥＰＳＣＡＮ分析の結果
を図４に示す。Ｘ軸の数字は、分析した１２量体（１２
−ｍｅｒ）ペプチドの各々のＶＣＡ−ｐ１８配列上の初
期位置を示す。ＢＦＲＦ３読取枠にコードされたＶＣＡ
−ｐ１８タンパク質の１２量体ペプチドに対して反応性
を有していたヒト血清のパーセンテージを図４のＹ軸に
示す。同一組のピンに対するＥＢＶ−血清陰性のヒト血
清の平均反応性を上回る標準偏差の３倍を陽性反応と定
義する。図４から、３つの免疫支配性ドメインを定義で
きる：ドメインＩ；ＡＡ１２０〜１４０、ドメインII：
ＡＡ１５２〜１５５、ドメインIII：ＡＡ１５９〜１６
５（これらの数字はまたＰＥＰＳＣＡＮに使用した１２
量体ペプチドの初期位置を示す）。表１は、この試験に
使用した個々の血清の各々に対して最も反応性の大きい
ペプチドを詳細に示している。表１の第１レーンは、個
々の血清の番号を示す。第２レーンは、ドメインＩの内
部の最も反応性の大きいペプチドのＰＥＰＳＣＡＮ Ｏ
Ｄ４５０値（４５０ｎｍの光学密度）を示す。このペプ
チドはレーン３に示されている。レーン４及び５はドメ
インII及びIIIに対する同様のデータを示す。
Ｎ） １２個のアミノ酸（ＡＡ）の長さを有し且つＯＲＦ Ｂ
ＦＲＦ３及びＢｄＲＦ１のアミノ酸配列の１１個のアミ
ノ酸がオーバーラップしたペプチドを、Ｇｅｉｊｓｅｎ
らによって最初に記載された化学的に活性化したポリエ
チレンピン上に全自動固相ペプチド合成法（Ｐｒｏｃ.
Ｎａｔ.Ａｃａｄ.Ｓｃｉ.、アメリカ、８３、３９９８
〜４００２、１９８４）によって合成した。健康なＥＢ
Ｖ血清陽性のドナーから採取した１５の血清を用い、Ｅ
ＢＶ特異的抗体に対する免疫反応性を、Ｍｉｄｄｅｌｄ
ｏｒｐ及びＭｅｌｏｅｎによって記載された方法（Ｊ.
Ｖｉｒｏｌ.ｍｅｔｈ.、２１、１４７〜１５９、１９８
８）で決定した。ＶＣＡ−ｐ１８配列に由来の１２個の
アミノ酸から成るペプチドのＰＥＰＳＣＡＮ分析の結果
を図４に示す。Ｘ軸の数字は、分析した１２量体（１２
−ｍｅｒ）ペプチドの各々のＶＣＡ−ｐ１８配列上の初
期位置を示す。ＢＦＲＦ３読取枠にコードされたＶＣＡ
−ｐ１８タンパク質の１２量体ペプチドに対して反応性
を有していたヒト血清のパーセンテージを図４のＹ軸に
示す。同一組のピンに対するＥＢＶ−血清陰性のヒト血
清の平均反応性を上回る標準偏差の３倍を陽性反応と定
義する。図４から、３つの免疫支配性ドメインを定義で
きる：ドメインＩ；ＡＡ１２０〜１４０、ドメインII：
ＡＡ１５２〜１５５、ドメインIII：ＡＡ１５９〜１６
５（これらの数字はまたＰＥＰＳＣＡＮに使用した１２
量体ペプチドの初期位置を示す）。表１は、この試験に
使用した個々の血清の各々に対して最も反応性の大きい
ペプチドを詳細に示している。表１の第１レーンは、個
々の血清の番号を示す。第２レーンは、ドメインＩの内
部の最も反応性の大きいペプチドのＰＥＰＳＣＡＮ Ｏ
Ｄ４５０値（４５０ｎｍの光学密度）を示す。このペプ
チドはレーン３に示されている。レーン４及び５はドメ
インII及びIIIに対する同様のデータを示す。
【０１０９】
【表１】 実施例５ ＢＦＲＦ３によってコードされたＶＣＡ−ｐ１８タンパ
ク質またはＢｄＲＦ１によってコードされたＶＣＡ−ｐ
４０タンパク質に対するラット及びマウスのモノクロー
ナル抗体によるＰＥＰＳＣＡＮ分析 実施例４に記載の手順と同様にしてヒト血清に対するＰ
ＥＰＳＣＡＮ分析を行なって、モノクローナル抗体によ
って検出された直鎖状エピトープの位置を作図した。
ク質またはＢｄＲＦ１によってコードされたＶＣＡ−ｐ
４０タンパク質に対するラット及びマウスのモノクロー
ナル抗体によるＰＥＰＳＣＡＮ分析 実施例４に記載の手順と同様にしてヒト血清に対するＰ
ＥＰＳＣＡＮ分析を行なって、モノクローナル抗体によ
って検出された直鎖状エピトープの位置を作図した。
【０１１０】図５及び図６は、各々が異なる直鎖状エピ
トープを検出するＶＣＡ−ｐ１８に対する２つのラット
モノクローナル抗体（夫々ＥＢＶ.ＯＴ１５Ｅ及びＥＢ
Ｖ.ＯＴ１５Ｉ）を用いたかかる分析のＰＥＰＳＣＡＮ
結果を示す。
トープを検出するＶＣＡ−ｐ１８に対する２つのラット
モノクローナル抗体（夫々ＥＢＶ.ＯＴ１５Ｅ及びＥＢ
Ｖ.ＯＴ１５Ｉ）を用いたかかる分析のＰＥＰＳＣＡＮ
結果を示す。
【０１１１】図７は、ＢｄＲＦ１読取枠によってコード
されたＶＣＡ−ｐ４０に対するマウスモノクローナル抗
体（ＥＢＶ.ＯＴ４１Ａ）のＰＥＰＳＣＡＮ結果を示
す。ＶＣＡ−ｐ４０（ＢｄＲＦ１）配列に対する２つの
ラットモノクローナルの交差分析及びＶＣＡ−ｐ１８
（ＢＦＲＦ３）配列に対するマウスモノクローナルの交
差分析（ｖｉｃｅ−ｖｅｒｓａ）は明白な陰性結果を示
す。
されたＶＣＡ−ｐ４０に対するマウスモノクローナル抗
体（ＥＢＶ.ＯＴ４１Ａ）のＰＥＰＳＣＡＮ結果を示
す。ＶＣＡ−ｐ４０（ＢｄＲＦ１）配列に対する２つの
ラットモノクローナルの交差分析及びＶＣＡ−ｐ１８
（ＢＦＲＦ３）配列に対するマウスモノクローナルの交
差分析（ｖｉｃｅ−ｖｅｒｓａ）は明白な陰性結果を示
す。
【０１１２】図７から、ＥＢＶ.ＯＴ４１ＡがＶＣＡ−
ｐ４０タンパク質のＣ末端領域に明確な直鎖状エピトー
プを認識することが明らかである。
ｐ４０タンパク質のＣ末端領域に明確な直鎖状エピトー
プを認識することが明らかである。
【０１１３】実施例６ コンピュータ分析及びＰＥＰＳＣＡＮによるＢＦＲＦ３
にコードされたＶＣＡ−ｐ１８タンパク質に由来の合成
ペプチドの選択、及びこれらのペプチドと正常ヒトドナ
ー血清との免疫反応性の分析 ｔ−ＢＯＣ化学を用いた標準固相合成によって合成ペプ
チドを調製した。
にコードされたＶＣＡ−ｐ１８タンパク質に由来の合成
ペプチドの選択、及びこれらのペプチドと正常ヒトドナ
ー血清との免疫反応性の分析 ｔ−ＢＯＣ化学を用いた標準固相合成によって合成ペプ
チドを調製した。
【０１１４】ＢＦＲＦ３によってコードされたＶＣＡ−
ｐ１８タンパク質に由来のペプチドを、Ｊａｍｅｓｏｎ
及びＷｏｌｆ（ＣＡＢＩＯＳ ４、１８１〜１８６、１
９８８）によって開発されたコンピュータプログラム
「抗原性指数」を用いて予測された高い抗原性に基づい
て、または実施例４に記載したようなＰＥＰＳＣＡＮに
おける機能性の高抗原反応性に基づいて選択した（図８
のペプチド１及び２は前者に基づいて選択され、図８の
ペプチド３及び４は後者に基づいて選択された。ペプチ
ド３及び４は表１のドメインＩ＋II及びドメインIIIを
示す）。更に、ＰＥＰＳＣＡＮによって同定された最も
反応性の大きい３つのドメインを結合させ、ＰＥＰＳＣ
ＡＮ反応性の低いペプチド領域を除去した結合ペプチド
を調製した（図８のペプチド５）。
ｐ１８タンパク質に由来のペプチドを、Ｊａｍｅｓｏｎ
及びＷｏｌｆ（ＣＡＢＩＯＳ ４、１８１〜１８６、１
９８８）によって開発されたコンピュータプログラム
「抗原性指数」を用いて予測された高い抗原性に基づい
て、または実施例４に記載したようなＰＥＰＳＣＡＮに
おける機能性の高抗原反応性に基づいて選択した（図８
のペプチド１及び２は前者に基づいて選択され、図８の
ペプチド３及び４は後者に基づいて選択された。ペプチ
ド３及び４は表１のドメインＩ＋II及びドメインIIIを
示す）。更に、ＰＥＰＳＣＡＮによって同定された最も
反応性の大きい３つのドメインを結合させ、ＰＥＰＳＣ
ＡＮ反応性の低いペプチド領域を除去した結合ペプチド
を調製した（図８のペプチド５）。
【０１１５】以下のアミノ酸配列を有するペプチド１〜
５を、０.０５ＭのＮＨＣＯ3バッファ ｐＨ９.６中に
１μｇ／ｍｌの濃度で、固相、即ちポリスチレンマイク
ロタイタープレートのウェルにコートし、４℃で一夜維
持した。リン酸塩緩衝塩水（ＰＢＳ）ｐＨ７.４で２回
洗浄した後でウェルに１００μｌのヒト血清を充填し、
０.０５％Ｔｗｅｅｎ ２０を含有するＰＢＳ（ＰＢＳ
Ｔ）で１：１００に希釈し、３７℃で１時間インキュベ
ートした。ＰＢＳ−Ｔで３回洗浄した後で、ＰＢＳ−Ｔ
中に適当な希釈度で希釈したＨＲＰ標識ヒツジ抗ヒトＩ
ｇＧ抗体を添加し、３７℃で１時間インキュベートし
た。ＰＢＳ−Ｔで３回洗浄した後で、結合した酵素活性
を、テトラメチルベンジジンを基質として用いることに
よって検出した。３０分後に、１００μｌの１ＭのＨ2
ＳＯ4を添加することによって反応を停止させた。Ｍｕ
ｌｔｉｓｃａｎホトメーターを使用して４５０ｎｍの吸
光度を測定した。標準免疫蛍光血清学または前述のイム
ノブロット分析を用いて血清中のＥＢＶ抗体を試験し
た。
５を、０.０５ＭのＮＨＣＯ3バッファ ｐＨ９.６中に
１μｇ／ｍｌの濃度で、固相、即ちポリスチレンマイク
ロタイタープレートのウェルにコートし、４℃で一夜維
持した。リン酸塩緩衝塩水（ＰＢＳ）ｐＨ７.４で２回
洗浄した後でウェルに１００μｌのヒト血清を充填し、
０.０５％Ｔｗｅｅｎ ２０を含有するＰＢＳ（ＰＢＳ
Ｔ）で１：１００に希釈し、３７℃で１時間インキュベ
ートした。ＰＢＳ−Ｔで３回洗浄した後で、ＰＢＳ−Ｔ
中に適当な希釈度で希釈したＨＲＰ標識ヒツジ抗ヒトＩ
ｇＧ抗体を添加し、３７℃で１時間インキュベートし
た。ＰＢＳ−Ｔで３回洗浄した後で、結合した酵素活性
を、テトラメチルベンジジンを基質として用いることに
よって検出した。３０分後に、１００μｌの１ＭのＨ2
ＳＯ4を添加することによって反応を停止させた。Ｍｕ
ｌｔｉｓｃａｎホトメーターを使用して４５０ｎｍの吸
光度を測定した。標準免疫蛍光血清学または前述のイム
ノブロット分析を用いて血清中のＥＢＶ抗体を試験し
た。
【０１１６】以下のペプチドを使用した： ペプチド１：Ｈ2Ｎ−ＧＶＰＲＲＱＲＡＩＤＫＲＱＲＡ
−ＣＯＯＨ； ペプチド２：Ｈ2Ｎ−ＧＱＰＨＤＴＡＰＲＧＡＲＫＫＱ
−ＣＯＯＨ； ペプチド３：Ｈ2Ｎ−ＡＶＤＴＧＳＧＧＧＧＱＰＨＤＴ
ＡＰＲＧＡＲＫＫＱ−ＣＯＯＨ； ペプチド４：Ｈ2Ｎ−ＳＴＡＶＡＱＳＡＴＰＳＶＳＳＳ
ＩＳＳＬＲＡＡＴＳＧＡＴＡＡＡ−ＣＯＯＨ； ペプチド５：ペプチド４のＣ末端及びペプチド３のＮ末
端の外部（ｅｘｔｒａ）システイン残基を用いＳ−Ｓ−
架橋によって結合させたペプチド４と３との結合ペプチ
ド。
−ＣＯＯＨ； ペプチド２：Ｈ2Ｎ−ＧＱＰＨＤＴＡＰＲＧＡＲＫＫＱ
−ＣＯＯＨ； ペプチド３：Ｈ2Ｎ−ＡＶＤＴＧＳＧＧＧＧＱＰＨＤＴ
ＡＰＲＧＡＲＫＫＱ−ＣＯＯＨ； ペプチド４：Ｈ2Ｎ−ＳＴＡＶＡＱＳＡＴＰＳＶＳＳＳ
ＩＳＳＬＲＡＡＴＳＧＡＴＡＡＡ−ＣＯＯＨ； ペプチド５：ペプチド４のＣ末端及びペプチド３のＮ末
端の外部（ｅｘｔｒａ）システイン残基を用いＳ−Ｓ−
架橋によって結合させたペプチド４と３との結合ペプチ
ド。
【０１１７】図８は、固相にコートしたペプチド１〜５
及び標準手順に従って１：１００の希釈度で使用した健
康なヒト血液ドナーのランダムパネルとを用いたＥＬＩ
ＳＡ実験の結果を示す。
及び標準手順に従って１：１００の希釈度で使用した健
康なヒト血液ドナーのランダムパネルとを用いたＥＬＩ
ＳＡ実験の結果を示す。
【０１１８】次にこれらの血清について、ウイルスＶＣ
Ａ−ｐ１８との反応性をイムノブロットによって試験し
た。
Ａ−ｐ１８との反応性をイムノブロットによって試験し
た。
【０１１９】これらの実験によれば、自然感染した個体
から得られた血清の場合、ほとんど全部の血清がペプチ
ド１に対して陰性であり且つペプチド２は試験血清の約
５０％だけと反応したので、「抗原性指数」プログラム
に基づいたコンピュータ予測では、これらの血清に対す
る免疫原性に関する予測値が全く得られないことは明ら
かである。ＰＥＰＳＣＡＮに基づいて選択されたペプチ
ドは試験血清の夫々に対して６０〜８０％の良好な反応
性を示す。意外にも、ペプチド３と４とを結合させた結
合ペプチドは、ヒト血清に対して９５％の反応性を示
す。Ｐ１８イムノブロット陰性血清は選択されたペプチ
ド類に対して反応性を全く示さない。
から得られた血清の場合、ほとんど全部の血清がペプチ
ド１に対して陰性であり且つペプチド２は試験血清の約
５０％だけと反応したので、「抗原性指数」プログラム
に基づいたコンピュータ予測では、これらの血清に対す
る免疫原性に関する予測値が全く得られないことは明ら
かである。ＰＥＰＳＣＡＮに基づいて選択されたペプチ
ドは試験血清の夫々に対して６０〜８０％の良好な反応
性を示す。意外にも、ペプチド３と４とを結合させた結
合ペプチドは、ヒト血清に対して９５％の反応性を示
す。Ｐ１８イムノブロット陰性血清は選択されたペプチ
ド類に対して反応性を全く示さない。
【０１２０】実施例７ ＢＦＲＦ３によってコードされたＶＣＡ−ｐ１８タンパ
ク質に由来の結合ペプチド５と種々のサブクラスのヒト
血清抗体との反応性 実施例６に示すようなアミノ酸配列を有している結合ペ
プチド５を用い、種々のサブクラスのヒト血清免疫グロ
ブリンに対す反応性をＥＬＩＳＡによって試験した（実
施例６に記載の手順）。全ての場合に、実施例６と全く
同様に結合ペプチド５を固相に使用した。１：１００に
希釈した血清を使用して実施例６に記載したように抗体
反応性を検出した。結果を図９〜１１に示す。ＩｇＧ反
応性を阻害するために、製造業者の指示通りにＧｕｌｌ
−Ｓｏｒｂ（Ｇｕｌｌ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ Ｉ
ｎｃ.、Ｓａｌｔ Ｌａｋｅ Ｃｉｔｙ、Ｕｔａｈ、米
国）をヒト血清に予め吸収させ、このヒト血清中でＩｇ
Ｍ反応性を検出した。ヒトＩｇＭのＨ鎖に特異的なＨＲ
Ｐ標識ヒツジ抗ヒトＩｇＭ抗体によってＩｇＭ抗体を検
出した。
ク質に由来の結合ペプチド５と種々のサブクラスのヒト
血清抗体との反応性 実施例６に示すようなアミノ酸配列を有している結合ペ
プチド５を用い、種々のサブクラスのヒト血清免疫グロ
ブリンに対す反応性をＥＬＩＳＡによって試験した（実
施例６に記載の手順）。全ての場合に、実施例６と全く
同様に結合ペプチド５を固相に使用した。１：１００に
希釈した血清を使用して実施例６に記載したように抗体
反応性を検出した。結果を図９〜１１に示す。ＩｇＧ反
応性を阻害するために、製造業者の指示通りにＧｕｌｌ
−Ｓｏｒｂ（Ｇｕｌｌ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ Ｉ
ｎｃ.、Ｓａｌｔ Ｌａｋｅ Ｃｉｔｙ、Ｕｔａｈ、米
国）をヒト血清に予め吸収させ、このヒト血清中でＩｇ
Ｍ反応性を検出した。ヒトＩｇＭのＨ鎖に特異的なＨＲ
Ｐ標識ヒツジ抗ヒトＩｇＭ抗体によってＩｇＭ抗体を検
出した。
【０１２１】また、抗ＩｇＡ特異的ＨＲＰ標識第二抗体
を使用し、Ｇｕｌｌ Ｓｏｒｂで処理した血清中のＩｇ
Ａ反応性を検出した。図９の血清（ＩｇＧ）は、標準血
清学によってＶＣＡ−ＩｇＧ陽性の７６人の健康な血清
陽性の血液ドナーとＥＢＶ抗体陰性の９人のドナーとか
ら得られた。
を使用し、Ｇｕｌｌ Ｓｏｒｂで処理した血清中のＩｇ
Ａ反応性を検出した。図９の血清（ＩｇＧ）は、標準血
清学によってＶＣＡ−ＩｇＧ陽性の７６人の健康な血清
陽性の血液ドナーとＥＢＶ抗体陰性の９人のドナーとか
ら得られた。
【０１２２】図１０の血清（ＩｇＭ）は、標準血清学に
よってＶＣＡ−ＩｇＭ陽性の２６人の単核細胞症患者と
ＶＣＡ−ＩｇＭ陰性でＶＣＡ−ＩｇＧ陽性の１８人の健
康なドナーとから得られた。
よってＶＣＡ−ＩｇＭ陽性の２６人の単核細胞症患者と
ＶＣＡ−ＩｇＭ陰性でＶＣＡ−ＩｇＧ陽性の１８人の健
康なドナーとから得られた。
【０１２３】図１１の血清（ＩｇＡ）は、ＩｇＡ特異的
データは入手できなかったがＩｇＧ−ＶＣＡ陽性の３５
人の鼻咽頭癌患者とＶＣＡ−ＩｇＧ陽性の７人の健康な
ドナーとから得られた。
データは入手できなかったがＩｇＧ−ＶＣＡ陽性の３５
人の鼻咽頭癌患者とＶＣＡ−ＩｇＧ陽性の７人の健康な
ドナーとから得られた。
【０１２４】上記実験より、ＶＣＡ−ｐ１８に由来の結
合ペプチドがＥＢＶ−ＶＣＡに対するＩｇＧ、ＩｇＭ及
びＩｇＡ抗体の特異的検出に使用でき、標準血清学的方
法と同様の感度またはより優れた感度を有することが理
解されよう。すべての場合にＥＢＶ陰性血清は陰性であ
る。
合ペプチドがＥＢＶ−ＶＣＡに対するＩｇＧ、ＩｇＭ及
びＩｇＡ抗体の特異的検出に使用でき、標準血清学的方
法と同様の感度またはより優れた感度を有することが理
解されよう。すべての場合にＥＢＶ陰性血清は陰性であ
る。
【０１２５】
【配列表】配列番号：１ 配列の長さ：５３８塩基対 配列の型：核酸 鎖の数：二本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：Ｇｅｎｏｍｉｃ ＤＮＡ 起源 生物名：Ｅｐｓｔｅｉｎ−Ｂａｒｒウイルス 配列
【０１２６】
【表２】 配列番号：２ 配列の長さ：１７６アミノ酸 配列の型：アミノ酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：ペプチド 起源 生物名：Ｅｐｓｔｅｉｎ−Ｂａｒｒウイルス 配列
【０１２７】
【表３】 配列番号：３ 配列の長さ：１０３８塩基対 配列の型：核酸 鎖の数：二本鎖 トポロジー：不明 配列の種類：Ｇｅｎｏｍｉｃ ＤＮＡ 起源 生物名：Ｅｐｓｔｅｉｎ−Ｂａｒｒウイルス 配列
【０１２８】
【表４】 配列番号：４ 配列の長さ：３４５アミノ酸 配列の型：アミノ酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：ペプチド 起源 生物名：Ｅｐｓｔｅｉｎ−Ｂａｒｒウイルス 配列
【０１２９】
【表５】 （配列番号：４の配列のつづき）
【０１３０】
【表６】 配列番号：５ 配列の長さ：２４アミノ酸 配列の型：アミノ酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：ペプチド 起源 生物名：Ｅｐｓｔｅｉｎ−Ｂａｒｒウイルス 配列
【０１３１】
【表７】 配列番号：６ 配列の長さ：３０アミノ酸 配列の型：アミノ酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：ペプチド 起源 生物名：Ｅｐｓｔｅｉｎ−Ｂａｒｒウイルス 配列
【０１３２】
【表８】 配列番号：７ 配列の長さ：１５アミノ酸 配列の型：アミノ酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：ペプチド 起源 生物名：Ｅｐｓｔｅｉｎ−Ｂａｒｒウイルス 配列
【０１３３】
【表９】 配列番号：８ 配列の長さ：１５アミノ酸 配列の型：アミノ酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：ペプチド 起源 生物名：Ｅｐｓｔｅｉｎ−Ｂａｒｒウイルス 配列
【０１３４】
【表１０】 配列番号：９ 配列の長さ：１２アミノ酸 配列の型：アミノ酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：ペプチド 起源 生物名：Ｅｐｓｔｅｉｎ−Ｂａｒｒウイルス 配列
【０１３５】
【表１１】 配列番号：１０ 配列の長さ：１２アミノ酸 配列の型：アミノ酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：ペプチド 起源 生物名：Ｅｐｓｔｅｉｎ−Ｂａｒｒウイルス 配列
【０１３６】
【表１２】 配列番号：１１ 配列の長さ：１２アミノ酸 配列の型：アミノ酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：ペプチド 起源 生物名：Ｅｐｓｔｅｉｎ−Ｂａｒｒウイルス 配列
【０１３７】
【表１３】 配列番号：１２ 配列の長さ：１２アミノ酸 配列の型：アミノ酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：ペプチド 起源 生物名：Ｅｐｓｔｅｉｎ−Ｂａｒｒウイルス 配列
【０１３８】
【表１４】 配列番号：１３ 配列の長さ：１２アミノ酸 配列の型：アミノ酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：ペプチド 起源 生物名：Ｅｐｓｔｅｉｎ−Ｂａｒｒウイルス 配列
【０１３９】
【表１５】 配列番号：１４ 配列の長さ：１２アミノ酸 配列の型：アミノ酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：ペプチド 起源 生物名：Ｅｐｓｔｅｉｎ−Ｂａｒｒウイルス 配列
【０１４０】
【表１６】 配列番号：１５ 配列の長さ：１２アミノ酸 配列の型：アミノ酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：ペプチド 起源 生物名：Ｅｐｓｔｅｉｎ−Ｂａｒｒウイルス 配列
【０１４１】
【表１７】 配列番号：１６ 配列の長さ：１２アミノ酸 配列の型：アミノ酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：ペプチド 起源 生物名：Ｅｐｓｔｅｉｎ−Ｂａｒｒウイルス 配列
【０１４２】
【表１８】 配列番号：１７ 配列の長さ：１２アミノ酸 配列の型：アミノ酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：ペプチド 起源 生物名：Ｅｐｓｔｅｉｎ−Ｂａｒｒウイルス 配列
【０１４３】
【表１９】 配列番号：１８ 配列の長さ：１２アミノ酸 配列の型：アミノ酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：ペプチド 起源 生物名：Ｅｐｓｔｅｉｎ−Ｂａｒｒウイルス 配列
【０１４４】
【表２０】 配列番号：１９ 配列の長さ：１２アミノ酸 配列の型：アミノ酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：ペプチド 起源 生物名：Ｅｐｓｔｅｉｎ−Ｂａｒｒウイルス 配列
【０１４５】
【表２１】 配列番号：２０ 配列の長さ：１２アミノ酸 配列の型：アミノ酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：ペプチド 起源 生物名：Ｅｐｓｔｅｉｎ−Ｂａｒｒウイルス 配列
【０１４６】
【表２２】 配列番号：２１ 配列の長さ：１２アミノ酸 配列の型：アミノ酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：ペプチド 起源 生物名：Ｅｐｓｔｅｉｎ−Ｂａｒｒウイルス 配列
【０１４７】
【表２３】 配列番号：２２ 配列の長さ：１２アミノ酸 配列の型：アミノ酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：ペプチド 起源 生物名：Ｅｐｓｔｅｉｎ−Ｂａｒｒウイルス 配列
【０１４８】
【表２４】
【図１】ＥＢＶによってコードされており且つＶＣＡ−
ｐ４０及びＶＣＡ−ｐ１８タンパク質をコードする遺伝
子を同定するために使用される方法の概略図である。
ｐ４０及びＶＣＡ−ｐ１８タンパク質をコードする遺伝
子を同定するために使用される方法の概略図である。
【図２】（ａ）ＥＡ及びＶＣＡを発現させるように誘導
されたウイルス産生細胞系ＨＨ５１４の核抗原抽出物の
ウェスタンブロットを示す。 （ｂ）ＢＦＲＦ３−β−ガラクトシダーゼ融合タンパク
質を発現する大腸菌の全細胞溶解物のウェスタンブロッ
トを示す。 （ｃ）ＢｄＲＦ１−β−ガラクトシダーゼ融合タンパク
質を発現する大腸菌の全細胞溶解物のウェスタンブロッ
トを示す。 （ｄ）β−ガラクトシダーゼだけを発現する大腸菌の全
細胞溶解物のウェスタンブロットを示す。 ブロットを１組のヒト血清によってプローブした。ブロ
ットのレーン１〜１６に以下の血清を夫々使用した： １．β−Ｇａｌに対するマウスモノクローナル抗体（Ｐ
ｒｏｍｅｇａ）； ２．天然ウイルスキャプシドタンパク質（ＥＢＶ.ＯＴ
４１Ａ）で免疫感作することによって増強したＶＣＡ−
Ｐ４０に対するマウスモノクローナル抗体； ３．ウイルスＶＣＡ−Ｐ１８による特異的イムノアフィ
ニティ精製によって得られたウイルスＶＣＡ−Ｐ１８に
単一特異性のヒト抗体； ４−５．ヒトＥＢＶ−血清陰性の血清； ６−１６．ウイルスＶＣＡ−Ｐ１８及びＶＣＡ−Ｐ４０
に対して異なる相対反応性を有するヒトＥＢＶ−血清陽
性の血清。
されたウイルス産生細胞系ＨＨ５１４の核抗原抽出物の
ウェスタンブロットを示す。 （ｂ）ＢＦＲＦ３−β−ガラクトシダーゼ融合タンパク
質を発現する大腸菌の全細胞溶解物のウェスタンブロッ
トを示す。 （ｃ）ＢｄＲＦ１−β−ガラクトシダーゼ融合タンパク
質を発現する大腸菌の全細胞溶解物のウェスタンブロッ
トを示す。 （ｄ）β−ガラクトシダーゼだけを発現する大腸菌の全
細胞溶解物のウェスタンブロットを示す。 ブロットを１組のヒト血清によってプローブした。ブロ
ットのレーン１〜１６に以下の血清を夫々使用した： １．β−Ｇａｌに対するマウスモノクローナル抗体（Ｐ
ｒｏｍｅｇａ）； ２．天然ウイルスキャプシドタンパク質（ＥＢＶ.ＯＴ
４１Ａ）で免疫感作することによって増強したＶＣＡ−
Ｐ４０に対するマウスモノクローナル抗体； ３．ウイルスＶＣＡ−Ｐ１８による特異的イムノアフィ
ニティ精製によって得られたウイルスＶＣＡ−Ｐ１８に
単一特異性のヒト抗体； ４−５．ヒトＥＢＶ−血清陰性の血清； ６−１６．ウイルスＶＣＡ−Ｐ１８及びＶＣＡ−Ｐ４０
に対して異なる相対反応性を有するヒトＥＢＶ−血清陽
性の血清。
【図３】以下の量のＢＦＲＦ３−β−ガラクトシダーゼ
融合タンパク質を予め吸収させたニトロセルローススト
リップ上の３つのヒト血清（血清９２、血清２１４及び
血清２１９）のイムノブロット： レーン１：０μｇ ＢＦＲＦ３−β−ガラクトシダー
ゼ； レーン２：０.０１μｇ ＢＦＲＦ３−β−ガラクトシ
ダーゼ； レーン３：０.１μｇ ＢＦＲＦ３−β−ガラクトシダ
ーゼ； レーン４：０.５μｇ ＢＦＲＦ３−β−ガラクトシダ
ーゼ； レーン５：１μｇ ＢＦＲＦ３−β−ガラクトシダー
ゼ。 β−ガラクトシダーゼが単独に存在するレーンをレーン
βとして示す。
融合タンパク質を予め吸収させたニトロセルローススト
リップ上の３つのヒト血清（血清９２、血清２１４及び
血清２１９）のイムノブロット： レーン１：０μｇ ＢＦＲＦ３−β−ガラクトシダー
ゼ； レーン２：０.０１μｇ ＢＦＲＦ３−β−ガラクトシ
ダーゼ； レーン３：０.１μｇ ＢＦＲＦ３−β−ガラクトシダ
ーゼ； レーン４：０.５μｇ ＢＦＲＦ３−β−ガラクトシダ
ーゼ； レーン５：１μｇ ＢＦＲＦ３−β−ガラクトシダー
ゼ。 β−ガラクトシダーゼが単独に存在するレーンをレーン
βとして示す。
【図４】ＰＥＰＳＣＡＮ分析の結果：ＶＣＡ−１８配列
に由来の１２量体ペプチドと反応性の健康なＥＢＶ血清
陽性ドナーに由来の１５人のヒト血清のパーセンテー
ジ。ＶＣＡ−ｐ１８タンパク質のアミノ酸配列の内部の
１２量体ペプチドの初期位置をＸ軸に示す。
に由来の１２量体ペプチドと反応性の健康なＥＢＶ血清
陽性ドナーに由来の１５人のヒト血清のパーセンテー
ジ。ＶＣＡ−ｐ１８タンパク質のアミノ酸配列の内部の
１２量体ペプチドの初期位置をＸ軸に示す。
【図５】ＶＣＡ−ｐ１８に対するラットモノクローナル
抗体（ＥＢＶ.ＯＴ１５Ｅ）を用いたＶＣＡ−ｐ１８由
来の１２量体ペプチドの分析のＰＥＰＳＣＡＮ結果（４
５０ｎｍの光学密度）を示す。
抗体（ＥＢＶ.ＯＴ１５Ｅ）を用いたＶＣＡ−ｐ１８由
来の１２量体ペプチドの分析のＰＥＰＳＣＡＮ結果（４
５０ｎｍの光学密度）を示す。
【図６】ＶＣＡ−ｐ１８に対するラットモノクローナル
抗体（ＥＢＶ.ＯＴ１５Ｉ）を用いたＶＣＡ−ｐ１８由
来の１２量体ペプチドの分析のＰＥＰＳＣＡＮ結果（４
５０ｎｍの光学密度）を示す。
抗体（ＥＢＶ.ＯＴ１５Ｉ）を用いたＶＣＡ−ｐ１８由
来の１２量体ペプチドの分析のＰＥＰＳＣＡＮ結果（４
５０ｎｍの光学密度）を示す。
【図７】ＶＣＡ−ｐ４０に対するマウスモノクローナル
抗体（ＥＢＶ.ＯＴ４１Ａ）によるＶＣＡ−ｐ４０タン
パク質から誘導された１２量体ペプチドの分析のＰＥＰ
ＳＣＡＮ結果を示す。
抗体（ＥＢＶ.ＯＴ４１Ａ）によるＶＣＡ−ｐ４０タン
パク質から誘導された１２量体ペプチドの分析のＰＥＰ
ＳＣＡＮ結果を示す。
【図８】健康な血液ドナーから得られた４３人のヒト血
清サンプルのＥＬＩＳＡ反応性（４５０ｎｍの光学密
度）を試験するために、ＢＦＲＦ３によってコードされ
たＶＣＡ−ｐ１８タンパク質に由来の選択された合成ペ
プチドに対するＩｇＧ−反応性を試験した結果を示す。 △：標準血清学的分析による陰性血清を示す； □：標準血清学的分析による陽性血清を示す； ◇：標準血清学的分析によってＥＢＶ抗体を特定できな
いがイムノブロットで陰性の血清を示す； ＊：標準血清学によって陽性であるがイムノブロット上
の抗ｐ１８抗体に陰性血清を示す。 ペプチド１：Ｈ2Ｎ−ＧＶＰＲＲＱＲＡＩＤＫＲＱＲＡ
−ＣＯＯＨ； ペプチド２：Ｈ2Ｎ−ＧＱＰＨＤＴＡＰＲＧＡＲＫＫＱ
−ＣＯＯＨ； ペプチド３：Ｈ2Ｎ−ＡＶＤＴＧＳＧＧＧＧＱＰＨＤＴ
ＡＰＲＧＡＲＫＫＱ−ＣＯＯＨ； ペプチド４：Ｈ2Ｎ−ＳＴＡＶＡＱＳＡＴＰＳＶＳＳＳ
ＩＳＳＬＲＡＡＴＳＧＡＴＡＡＡ−ＣＯＯＨ； ペプチド５：Ｓ−Ｓ−架橋によって結合させたペプチド
４と３との結合ペプチド。
清サンプルのＥＬＩＳＡ反応性（４５０ｎｍの光学密
度）を試験するために、ＢＦＲＦ３によってコードされ
たＶＣＡ−ｐ１８タンパク質に由来の選択された合成ペ
プチドに対するＩｇＧ−反応性を試験した結果を示す。 △：標準血清学的分析による陰性血清を示す； □：標準血清学的分析による陽性血清を示す； ◇：標準血清学的分析によってＥＢＶ抗体を特定できな
いがイムノブロットで陰性の血清を示す； ＊：標準血清学によって陽性であるがイムノブロット上
の抗ｐ１８抗体に陰性血清を示す。 ペプチド１：Ｈ2Ｎ−ＧＶＰＲＲＱＲＡＩＤＫＲＱＲＡ
−ＣＯＯＨ； ペプチド２：Ｈ2Ｎ−ＧＱＰＨＤＴＡＰＲＧＡＲＫＫＱ
−ＣＯＯＨ； ペプチド３：Ｈ2Ｎ−ＡＶＤＴＧＳＧＧＧＧＱＰＨＤＴ
ＡＰＲＧＡＲＫＫＱ−ＣＯＯＨ； ペプチド４：Ｈ2Ｎ−ＳＴＡＶＡＱＳＡＴＰＳＶＳＳＳ
ＩＳＳＬＲＡＡＴＳＧＡＴＡＡＡ−ＣＯＯＨ； ペプチド５：Ｓ−Ｓ−架橋によって結合させたペプチド
４と３との結合ペプチド。
【図９】結合ペプチド５と抗体（ａ）ヒトＩｇＧ（７６
ＶＣＡ−Ｉ.Ｆ.陽性血清）との免疫反応性の分析（Ｅ
ＬＩＳＡ）を示す。
ＶＣＡ−Ｉ.Ｆ.陽性血清）との免疫反応性の分析（Ｅ
ＬＩＳＡ）を示す。
【図１０】結合ペプチド５と抗体（ｂ）ヒトＩｇＭ（２
６ ＩｇＭ 陽性血清）との免疫反応性の分析（ＥＬＩ
ＳＡ）を示す。
６ ＩｇＭ 陽性血清）との免疫反応性の分析（ＥＬＩ
ＳＡ）を示す。
【図１１】結合ペプチド５と抗体（ｃ）ヒトＩｇＡ（Ｎ
ＰＣ患者の３５血清）との免疫反応性の分析（ＥＬＩＳ
Ａ）を示す。
ＰＣ患者の３５血清）との免疫反応性の分析（ＥＬＩＳ
Ａ）を示す。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.5 識別記号 庁内整理番号 ＦＩ 技術表示箇所 Ｃ０７Ｋ 13/00 8517−4Ｈ Ｃ１２Ｎ 5/20 15/06 15/12 Ｇ０１Ｎ 33/53 Ｄ 8310−2Ｊ 33/569 Ｊ 9015−2Ｊ 33/577 Ｂ 9015−2Ｊ //(Ｃ１２Ｐ 21/08 Ｃ１２Ｒ 1:91） (Ｃ１２Ｎ 5/20 Ｃ１２Ｒ 1:91） Ｃ０７Ｋ 99:00
Claims (25)
- 【請求項１】 夫々エプスタイン−バールウイルスオー
プンリーディングフレームＢＦＲＦ３及びＢｄＲＦ１の
内側でコードされたＶＣＡ−ｐ１８又はＶＣＡ−ｐ４０
タンパク質の少なくとも一部を含むことを特徴とする、
抗エプスタイン−バールウイルス抗体に対して免疫化学
的に反応性のペプチド又はその機能的変異体。 - 【請求項２】 配列番号２に示すアミノ酸配列の少なく
とも一部を含むことを特徴とする請求項１に記載のペプ
チド又はその機能的変異体。 - 【請求項３】 配列番号４に示すアミノ酸配列の少なく
とも一部を含むことを特徴とする請求項１に記載のペプ
チド又はその機能的変異体。 - 【請求項４】 配列番号５及び配列番号６に示すアミノ
酸配列から選択されたアミノ酸配列の少なくとも一部を
含むことを特徴とする請求項２に記載のペプチド。 - 【請求項５】 配列番号５に示すアミノ酸配列と配列番
号６に示すアミノ酸配列とを結合した配列を含むことを
特徴とする請求項４に記載のペプチド。 - 【請求項６】 請求項１から６のいずれか一項に記載の
ペプチドをコードする核酸配列。 - 【請求項７】 配列番号１に示す核酸配列の少なくとも
一部を含むことを特徴とする核酸配列。 - 【請求項８】 配列番号３に示す核酸配列の少なくとも
一部を含むことを特徴とする核酸配列。 - 【請求項９】 請求項６から８のいずれか一項に記載の
核酸を含む組換ベクター分子。 - 【請求項１０】 請求項９に記載の組換ベクター分子で
形質転換又はトランスフェクトされた宿主細胞。 - 【請求項１１】 請求項１から５のいずれか一項に記載
のペプチドに対する抗体。 - 【請求項１２】 モノクローナル抗体であることを特徴
とする請求項１１に記載の抗体。 - 【請求項１３】 Ｅｕｒｏｐｅａｎ Ｃｏｌｌｅｃｔｉ
ｏｎ ｏｆ Ａｎｉｍａｌ Ｃｅｌｌ Ｃｕｌｔｕｒｅ
ｓ （ＥＣＡＣＣ）， Ｐｏｒｔｏｎ Ｄｏｗｎ（英
国）に夫々寄託番号９３０２０４１３及び９３０２０４
１２で寄託されたラット−マウスハイブリドーマ細胞系
により産生されるモノクローナル抗体ＥＢＶ．ＯＴ１５
Ｅ又はＥＢＶ．ＯＴ１５Ｉと同一の反応性をＶＣＡ−ｐ
１８に対して有することを特徴とするモノクローナル抗
体。 - 【請求項１４】 Ｅｕｒｏｐｅａｎ Ｃｏｌｌｅｃｔｉ
ｏｎ ｏｆ Ａｎｉｍａｌ Ｃｅｌｌ Ｃｕｌｔｕｒｅ
ｓ （ＥＣＡＣＣ）， Ｐｏｒｔｏｎ Ｄｏｗｎ（英
国）に寄託番号９３０２０４１４で寄託されたマウス−
マウスハイブリドーマ細胞系により産生されるモノクロ
ーナル抗体ＥＢＶ．ＯＴ４１Ａと同一の反応性をＶＣＡ
−ｐ４０に対して有することを特徴とするモノクローナ
ル抗体。 - 【請求項１５】 請求項１３又は１４に記載のモノクロ
ーナル抗体を産生することが可能な不滅化細胞系。 - 【請求項１６】 Ｅｕｒｏｐｅａｎ Ｃｏｌｌｅｃｔｉ
ｏｎ ｏｆ Ａｎｉｍａｌ Ｃｅｌｌ Ｃｕｌｔｕｒｅ
ｓ （ＥＣＡＣＣ）， Ｐｏｒｔｏｎ Ｄｏｗｎ（英
国）に寄託番号９３０２０４１３又は９３０２０４１２
又は９３０２０４１４で寄託された請求項１５に記載の
不滅化細胞系。 - 【請求項１７】 請求項１１に記載の抗体に対して反応
性の抗イディオタイプ抗体。 - 【請求項１８】 請求項１から５のいずれか一項に記載
の１種以上のペプチドを含む免疫化学的試薬。 - 【請求項１９】 請求項１１から１４のいずれか一項に
記載の１種以上の抗体を含む免疫学的試薬。 - 【請求項２０】 請求項１１から１４のいずれか一項に
記載の抗体を試料に接触させた後、形成された免疫複合
体の存在を検出し、試料中のエプスタイン−バールウイ
ルスの有無を決定することを特徴とする、試料中のエプ
スタイン−バールウイルスの検出方法。 - 【請求項２１】 請求項１４に記載の免疫化学的試薬を
試料に接触させ、ペプチドと試料中の抗体との間で形成
された免疫複合体の存在を検出し、試料中のエプスタイ
ン−バールウイルス抗体の有無を決定することを特徴と
する、試料中の抗エプスタイン−バールウイルス抗体の
検出方法。 - 【請求項２２】 請求項１から５のいずれか一項に記載
の１種以上のペプチドを試料及び抗エプスタイン−バー
ルウイルス抗体に接触させた後、形成された免疫複合体
の存在を検出し、この結果から試料中のエプスタイン−
バールウイルスの有無を決定することを特徴とする、試
料中のエプスタイン−バールウイルスの検出方法。 - 【請求項２３】 エプスタイン−バールウイルス核酸配
列の核酸増幅を行い、増幅された配列を検出するため
に、請求項６から８のいずれか一項に記載の少なくとも
１種の核酸配列又はそのフラグメントをプライマーとし
て使用して試料中のエプスタイン−バールウイルス核酸
配列を増幅及び検出するための方法。 - 【請求項２４】 請求項２０から２２のいずれか一項に
記載の方法を実施するためのテストキット。 - 【請求項２５】 請求項２３に記載の増幅方法を実施す
るための増幅用テストキット。
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