JPH0691826B2 - ストレプトマイセス属の菌株に使用するための二機能性クローニングベクター - Google Patents
ストレプトマイセス属の菌株に使用するための二機能性クローニングベクターInfo
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- JPH0691826B2 JPH0691826B2 JP60175629A JP17562985A JPH0691826B2 JP H0691826 B2 JPH0691826 B2 JP H0691826B2 JP 60175629 A JP60175629 A JP 60175629A JP 17562985 A JP17562985 A JP 17562985A JP H0691826 B2 JPH0691826 B2 JP H0691826B2
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- streptomyces
- coli
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Description
【発明の詳細な説明】 産業上の利用分野 本発明は、選択可能であつて、適度に高いコピー数を有
する新規な組換えDNAクローニングベクターに関し、更
に詳しくは、プラスミドpJL192の〜2.5kbKpnI複制起源
含有制限フラグメントと、感受性を有する非制限宿主細
胞（宿主内の制限酵素によって外来遺伝子を分解する機
構を欠失している為、外来遺伝子を成功裏に導入するこ
とができる宿主細胞）に導入（trans form）したとき、
該宿主細胞に少くとも１個の抗生物質に対する耐性を付
与し得る１またはそれ以上のDNAセグメントとを含む組
換えDNAクローニングベクターに関するものである。本
発明のベクターは、突然変異を生じたストレプトマイセ
ス属の菌株（streptomycetes）のレプリコンであつて、
それを含むプラスミドのコピー数がpJL192内に存在する
野生型のレプリコンを含んでいるプラスミドのコピー数
よりも多くなる様に作用するレプリコンを含有してい
る。本発明はまた、前記のベクターを含有している形質
転換体に関するものである。
する新規な組換えDNAクローニングベクターに関し、更
に詳しくは、プラスミドpJL192の〜2.5kbKpnI複制起源
含有制限フラグメントと、感受性を有する非制限宿主細
胞（宿主内の制限酵素によって外来遺伝子を分解する機
構を欠失している為、外来遺伝子を成功裏に導入するこ
とができる宿主細胞）に導入（trans form）したとき、
該宿主細胞に少くとも１個の抗生物質に対する耐性を付
与し得る１またはそれ以上のDNAセグメントとを含む組
換えDNAクローニングベクターに関するものである。本
発明のベクターは、突然変異を生じたストレプトマイセ
ス属の菌株（streptomycetes）のレプリコンであつて、
それを含むプラスミドのコピー数がpJL192内に存在する
野生型のレプリコンを含んでいるプラスミドのコピー数
よりも多くなる様に作用するレプリコンを含有してい
る。本発明はまた、前記のベクターを含有している形質
転換体に関するものである。
従来技術 選択可能であつて、適度に高いコピー数を有するプラス
ミド（約50コピー／細胞）は、ストレプトマイセスおよ
び関連の宿主細胞に用いられる。これまで、適度に高い
コピー数のベクターが一般に欠如していたために、スト
レプトマイセスにおける組換えDNA技術の発展と開発は
特に優れ、困難なものとなつていた。これまで、細胞当
り数百コピーという極めて高いコピー数のベクターや、
細胞当り１〜５コピーという低いコピー数のベクターは
入手可能であつた。適度に高いコピー数のプラスミドに
よれば、その様なプラスミドに遺伝子を担持させること
により、この遺伝子にコードされているタンパク質の生
産収率を、低コピー数のプラスミドに担持されている遺
伝子による発現の場合のそれよりも高くすることができ
る。また、適度に高いコピー数のプラスミドは、高いコ
ピー数のプラスミドの場合に起こり易い致死発現（leth
al expression）の問題を伴なうことなく、ストレプト
マイセス菌株にクローンされている、転写または翻訳効
率の悪い遺伝子を発現させるのに便利である。
ミド（約50コピー／細胞）は、ストレプトマイセスおよ
び関連の宿主細胞に用いられる。これまで、適度に高い
コピー数のベクターが一般に欠如していたために、スト
レプトマイセスにおける組換えDNA技術の発展と開発は
特に優れ、困難なものとなつていた。これまで、細胞当
り数百コピーという極めて高いコピー数のベクターや、
細胞当り１〜５コピーという低いコピー数のベクターは
入手可能であつた。適度に高いコピー数のプラスミドに
よれば、その様なプラスミドに遺伝子を担持させること
により、この遺伝子にコードされているタンパク質の生
産収率を、低コピー数のプラスミドに担持されている遺
伝子による発現の場合のそれよりも高くすることができ
る。また、適度に高いコピー数のプラスミドは、高いコ
ピー数のプラスミドの場合に起こり易い致死発現（leth
al expression）の問題を伴なうことなく、ストレプト
マイセス菌株にクローンされている、転写または翻訳効
率の悪い遺伝子を発現させるのに便利である。
発明の構成および目的 本発明に係るベクターは、適度に高いコピー数で存在
し、ストレプトマイセスおよびその他の菌株のいずれの
宿主においても機能し、かつ選択可能であるが故に、当
該技術分野における著しい進歩を示すものである。
し、ストレプトマイセスおよびその他の菌株のいずれの
宿主においても機能し、かつ選択可能であるが故に、当
該技術分野における著しい進歩を示すものである。
本発明に係るベクターは、比較的小さく、多方面に利用
でき、耐性を付与しようとする抗生物質に対して感受性
を有し、突然変異レプリコンが自己複製に関する充分な
情報を提供するあらゆるストレプトマイセス細胞を形質
転換し得ると共に、選択可能である。天然の抗生物質の
内、70％以上がストレプトマイセス株によつて生産され
るため、この工業的に重要な微生物に適用できるクロー
ニング系およびベクター類の開発が望まれている。本発
明は、かかるベクターを提供し、これにより、既知の抗
生物質の収量を上げるために、または、新規抗生物質お
よび抗生物質誘導体を生産するために、遺伝子をストレ
プトマイセス中へクローンすることを可能にするもので
ある。
でき、耐性を付与しようとする抗生物質に対して感受性
を有し、突然変異レプリコンが自己複製に関する充分な
情報を提供するあらゆるストレプトマイセス細胞を形質
転換し得ると共に、選択可能である。天然の抗生物質の
内、70％以上がストレプトマイセス株によつて生産され
るため、この工業的に重要な微生物に適用できるクロー
ニング系およびベクター類の開発が望まれている。本発
明は、かかるベクターを提供し、これにより、既知の抗
生物質の収量を上げるために、または、新規抗生物質お
よび抗生物質誘導体を生産するために、遺伝子をストレ
プトマイセス中へクローンすることを可能にするもので
ある。
このベクターはまた、DNAをストレプトマイセス宿主細
胞にクローニングするためのビヒクルを提供すると共
に、形質転換体の簡便な選択を可能ならしめるものであ
る。形質転換は極めて低い確率で起こる現象であるの
で、何十億もの細胞のうちからプラスミドDNAを獲得し
た細胞を決定するためには、このような機能試験が実際
上必須である。該ベクターには非選択性DNA配列を挿入
することができ、形質転換により、このベクターと所望
の特定のDNA配列を含有する細胞を、適当な表現型の選
択に基いて分離することができるので、上記のことは極
めて重要である。
胞にクローニングするためのビヒクルを提供すると共
に、形質転換体の簡便な選択を可能ならしめるものであ
る。形質転換は極めて低い確率で起こる現象であるの
で、何十億もの細胞のうちからプラスミドDNAを獲得し
た細胞を決定するためには、このような機能試験が実際
上必須である。該ベクターには非選択性DNA配列を挿入
することができ、形質転換により、このベクターと所望
の特定のDNA配列を含有する細胞を、適当な表現型の選
択に基いて分離することができるので、上記のことは極
めて重要である。
本明細書中に記載した発明の理解を助けるために、以下
に用語を定義する。
に用語を定義する。
組換えDNAクローニングベクター:1またはそれ以上のDNA
セグメントを付加することのできる、もしくはそれらが
既に付加されたDNA分子からなる自律的複製本であつ
て、プラスミドを含むがこれに限定されない。
セグメントを付加することのできる、もしくはそれらが
既に付加されたDNA分子からなる自律的複製本であつ
て、プラスミドを含むがこれに限定されない。
形質転換:DNAを宿主受容細胞中に導入し、その遺伝子型
を変化させ、その結果該受容細胞に変化をもたらすこ
と。
を変化させ、その結果該受容細胞に変化をもたらすこ
と。
形質転換体：形質転換された宿主受容細胞。
感受性宿主細胞：ある特定の抗生物質耐性を付与するDN
Aセグメントなしでは、該抗生物質の存在下において生
育できない宿主細胞。
Aセグメントなしでは、該抗生物質の存在下において生
育できない宿主細胞。
制限フラグメント:1または１以上の制限酵素の作用によ
つて生じた直線状DNA。
つて生じた直線状DNA。
挿入異性体：受容体DNAの２またはそれ以上の適合し得
る部位の内の１つの部位にDNAフラグメントが挿入され
ることにより、あるいは、受容体DNAのある部位におけ
る２つの相異なる方向の内の１方の方向にDNAフラグメ
ントが挿入されることにより形成される２またはそれ以
上の組換えDNA分子の内の１つ。
る部位の内の１つの部位にDNAフラグメントが挿入され
ることにより、あるいは、受容体DNAのある部位におけ
る２つの相異なる方向の内の１方の方向にDNAフラグメ
ントが挿入されることにより形成される２またはそれ以
上の組換えDNA分子の内の１つ。
レプリコン:DNAの複製を制御（コントロール）したり、
許容したりするDNA配列。
許容したりするDNA配列。
大腸菌（E.coli）の複製起源（レプリコン）：大腸菌内
に於けるプラスミド、あるいは他のベクターの複製を制
御したり、許容したりするDNA配列。
に於けるプラスミド、あるいは他のベクターの複製を制
御したり、許容したりするDNA配列。
ストレプトマイセスの複製起源（レプリコン）：ストレ
プトマイセスにおけるプラスミドまたは他のベクターの
複製を制御したり、許容したりするDNA配列。
プトマイセスにおけるプラスミドまたは他のベクターの
複製を制御したり、許容したりするDNA配列。
Ａｐ Ｒ：アンピシリン耐性表現型。
Ｔｃ Ｓ：テトラサイクリン感受性表現型。
Ｎｍ Ｒ：ネオマイシン耐性表現型。
Ｔｓ Ｒ：チオストレプトン耐性表現型。
kb:キロ塩基対即ち1000塩基対。
本発明の詳しい記述 本発明は、適度に高いコピー数を有する組換えDNAクロ
ーニングベクターであつて、:a）プラスミドpJL192の〜
2.5kbKpnＩ複製起源含有制限フラグメントと、ｂ）感受
性を有する非制限宿主細胞に導入した時、少くとも１個
の抗生物質に対する耐性を付与し得る１またはそれ以上
のDNAセグメント、とを含有するクローニングベクター
を提供するものである。
ーニングベクターであつて、:a）プラスミドpJL192の〜
2.5kbKpnＩ複製起源含有制限フラグメントと、ｂ）感受
性を有する非制限宿主細胞に導入した時、少くとも１個
の抗生物質に対する耐性を付与し得る１またはそれ以上
のDNAセグメント、とを含有するクローニングベクター
を提供するものである。
本発明はまた、上記のベクターによつて形質転換された
形質転換体をも包含するものである。
形質転換体をも包含するものである。
本発明のベクターは、１またはそれ以上の抗生物質耐性
付与DNAフラグメントを、プラスミドpJL192の〜2.5kb複
製起源含有制限フラグメントとライゲート（結合）する
ことにより組立てられる。次いで、得られたベクター
を、大腸菌プラスミドの、複製起源を含有し、抗生物質
耐性を付与し得る機能的な制限フラグメントにライゲー
トすることにより、大腸菌およびストレプトマイセスの
両者で選択可能であつて、自己複製可能な二機能性ベク
ターを得ることができる。
付与DNAフラグメントを、プラスミドpJL192の〜2.5kb複
製起源含有制限フラグメントとライゲート（結合）する
ことにより組立てられる。次いで、得られたベクター
を、大腸菌プラスミドの、複製起源を含有し、抗生物質
耐性を付与し得る機能的な制限フラグメントにライゲー
トすることにより、大腸菌およびストレプトマイセスの
両者で選択可能であつて、自己複製可能な二機能性ベク
ターを得ることができる。
プラスミドpJL192は、ノーザン・リージヨナル・リサー
チ・ラボラトリイ、ペオリア、イリノイス61604（North
ern Regional Reserch Laboratory、Peoria、Illinois
61604）に寄託され、その一部とあつている菌株、大腸
菌K12C600Rk−Mk−/pJL192から常法通り単離することが
できる。この菌株は、該プラスミドの好ましい供給源お
よび保管体として寄託番目NRRL−15040の下、誰でも入
手可能である。プラスミドpJL192の制限サイト地図を添
付図面の第１図に示す。本出願の目的からして、第１
図、および以後の全ての図面は等縮尺で描かれていな
い。
チ・ラボラトリイ、ペオリア、イリノイス61604（North
ern Regional Reserch Laboratory、Peoria、Illinois
61604）に寄託され、その一部とあつている菌株、大腸
菌K12C600Rk−Mk−/pJL192から常法通り単離することが
できる。この菌株は、該プラスミドの好ましい供給源お
よび保管体として寄託番目NRRL−15040の下、誰でも入
手可能である。プラスミドpJL192の制限サイト地図を添
付図面の第１図に示す。本出願の目的からして、第１
図、および以後の全ての図面は等縮尺で描かれていな
い。
多くの異なつた、プラスミドpJL192のストレプトマイセ
ス複製起源含有フラグメントを組立てることができる
が、本発明を例示するために本明細書中に記載したフラ
グメントは、全て〜2.5kbKpnI制限フラグメントを含有
していることを特徴とするものである。この〜2.5kbKpn
Ｉ制限フラグメントは、プラスミドpJL192のＫpnＩ酵素
による完全消化によつて生成するフラグメントであり、
適度に高いコピー数（細胞当り40〜50コピー）の誘導体
プラスミドを生産することが見出された。プラスミドｐ
JL192は、細胞当り１〜５という低いコピー数を有する
プラスミドとして知られているストレプトマイシスプラ
スミドSCP2＊からの〜5.9kbEcoRI−SalIレプリコンフラ
グメントを含有している。この〜5.9kbEcoRI−SalISCP2
＊複製起源含有フラグメントを切断して本発明の〜2.5k
bKpnＩ制限フラグメントとする際に、SCP2＊のコピー数
を制御している制御配列に実質的な突然変異が起こるの
であろうと思われる。
ス複製起源含有フラグメントを組立てることができる
が、本発明を例示するために本明細書中に記載したフラ
グメントは、全て〜2.5kbKpnI制限フラグメントを含有
していることを特徴とするものである。この〜2.5kbKpn
Ｉ制限フラグメントは、プラスミドpJL192のＫpnＩ酵素
による完全消化によつて生成するフラグメントであり、
適度に高いコピー数（細胞当り40〜50コピー）の誘導体
プラスミドを生産することが見出された。プラスミドｐ
JL192は、細胞当り１〜５という低いコピー数を有する
プラスミドとして知られているストレプトマイシスプラ
スミドSCP2＊からの〜5.9kbEcoRI−SalIレプリコンフラ
グメントを含有している。この〜5.9kbEcoRI−SalISCP2
＊複製起源含有フラグメントを切断して本発明の〜2.5k
bKpnＩ制限フラグメントとする際に、SCP2＊のコピー数
を制御している制御配列に実質的な突然変異が起こるの
であろうと思われる。
ストレプトマイセスにとつて望ましいクローニングベク
ターは、ストレプトマイセス内で発現され得るプラスミ
ド複製機能と、抗生物質耐性に関する２つのマーカー
（これらの各耐性マーカー内に特異な制限酵素認識部位
が含まれていることが好ましい）とを含有している必要
がある。理想的なクローニングベクターの組立ては、プ
ラスミドpJL192の〜2.5kbKpnＩ複製起源含有制限フラグ
メントに、１またはそれ以上の抗生物質耐性付与DNAフ
ラグメント（本明細書中で例示する如く、例えば、プラ
スミドｐLa2のチオストレプトン耐性付与〜1.6kbBamHI
制限フラグメントおよびプラスミドｐLR4のネオマイシ
ン耐性付与〜3.4kbBamHI制限フラグメント）を独立にラ
イゲートすることにより行ない、この様にして本発明で
例示したベクターを形成することができる。プラスミド
ｐLR2およびｐLR4は、それぞれチオストレプトンおよび
ネオマイシン耐性付与フラグメントの供給源であつてア
メリカ特許第4,416,994号に係る物質であり、該特許の
方法に従つて組立てることができる。これらのプラスミ
ドｐLR2およびｐLR4は大腸菌（E.coli）内で機能的であ
る故に、以後の操作のために増幅し、単離する上で好都
合である。
ターは、ストレプトマイセス内で発現され得るプラスミ
ド複製機能と、抗生物質耐性に関する２つのマーカー
（これらの各耐性マーカー内に特異な制限酵素認識部位
が含まれていることが好ましい）とを含有している必要
がある。理想的なクローニングベクターの組立ては、プ
ラスミドpJL192の〜2.5kbKpnＩ複製起源含有制限フラグ
メントに、１またはそれ以上の抗生物質耐性付与DNAフ
ラグメント（本明細書中で例示する如く、例えば、プラ
スミドｐLa2のチオストレプトン耐性付与〜1.6kbBamHI
制限フラグメントおよびプラスミドｐLR4のネオマイシ
ン耐性付与〜3.4kbBamHI制限フラグメント）を独立にラ
イゲートすることにより行ない、この様にして本発明で
例示したベクターを形成することができる。プラスミド
ｐLR2およびｐLR4は、それぞれチオストレプトンおよび
ネオマイシン耐性付与フラグメントの供給源であつてア
メリカ特許第4,416,994号に係る物質であり、該特許の
方法に従つて組立てることができる。これらのプラスミ
ドｐLR2およびｐLR4は大腸菌（E.coli）内で機能的であ
る故に、以後の操作のために増幅し、単離する上で好都
合である。
組立てを便利にかつ簡単にするためにこれらのチオスト
レプトン耐性付与〜1.6kbBamHIフラグメントとネオマイ
シン耐性付与〜3.4kbBamHIフラグメントとをプラスミド
pJL192の〜2.5Kpnkb複製起源含有フラグメントにライゲ
ートし、本発明の例示プラスミドを組立てる。挿入され
たDNAフラグメントの方向性に基き、所望の２方向の組
換えプラスミドが得られる。即ち、プラスミドｐLR2の
〜1.6kbBamHIフラグメントをプラスミドpJL192の〜1.6k
bkpnＩ制限フラグメントに挿入することにより、例示の
プラスミドｐHJL2200およびｐHJL2201が得られ；同様
に、〜3.4kbBamHIフラグメントをｐHJL2200に挿入する
ことにより、例示プラスミドｐHJL2202およびｐHJL2203
が得られる。
レプトン耐性付与〜1.6kbBamHIフラグメントとネオマイ
シン耐性付与〜3.4kbBamHIフラグメントとをプラスミド
pJL192の〜2.5Kpnkb複製起源含有フラグメントにライゲ
ートし、本発明の例示プラスミドを組立てる。挿入され
たDNAフラグメントの方向性に基き、所望の２方向の組
換えプラスミドが得られる。即ち、プラスミドｐLR2の
〜1.6kbBamHIフラグメントをプラスミドpJL192の〜1.6k
bkpnＩ制限フラグメントに挿入することにより、例示の
プラスミドｐHJL2200およびｐHJL2201が得られ；同様
に、〜3.4kbBamHIフラグメントをｐHJL2200に挿入する
ことにより、例示プラスミドｐHJL2202およびｐHJL2203
が得られる。
本明細書中に例示した抗生物質チオストレプトンおよび
ネオマイシン耐性付与DNAセグメントは、それぞれプラ
スミドpLR2およびｐLR4の〜1.6kbおよび〜3.4kbBamHI制
限フラグメントであるが、当業者には、チオストレプト
ンおよびネオマイシンに対する耐性を付与する他のDNA
セグメントを組立て、これらを個別に、または組み合わ
せて使用することができるであろう。プラスミドpLR2の
他のチオストレプトン耐性付与DNAセグメントには、例
えば〜13kbPstI制限フラグメントおよび〜1kbBclI制限
フラグメントがある。プラスミドpLR4の他のネオマイシ
ン耐性付与DNAセグメントには、例えば〜3.5Pst制限フ
ラグメントおよび〜3.4kbBamHI制限フラグメントのSacI
I−KpnIフラグメントのうち、大きい方のフラグメント
がある。さらに、上記のまたは上記とは異なる抗生物
質、例えばクロラムフエニコール、ハイグロマイシン、
ビオマイシン、タイロシンおよびエリスロマイシン等の
抗生物質に対する耐性を付与するその他のDNAセグメン
トも、組立てて使用することができる。さらに、上記の
抗生物質耐性付与DNAセグメントの様々な機能的誘導体
も、あるヌクレオチドを付加、脱離または置換すること
によつて組立てることができる。これらの誘導体、もし
くはこれら以外の抗生物質耐性付与DNAセグメントを、
本明細書中で例示した抗生物質耐性付与DNAセグメント
の代りに〜2.5kbKpnＩ制限フラグメントにライゲーシヨ
ンすることによつても、本発明の範囲内に含まれるプラ
スミドを得ることができる。
ネオマイシン耐性付与DNAセグメントは、それぞれプラ
スミドpLR2およびｐLR4の〜1.6kbおよび〜3.4kbBamHI制
限フラグメントであるが、当業者には、チオストレプト
ンおよびネオマイシンに対する耐性を付与する他のDNA
セグメントを組立て、これらを個別に、または組み合わ
せて使用することができるであろう。プラスミドpLR2の
他のチオストレプトン耐性付与DNAセグメントには、例
えば〜13kbPstI制限フラグメントおよび〜1kbBclI制限
フラグメントがある。プラスミドpLR4の他のネオマイシ
ン耐性付与DNAセグメントには、例えば〜3.5Pst制限フ
ラグメントおよび〜3.4kbBamHI制限フラグメントのSacI
I−KpnIフラグメントのうち、大きい方のフラグメント
がある。さらに、上記のまたは上記とは異なる抗生物
質、例えばクロラムフエニコール、ハイグロマイシン、
ビオマイシン、タイロシンおよびエリスロマイシン等の
抗生物質に対する耐性を付与するその他のDNAセグメン
トも、組立てて使用することができる。さらに、上記の
抗生物質耐性付与DNAセグメントの様々な機能的誘導体
も、あるヌクレオチドを付加、脱離または置換すること
によつて組立てることができる。これらの誘導体、もし
くはこれら以外の抗生物質耐性付与DNAセグメントを、
本明細書中で例示した抗生物質耐性付与DNAセグメント
の代りに〜2.5kbKpnＩ制限フラグメントにライゲーシヨ
ンすることによつても、本発明の範囲内に含まれるプラ
スミドを得ることができる。
本発明に係るストレプトマイセス内で機能的なベクタ
ー、例えばｐHJL2200およびpHJL2202と、例えばｐBR32
2、ｐBR325、ｐBR328等の、種々の大腸菌プラスミドの
機能的な複製起源−含有、並びに抗生物質耐性−付与制
限フラグメントとをライゲートすることにより、大腸菌
およびストレプトマイセスの両者において選択可能な、
二機能性の自己複製ベクターを作り出すことができる。
これらの二機能性の組立て物は、プラスミドｐJL192の
〜2.5kbKpnＩ複製起源含有制限フラグメント、ストレプ
トマイセスに抗生物質耐性を付与する１またはそれ以上
のDNAセグメント、大腸菌内で機能的なレプリン、並び
に大腸菌に抗生物質耐性を付与するDNAセグメントから
なる。本発明において開示したプラスミドｐHJL201は、
約9.9kbの小さい二機能性プラスミドであり、そのクロ
ーニングベクターとしての用途には何ら関与しない、極
く小さい余分の配列を有している。プラスミドpHJL201
は、比較的サイズが小さく、機能的な組立て物であり、
更に、２個のBamHI制限部位を有しているため、その内
の１個を他の抗生物質耐性マーカー、あるいはヘテロロ
ーガスな（異質の）DNAの挿入に利用することができる
ので、望ましいクローニングベクターである。当業者に
は、プラスミドpJL192をkpnI消化すれば、プラスミドpH
JL201が容易に得られるということが理解できるであろ
う。
ー、例えばｐHJL2200およびpHJL2202と、例えばｐBR32
2、ｐBR325、ｐBR328等の、種々の大腸菌プラスミドの
機能的な複製起源−含有、並びに抗生物質耐性−付与制
限フラグメントとをライゲートすることにより、大腸菌
およびストレプトマイセスの両者において選択可能な、
二機能性の自己複製ベクターを作り出すことができる。
これらの二機能性の組立て物は、プラスミドｐJL192の
〜2.5kbKpnＩ複製起源含有制限フラグメント、ストレプ
トマイセスに抗生物質耐性を付与する１またはそれ以上
のDNAセグメント、大腸菌内で機能的なレプリン、並び
に大腸菌に抗生物質耐性を付与するDNAセグメントから
なる。本発明において開示したプラスミドｐHJL201は、
約9.9kbの小さい二機能性プラスミドであり、そのクロ
ーニングベクターとしての用途には何ら関与しない、極
く小さい余分の配列を有している。プラスミドpHJL201
は、比較的サイズが小さく、機能的な組立て物であり、
更に、２個のBamHI制限部位を有しているため、その内
の１個を他の抗生物質耐性マーカー、あるいはヘテロロ
ーガスな（異質の）DNAの挿入に利用することができる
ので、望ましいクローニングベクターである。当業者に
は、プラスミドpJL192をkpnI消化すれば、プラスミドpH
JL201が容易に得られるということが理解できるであろ
う。
その上、プラスミドｐHJL201、ｐHJL210およびｐHJL211
で代表される本発明の二機能性組立て物は、ストレプト
マイセスよりも大腸菌内に於いて、そのプラスミドの増
幅および操作を迅速かつ簡便に行うことができるので、
特に好都合である。即ち、大腸菌宿主系で所望の組換え
DNA法を行なつた後、このプラスミドをストレプトマイ
セス宿主細胞内に導入（トランスホーム）することがで
きる。あるいはまた、特定のストレプトマイセスDNAを
取出し、（必要ならば）プラスミドの形に再構成し、次
いでストレプトマイセスまたは関連の宿主細胞に導入し
てもよい。本発明のベクターはストレプトマイセス内で
完全に選択可能であるため、組換えクローンの同定を効
率良く行なうことができる。
で代表される本発明の二機能性組立て物は、ストレプト
マイセスよりも大腸菌内に於いて、そのプラスミドの増
幅および操作を迅速かつ簡便に行うことができるので、
特に好都合である。即ち、大腸菌宿主系で所望の組換え
DNA法を行なつた後、このプラスミドをストレプトマイ
セス宿主細胞内に導入（トランスホーム）することがで
きる。あるいはまた、特定のストレプトマイセスDNAを
取出し、（必要ならば）プラスミドの形に再構成し、次
いでストレプトマイセスまたは関連の宿主細胞に導入し
てもよい。本発明のベクターはストレプトマイセス内で
完全に選択可能であるため、組換えクローンの同定を効
率良く行なうことができる。
プラスミドｐJL192、ｐBR322およびｐBR325等の様々な
レプリコン制限フラグメントおよび種々の抗生物質耐性
付与DNAセグメントを、ライゲシヨンを容易なものにす
るために修飾することができる。例えば、〜2.5kbKpnＩ
レプリコンフラグメント、同じく特定の耐性付与DNAセ
グメントに分子リンカーを付加し、以後のライゲーシヨ
ンにおける特異部位を生成させることができる。更に、
複製起源含有制限フラグメントを、あるヌクレオチドの
付加、除去または置換によつて修飾することにより、そ
の性質を変え、DNAのライゲーシヨンのための様々な制
限部位を供給することができる。当業者はヌクレオチド
の化学および遺伝子暗号等について理解しているので、
ある目的のために、どのヌクレオチドが交換可能であ
り、どのDNA修飾法が望ましいかを知つている。
レプリコン制限フラグメントおよび種々の抗生物質耐性
付与DNAセグメントを、ライゲシヨンを容易なものにす
るために修飾することができる。例えば、〜2.5kbKpnＩ
レプリコンフラグメント、同じく特定の耐性付与DNAセ
グメントに分子リンカーを付加し、以後のライゲーシヨ
ンにおける特異部位を生成させることができる。更に、
複製起源含有制限フラグメントを、あるヌクレオチドの
付加、除去または置換によつて修飾することにより、そ
の性質を変え、DNAのライゲーシヨンのための様々な制
限部位を供給することができる。当業者はヌクレオチド
の化学および遺伝子暗号等について理解しているので、
ある目的のために、どのヌクレオチドが交換可能であ
り、どのDNA修飾法が望ましいかを知つている。
本発明に係る組換えDNAクローニングベクターは、その
用途をストレプトマイセスの単一の種または菌株に限る
ものではない。逆に、本ベクターは広範囲の適用が可能
で、多くのストレプトマイセス類の宿主細胞、特にアミ
ノグリコシド、マクロライド、β−ラクタム、ポリエー
テルおよびグリコペプチドのような抗生物質を産生する
経済的重要性のある非制限菌株に導入することができ
る。こうした非制限菌株は、当業者周知の常法〔ロモフ
スカヤ（Lomovskaya）等、1980、マイクロバイオロジカ
ルレビユーズ（Microbiological Reviews）44:206〕に
より、ストレプトマイセス類から容易に選択、分離され
る。非制限菌株の宿主細胞は制限酵素を欠くため、形質
転換の際プラスミドDNAを切断したり劣化させることが
ない。本発明においては、本発明に係るベクターのいか
なる制限サイトも切断しない制限酵素を含んでいる宿主
細胞もまた非制限性とみなすこととする。
用途をストレプトマイセスの単一の種または菌株に限る
ものではない。逆に、本ベクターは広範囲の適用が可能
で、多くのストレプトマイセス類の宿主細胞、特にアミ
ノグリコシド、マクロライド、β−ラクタム、ポリエー
テルおよびグリコペプチドのような抗生物質を産生する
経済的重要性のある非制限菌株に導入することができ
る。こうした非制限菌株は、当業者周知の常法〔ロモフ
スカヤ（Lomovskaya）等、1980、マイクロバイオロジカ
ルレビユーズ（Microbiological Reviews）44:206〕に
より、ストレプトマイセス類から容易に選択、分離され
る。非制限菌株の宿主細胞は制限酵素を欠くため、形質
転換の際プラスミドDNAを切断したり劣化させることが
ない。本発明においては、本発明に係るベクターのいか
なる制限サイトも切断しない制限酵素を含んでいる宿主
細胞もまた非制限性とみなすこととする。
アミノグリコシド抗生物質を産生し、本発明に係るベク
ターを特に有用に使用でき、形質転換できるストレプト
マイセス類の非制限的な菌株の好ましい宿主細胞には、
例えば以下の菌株に由来する非制限細胞が含まれる： ストレプトマイセス・カナマイセチカス（Strepto myce
s Kanamyceticus）（カナマイシン類）、 S.クレストマイセチカス（S.chrestomyceticus）（アミ
ノシジン）、S.グリセオフラバス（S.griscoflavus）
（抗生物質MA1267）、S.ミクロスポレウス（S.microspo
reus）（抗生物質SF−767）、S.リボシジフイカス（S.r
ibosidificus）（抗生物質SF733）、S.フラボペルシカ
ス（S.flavopersicus）（スペクチノマイシン）、S.ス
ペクタビリス（S.spectabilis）（アクチノスペクタシ
ン）、S.リモサス・ホルマ・バロモマイシナス（S.rimo
susforma paromomycinus）パロモマイシン類、カテヌリ
ン）、S.フラデイエ・バー・イタリカス（S.fradiaeva
r.italicus）（アミノシジン）、S.ブルエンシス・バー
・ブルエンシス（S.bluensis var.bluensis）（ブルエ
ンソマイシン）、S.カテニユーレ（S.catenulae）（カ
テヌリン）、S.オリボレテイキユリ・バー・セルロフイ
ラス（S.olivoreticuli var cellulophilus）（デスト
マイシンＡ）、S.テネブラリウス（S.tenebrarius）
（トブラマイシン、アプラマイシン）、S.ラベンデユー
レ（S.lavendulae）（ネオマイシン）、S.アルボグリセ
オラス（S.albogriseolus）（ネオマイシン類）、S.ア
ルブス・バー・メタマイシヌス（S.albus var.metamyci
nus）（メタマイシン）、S.ハイグロスコピカス・バー
・サガミエンシス（S.hygroscopicus var.sagamiensi
s）（スペクチノマイシン）、S.ビキニエンシス（S.bik
iniensis）（ストレプトマイシン）、S.グリセウス（S.
griseus）（ストレプトマイシン）、S.エリスロクロモ
ゲネス・バー・ナルトエンシス（S.erythrochromogenes
var.narutoensis）（ストレプトマイシン）、S.プール
エンシス（S.poolensis）（ストレプトマイシン）、S.
ガルブス（S.galbus）（ストレプトマイシン）、S.ラメ
ウス（S.rameus）（ストレプトマイシン）、S.オリバセ
ウス（S.olivaceus）（ストレプトマイシン）、S.マシ
ユエンシス（S.mashuensis）（ストレプトマイシン）、
S.ハイグロスコピカス・バー・リモネウス（S.hygrosco
picus var.limoneus）（バリダマイシン類）、S.リモフ
アシエンス（S.rimofaciens）（デストマイシン）、S.
ハイグロスコピカス・ホルマ・グレボサス（S.hygrosco
picus forma glebosus）（グレボマイシン）、S.フラデ
イエ（S.fradiae）（ハイブリマイシン類、ネオマイシ
ン類）、S.ユーロシジカス（S.eurocidicus）（抗生物
質A16316−Ｃ）、S.アクアカナス（S.aquacanus）（Ｎ
−メチルハイグロマイシンＢ）、S.クリスタリヌス（S.
crystallinus）（ハイグロマイシンＡ）、S.ノボリトエ
ンシス（S.noboritoensis）（ハイグロマイシン）、S.
ハイグロスコピカス（S.hygroscopicus）（ハイグロマ
イシン類）、S.アトロフアシエンス（S.atrofaciens）
（ハイグロマイシン）、S.カスガスピナス（S.kasugasp
inus）（カスガマイシン）、S.カスガエンシス（S.kasu
gaensis）（カスガマイシン類）、S.ネトロプシス（S.n
etropsis）（抗生物質LL−AM31）、S.リビダス（S.livi
dus）（リビドマイシン類）、S.ホフエンシス（S.hofue
nsis）（セルドマイシン複合体）、およびS.カナス（S.
canus）（リボシルパロマミン）。
ターを特に有用に使用でき、形質転換できるストレプト
マイセス類の非制限的な菌株の好ましい宿主細胞には、
例えば以下の菌株に由来する非制限細胞が含まれる： ストレプトマイセス・カナマイセチカス（Strepto myce
s Kanamyceticus）（カナマイシン類）、 S.クレストマイセチカス（S.chrestomyceticus）（アミ
ノシジン）、S.グリセオフラバス（S.griscoflavus）
（抗生物質MA1267）、S.ミクロスポレウス（S.microspo
reus）（抗生物質SF−767）、S.リボシジフイカス（S.r
ibosidificus）（抗生物質SF733）、S.フラボペルシカ
ス（S.flavopersicus）（スペクチノマイシン）、S.ス
ペクタビリス（S.spectabilis）（アクチノスペクタシ
ン）、S.リモサス・ホルマ・バロモマイシナス（S.rimo
susforma paromomycinus）パロモマイシン類、カテヌリ
ン）、S.フラデイエ・バー・イタリカス（S.fradiaeva
r.italicus）（アミノシジン）、S.ブルエンシス・バー
・ブルエンシス（S.bluensis var.bluensis）（ブルエ
ンソマイシン）、S.カテニユーレ（S.catenulae）（カ
テヌリン）、S.オリボレテイキユリ・バー・セルロフイ
ラス（S.olivoreticuli var cellulophilus）（デスト
マイシンＡ）、S.テネブラリウス（S.tenebrarius）
（トブラマイシン、アプラマイシン）、S.ラベンデユー
レ（S.lavendulae）（ネオマイシン）、S.アルボグリセ
オラス（S.albogriseolus）（ネオマイシン類）、S.ア
ルブス・バー・メタマイシヌス（S.albus var.metamyci
nus）（メタマイシン）、S.ハイグロスコピカス・バー
・サガミエンシス（S.hygroscopicus var.sagamiensi
s）（スペクチノマイシン）、S.ビキニエンシス（S.bik
iniensis）（ストレプトマイシン）、S.グリセウス（S.
griseus）（ストレプトマイシン）、S.エリスロクロモ
ゲネス・バー・ナルトエンシス（S.erythrochromogenes
var.narutoensis）（ストレプトマイシン）、S.プール
エンシス（S.poolensis）（ストレプトマイシン）、S.
ガルブス（S.galbus）（ストレプトマイシン）、S.ラメ
ウス（S.rameus）（ストレプトマイシン）、S.オリバセ
ウス（S.olivaceus）（ストレプトマイシン）、S.マシ
ユエンシス（S.mashuensis）（ストレプトマイシン）、
S.ハイグロスコピカス・バー・リモネウス（S.hygrosco
picus var.limoneus）（バリダマイシン類）、S.リモフ
アシエンス（S.rimofaciens）（デストマイシン）、S.
ハイグロスコピカス・ホルマ・グレボサス（S.hygrosco
picus forma glebosus）（グレボマイシン）、S.フラデ
イエ（S.fradiae）（ハイブリマイシン類、ネオマイシ
ン類）、S.ユーロシジカス（S.eurocidicus）（抗生物
質A16316−Ｃ）、S.アクアカナス（S.aquacanus）（Ｎ
−メチルハイグロマイシンＢ）、S.クリスタリヌス（S.
crystallinus）（ハイグロマイシンＡ）、S.ノボリトエ
ンシス（S.noboritoensis）（ハイグロマイシン）、S.
ハイグロスコピカス（S.hygroscopicus）（ハイグロマ
イシン類）、S.アトロフアシエンス（S.atrofaciens）
（ハイグロマイシン）、S.カスガスピナス（S.kasugasp
inus）（カスガマイシン）、S.カスガエンシス（S.kasu
gaensis）（カスガマイシン類）、S.ネトロプシス（S.n
etropsis）（抗生物質LL−AM31）、S.リビダス（S.livi
dus）（リビドマイシン類）、S.ホフエンシス（S.hofue
nsis）（セルドマイシン複合体）、およびS.カナス（S.
canus）（リボシルパロマミン）。
マクロライド抗生物質を産生し、本発明に係るベクター
を特に有用に使用でき、形質転換できる好ましいストレ
プトマイセス類の非制限菌株宿主細胞には、例えば以下
のような微生物の非制限細胞が含まれる：ストレプトマ
イシス・ケレステイス（Steptomyces caelestis）（抗
生物質M188）、S.プラテンシス（S.platensis）（プラ
テノマイシン）、S.ロツチエイ・バー・ボルビリス（S.
rochei var.volubilis）（抗生物質T2636）、S.ベネズ
エレ、（S.venezuelae）（メチマイシン類）、S.グリセ
オフスカス（S.griseofuscus）（ブンドリン）、S.ナル
ボネンシス（S.narbonensis）（ジヨサマイシン、ナル
ボマイシン）、S.フンジシジカス（S.fungicidicus）
（抗生物質NA−181）、S.グリセオフアシエンス（S.gri
seofaciens）（抗生物質PA133A、Ｂ）、S.ロゼオシトレ
ウス（S.roseocitreus）（アイボサイクリン）、S.ブル
ネオグリセウス（S.bruneogrisceus）（アルボサイクリ
ン、S.ロゼオクロモゲネス（S.roseoehromogenes）（ア
ルボサイクリン）、S.シネロクロモゲネス（S.cineroch
romogenes）、（シネロマイシンＢ）、S.アルブス（S.a
lbus）（アルボマイセチン）、S.フエレウス（S.felleu
s）（アルゴマイシン、ピクロマイシン）、S.ロツチエ
イ（S.rochei）（ランカシジン、ボレリジン）、S.ビオ
ラセオニゲル（S.violaceoniger）（ランカシジン）、
S.グリセウス（S.griseus）（ボレリジン）、S.メゼウ
ス（S.maizeus）（イングラマイシン）、S.アルブス・
バー・コイルマイセチカス（S.albus var.coilmceticu
s）（コレイマイシン）、S.ミカロフアシエンス（S.myc
arofaciens）（アセチルロイコマイシン、エスピノマイ
シン）、S.ハイグロスコピカス（S.hygroscopicus）
（ツリマイシン、レロマイシン、マリドマイシン、タイ
ロシン、カルボマイシン）、S.グリセオスピラリス（S.
griseospiralis）（レロマイシン）、S.ラベンジユレ
（S.lavendulae）（アルドガマイシン）、S.リモサス
（S.rimosus）（ニユートラマイシン）、S.デルタエ
（S.deltae）（デルタマイシン類）、S.フアンジシジカ
ス・バー・エスピノマイセチカス（S.fungicidicus va
r.espinomyceticus）（エスピノマイシン類）、S.フル
ジシジカス（S.furdicidicus）（ミデカマイシン）、S.
アンボフアシエンス（S.ambofaciens）（フオロマシジ
ンＤ）、S.ユーロシデイカス（S.enrocidicus）（メチ
マイシン）、S.グリセオラス（S.griseolus）（グリセ
オマイシン）、S.フラボクロモゲネス（S.flavochromog
enes）（アマロマイシン、シンコマイシン類）、S.フイ
ムブリアタス（S.fimbriatus）（アマロマイシン）、S.
フアシキユラス（S.fasciculus）（アマロマイシン）、
S.エリスレウス（S.erythreus）（エリスロマイシン
類）、S.アンチビオチカス（S.antibioticus）（オレア
ンドマイシン）、S.オリボクロモゲネス（S.clivochrom
ogenes）（オレアンドマイシン）、S.スピニクロモゲネ
ス・バー・スラガオエンシス（S.spinichromogenes va
r.suragaoensis）（クジマイシン類）、S.キタサトエン
シス（S.kitasatoensis）（ロイコマイシン）、S.ナル
ボネンシス・バー・ジヨサマイセチカス（S.narbonensi
s var.josamycetius）（ロイコマイシンA3、ジヨサマイ
シン）、S.アルボグリセオラス（S.albogriseolus）
（ミコノマイシン）、S.ビキニエンシス（S.bikiniensi
s）（チヤルコマイシン）、S.サーラタス（S.cirratu
s）（シラマイシン）、S.ジヤカルテンシス（S.djakart
ensis）（ニダマイシン）、S.ユーリサーマス（S.euryt
hermus）（アンゴラマイシン）、S.フラデイエ（S.frad
iae）（タイロシン、ラクテノシン、マクロシン）、S.
ゴシキエンシス（S.goshikiensis）（バンダマイシ
ン）、S.グリセオフラブス（S.griseoflavus）（アキユ
マイシン）、S.ハルステジイ（S.halstedii）（カルボ
イシン）、S.テンダエ（S.tendae）（カルボマイシ
ン）、S.マクロスポレウス（S.macrosporeus）（カルボ
マイシン）、S.サーモトレランス（S.thermotolerans）
（カルボマイシン）、およびS.アルビレチキユリ（S.al
bireticuli）（カルボマイシン）。
を特に有用に使用でき、形質転換できる好ましいストレ
プトマイセス類の非制限菌株宿主細胞には、例えば以下
のような微生物の非制限細胞が含まれる：ストレプトマ
イシス・ケレステイス（Steptomyces caelestis）（抗
生物質M188）、S.プラテンシス（S.platensis）（プラ
テノマイシン）、S.ロツチエイ・バー・ボルビリス（S.
rochei var.volubilis）（抗生物質T2636）、S.ベネズ
エレ、（S.venezuelae）（メチマイシン類）、S.グリセ
オフスカス（S.griseofuscus）（ブンドリン）、S.ナル
ボネンシス（S.narbonensis）（ジヨサマイシン、ナル
ボマイシン）、S.フンジシジカス（S.fungicidicus）
（抗生物質NA−181）、S.グリセオフアシエンス（S.gri
seofaciens）（抗生物質PA133A、Ｂ）、S.ロゼオシトレ
ウス（S.roseocitreus）（アイボサイクリン）、S.ブル
ネオグリセウス（S.bruneogrisceus）（アルボサイクリ
ン、S.ロゼオクロモゲネス（S.roseoehromogenes）（ア
ルボサイクリン）、S.シネロクロモゲネス（S.cineroch
romogenes）、（シネロマイシンＢ）、S.アルブス（S.a
lbus）（アルボマイセチン）、S.フエレウス（S.felleu
s）（アルゴマイシン、ピクロマイシン）、S.ロツチエ
イ（S.rochei）（ランカシジン、ボレリジン）、S.ビオ
ラセオニゲル（S.violaceoniger）（ランカシジン）、
S.グリセウス（S.griseus）（ボレリジン）、S.メゼウ
ス（S.maizeus）（イングラマイシン）、S.アルブス・
バー・コイルマイセチカス（S.albus var.coilmceticu
s）（コレイマイシン）、S.ミカロフアシエンス（S.myc
arofaciens）（アセチルロイコマイシン、エスピノマイ
シン）、S.ハイグロスコピカス（S.hygroscopicus）
（ツリマイシン、レロマイシン、マリドマイシン、タイ
ロシン、カルボマイシン）、S.グリセオスピラリス（S.
griseospiralis）（レロマイシン）、S.ラベンジユレ
（S.lavendulae）（アルドガマイシン）、S.リモサス
（S.rimosus）（ニユートラマイシン）、S.デルタエ
（S.deltae）（デルタマイシン類）、S.フアンジシジカ
ス・バー・エスピノマイセチカス（S.fungicidicus va
r.espinomyceticus）（エスピノマイシン類）、S.フル
ジシジカス（S.furdicidicus）（ミデカマイシン）、S.
アンボフアシエンス（S.ambofaciens）（フオロマシジ
ンＤ）、S.ユーロシデイカス（S.enrocidicus）（メチ
マイシン）、S.グリセオラス（S.griseolus）（グリセ
オマイシン）、S.フラボクロモゲネス（S.flavochromog
enes）（アマロマイシン、シンコマイシン類）、S.フイ
ムブリアタス（S.fimbriatus）（アマロマイシン）、S.
フアシキユラス（S.fasciculus）（アマロマイシン）、
S.エリスレウス（S.erythreus）（エリスロマイシン
類）、S.アンチビオチカス（S.antibioticus）（オレア
ンドマイシン）、S.オリボクロモゲネス（S.clivochrom
ogenes）（オレアンドマイシン）、S.スピニクロモゲネ
ス・バー・スラガオエンシス（S.spinichromogenes va
r.suragaoensis）（クジマイシン類）、S.キタサトエン
シス（S.kitasatoensis）（ロイコマイシン）、S.ナル
ボネンシス・バー・ジヨサマイセチカス（S.narbonensi
s var.josamycetius）（ロイコマイシンA3、ジヨサマイ
シン）、S.アルボグリセオラス（S.albogriseolus）
（ミコノマイシン）、S.ビキニエンシス（S.bikiniensi
s）（チヤルコマイシン）、S.サーラタス（S.cirratu
s）（シラマイシン）、S.ジヤカルテンシス（S.djakart
ensis）（ニダマイシン）、S.ユーリサーマス（S.euryt
hermus）（アンゴラマイシン）、S.フラデイエ（S.frad
iae）（タイロシン、ラクテノシン、マクロシン）、S.
ゴシキエンシス（S.goshikiensis）（バンダマイシ
ン）、S.グリセオフラブス（S.griseoflavus）（アキユ
マイシン）、S.ハルステジイ（S.halstedii）（カルボ
イシン）、S.テンダエ（S.tendae）（カルボマイシ
ン）、S.マクロスポレウス（S.macrosporeus）（カルボ
マイシン）、S.サーモトレランス（S.thermotolerans）
（カルボマイシン）、およびS.アルビレチキユリ（S.al
bireticuli）（カルボマイシン）。
β−ラクタム抗生物質を産生し、本発明に係るベクター
を特に有用に使用でき、形質転換できる好ましいストレ
プトマイセス類の非制限菌株宿主細胞には、例えば以下
のような微生物の非制限細胞が含まれる：ストレプトマ
イセス・リツプマニ（Streptomyces lipmanii）（A1688
4、MM4550、MM13902）、S.クラブリゲラス（S.clavulig
erus）（A16886B、クラブラン酸）、S.ラクタムデユラ
ンス（S.lactamdurans）（セフアマイシンＣ）、S.グリ
セウス（S.griseus）（セフアマイシンＡ、Ｂ）、S.ハ
イグロスコピカス（S.hygroscopicus）（デアセトキシ
セフアロスポリンＣ）、S.ワダヤマエンシス（S.wadaya
maensis）（WS−3442−Ｄ）、S.チヤートレウシス（S.c
hartrensis）（SF1623）、S.ヘテロモルフアス（S.hete
romolphus）およびS.パナエンシス（S.panayensis）（C
2081X）;S.シナモネンシス；（S.cinnamonensis）、S.
フインブリアタス（S.fimbriatus）、S.ハルステジ（S.
halstedii）、S.ロツチエイ（S.rochei）およびS.ビリ
ドクロモゲネス（S.viridochromogenes）（セフアマイ
シンＡ、Ｂ）S.カトレヤ；（S.cattleya）（チエナマイ
シン）；およびS.オリバセウス（S.olivaceus）、S.フ
ラボビレンス（S.flavovirens）、S.フラバス（S.flavu
s）、S.フルボビリジス（S.fulvoviridis）、S.アルゲ
ンテオラス（S.argenteolus）およびS.シオヤエンシス
（S.sioyaensis）（MM4550およびMM13902）。
を特に有用に使用でき、形質転換できる好ましいストレ
プトマイセス類の非制限菌株宿主細胞には、例えば以下
のような微生物の非制限細胞が含まれる：ストレプトマ
イセス・リツプマニ（Streptomyces lipmanii）（A1688
4、MM4550、MM13902）、S.クラブリゲラス（S.clavulig
erus）（A16886B、クラブラン酸）、S.ラクタムデユラ
ンス（S.lactamdurans）（セフアマイシンＣ）、S.グリ
セウス（S.griseus）（セフアマイシンＡ、Ｂ）、S.ハ
イグロスコピカス（S.hygroscopicus）（デアセトキシ
セフアロスポリンＣ）、S.ワダヤマエンシス（S.wadaya
maensis）（WS−3442−Ｄ）、S.チヤートレウシス（S.c
hartrensis）（SF1623）、S.ヘテロモルフアス（S.hete
romolphus）およびS.パナエンシス（S.panayensis）（C
2081X）;S.シナモネンシス；（S.cinnamonensis）、S.
フインブリアタス（S.fimbriatus）、S.ハルステジ（S.
halstedii）、S.ロツチエイ（S.rochei）およびS.ビリ
ドクロモゲネス（S.viridochromogenes）（セフアマイ
シンＡ、Ｂ）S.カトレヤ；（S.cattleya）（チエナマイ
シン）；およびS.オリバセウス（S.olivaceus）、S.フ
ラボビレンス（S.flavovirens）、S.フラバス（S.flavu
s）、S.フルボビリジス（S.fulvoviridis）、S.アルゲ
ンテオラス（S.argenteolus）およびS.シオヤエンシス
（S.sioyaensis）（MM4550およびMM13902）。
ポリエーテル抗生物質を産生し、本発明に係るベクター
を特に有用に使用でき、形質転換できる好ましいストレ
プトマイセス類の非制限菌株宿主細胞には、例えば以下
のような微生物の非制限細胞が含まれる：ストレプトマ
イセスアルブス（Streptomycesalbus）（A204、A28695A
およびＢ、サリノマイシン）、S.ハイグロスコピカス
（S.hygroseopicus）（A218、エメリシド、DE3936、A12
0A、A28695AおよびＢ、エテロマイシン、ジアネマイシ
ン）、S.グリセウス（S.griseus）（クリソリキシ
ン）、S.コングロバタス（S.conglobatus）（イオノマ
イシン）、S.ユーロシジカス・バー・アステロシジカス
（S.eurocidicus var,asterocidicus）（ライドロマイ
シン）、S.ラサリエンシス（S.lasaliensis（ラサロシ
ド）、S.リボシジフイカス（S.ribosidificus）（ロノ
マイシン）、S.カカオ・バー・アソエンシス（S.cacaoi
var.asoensis）（ライソセリン）、S.シナモネンシス
（S.cinamonensis）（モネンシン）、S.オーレオフアシ
エンス（S.aureofaciens）（ナラシン）、S.ガリナリウ
ス（S.gallinarius）（RP30504）、S.ロングウツデンシ
ス（S.longwoodensis）（ライソセリン）、S.フラベオ
ラス（S.flaveolus）（CP38936）、S.ムタビリス（S.mu
tabillis）（Ｓ−11743a）、およびS.ビオラセオニゲル
（S.violaceoniger）（ニゲリシン）。
を特に有用に使用でき、形質転換できる好ましいストレ
プトマイセス類の非制限菌株宿主細胞には、例えば以下
のような微生物の非制限細胞が含まれる：ストレプトマ
イセスアルブス（Streptomycesalbus）（A204、A28695A
およびＢ、サリノマイシン）、S.ハイグロスコピカス
（S.hygroseopicus）（A218、エメリシド、DE3936、A12
0A、A28695AおよびＢ、エテロマイシン、ジアネマイシ
ン）、S.グリセウス（S.griseus）（クリソリキシ
ン）、S.コングロバタス（S.conglobatus）（イオノマ
イシン）、S.ユーロシジカス・バー・アステロシジカス
（S.eurocidicus var,asterocidicus）（ライドロマイ
シン）、S.ラサリエンシス（S.lasaliensis（ラサロシ
ド）、S.リボシジフイカス（S.ribosidificus）（ロノ
マイシン）、S.カカオ・バー・アソエンシス（S.cacaoi
var.asoensis）（ライソセリン）、S.シナモネンシス
（S.cinamonensis）（モネンシン）、S.オーレオフアシ
エンス（S.aureofaciens）（ナラシン）、S.ガリナリウ
ス（S.gallinarius）（RP30504）、S.ロングウツデンシ
ス（S.longwoodensis）（ライソセリン）、S.フラベオ
ラス（S.flaveolus）（CP38936）、S.ムタビリス（S.mu
tabillis）（Ｓ−11743a）、およびS.ビオラセオニゲル
（S.violaceoniger）（ニゲリシン）。
上記の代表的なストレプトマイセス宿主細胞に加えて、
本発明のベクターは、大腸菌を形質転換するのにも有用
である。この様に、本発明は広範囲に適用でき、有用で
あつて、様々な生物の宿主細胞を形質転換することがで
きる。
本発明のベクターは、大腸菌を形質転換するのにも有用
である。この様に、本発明は広範囲に適用でき、有用で
あつて、様々な生物の宿主細胞を形質転換することがで
きる。
本発明のあらゆる態様が利用できるが、本発明の組換え
DNAクローニングベクターおよび形質転換体の内、幾つ
かのものが好ましい。即ち、好適なベクターは、プラス
ミドpHJL2200、pHJL2202、pHJL201、pHJL210およびpHJL
211であり、好適な形質転換体は、ストレプトマイセス
・グリセオフスカス（Streptomyces griseofuscus）/pH
JL2200、S.グリセオフスカス/pHJL2202、S.リビダンス
（S.lividans）/pHJL201、S.リビダンス/pHJL210、S.リ
ビダンス/pHJL211、S.グリセオフスカス/pHJL201、S.グ
リセオフスカス/pHJL210、S.グリセオフスカス/pHJL21
1、S.フラデイエ（S.fradiae）pHJL201、S.フラデイエ/
pHJL210、S.フラデイエ/pHJL211、大腸菌K12C600Rk−Ｍ
ｋ−/pHJL201、大腸菌K12C600Rｋ−Ｍｋ−/pHJL210およ
び大腸菌K12C600Rｋ−Ｍｋ−/pHJL211である。以上の好
適なグループの中でも、プラスミドpHJL201、pHJL210お
よびpHJL211、並びに、形質転換体S.グリセオフスカス/
pHJL201、S.グリセオフスカス/pHJL210、S.グリセオフ
スカス/pHJL211、大腸菌K12C600Rk−Ｍｋ−/pHJL201、
大腸菌K12C600Rｋ−Ｍｋ−/pHJL210および大腸菌K12C60
0Rｋ−Ｍｋ−/pHJL211が最も好適である。
DNAクローニングベクターおよび形質転換体の内、幾つ
かのものが好ましい。即ち、好適なベクターは、プラス
ミドpHJL2200、pHJL2202、pHJL201、pHJL210およびpHJL
211であり、好適な形質転換体は、ストレプトマイセス
・グリセオフスカス（Streptomyces griseofuscus）/pH
JL2200、S.グリセオフスカス/pHJL2202、S.リビダンス
（S.lividans）/pHJL201、S.リビダンス/pHJL210、S.リ
ビダンス/pHJL211、S.グリセオフスカス/pHJL201、S.グ
リセオフスカス/pHJL210、S.グリセオフスカス/pHJL21
1、S.フラデイエ（S.fradiae）pHJL201、S.フラデイエ/
pHJL210、S.フラデイエ/pHJL211、大腸菌K12C600Rk−Ｍ
ｋ−/pHJL201、大腸菌K12C600Rｋ−Ｍｋ−/pHJL210およ
び大腸菌K12C600Rｋ−Ｍｋ−/pHJL211である。以上の好
適なグループの中でも、プラスミドpHJL201、pHJL210お
よびpHJL211、並びに、形質転換体S.グリセオフスカス/
pHJL201、S.グリセオフスカス/pHJL210、S.グリセオフ
スカス/pHJL211、大腸菌K12C600Rk−Ｍｋ−/pHJL201、
大腸菌K12C600Rｋ−Ｍｋ−/pHJL210および大腸菌K12C60
0Rｋ−Ｍｋ−/pHJL211が最も好適である。
本発明のベクターは大腸菌およびストレプトマイセス内
で機能的な複製起源を含有しているので、宿主の選択に
柔軟性がある。従つて、クローンされたDNA配列を大腸
菌内にシヤトル（shuttle）して新しいプラスミドを組
立て、物理的に分析し、更に、制限部位のマツピングを
行い、次いで、再度ストレプトマイセスにシヤトルして
機能分析を行い、菌株の改善を図ることができる。プラ
スミドの増憤および操作はストレプトマイセスよりも、
大腸菌内での方がより速く、簡便に行うことができるこ
とから、このことは特に有利な点である。例えば、本発
明のベクターは、大腸菌K12に入れ、スペクチノマイシ
ンまたはクロラムフエニコールの存在下で増殖させるこ
とにより常法により増幅させることができる。このこと
は、ストレプトマイセス宿主細胞系においては不可能で
ある。更に、全てのプラスミドベクターは大腸菌K12内
で発現される耐性マーカーを含有しているので、組換え
体の選択は容易である。従つて、大量のプラスミドDNA
を都合良く単離でき、しかも、それを、同一の操作をス
トレプトマイセスで行なう場合よりも短時間で行なうこ
とができる。
で機能的な複製起源を含有しているので、宿主の選択に
柔軟性がある。従つて、クローンされたDNA配列を大腸
菌内にシヤトル（shuttle）して新しいプラスミドを組
立て、物理的に分析し、更に、制限部位のマツピングを
行い、次いで、再度ストレプトマイセスにシヤトルして
機能分析を行い、菌株の改善を図ることができる。プラ
スミドの増憤および操作はストレプトマイセスよりも、
大腸菌内での方がより速く、簡便に行うことができるこ
とから、このことは特に有利な点である。例えば、本発
明のベクターは、大腸菌K12に入れ、スペクチノマイシ
ンまたはクロラムフエニコールの存在下で増殖させるこ
とにより常法により増幅させることができる。このこと
は、ストレプトマイセス宿主細胞系においては不可能で
ある。更に、全てのプラスミドベクターは大腸菌K12内
で発現される耐性マーカーを含有しているので、組換え
体の選択は容易である。従つて、大量のプラスミドDNA
を都合良く単離でき、しかも、それを、同一の操作をス
トレプトマイセスで行なう場合よりも短時間で行なうこ
とができる。
本発明に係る組換えDNAクローニングベクターおよび形
質転換体は、広範囲な効用を有し、ストレプトマイセス
および関連微生物に使用するための好適なクローニング
ビヒクルの必要性を満たすものである。その上、抗生物
質に対する耐性を付与する本発明に係るベクターの能力
は、形質転換体を選択する機能的手段を提供することに
もなる。このことは、ベクターDNAを獲得した特定の細
胞を決定し選択することが実際上必要であるが故に重要
である。その存在を確認するための機能的な試験法のな
い他のDNAセグメントもまた、本発明に係るベクター上
に挿入することができ、この非選択性DNAを含有する形
質転換体を、適当な抗生物質を選択することによつて分
離できる。このような非選択性DNAセグメントは、プラ
スミドの機能、維持、並びに複製に必要な領域の内部以
外ならどの部位へも挿入することができる。これには、
抗生物質修飾酵素、抗生物質耐性、抗生物質生合成を特
定する遺伝子およびあらゆる型の調節遺伝子が含まれる
が、これらに限定される訳ではない。
質転換体は、広範囲な効用を有し、ストレプトマイセス
および関連微生物に使用するための好適なクローニング
ビヒクルの必要性を満たすものである。その上、抗生物
質に対する耐性を付与する本発明に係るベクターの能力
は、形質転換体を選択する機能的手段を提供することに
もなる。このことは、ベクターDNAを獲得した特定の細
胞を決定し選択することが実際上必要であるが故に重要
である。その存在を確認するための機能的な試験法のな
い他のDNAセグメントもまた、本発明に係るベクター上
に挿入することができ、この非選択性DNAを含有する形
質転換体を、適当な抗生物質を選択することによつて分
離できる。このような非選択性DNAセグメントは、プラ
スミドの機能、維持、並びに複製に必要な領域の内部以
外ならどの部位へも挿入することができる。これには、
抗生物質修飾酵素、抗生物質耐性、抗生物質生合成を特
定する遺伝子およびあらゆる型の調節遺伝子が含まれる
が、これらに限定される訳ではない。
さらに詳細に述べると、ある遺伝子を含む非選択性のDN
Aセグメントを、例えば、例示プラスミドpHJL210の単一
のBamHI制限サイトに挿入することができる。かかる挿
入によつて、ネオマイシン耐性遺伝子が不活性化される
ので、組換えプラスミドを含むストレプトマイセス形質
転換体を容易に同定することができる。即ち、この場合
まずチオストレプトン耐性によつて選択し、次にネオマ
イシン耐性でないチオストレプトン耐性形質転換体を同
定する。同様に、所望のDNAセグメントを例えば、単一
のCIaI制限サイトに挿入してチオストレプトン耐性遺伝
子を不活性化する。従つて、この組換えプラスミドを持
つ形質転換体もまた、まずネオマイシン耐性で選択し、
次にチオストレプトン耐性でないネオマイシン耐性形質
転換体を同定することによつて、容易に同定できる。従
つて、ストレプトマイセスおよび関連細胞における抗生
物質耐性による選択能によつて、目的とする特定の非選
択性DNAを含有するごく少数の細胞を効率的に分離でき
るようになる。
Aセグメントを、例えば、例示プラスミドpHJL210の単一
のBamHI制限サイトに挿入することができる。かかる挿
入によつて、ネオマイシン耐性遺伝子が不活性化される
ので、組換えプラスミドを含むストレプトマイセス形質
転換体を容易に同定することができる。即ち、この場合
まずチオストレプトン耐性によつて選択し、次にネオマ
イシン耐性でないチオストレプトン耐性形質転換体を同
定する。同様に、所望のDNAセグメントを例えば、単一
のCIaI制限サイトに挿入してチオストレプトン耐性遺伝
子を不活性化する。従つて、この組換えプラスミドを持
つ形質転換体もまた、まずネオマイシン耐性で選択し、
次にチオストレプトン耐性でないネオマイシン耐性形質
転換体を同定することによつて、容易に同定できる。従
つて、ストレプトマイセスおよび関連細胞における抗生
物質耐性による選択能によつて、目的とする特定の非選
択性DNAを含有するごく少数の細胞を効率的に分離でき
るようになる。
上述の抗生物質耐性についての機能試験は、さらに、制
御（コントロール）因子または生合成因子として作用
し、個々の抗生物質耐性遺伝子の発現を指令するDNAセ
グメントの位置決定にも使用される。プロモーター、ア
テニユエーター、リプレツサー、インデユーサー、リボ
ゾーム結合サイト等を含む（これらに限定される訳では
ない）上記セグメントは、ストレプトマイセスおよび関
連微生物の細胞における他の遺伝子の発現の制御に使用
される。
御（コントロール）因子または生合成因子として作用
し、個々の抗生物質耐性遺伝子の発現を指令するDNAセ
グメントの位置決定にも使用される。プロモーター、ア
テニユエーター、リプレツサー、インデユーサー、リボ
ゾーム結合サイト等を含む（これらに限定される訳では
ない）上記セグメントは、ストレプトマイセスおよび関
連微生物の細胞における他の遺伝子の発現の制御に使用
される。
本発明の抗生物質耐性付与ベクターは、結合したDNAセ
グメントが宿主細胞中で幾世代にも渡つて安定に維持さ
れることを保証するためにも有用である。抗生物質耐性
付与フラグメントと共有結合し、ストレプトマイセスま
たは大腸菌のいずれかの中で増殖するこれら遺伝子ある
いはDNAフラグメントは、非形質転換細胞にとつては有
毒な濃度の抗生物質にこの形質転換体をさらすことによ
つて維持できる。そうすることにより、ベクターを失
い、従つて共有結合したあらゆるDNAを失つた形質転換
体は生育できず、培地から除去される。
グメントが宿主細胞中で幾世代にも渡つて安定に維持さ
れることを保証するためにも有用である。抗生物質耐性
付与フラグメントと共有結合し、ストレプトマイセスま
たは大腸菌のいずれかの中で増殖するこれら遺伝子ある
いはDNAフラグメントは、非形質転換細胞にとつては有
毒な濃度の抗生物質にこの形質転換体をさらすことによ
つて維持できる。そうすることにより、ベクターを失
い、従つて共有結合したあらゆるDNAを失つた形質転換
体は生育できず、培地から除去される。
このように、本発明に係るベクターは、クローンしたDN
Aあるいは発現産物が宿主細胞にとつて致死的なもので
ない限り、所望のいかなるDNA配列をも安定化し維持す
ることができる。
Aあるいは発現産物が宿主細胞にとつて致死的なもので
ない限り、所望のいかなるDNA配列をも安定化し維持す
ることができる。
本発明に係るクローニングベクターおよび形質転換体に
よれば、今日ストレプトマイセスおよび関連細胞内で生
産されている数多くの生成物の収量を向上させるために
遺伝子をクローンすることができる。こうした生成物の
例として、ストレプトマイシン、タイロシン、セフアロ
スポリン類、アクタプラニン、アボパルシン、ナラシ
ン、モネンシン、アプラマイシン、トブラマイシン、エ
リスロマイシン、テトラサイクリン、クロラムフエニコ
ール、バンコマイシンおよびタイコマイシン等が挙げら
れるが、これらに限定される訳ではない。さらに本発明
は、商業的に重要な蛋白質類、例えばヒトインシユリ
ン、ヒトプロインシユリン、グルカゴン、インターフエ
ロン、ヒト成長ホルモン、鳥類成長ホルモン、牛成長ホ
ルモン、豚成長ホルモン、インターロイキンＩおよびイ
ンターロイキンII等、商業的に重要な工程および物質に
つながる代謝経路における酵素機能、または遺伝子の発
現を改善する制御因子、を暗号化しているDNA配列をク
ローンし、特性化し、再構成するのに有用な選択可能な
ベクターを提供する。これらの望ましいDNA配列とは、
例えばストレプトマイシン、セフアロスポリン、タイロ
シン、アクタプラニン、アボパルシン、ナラシン、モネ
ンシン、アプラマイシン、トブラマイシン、テトラサイ
クリン、クロラムフエニコール、エリスロマイシン、タ
イコマイシンおよびバンコマイシン誘導体等の誘導抗生
物質の合成を触媒する酵素、または抗生物質もしくは他
の生成物の生合成を仲介し増強させる酵素をコードして
いるDNAを含むが、これらに限定される訳ではない。
よれば、今日ストレプトマイセスおよび関連細胞内で生
産されている数多くの生成物の収量を向上させるために
遺伝子をクローンすることができる。こうした生成物の
例として、ストレプトマイシン、タイロシン、セフアロ
スポリン類、アクタプラニン、アボパルシン、ナラシ
ン、モネンシン、アプラマイシン、トブラマイシン、エ
リスロマイシン、テトラサイクリン、クロラムフエニコ
ール、バンコマイシンおよびタイコマイシン等が挙げら
れるが、これらに限定される訳ではない。さらに本発明
は、商業的に重要な蛋白質類、例えばヒトインシユリ
ン、ヒトプロインシユリン、グルカゴン、インターフエ
ロン、ヒト成長ホルモン、鳥類成長ホルモン、牛成長ホ
ルモン、豚成長ホルモン、インターロイキンＩおよびイ
ンターロイキンII等、商業的に重要な工程および物質に
つながる代謝経路における酵素機能、または遺伝子の発
現を改善する制御因子、を暗号化しているDNA配列をク
ローンし、特性化し、再構成するのに有用な選択可能な
ベクターを提供する。これらの望ましいDNA配列とは、
例えばストレプトマイシン、セフアロスポリン、タイロ
シン、アクタプラニン、アボパルシン、ナラシン、モネ
ンシン、アプラマイシン、トブラマイシン、テトラサイ
クリン、クロラムフエニコール、エリスロマイシン、タ
イコマイシンおよびバンコマイシン誘導体等の誘導抗生
物質の合成を触媒する酵素、または抗生物質もしくは他
の生成物の生合成を仲介し増強させる酵素をコードして
いるDNAを含むが、これらに限定される訳ではない。
前記の如くDNAセグメントを、ストレプトマイセスおよ
び大腸菌に挿入し、安定化し、シヤトル操作することが
できるので、ストレプトマイセスが産生する抗生物質の
収量と利用性の向上を目的とする遺伝子組換え操作を容
易に行うことができる。更に、プラスミドpJL192の〜2.
5kbKpnＩ複製起源含有フラグメントは高いコピー数のプ
ラスミドを与えるので、彫写または翻訳効率の低いDNA
配列の殆んど全てのものを、本発明のベクターに容易に
クローンし、ストレプトマイセスと大腸菌の間でシヤト
ル操作することができる。
び大腸菌に挿入し、安定化し、シヤトル操作することが
できるので、ストレプトマイセスが産生する抗生物質の
収量と利用性の向上を目的とする遺伝子組換え操作を容
易に行うことができる。更に、プラスミドpJL192の〜2.
5kbKpnＩ複製起源含有フラグメントは高いコピー数のプ
ラスミドを与えるので、彫写または翻訳効率の低いDNA
配列の殆んど全てのものを、本発明のベクターに容易に
クローンし、ストレプトマイセスと大腸菌の間でシヤト
ル操作することができる。
大腸菌K12C600Rｋ−Ｍｋ−/pJL192（NRRL15040）は、幾
つかの異なる培地のどれかを用いて種々の方法で培養で
きる。培地中の好ましい炭水化物源としては、例えば、
グルコースおよびグリセリンが含まれ、窒素源としては
例えばアンモニウム塩、アミノ酸混合物およびペプトン
類が含まれる。栄養無機塩類もまた添加され、これには
マグネシウム、ナトリウム、カリウム、アンモニウム、
カルシウム、リン酸、塩素および硫酸イオンなどを放出
し得る通常の塩類が含まれる。他の微生物の発育と増殖
に必要であるように、必須微量元素もまた添加する。こ
うした微量元素は、通常、他の培地成分の添加に付随す
る不純物の形で供給される。
つかの異なる培地のどれかを用いて種々の方法で培養で
きる。培地中の好ましい炭水化物源としては、例えば、
グルコースおよびグリセリンが含まれ、窒素源としては
例えばアンモニウム塩、アミノ酸混合物およびペプトン
類が含まれる。栄養無機塩類もまた添加され、これには
マグネシウム、ナトリウム、カリウム、アンモニウム、
カルシウム、リン酸、塩素および硫酸イオンなどを放出
し得る通常の塩類が含まれる。他の微生物の発育と増殖
に必要であるように、必須微量元素もまた添加する。こ
うした微量元素は、通常、他の培地成分の添加に付随す
る不純物の形で供給される。
大腸菌K12CR600Rｋ−Ｍｋ−/pJL192は、約6.5〜7.5とい
う比較的広いpH領域に渡つて約25℃〜42℃の温度範囲に
おいて好気的培養条件下に発育させることができる。し
かしながら、プラスミドpJL192を最大量生産するために
は、培地のpHを約7.2で培養を開始し、約37℃の温度に
維持するのが望ましい。上記の条件で大腸菌細胞を培養
すれば、プラスミドpJL192を常套の技術によつて単離す
ることができる貯蔵体としての細胞が得られる。
う比較的広いpH領域に渡つて約25℃〜42℃の温度範囲に
おいて好気的培養条件下に発育させることができる。し
かしながら、プラスミドpJL192を最大量生産するために
は、培地のpHを約7.2で培養を開始し、約37℃の温度に
維持するのが望ましい。上記の条件で大腸菌細胞を培養
すれば、プラスミドpJL192を常套の技術によつて単離す
ることができる貯蔵体としての細胞が得られる。
図面の説明 第１図はプラスミドpJL192の制限サイト地図である。
第２図はプラスミドpHJL2200およびpHJL2201の制限サイ
トおよび機能地図である。
トおよび機能地図である。
第３図はプラスミドpHJL2202およびpHJL2203の制限サイ
トおよび機能地図である。
トおよび機能地図である。
第４図はプラスミドpHJL201の制限サイトおよび機能地
図である。
図である。
第５図はプラスミドpHJL200、pHJL202、pHJL203、pHJL2
04およびpHJL205の制限サイトおよび機能地図である。
04およびpHJL205の制限サイトおよび機能地図である。
第６図はプラスミドpHJL210およびpHJL211の制限サイト
および機能地図である。
および機能地図である。
以下に実施例を挙げ、本発明を詳しく説明する。本発明
の説明、および本発明の組立てに用いた実際の方法を適
宜記述した。
の説明、および本発明の組立てに用いた実際の方法を適
宜記述した。
実施例１ 大腸菌K12C600Rｋ−Ｍｋ−/pJL192の培養お
よびプラスミドpJL192の単離 大腸菌12C600Rｋ−Ｍｋ−/pJL192（NRRL B−15040）の
細菌コロニー１個を、水溶液１中に、バクト（Bact
o）トリプトン10g、バクト酵母エキス5gおよびNaCl10g
を含有し（pH7.5）、さらにアンピシリン25μg/mlを含
んでいるLB培地に、通常の微生物学的手法に従つて接種
した。この培養物を37℃で一夜インキユベートした。翌
朝、1mM MgSO4、0.2％グルコース、.3−４％CAA（カザ
ミノ酸、Difco）、２μg/mlB1（チアミン−HCl、Sigm
a）および添加物を補充したM9培地〔ミラー（Miller）
ら、1979、エクスペリメンツ・イン・モレキユラー・ジ
エネテイツクス（Experiments in Molecular Genetic
s）、コールド・スプリング・ハーバー・ラボラトリイ
ズ（Cold Spring Harbor Laboratories）、コールド・
スプリング・ハーバー、ニユーヨーク〕500mlに、上記
の一夜培養物5mlを接種した。培養物を、激しく振盪し
ながら37℃で一夜インキユベートし、翌朝得た一夜培養
物の標本を、補充したM9培地に、希釈率1/10〜1/50で接
種し、激しく振盪しながら37℃で21/2〜３時間インキユ
ベートした。青色フイルターを用いて測定した培養物の
濁り度は約300〜400Klett単位であつた。この微生物に
クロラムフエニコール（150−175μg/ml）を加えて、激
しい振盪下でのインキユベーシヨンを更に一夜続けた。
よびプラスミドpJL192の単離 大腸菌12C600Rｋ−Ｍｋ−/pJL192（NRRL B−15040）の
細菌コロニー１個を、水溶液１中に、バクト（Bact
o）トリプトン10g、バクト酵母エキス5gおよびNaCl10g
を含有し（pH7.5）、さらにアンピシリン25μg/mlを含
んでいるLB培地に、通常の微生物学的手法に従つて接種
した。この培養物を37℃で一夜インキユベートした。翌
朝、1mM MgSO4、0.2％グルコース、.3−４％CAA（カザ
ミノ酸、Difco）、２μg/mlB1（チアミン−HCl、Sigm
a）および添加物を補充したM9培地〔ミラー（Miller）
ら、1979、エクスペリメンツ・イン・モレキユラー・ジ
エネテイツクス（Experiments in Molecular Genetic
s）、コールド・スプリング・ハーバー・ラボラトリイ
ズ（Cold Spring Harbor Laboratories）、コールド・
スプリング・ハーバー、ニユーヨーク〕500mlに、上記
の一夜培養物5mlを接種した。培養物を、激しく振盪し
ながら37℃で一夜インキユベートし、翌朝得た一夜培養
物の標本を、補充したM9培地に、希釈率1/10〜1/50で接
種し、激しく振盪しながら37℃で21/2〜３時間インキユ
ベートした。青色フイルターを用いて測定した培養物の
濁り度は約300〜400Klett単位であつた。この微生物に
クロラムフエニコール（150−175μg/ml）を加えて、激
しい振盪下でのインキユベーシヨンを更に一夜続けた。
４℃において５分間、7,500rpmで遠心して細菌細胞を収
獲し、次いでSV（.15MNACl、.1MNaEDTA pH8.0）200mlで
２回洗浄した。このペレツトを、TS溶液（25％スクロー
ス、50mMトリス、pH8）に10ml/g（湿重量）の割合で懸
濁し、氷上に置いた。この懸濁液にリゾチーム（50mMト
リス−HClpH7.8中5mg/ml）を2ml/g（湿重量）の割合で
加え、５分間、氷の上で冷やした。次いで、.25MEDTA
（pH8.0）を16ml/g（湿重量）の割合で加え、更に５分
間冷却した。溶菌溶液（.4％デオキシコレート、１％Br
ij58、50mMトリスおよび.0625MEDTA、pH8）16ml/g（湿
重量）を加え、得られた混合物を37℃で15−30分間イン
キユベートした。ソルボール（Sorvall）SS34ローター
内で、４℃において21,000rpmで15−30分間遠心するこ
とにより、DNAを回収した。上清をとり、これに.1容量
の3MNaOAc（pH8）および.64容量のイソプロパノールを
加えた。４℃で遠心し（10,000rpm×10分間）、得られ
たDNAペレツトを.1容量のTE（10mMトリス、1mMEDTA.pH
8）に懸濁した。このプラスミドDNAを、既知の手法に従
い、ヨウ化プロピジウムを含有する塩化セシウム密度勾
配中で遠心して平衡化することにより、精製した。
獲し、次いでSV（.15MNACl、.1MNaEDTA pH8.0）200mlで
２回洗浄した。このペレツトを、TS溶液（25％スクロー
ス、50mMトリス、pH8）に10ml/g（湿重量）の割合で懸
濁し、氷上に置いた。この懸濁液にリゾチーム（50mMト
リス−HClpH7.8中5mg/ml）を2ml/g（湿重量）の割合で
加え、５分間、氷の上で冷やした。次いで、.25MEDTA
（pH8.0）を16ml/g（湿重量）の割合で加え、更に５分
間冷却した。溶菌溶液（.4％デオキシコレート、１％Br
ij58、50mMトリスおよび.0625MEDTA、pH8）16ml/g（湿
重量）を加え、得られた混合物を37℃で15−30分間イン
キユベートした。ソルボール（Sorvall）SS34ローター
内で、４℃において21,000rpmで15−30分間遠心するこ
とにより、DNAを回収した。上清をとり、これに.1容量
の3MNaOAc（pH8）および.64容量のイソプロパノールを
加えた。４℃で遠心し（10,000rpm×10分間）、得られ
たDNAペレツトを.1容量のTE（10mMトリス、1mMEDTA.pH
8）に懸濁した。このプラスミドDNAを、既知の手法に従
い、ヨウ化プロピジウムを含有する塩化セシウム密度勾
配中で遠心して平衡化することにより、精製した。
実施例２ ストレプトマイセス−機能的プラスミドpHJL
2200、pHJL2201、pHJL2202、およびpHJL2203の組立て A.プラスミドpJL192のｋpnＩ消化、および〜2.5kb複製
起源含有制限フラグメントの単離プラスミドpJL192DNA
約20μｌ（20μｇ）、BSA（ウシ血清アルブミン、1mg/m
l）５μｌ、水19μｌ、ＫpnＩ（８単位／μｌ）制限酵
素＊１μｌおよび反応ミツクス＊＊５μｌを37℃で２時
間インキユベートした後、70℃において10分間加熱し、
反応を終了させた。0.1容量の3MNAOAc（pH8）、次いで
２容量の100％エタノールで処理してDNAを沈殿させた。
この沈殿処理は、−20℃で一夜あるいは−70℃（ドライ
アイス上）で少くとも15分間冷却してもよい。このDNA
沈殿を70％冷エタノールで１回洗浄した後、乾燥し、TE
（10mMトリス、1mMEDTA、pH8.0）50μｌに懸濁した。得
られたDNAを、実質上、マニアテイス（Maniatis）らの
方法〔1982、モレキユラー・クローニング（Molecular
Cloning）、コールド・スプリング・ハーバー・ラボラ
トリイズ、コールド・スプリング・ハーバー、ニユーヨ
ーク）に従い、水平アガロースゲル上、1XTBE緩衝液（8
9mMトリス−HCl、pH8.3、89mMホウ酸、2.5mMEDTA）中で
電気泳動させた。
2200、pHJL2201、pHJL2202、およびpHJL2203の組立て A.プラスミドpJL192のｋpnＩ消化、および〜2.5kb複製
起源含有制限フラグメントの単離プラスミドpJL192DNA
約20μｌ（20μｇ）、BSA（ウシ血清アルブミン、1mg/m
l）５μｌ、水19μｌ、ＫpnＩ（８単位／μｌ）制限酵
素＊１μｌおよび反応ミツクス＊＊５μｌを37℃で２時
間インキユベートした後、70℃において10分間加熱し、
反応を終了させた。0.1容量の3MNAOAc（pH8）、次いで
２容量の100％エタノールで処理してDNAを沈殿させた。
この沈殿処理は、−20℃で一夜あるいは−70℃（ドライ
アイス上）で少くとも15分間冷却してもよい。このDNA
沈殿を70％冷エタノールで１回洗浄した後、乾燥し、TE
（10mMトリス、1mMEDTA、pH8.0）50μｌに懸濁した。得
られたDNAを、実質上、マニアテイス（Maniatis）らの
方法〔1982、モレキユラー・クローニング（Molecular
Cloning）、コールド・スプリング・ハーバー・ラボラ
トリイズ、コールド・スプリング・ハーバー、ニユーヨ
ーク）に従い、水平アガロースゲル上、1XTBE緩衝液（8
9mMトリス−HCl、pH8.3、89mMホウ酸、2.5mMEDTA）中で
電気泳動させた。
分離したフラグメントを臭化エチジウム染色でゲル上の
位置決めをし、紫外線照射下で螢光性のバンドを観察し
た。所望の〜2.5kbバンドに隣接する位置から薄片を切
り出し、その間隙にDEAE−セルロース（ワツトマン（wh
atman）DE−81）紙をおいた。この紙に、DNAが完全
に結合するまでDNAを電気泳動させた。この紙をとり
出して100mMKClおよび10mMトリス−HCl（pH8）中で１回
洗浄し、溶離緩衝液（1M NaCl、10mMトリス−HCl、pH
8）中で激しく振り混ぜることにより、拡散させた。シ
リコーン処理したパイレツクス・ウールで過して紙
を除き、液を直接、２容量のエタノールで処理してDN
Aを沈殿させるか、あるいは、１容量の水で希釈してか
らエタノール沈殿に付すことにより、DNAを沈殿させ
た。ドライアイス上で１時間、あるいは−20℃で一夜処
理する沈殿法によつてもよい。沈殿させた後、フラグメ
ントをTE緩衝液100−500μｌに再溶解し、以後のライゲ
ーシヨンに供した。＊ 制限酵素類およびそれに関する指示は、下記の供給源
から得た： ニユーイングランド・バイオ・ラポラトリイズ（New En
gland Bio Labs.）Inc.32 トザー・ロード・ベバリイ
（Tozer Road Bevely）、マサチユーセツツ01915 ベーリンガー−マンハイム・バイオケミカルス（Boehri
nger−Mannheim Biochemicals）、7941キヤツスルウエ
イ・ドライブ（Castlewey Drive）P.O.Box50816インデ
イアナポリス、インデイアナ46250 ベサスダ・リサーチ・ラポラトリイズ（Bethesda Reser
ch Laboratories）Inc.、8717グローブモント・サーク
ル（Grovemont Circle）P.O.Box577、ガイザースバー
グ、メアリーランド20760＊＊ ｋpnＩ制限酵素のための反応ミツクスは、以下の組
成物から調製された： 60mM NaCl 60mMトリス・HCl、pH7.5 60mM MgCl2 60mM2−メルカプトエタノール B.プラスミドpJR2のチオストレプトン耐性−付与フラグ
メントの消化と単離 アメリカ特許第4,416,994号によつてその組立て方が開
示されているプラスミドpLR2DNA約20μｇを、このプラ
スミドを４箇所で切り開く制限酵素BamHIＲで消化す
る。こうして生成するBamHI−末端を、マニアテイスら
（1982年）が記述した如く、クレノー（Klenow）ポリメ
ラーゼＩでうめる（billedin）。次に、これらの平滑末
端フラグメントをＫpnＩリンカー（配列:pCGGTACCGの、
自己相補性オリゴヌクレオチドからなるリンカーであつ
て、コラボラテイブ・リサーチ（Collaborative Reserc
h）,Inc.128スプリング・ストリート（Spring Stree
t）、レキシントン、マサチユーセツツ02173から入手可
能である〕と結合させてプラスミドpJL192の〜2.5kbKpn
Ｉ複製起源含有フラグメントとライゲーシヨンするため
の、ＫpnＩ開裂部位を供給する。pJR2から得たDNAフラ
グメント20μｇを、５′−りん酸化合成オリゴヌクレオ
チドPCGGTACCG200ピコモルの存在下、T4DNAリガーゼ緩
衝液（20mMトリス、pH7.6、0.5mMATP、10mM MgCl2、5mM
ジチオトレイトール）20μｌ中で、20−22℃において、
T4DNAリガーゼ＊＊10単位で一夜処理する。次いで、こ
の溶液を70℃で10分間加熱してライゲーシヨンを終止さ
せる。ＫpnＩ消化してリンカーを開裂させ、ＫpnＩ末端
を有するフラグメントを１％AGEによつて分離する（ア
ガロースゲル電気泳動）。最初にゲルを臭化エチジウム
で染色し、紫外線でフラグメントの位置を定め、次いで
紙から目的物を溶離する、という前記実施例2Aの方法
に従つて、〜1.6kbフラグメントをゲルから単離する。＊ BamHI制限酵素のための反応ミツクスは、以下の組成
物で調製した： 1.5M NaCl 60mMトリス−HCl、pH7.9 60mM MgCl2 ＊＊ T4DNAリガーゼは下記の供給源から入手し得る： ニユーイングランド・バイオ・ラボラトリイズ、Inc.32
トザー・ロード・ベバリイ、マサチユーセツツ01915 ベセスダ・リサーチ・ラポラトリイズP.O.Box577ガイザ
ースバーグ、メアリーランド20760 ベーリンガー・マンハイム・バイオケミカルス7941キヤ
ツスルウエイ・ドライブP.O.Box50816インデイアナポリ
ス、インデイアナ（46250）C.プラスミドpHJL2200およ
びpHJL2201を生成させるためのライゲーシヨン プラスミドpJL192DNAの〜2.5kbKpnIフラグメント（実施
例2A）約20μｌ、プラスミドpJR2DNAの〜1.6kbBamHIフ
ラグメント（実施例2B）20μｌ、５×キナーゼ／リガー
ゼ緩衝液（実施例4B）10μｌ、およびT4DNAリガーゼ１
μｌを16℃で４時間インキユベートする。次いで、この
ライゲーシヨン生成物を、直接ストレプトマイセス菌株
の形質転換に用いることができる。プラスミドpHJL2200
およびpHJL2201の制限サイトおよび機能地図を添付の第
２図に示す。
位置決めをし、紫外線照射下で螢光性のバンドを観察し
た。所望の〜2.5kbバンドに隣接する位置から薄片を切
り出し、その間隙にDEAE−セルロース（ワツトマン（wh
atman）DE−81）紙をおいた。この紙に、DNAが完全
に結合するまでDNAを電気泳動させた。この紙をとり
出して100mMKClおよび10mMトリス−HCl（pH8）中で１回
洗浄し、溶離緩衝液（1M NaCl、10mMトリス−HCl、pH
8）中で激しく振り混ぜることにより、拡散させた。シ
リコーン処理したパイレツクス・ウールで過して紙
を除き、液を直接、２容量のエタノールで処理してDN
Aを沈殿させるか、あるいは、１容量の水で希釈してか
らエタノール沈殿に付すことにより、DNAを沈殿させ
た。ドライアイス上で１時間、あるいは−20℃で一夜処
理する沈殿法によつてもよい。沈殿させた後、フラグメ
ントをTE緩衝液100−500μｌに再溶解し、以後のライゲ
ーシヨンに供した。＊ 制限酵素類およびそれに関する指示は、下記の供給源
から得た： ニユーイングランド・バイオ・ラポラトリイズ（New En
gland Bio Labs.）Inc.32 トザー・ロード・ベバリイ
（Tozer Road Bevely）、マサチユーセツツ01915 ベーリンガー−マンハイム・バイオケミカルス（Boehri
nger−Mannheim Biochemicals）、7941キヤツスルウエ
イ・ドライブ（Castlewey Drive）P.O.Box50816インデ
イアナポリス、インデイアナ46250 ベサスダ・リサーチ・ラポラトリイズ（Bethesda Reser
ch Laboratories）Inc.、8717グローブモント・サーク
ル（Grovemont Circle）P.O.Box577、ガイザースバー
グ、メアリーランド20760＊＊ ｋpnＩ制限酵素のための反応ミツクスは、以下の組
成物から調製された： 60mM NaCl 60mMトリス・HCl、pH7.5 60mM MgCl2 60mM2−メルカプトエタノール B.プラスミドpJR2のチオストレプトン耐性−付与フラグ
メントの消化と単離 アメリカ特許第4,416,994号によつてその組立て方が開
示されているプラスミドpLR2DNA約20μｇを、このプラ
スミドを４箇所で切り開く制限酵素BamHIＲで消化す
る。こうして生成するBamHI−末端を、マニアテイスら
（1982年）が記述した如く、クレノー（Klenow）ポリメ
ラーゼＩでうめる（billedin）。次に、これらの平滑末
端フラグメントをＫpnＩリンカー（配列:pCGGTACCGの、
自己相補性オリゴヌクレオチドからなるリンカーであつ
て、コラボラテイブ・リサーチ（Collaborative Reserc
h）,Inc.128スプリング・ストリート（Spring Stree
t）、レキシントン、マサチユーセツツ02173から入手可
能である〕と結合させてプラスミドpJL192の〜2.5kbKpn
Ｉ複製起源含有フラグメントとライゲーシヨンするため
の、ＫpnＩ開裂部位を供給する。pJR2から得たDNAフラ
グメント20μｇを、５′−りん酸化合成オリゴヌクレオ
チドPCGGTACCG200ピコモルの存在下、T4DNAリガーゼ緩
衝液（20mMトリス、pH7.6、0.5mMATP、10mM MgCl2、5mM
ジチオトレイトール）20μｌ中で、20−22℃において、
T4DNAリガーゼ＊＊10単位で一夜処理する。次いで、こ
の溶液を70℃で10分間加熱してライゲーシヨンを終止さ
せる。ＫpnＩ消化してリンカーを開裂させ、ＫpnＩ末端
を有するフラグメントを１％AGEによつて分離する（ア
ガロースゲル電気泳動）。最初にゲルを臭化エチジウム
で染色し、紫外線でフラグメントの位置を定め、次いで
紙から目的物を溶離する、という前記実施例2Aの方法
に従つて、〜1.6kbフラグメントをゲルから単離する。＊ BamHI制限酵素のための反応ミツクスは、以下の組成
物で調製した： 1.5M NaCl 60mMトリス−HCl、pH7.9 60mM MgCl2 ＊＊ T4DNAリガーゼは下記の供給源から入手し得る： ニユーイングランド・バイオ・ラボラトリイズ、Inc.32
トザー・ロード・ベバリイ、マサチユーセツツ01915 ベセスダ・リサーチ・ラポラトリイズP.O.Box577ガイザ
ースバーグ、メアリーランド20760 ベーリンガー・マンハイム・バイオケミカルス7941キヤ
ツスルウエイ・ドライブP.O.Box50816インデイアナポリ
ス、インデイアナ（46250）C.プラスミドpHJL2200およ
びpHJL2201を生成させるためのライゲーシヨン プラスミドpJL192DNAの〜2.5kbKpnIフラグメント（実施
例2A）約20μｌ、プラスミドpJR2DNAの〜1.6kbBamHIフ
ラグメント（実施例2B）20μｌ、５×キナーゼ／リガー
ゼ緩衝液（実施例4B）10μｌ、およびT4DNAリガーゼ１
μｌを16℃で４時間インキユベートする。次いで、この
ライゲーシヨン生成物を、直接ストレプトマイセス菌株
の形質転換に用いることができる。プラスミドpHJL2200
およびpHJL2201の制限サイトおよび機能地図を添付の第
２図に示す。
D.プラスミドpHJL2200のBclI部分消化 プラスミドpJL192、KpnI制限酵素および反応ミツクスの
代りにプラスミドpHJL2200、BclI制限酵素および反応ミ
ツクス＊を用いる外は実施例2Aと実質上同様にして所望
の消化を行う。なお、反応温度は50℃であり、また、２
回のフエノール抽出、３回のエーテル抽出の後、エタノ
ール沈殿に付して反応を終了させ、得られた沈殿を水に
懸濁し、以後のAGE処理に供する。ＲBclI制限酵素のた
めの反応ミツクスは以下の成分から調製した：＊ BclI制限酵素のための反応ミツクスは以下の成分から
調製した： 750mM KCl 60mMトリス−HCl、pH7.4（25℃） 100mM MgCl2 10mMジチオトレイトール E.プラスミドpLR1の〜3.4kbBamHIフラグメントの消化お
よび単離 プラスミドpJL192およびＫpnＩ制限酵素の代りに、アメ
リカ特許第4,416,994号でその組立て方法が開示されて
いるプラスミドpLR4およびBamHI制限酵素を用いる以外
は、実質上、実施例2Aと同様にして所望の消化を行う。
代りにプラスミドpHJL2200、BclI制限酵素および反応ミ
ツクス＊を用いる外は実施例2Aと実質上同様にして所望
の消化を行う。なお、反応温度は50℃であり、また、２
回のフエノール抽出、３回のエーテル抽出の後、エタノ
ール沈殿に付して反応を終了させ、得られた沈殿を水に
懸濁し、以後のAGE処理に供する。ＲBclI制限酵素のた
めの反応ミツクスは以下の成分から調製した：＊ BclI制限酵素のための反応ミツクスは以下の成分から
調製した： 750mM KCl 60mMトリス−HCl、pH7.4（25℃） 100mM MgCl2 10mMジチオトレイトール E.プラスミドpLR1の〜3.4kbBamHIフラグメントの消化お
よび単離 プラスミドpJL192およびＫpnＩ制限酵素の代りに、アメ
リカ特許第4,416,994号でその組立て方法が開示されて
いるプラスミドpLR4およびBamHI制限酵素を用いる以外
は、実質上、実施例2Aと同様にして所望の消化を行う。
F.プラスミドpHJL2202およびpHJL2203を生成たせるため
のライゲーシヨン 実質上、実施例2Cと同様にして所望のライゲーシヨンを
行う。〜3.4kbBamHIネオマイシン耐性付与フラグメント
は、プラスミドpHJL2200の２つのBamHI部位のいずれに
も、どちらの方向性によつてもライゲートし得るので、
所望の表現型を持つた、４つの方向性の組換えプラスミ
ドが得られる。プラスミドpHJL2202およびpHJL2203の制
限サイトおよび機能地図を添付の第３図に示す。
のライゲーシヨン 実質上、実施例2Cと同様にして所望のライゲーシヨンを
行う。〜3.4kbBamHIネオマイシン耐性付与フラグメント
は、プラスミドpHJL2200の２つのBamHI部位のいずれに
も、どちらの方向性によつてもライゲートし得るので、
所望の表現型を持つた、４つの方向性の組換えプラスミ
ドが得られる。プラスミドpHJL2202およびpHJL2203の制
限サイトおよび機能地図を添付の第３図に示す。
実施例３ ストレプトマイセス・グリセオフスカス/pHJ
L2200およびS.グリセオフスカス/pHJL2202の組立て A.プロトプラストを調製するための、培養物の増殖 アメリカン・タイプ・カルチヤー・コレクシヨン（Amer
ican Type Culture Collection）、ロツクビレ（Rockvi
lle）、メアリーランド20852のパーマネント・ストツク
・カルチヤー・コレクシヨンに寄託され、その一部を構
成しており、寄託番号ATCC23916の下、誰でも入手可能
である菌株、S.グリセオフスカス（S.griseofuscus）
を、４％グリシンを補充したTSB＊中において、液中条
件下、30℃で20時間増殖させることにより、常法通り栄
養接種物を調製した。S.グリセオフスカスのプロトプラ
スト化は時間がかかるが、一般に次の様にして行われ
る。YMX寒天（0.3酵母エキス、0.3％麦芽エキス、0.2％
デキストロースおよび２％寒天を含有する平板上にS.グ
リセオフスカスを直線接種する。約48時間後、１個の細
菌コロニーを10mlのTSB＊に接種し；ホモジナイズ（均
質化）し、次いで30℃で一夜インキユベートする。次い
で、一夜培養物4mlをホモジナイズし、.4％グリシンを
補充したTSB100mlを加え、30℃で一夜培養する。次の日
の午後に、得られたばかりの一夜培養物を用いて上記操
作を繰返し、行う。翌朝、この培養物に50％（v/v）グ
リセリン50mlを加え、試料15mlを−20℃で凍結する。こ
の凍結細胞は６カ月間保存することができ、それを形質
転換に用いることができる。水を張ったビーカー内にチ
ユーブを入れ、室温に放置することにより、凍結細胞を
解凍する。ベンチ・トツプ（bench top）遠心器内に細
胞を収獲し、10.3％スクロース10ml中で３回洗浄する。
この細胞ペレツトを、リゾチーム（1mg/ml）を補充した
Ｐ培地〔ホツプウツドおよびライト（Hopwood and Wrig
ht）、1978、ジヤーナル・オブ・モレキユラー・アンド
・ジエネラル・ジエネテイツクス（J.Molecular and Ge
neral Genetics）162:307〕10mlに懸濁し、30℃で２時
間インキユベートする。遠心してプロトプラストをペレ
ツト化し、得られたペレツトを、洗浄の度にＰ培地10ml
中で渦巻かせ、次いで該ペレツトをピペツトで溶液に加
えることにより、３回洗浄する。最終的に得られたペレ
ツトをＰ培地2mlに懸濁し、以後の形質転換に供する。
L2200およびS.グリセオフスカス/pHJL2202の組立て A.プロトプラストを調製するための、培養物の増殖 アメリカン・タイプ・カルチヤー・コレクシヨン（Amer
ican Type Culture Collection）、ロツクビレ（Rockvi
lle）、メアリーランド20852のパーマネント・ストツク
・カルチヤー・コレクシヨンに寄託され、その一部を構
成しており、寄託番号ATCC23916の下、誰でも入手可能
である菌株、S.グリセオフスカス（S.griseofuscus）
を、４％グリシンを補充したTSB＊中において、液中条
件下、30℃で20時間増殖させることにより、常法通り栄
養接種物を調製した。S.グリセオフスカスのプロトプラ
スト化は時間がかかるが、一般に次の様にして行われ
る。YMX寒天（0.3酵母エキス、0.3％麦芽エキス、0.2％
デキストロースおよび２％寒天を含有する平板上にS.グ
リセオフスカスを直線接種する。約48時間後、１個の細
菌コロニーを10mlのTSB＊に接種し；ホモジナイズ（均
質化）し、次いで30℃で一夜インキユベートする。次い
で、一夜培養物4mlをホモジナイズし、.4％グリシンを
補充したTSB100mlを加え、30℃で一夜培養する。次の日
の午後に、得られたばかりの一夜培養物を用いて上記操
作を繰返し、行う。翌朝、この培養物に50％（v/v）グ
リセリン50mlを加え、試料15mlを−20℃で凍結する。こ
の凍結細胞は６カ月間保存することができ、それを形質
転換に用いることができる。水を張ったビーカー内にチ
ユーブを入れ、室温に放置することにより、凍結細胞を
解凍する。ベンチ・トツプ（bench top）遠心器内に細
胞を収獲し、10.3％スクロース10ml中で３回洗浄する。
この細胞ペレツトを、リゾチーム（1mg/ml）を補充した
Ｐ培地〔ホツプウツドおよびライト（Hopwood and Wrig
ht）、1978、ジヤーナル・オブ・モレキユラー・アンド
・ジエネラル・ジエネテイツクス（J.Molecular and Ge
neral Genetics）162:307〕10mlに懸濁し、30℃で２時
間インキユベートする。遠心してプロトプラストをペレ
ツト化し、得られたペレツトを、洗浄の度にＰ培地10ml
中で渦巻かせ、次いで該ペレツトをピペツトで溶液に加
えることにより、３回洗浄する。最終的に得られたペレ
ツトをＰ培地2mlに懸濁し、以後の形質転換に供する。
＊トリプチカーゼ・ソイ・プロスは、ジフコ・ラポラト
リイズ、デトロイト、ミンガンまたは、バルチモア・バ
イオロジカル・ラボラトリイズ（Baltimore Biological
Laboratories）、P.O.Box243、コツキースビレ、メア
リーランド21031から入手可能である。
リイズ、デトロイト、ミンガンまたは、バルチモア・バ
イオロジカル・ラボラトリイズ（Baltimore Biological
Laboratories）、P.O.Box243、コツキースビレ、メア
リーランド21031から入手可能である。
B.形質転換 ライゲーシヨン緩衝液中のプラスミドDNA約10μｌとS.
グリセオフスカスのプロトプラスト約150μｌとを試験
管内で軽く混合する。この混合物に、50％PEG1000（ポ
リエチレングリコール、Sigma）のＰ培地中混合物約101
μｌを加え、ピペツトを用いて混合する。１〜２分間経
過した後、Ｐ培地を加えて容量を1mlにする。形質転換
した細胞をR2培地中にプレートし、30℃で一夜インキユ
ベートする。再生してきたプロトプラストに、チオスト
レプトン400μg/mlを含んだR2オーバーレイ（上掛け）3
mlを積層し、30℃で少くとも４日間インキユベートす
る。得られたS.グリセオフスカス/pHJL2200チオストレ
プトン耐性コロニーは既知の方法で単離して培養し、実
施例3Cの記載に従つて常法通り同定することができる。
次いでこの形質転換体培養物を用いて引き続きプラスミ
ドDNAを生産、単離する。
グリセオフスカスのプロトプラスト約150μｌとを試験
管内で軽く混合する。この混合物に、50％PEG1000（ポ
リエチレングリコール、Sigma）のＰ培地中混合物約101
μｌを加え、ピペツトを用いて混合する。１〜２分間経
過した後、Ｐ培地を加えて容量を1mlにする。形質転換
した細胞をR2培地中にプレートし、30℃で一夜インキユ
ベートする。再生してきたプロトプラストに、チオスト
レプトン400μg/mlを含んだR2オーバーレイ（上掛け）3
mlを積層し、30℃で少くとも４日間インキユベートす
る。得られたS.グリセオフスカス/pHJL2200チオストレ
プトン耐性コロニーは既知の方法で単離して培養し、実
施例3Cの記載に従つて常法通り同定することができる。
次いでこの形質転換体培養物を用いて引き続きプラスミ
ドDNAを生産、単離する。
S.グリセオフスカス/pHJL2202形質転換体は、再生する
プロトプラストに、ネオマイシン50μg/mlとチオストレ
プトン400μg/mlとを補充したR2オーバーレイを積層す
ることにより、チオストレプトン耐性およびネオマイシ
ン耐性に関して選択することができる。得られたグリセ
オフスカス/pHJL2202チオストレプトンおよびネオマイ
シン耐性コロニーを既知の方法で単離し、実施例3Cで示
した方法に従つて同定する。
プロトプラストに、ネオマイシン50μg/mlとチオストレ
プトン400μg/mlとを補充したR2オーバーレイを積層す
ることにより、チオストレプトン耐性およびネオマイシ
ン耐性に関して選択することができる。得られたグリセ
オフスカス/pHJL2202チオストレプトンおよびネオマイ
シン耐性コロニーを既知の方法で単離し、実施例3Cで示
した方法に従つて同定する。
C.S.グリセオフスカス形質転換体の分析 得られた形質転換体をチオストレプトン（40μg/ml）を
補充したYMX寒天（0.3％酵母エキス、0.3％麦芽エキ
ス、0.2％デキストロースおよび２％寒天）上で培養
し、単独のコロニー群を得る。これらのコロニーを、チ
オストレプトン（40μg/ml）を含んだTSB培養物10mlに
接種する。この培養物をロータリー・シエーカー（rota
ry shaker）中でホモジナイズし、30℃で一夜増殖させ
る。
補充したYMX寒天（0.3％酵母エキス、0.3％麦芽エキ
ス、0.2％デキストロースおよび２％寒天）上で培養
し、単独のコロニー群を得る。これらのコロニーを、チ
オストレプトン（40μg/ml）を含んだTSB培養物10mlに
接種する。この培養物をロータリー・シエーカー（rota
ry shaker）中でホモジナイズし、30℃で一夜増殖させ
る。
この培養物をホモジナイズし、チオストレプトン（40μ
g/μｌ）を補充した200mlのTSBおよび0.4％グリシンに
加え、30℃で１〜２日間増殖させる。ソルボールGSA
中、10,000rpmで15分間遠心して細胞を収獲する。この
細胞を25％スクロースおよびリゾチーム（5mg/ml）を含
有するTE100mlに懸濁する。37℃で１時間インキユベー
シヨンした後、25MNaEDTA（pH8.0）50mlを加える。試料
25mlを20％w/vSDS（ドデシル硫酸ナトリウム）1mlを入
れたソルボール・チユーブに移し、室温で20〜30分間、
静かに混合して細胞を溶菌する。5MNaCl8mlを加えた
後、室温で30分間、静かり混合し、細胞を11/2時間氷上
に置く。ソルボール・ローター内で、15,000rpmで20分
間遠心してDNAを回収する。上清を集め、.64容量のイソ
プロパノールを加えてDNAを沈殿させ、10,000rpmで20分
間遠心する。上清をデカントし、得られたDNAペレツト
を風乾してTE緩衝液10mlに懸濁する。次いでこれを、実
施例１で述べた如くＣｓCl平衡化グラデイエントによ
り、精製することもできる。
g/μｌ）を補充した200mlのTSBおよび0.4％グリシンに
加え、30℃で１〜２日間増殖させる。ソルボールGSA
中、10,000rpmで15分間遠心して細胞を収獲する。この
細胞を25％スクロースおよびリゾチーム（5mg/ml）を含
有するTE100mlに懸濁する。37℃で１時間インキユベー
シヨンした後、25MNaEDTA（pH8.0）50mlを加える。試料
25mlを20％w/vSDS（ドデシル硫酸ナトリウム）1mlを入
れたソルボール・チユーブに移し、室温で20〜30分間、
静かに混合して細胞を溶菌する。5MNaCl8mlを加えた
後、室温で30分間、静かり混合し、細胞を11/2時間氷上
に置く。ソルボール・ローター内で、15,000rpmで20分
間遠心してDNAを回収する。上清を集め、.64容量のイソ
プロパノールを加えてDNAを沈殿させ、10,000rpmで20分
間遠心する。上清をデカントし、得られたDNAペレツト
を風乾してTE緩衝液10mlに懸濁する。次いでこれを、実
施例１で述べた如くＣｓCl平衡化グラデイエントによ
り、精製することもできる。
実施例４ (I)プラスミドpHJL2200、pHJL201、pHJL20
2、pHJL203、pHJL204、およびpHJL205並びに(II)これら
プラスミドによる大腸菌K12C600Rｋ−Ｍｋ−の形質転換
体の組立て I.プラスミドの組立て A.プラスミドpJL192のＫpnＩ部分消化 以下の消化を行つた。実施例１の方法に従い、水25μ
ｌ、BSA5μｌ、10xKpnＩ制限緩衝液５μｌおよびＫpnＩ
酵素２μｌを混合し、37℃でインキユベートすることに
より、プラスミドpJL192DNA約13μｌ（約3.25μｇ）を
調製した。15、30、60、90および120分の間隔をあけて1
0μｌづつをとり、水40μｌと混合し、70℃で10分間加
熱した。このプロトコールによつて、ＫpnＩ制限酵素で
開裂されなかつた分子から、ＫpnＩ制限酵素で完全に消
化された分子に至るまでの、あらゆる可能な反応生成物
を生産することができる。これらの各部分に、1/10容量
の3MNaOAc、pH8および２容量のエタノールを加えてDNA
を沈殿させ、−70℃で１時間、凍結した。
2、pHJL203、pHJL204、およびpHJL205並びに(II)これら
プラスミドによる大腸菌K12C600Rｋ−Ｍｋ−の形質転換
体の組立て I.プラスミドの組立て A.プラスミドpJL192のＫpnＩ部分消化 以下の消化を行つた。実施例１の方法に従い、水25μ
ｌ、BSA5μｌ、10xKpnＩ制限緩衝液５μｌおよびＫpnＩ
酵素２μｌを混合し、37℃でインキユベートすることに
より、プラスミドpJL192DNA約13μｌ（約3.25μｇ）を
調製した。15、30、60、90および120分の間隔をあけて1
0μｌづつをとり、水40μｌと混合し、70℃で10分間加
熱した。このプロトコールによつて、ＫpnＩ制限酵素で
開裂されなかつた分子から、ＫpnＩ制限酵素で完全に消
化された分子に至るまでの、あらゆる可能な反応生成物
を生産することができる。これらの各部分に、1/10容量
の3MNaOAc、pH8および２容量のエタノールを加えてDNA
を沈殿させ、−70℃で１時間、凍結した。
B.ライゲーシヨン 各沈殿を集め、２回洗浄して風乾し、次いで水20μｌに
懸濁した。各懸濁液から60μｌをとり、5xキナリーゼ／
リガーゼ緩衝液＊20μｌ、0.66MATP、pH7.440μｌ、水3
3μｌおよびT4DNAリガーゼ（ベーリンガー・マンハイム
〜１単位／μｌ）１μｌを含む溶液と混合し、15℃で72
時間インキユベートし、自己環化を促進した。インキユ
ベーシヨンした後、各懸濁液から50μｌとり、温度を70
℃に上げて10分間保ち、反応を終止させた。これらの懸
濁液から上記の如くにして沈殿を析出させ、15μｌの水
に懸濁した。
懸濁した。各懸濁液から60μｌをとり、5xキナリーゼ／
リガーゼ緩衝液＊20μｌ、0.66MATP、pH7.440μｌ、水3
3μｌおよびT4DNAリガーゼ（ベーリンガー・マンハイム
〜１単位／μｌ）１μｌを含む溶液と混合し、15℃で72
時間インキユベートし、自己環化を促進した。インキユ
ベーシヨンした後、各懸濁液から50μｌとり、温度を70
℃に上げて10分間保ち、反応を終止させた。これらの懸
濁液から上記の如くにして沈殿を析出させ、15μｌの水
に懸濁した。
＊5xキナーゼ／リガーゼ緩衝液は、下記の構成々分から
調製された： 250mMトリス−HCl、PH7.8 25％グリセリン 25mMジチオトレイトール 50mMMgCl2 実施例５ 大腸菌K12C600Rk−Mk−/pHJL201、 大腸菌K12C600Rk−Mk−/pHJL200、 大腸菌K12C600Rk−Mk−/pHJL202 大腸菌K12C600Rk−Mk−/pHJL203 大腸菌K12C600Rk−Mk−/pHJL204 および大腸菌K12C600Rk−Mk−/pHJL205の組立て A.凍結コンピテント大腸菌K12C600Rk−Mk−の調製 ATCCに寄託されている菌株であつて、寄託番号ATCC3352
5の下で広く入手可能な、大腸菌K12C600Rk−Mk−の一夜
培養物を、調製したばかりのＬ−ブロス〔ミラー（Mill
er）、1972、エクスペリメンツ・イン・モレキユラー・
ジエネテイツクス（Experiments in Molecular Genetic
s）コールドスプリングハーバー・ラボラトリイズ、コ
ールドスプリングバーバー、ニユーヨーク〕中、1:10の
割合で継代培養し、37℃で１時間増殖させた。合計660K
lett単位の細胞を収獲し、100mM NaCl2.5mlで洗浄して1
50mM CaCl22.5mlの懸濁し、室温で20分間インキユベー
トした。遠心して細胞を収獲し、150mM CaCl2−10％グ
リセリン0.5mlに懸濁し、氷上で３−５分間冷やした
後、凍結した。使用するまで、この細胞懸濁液を液体窒
素中に保管した。保存または保管は、生育能および共有
結合的に環化したDNAによる形質転換の頻度に悪影響を
及ぼさなかつた。
調製された： 250mMトリス−HCl、PH7.8 25％グリセリン 25mMジチオトレイトール 50mMMgCl2 実施例５ 大腸菌K12C600Rk−Mk−/pHJL201、 大腸菌K12C600Rk−Mk−/pHJL200、 大腸菌K12C600Rk−Mk−/pHJL202 大腸菌K12C600Rk−Mk−/pHJL203 大腸菌K12C600Rk−Mk−/pHJL204 および大腸菌K12C600Rk−Mk−/pHJL205の組立て A.凍結コンピテント大腸菌K12C600Rk−Mk−の調製 ATCCに寄託されている菌株であつて、寄託番号ATCC3352
5の下で広く入手可能な、大腸菌K12C600Rk−Mk−の一夜
培養物を、調製したばかりのＬ−ブロス〔ミラー（Mill
er）、1972、エクスペリメンツ・イン・モレキユラー・
ジエネテイツクス（Experiments in Molecular Genetic
s）コールドスプリングハーバー・ラボラトリイズ、コ
ールドスプリングバーバー、ニユーヨーク〕中、1:10の
割合で継代培養し、37℃で１時間増殖させた。合計660K
lett単位の細胞を収獲し、100mM NaCl2.5mlで洗浄して1
50mM CaCl22.5mlの懸濁し、室温で20分間インキユベー
トした。遠心して細胞を収獲し、150mM CaCl2−10％グ
リセリン0.5mlに懸濁し、氷上で３−５分間冷やした
後、凍結した。使用するまで、この細胞懸濁液を液体窒
素中に保管した。保存または保管は、生育能および共有
結合的に環化したDNAによる形質転換の頻度に悪影響を
及ぼさなかつた。
B.形質転換 コンピテント細胞を氷浴中で解凍し、この細胞.1mlに対
し、.05mlの割合のDNA（実施例4Bおよび6Cの得たもの1
2.5μｌ）および.1xSSC（.015M NaCl、.0015Mクエン酸
ナトリウム、pH7）37.5μｌを混合した。この形質転換
混合物を氷上で20分間冷やし、42℃で１時間熱衝撃を与
え、氷上で10分間冷却した。次いでこの試料をＬ−ブロ
ス.85mlで希釈し、37℃で1.5時間インキユベートし、ア
ンピシリン（50μg/ml）を含んだＬ−寒天上に広げ、37
℃で18時間インキユベートした。得られた正しい表現型
（Ａｐ Ｒ、ＴＣ Ｓ）を有するコロニーを、エツクハート
（Eckhardt）らの壁内溶菌法（in−the−wall−lysis）
（1978、プラスミド、1:584）と実質上同様にして、プ
ラスミドの大きさに関し、スクリーンした。この様にし
て得られたコロニーは、所望の大腸菌K12C600Rk−Mk−/
pHJL201、大腸菌K12C600Rk−Mk−/pHJL200、大腸菌K12C
600Rk−Mk−/pHJL202、大腸菌K12C600Rk−Mk−/pHJL20
3、大腸菌K12C600Rk−Mk−/pHJL204および大腸菌K12C60
0Rk−Mk−/pHJL205形質転換体を構成していた。既知の
方法に従つてアンピシリン耐性、テトラサイクリン感受
性のコロニーを単離して培養し、これを用いて共有結合
的に閉環したDNAを精製し、次いでこのDNAを構成プラス
ミドの制限酵素分析並びにAGE分析によつて常法通り同
定した。次いで、この同定した形質転換体を使用し、大
腸菌K12C600Rk−Mk−/pJL192の代りに所望のプラスミド
を含む菌体を用いる外は実施例１と同様の方法に従つ
て、プラスミドpHJL201、pHJL200、pHJL202、pHJL203、
pHJL204およびpHJL205を生産し、単離した。プラスミド
pHJL201の制限サイトおよび機能地図を添付の第４図に
示す。プラスミドpHJL200、pHJL202、pHJL203、pHJL204
およびpHJL205の制限サイトおよび機能地図を添付の第
５図に示す。
し、.05mlの割合のDNA（実施例4Bおよび6Cの得たもの1
2.5μｌ）および.1xSSC（.015M NaCl、.0015Mクエン酸
ナトリウム、pH7）37.5μｌを混合した。この形質転換
混合物を氷上で20分間冷やし、42℃で１時間熱衝撃を与
え、氷上で10分間冷却した。次いでこの試料をＬ−ブロ
ス.85mlで希釈し、37℃で1.5時間インキユベートし、ア
ンピシリン（50μg/ml）を含んだＬ−寒天上に広げ、37
℃で18時間インキユベートした。得られた正しい表現型
（Ａｐ Ｒ、ＴＣ Ｓ）を有するコロニーを、エツクハート
（Eckhardt）らの壁内溶菌法（in−the−wall−lysis）
（1978、プラスミド、1:584）と実質上同様にして、プ
ラスミドの大きさに関し、スクリーンした。この様にし
て得られたコロニーは、所望の大腸菌K12C600Rk−Mk−/
pHJL201、大腸菌K12C600Rk−Mk−/pHJL200、大腸菌K12C
600Rk−Mk−/pHJL202、大腸菌K12C600Rk−Mk−/pHJL20
3、大腸菌K12C600Rk−Mk−/pHJL204および大腸菌K12C60
0Rk−Mk−/pHJL205形質転換体を構成していた。既知の
方法に従つてアンピシリン耐性、テトラサイクリン感受
性のコロニーを単離して培養し、これを用いて共有結合
的に閉環したDNAを精製し、次いでこのDNAを構成プラス
ミドの制限酵素分析並びにAGE分析によつて常法通り同
定した。次いで、この同定した形質転換体を使用し、大
腸菌K12C600Rk−Mk−/pJL192の代りに所望のプラスミド
を含む菌体を用いる外は実施例１と同様の方法に従つ
て、プラスミドpHJL201、pHJL200、pHJL202、pHJL203、
pHJL204およびpHJL205を生産し、単離した。プラスミド
pHJL201の制限サイトおよび機能地図を添付の第４図に
示す。プラスミドpHJL200、pHJL202、pHJL203、pHJL204
およびpHJL205の制限サイトおよび機能地図を添付の第
５図に示す。
実施例６ プラスミドpHJL210およびpHJL211の組立て A.プラスミドpHJL201のBamHI部分消化 プラスミドpHJL201（実施例５の方法に従つて調製した
もの）約10μｌ（10μｇ）、BSA（1mg/ml）５μｌ、水2
9μｌ、BamHI制限酵素（水で1:4に希釈）１μｌ、およ
びBamHI反応ミツクス５μｌを37℃で15分間インキユベ
ートした。70℃で10分間加熱して反応を終結させた。実
施例１の方法に従い、AGEによつて、直線状プラスミド
分子の全長に相当する部分消化産物から、より短い、完
全消化産物を除き、精製した。実施例４の方法に実質上
同様にしてDNAを沈殿させた。得られたDNAの沈殿を水20
μｌに懸濁し、次のライゲーシヨンに供した。
もの）約10μｌ（10μｇ）、BSA（1mg/ml）５μｌ、水2
9μｌ、BamHI制限酵素（水で1:4に希釈）１μｌ、およ
びBamHI反応ミツクス５μｌを37℃で15分間インキユベ
ートした。70℃で10分間加熱して反応を終結させた。実
施例１の方法に従い、AGEによつて、直線状プラスミド
分子の全長に相当する部分消化産物から、より短い、完
全消化産物を除き、精製した。実施例４の方法に実質上
同様にしてDNAを沈殿させた。得られたDNAの沈殿を水20
μｌに懸濁し、次のライゲーシヨンに供した。
B.プラスミドpLR2の〜1kb BclI制限フラグメントの単離 大部分の大腸菌K12株は自己のDNAのある残基をメチル化
する。例えば、dam遺伝子によつて指定されるメチラー
ゼは、DNA配列、５′GAmeTC3′中の指示されたアテニン
をN6位でメチル化する。この様にメチル化することによ
り、その認識配列がこのメチル化された配列で構成され
ているか、あるいは、その様な配列を包含しているある
種の（全てではない）制限エンドヌクレアーゼによるDN
Aの開裂が妨害されることが分つている。本発明におい
て一般的に用いている制限酵素、BclIは、BclI認識配列
である５′TGATCA3′がメチル化されていれば、これを
開裂しない。この様な問題を避けるために、pLR2は、例
えば、GM48（ノーザン・リージヨナル・リサーチ・ラボ
ラトリイ、ペオリア、イリノイスに寄託され、そのパー
マネント・ストツク・カルチヤー・コレクシヨンの一部
となつている菌株）の如き大腸菌dam-株に導入（トラン
スフオーム）する必要がある。この菌株は寄託番号NRRL
B−15725の下、誰でも入手できる。次いで、BamHI制限
酵素の代りにBclI制限酵素を用いる外は実施例2Bの方法
と実質的に同様にして所望の消化を行う。実施例１の方
法に従い、AGEによつて〜1kbBclI制限フラグメントを精
製する。
する。例えば、dam遺伝子によつて指定されるメチラー
ゼは、DNA配列、５′GAmeTC3′中の指示されたアテニン
をN6位でメチル化する。この様にメチル化することによ
り、その認識配列がこのメチル化された配列で構成され
ているか、あるいは、その様な配列を包含しているある
種の（全てではない）制限エンドヌクレアーゼによるDN
Aの開裂が妨害されることが分つている。本発明におい
て一般的に用いている制限酵素、BclIは、BclI認識配列
である５′TGATCA3′がメチル化されていれば、これを
開裂しない。この様な問題を避けるために、pLR2は、例
えば、GM48（ノーザン・リージヨナル・リサーチ・ラボ
ラトリイ、ペオリア、イリノイスに寄託され、そのパー
マネント・ストツク・カルチヤー・コレクシヨンの一部
となつている菌株）の如き大腸菌dam-株に導入（トラン
スフオーム）する必要がある。この菌株は寄託番号NRRL
B−15725の下、誰でも入手できる。次いで、BamHI制限
酵素の代りにBclI制限酵素を用いる外は実施例2Bの方法
と実質的に同様にして所望の消化を行う。実施例１の方
法に従い、AGEによつて〜1kbBclI制限フラグメントを精
製する。
C.ライゲーシヨン 実施例2Cの方法と実質的に同様にして所望のライゲーシ
ヨンを行う。様々なプラスミド組立て物が形成される
が、所望の組換えプラスミドは、ネオマイシンおよびチ
オストレプトン耐性表現型のものである。更に、〜1kbB
clI耐性付与フラグメントはどちらの方向をもとり得る
ので、２つの方向性に係るプラスミドが生産される。プ
ラスミドpHJL210およびpHJL211の制限サイトおよび機能
地図を添付の第５図に示す。
ヨンを行う。様々なプラスミド組立て物が形成される
が、所望の組換えプラスミドは、ネオマイシンおよびチ
オストレプトン耐性表現型のものである。更に、〜1kbB
clI耐性付与フラグメントはどちらの方向をもとり得る
ので、２つの方向性に係るプラスミドが生産される。プ
ラスミドpHJL210およびpHJL211の制限サイトおよび機能
地図を添付の第５図に示す。
実施例７ 大腸菌K12 C600Rk−Mk−/pHJL210および大
腸菌K12 C600Rk−Mk−/pHJL211の組立て プラスミドpHJL200、pHJL201、pHJL202、pHJL203、pHJL
204およびpHJL205の代りにプラスミドpHJL210およびpHJ
L211を用いる外は、実施例５の方法と実質的に同様にし
て所望の組立てを別々に行い、選択し、回収した。
腸菌K12 C600Rk−Mk−/pHJL211の組立て プラスミドpHJL200、pHJL201、pHJL202、pHJL203、pHJL
204およびpHJL205の代りにプラスミドpHJL210およびpHJ
L211を用いる外は、実施例５の方法と実質的に同様にし
て所望の組立てを別々に行い、選択し、回収した。
実施例８ ストレプトマイシス・グリセオフスカス/pHJ
L201、S.グリセオフスカス/pHJL210およびS.グリセオフ
スカス/pHJL211の組立て プラスミドpHJL2200ではなくプラスミドpHJL201を用
い、また選択に際して、チオストレプトンの代りにネオ
マイシンを、最終的な平板中の濃度が２μg/μｌとなる
に充分な量、含有せしめたトツプ・アガーを使用する外
は、実施例３の方法と実質的に同様にして所望の組立て
を個々に行い、選択し、回収した。同様に、プラスミド
pHJL2202の代りにプラスミドpHJL210およびpHJL211を用
いる外は実施例３の方法と実質的に同様にしてpHJL210
およびpHJL211の組立てを個々に行い、選択し、回収し
た。
L201、S.グリセオフスカス/pHJL210およびS.グリセオフ
スカス/pHJL211の組立て プラスミドpHJL2200ではなくプラスミドpHJL201を用
い、また選択に際して、チオストレプトンの代りにネオ
マイシンを、最終的な平板中の濃度が２μg/μｌとなる
に充分な量、含有せしめたトツプ・アガーを使用する外
は、実施例３の方法と実質的に同様にして所望の組立て
を個々に行い、選択し、回収した。同様に、プラスミド
pHJL2202の代りにプラスミドpHJL210およびpHJL211を用
いる外は実施例３の方法と実質的に同様にしてpHJL210
およびpHJL211の組立てを個々に行い、選択し、回収し
た。
実施例９ ストレプトマイシス・リビダンス/pHJL201、
S.リビダンス/pHJL210およびS.リビダンス/pHJL211の組
立て S.グリセオフスカスの代りにS.リビダンス（lividans）
を用いる外は、実施例８の方法と実質的に同様にして所
望の組立てを個々に行い、選択し、回収した。S.リビダ
ンスは古くから存在し、良く知られている菌株であつ
て、ノーザン・リージヨナル・リサーチ・ラポラトリ
イ、ペオリア、イリノイス61604に寄託され、その一部
となつている菌株から、寄託番号NRRLB−15826の下、誰
でも入手できる。更に、S.リビダンスのプロトプラスト
化および増殖方法、並びにプロトプラストおよび形質転
換体の調製方法は、国際公開No.WO79/01169の実施例２
（国際特許出願No.PCT/BG79/00095）に記載されてい
る。次いで、同定された形質転換体を使用し、実施例3C
の方法と実質的に同様の、既知の方法により、プラスミ
ドpHJL201、pHJL210およびpHJL211を生産させ、単離し
た。
S.リビダンス/pHJL210およびS.リビダンス/pHJL211の組
立て S.グリセオフスカスの代りにS.リビダンス（lividans）
を用いる外は、実施例８の方法と実質的に同様にして所
望の組立てを個々に行い、選択し、回収した。S.リビダ
ンスは古くから存在し、良く知られている菌株であつ
て、ノーザン・リージヨナル・リサーチ・ラポラトリ
イ、ペオリア、イリノイス61604に寄託され、その一部
となつている菌株から、寄託番号NRRLB−15826の下、誰
でも入手できる。更に、S.リビダンスのプロトプラスト
化および増殖方法、並びにプロトプラストおよび形質転
換体の調製方法は、国際公開No.WO79/01169の実施例２
（国際特許出願No.PCT/BG79/00095）に記載されてい
る。次いで、同定された形質転換体を使用し、実施例3C
の方法と実質的に同様の、既知の方法により、プラスミ
ドpHJL201、pHJL210およびpHJL211を生産させ、単離し
た。
実施例10 ストレプトマイシス・フラデイエ/pHJL201、
S.フラデイエ/pHJL200およびS.フラデイエ/pHJL211の組
立て ストレプトマイシス・グリセオフスカスの代りにS.フラ
デイエ（fradiae）を用いる外は、実施例８の方法と実
質上同様にして所望の組立てを個々に行い、選択し、回
収した。S.フラデイエは古くから存在し、良く知られて
いる菌株であつて、アメリカン・タイプ・カルチヤー・
コレクシヨン、12301パークローン・ドライブ（Parklaw
n Drive）、ロツクビレ、メアリーランド20852に寄託さ
れ、その一部となつている菌株から、寄託番号ATCC1960
9の下、誰でも入手することができる。なお、S.フラデ
イエのプロトプラスト化および増殖のために用いるTSB
培地は改良されたものであり、グリシン含有量は.2％に
すぎない。エンドジーニアス（内因性）の制限酵素系に
起因してS.フラデイエの形質転換の頻度は極めて低く、
従つて、pHJL201、pHJL210およびpHJL211で形質転換さ
れたS.フラデイエ宿主の形質転換体のDNA1μｇ当りの数
は、S.グリセオフスカスまたはS.リビダンス宿主の場合
の数よりも、実質的に少い。しかしながら、S.フラデイ
エから単離されたプラスミドDNAをS.フラデイエに再導
入（リトランスフオーム）した場合には、高頻度で形質
転換が起こる。
S.フラデイエ/pHJL200およびS.フラデイエ/pHJL211の組
立て ストレプトマイシス・グリセオフスカスの代りにS.フラ
デイエ（fradiae）を用いる外は、実施例８の方法と実
質上同様にして所望の組立てを個々に行い、選択し、回
収した。S.フラデイエは古くから存在し、良く知られて
いる菌株であつて、アメリカン・タイプ・カルチヤー・
コレクシヨン、12301パークローン・ドライブ（Parklaw
n Drive）、ロツクビレ、メアリーランド20852に寄託さ
れ、その一部となつている菌株から、寄託番号ATCC1960
9の下、誰でも入手することができる。なお、S.フラデ
イエのプロトプラスト化および増殖のために用いるTSB
培地は改良されたものであり、グリシン含有量は.2％に
すぎない。エンドジーニアス（内因性）の制限酵素系に
起因してS.フラデイエの形質転換の頻度は極めて低く、
従つて、pHJL201、pHJL210およびpHJL211で形質転換さ
れたS.フラデイエ宿主の形質転換体のDNA1μｇ当りの数
は、S.グリセオフスカスまたはS.リビダンス宿主の場合
の数よりも、実質的に少い。しかしながら、S.フラデイ
エから単離されたプラスミドDNAをS.フラデイエに再導
入（リトランスフオーム）した場合には、高頻度で形質
転換が起こる。
第１図はプラスミドpJL192の制限サイト地図、第２図は
プラスミドpHJL2200およびpHJL2201の制限サイトおよび
機能地図、第３図はプラスミドpHJL2202およびpHJL2203
の制限サイトおよび機能地図、第４図はプラスミドpHJL
201の制限サイトおよび機能地図、第５図はプラスミドp
HJL200、pHJL202、pHJL203、pHJL204およびpHJL205の制
限サイトおよび機能地図、第６図はプラスミドpHJL210
およびpHJL211の制限サイトおよび機能地図を示す模式
図である。
プラスミドpHJL2200およびpHJL2201の制限サイトおよび
機能地図、第３図はプラスミドpHJL2202およびpHJL2203
の制限サイトおよび機能地図、第４図はプラスミドpHJL
201の制限サイトおよび機能地図、第５図はプラスミドp
HJL200、pHJL202、pHJL203、pHJL204およびpHJL205の制
限サイトおよび機能地図、第６図はプラスミドpHJL210
およびpHJL211の制限サイトおよび機能地図を示す模式
図である。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.5 識別記号 庁内整理番号 ＦＩ 技術表示箇所 (Ｃ１２Ｎ 1/21 Ｃ１２Ｒ 1:465）
Claims (2)
- 【請求項１】ａ）大腸菌K12C600RＫ−ＭＫ−/pJL192（N
RRL B−15040） から単離され、以下の制限酵素地図： で表されるプラスミドpJL192の 2.5kbKpnI複製起源含
有制限フラグメントと、ｂ）感受性を有する非制限宿主
細胞に導入した時、少くとも１個の抗生物質に対する耐
性を付与し得る１またはそれ以上のDNAセグメントとを
含む、適度に高いコピー数を有する組換えDNAクローニ
ングベクター。 - 【請求項２】更に、ｃ）大腸菌の複製起源を含有する制
限フラグメントをも含む、第１項記載のベクター。
Applications Claiming Priority (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| US06/639,566 US4753886A (en) | 1984-08-10 | 1984-08-10 | Plasmid PHJL210 and related bifunctional cloning vectors for use in streptomycetes |
| US639566 | 1984-08-10 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPS6147192A JPS6147192A (ja) | 1986-03-07 |
| JPH0691826B2 true JPH0691826B2 (ja) | 1994-11-16 |
Family
ID=24564632
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP60175629A Expired - Lifetime JPH0691826B2 (ja) | 1984-08-10 | 1985-08-08 | ストレプトマイセス属の菌株に使用するための二機能性クローニングベクター |
Country Status (11)
| Country | Link |
|---|---|
| US (1) | US4753886A (ja) |
| EP (1) | EP0176199B1 (ja) |
| JP (1) | JPH0691826B2 (ja) |
| AT (1) | ATE45185T1 (ja) |
| AU (1) | AU592763B2 (ja) |
| CA (1) | CA1253091A (ja) |
| DE (1) | DE3572009D1 (ja) |
| DK (1) | DK360785A (ja) |
| HU (1) | HU197352B (ja) |
| IE (1) | IE58676B1 (ja) |
| IL (1) | IL76028A (ja) |
Families Citing this family (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US4680265A (en) * | 1984-09-25 | 1987-07-14 | Eli Lilly And Company | Method of selecting recombinant DNA-containing streptomyces |
| US4898828A (en) * | 1985-08-07 | 1990-02-06 | Eli Lilly And Company | Ultrahigh copy number streptomycetes plasmids |
| US4886757A (en) * | 1987-04-15 | 1989-12-12 | Eli Lilly And Company | Spiramycin resistance-conferring cloning vectors |
| EP0354727A3 (en) * | 1988-08-08 | 1990-11-22 | Eli Lilly And Company | Novel single stranded phasmid vectors and methods for transforming streptomyces and other actinomycetes |
Family Cites Families (6)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| DE2759053A1 (de) * | 1977-12-30 | 1979-07-12 | Uhlin | Verfahren zum herstellen von genprodukten von plasmid-dns |
| CA1198067A (en) * | 1981-02-27 | 1985-12-17 | David H. Gelfand | Stable high copy number plasmids |
| US4416994A (en) * | 1981-10-19 | 1983-11-22 | Eli Lilly And Company | Plasmid pEL7 and related cloning vectors for use in streptomyces and related organisms |
| US4503155A (en) * | 1982-02-01 | 1985-03-05 | Eli Lilly And Company | Multifunctional, cloning vectors for use in Streptomyces, Bacillus, and E. coli |
| ZA832526B (en) * | 1982-04-16 | 1984-11-28 | Lilly Co Eli | Chimeric cloning vectors for use in streptomyces and e.coli |
| EP0118520B1 (en) * | 1982-09-14 | 1989-01-25 | HOYLE, Edgar | Self-adjusting clutch mechanism |
-
1984
- 1984-08-10 US US06/639,566 patent/US4753886A/en not_active Expired - Fee Related
-
1985
- 1985-08-02 CA CA000488076A patent/CA1253091A/en not_active Expired
- 1985-08-06 DE DE8585305599T patent/DE3572009D1/de not_active Expired
- 1985-08-06 AT AT85305599T patent/ATE45185T1/de active
- 1985-08-06 EP EP85305599A patent/EP0176199B1/en not_active Expired
- 1985-08-06 IL IL76028A patent/IL76028A/xx not_active IP Right Cessation
- 1985-08-08 JP JP60175629A patent/JPH0691826B2/ja not_active Expired - Lifetime
- 1985-08-08 DK DK360785A patent/DK360785A/da not_active Application Discontinuation
- 1985-08-08 HU HU853068A patent/HU197352B/hu not_active IP Right Cessation
- 1985-08-08 AU AU45925/85A patent/AU592763B2/en not_active Ceased
- 1985-08-08 IE IE196385A patent/IE58676B1/en not_active IP Right Cessation
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| IL76028A (en) | 1990-08-31 |
| JPS6147192A (ja) | 1986-03-07 |
| EP0176199A1 (en) | 1986-04-02 |
| CA1253091A (en) | 1989-04-25 |
| IE851963L (en) | 1986-02-10 |
| AU592763B2 (en) | 1990-01-25 |
| IL76028A0 (en) | 1985-12-31 |
| DK360785A (da) | 1986-02-11 |
| DE3572009D1 (en) | 1989-09-07 |
| ATE45185T1 (de) | 1989-08-15 |
| HUT38392A (en) | 1986-05-28 |
| EP0176199B1 (en) | 1989-08-02 |
| US4753886A (en) | 1988-06-28 |
| DK360785D0 (da) | 1985-08-08 |
| IE58676B1 (en) | 1993-11-03 |
| AU4592585A (en) | 1986-02-13 |
| HU197352B (en) | 1989-03-28 |
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