JPH0692972B2 - Ｈｔｌｖ−▲ｉｉｉ▼抗原用免疫検定法 - Google Patents
Ｈｔｌｖ−▲ｉｉｉ▼抗原用免疫検定法Info
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Description
【発明の詳細な説明】 発明の背景 獲得免疫不全症候群（エイズ）の蓋然的な病因剤として
のヒトＴ細胞向リンパウイルス−III（HTLV−III）の同
定は、血清又は血しょう中HTLV−IIIに対する抗体の検
出のための診断検定法の開発をもたらした。米国特許第
4,520,113号においては、このようなHTLV−III抗体に対
する免疫検定法が記載されている。その後、ガロら、Sc
ience 224:500〜503（1984）は、抗HTLV−III陽性の固
体の大部分からHTLV−IIIウイルスの検出を報告した。
のヒトＴ細胞向リンパウイルス−III（HTLV−III）の同
定は、血清又は血しょう中HTLV−IIIに対する抗体の検
出のための診断検定法の開発をもたらした。米国特許第
4,520,113号においては、このようなHTLV−III抗体に対
する免疫検定法が記載されている。その後、ガロら、Sc
ience 224:500〜503（1984）は、抗HTLV−III陽性の固
体の大部分からHTLV−IIIウイルスの検出を報告した。
以前には、リンパ球の単離、続いてこれらのリンパ球の
組織培養及びHTLV−IIIによる感染に対して感受性のHT
−９のようなヒトＴ細胞ラインとの共培養によって、HT
LV−III抗原が試験管内で検出された。次にHTLV−III抗
原の存在は、逆転写酵素活性に対する試験によるか又は
免疫螢光抗体又はサンドイツチ酵素免疫検定技術によっ
て細胞培養中検出されている。この方法の場合の問題
は、それが極端に技術に敏感、労力集約型であり、かつ
特別の実験設備及び結果を得るのに２〜８週の温置期間
を必要とすることである。
組織培養及びHTLV−IIIによる感染に対して感受性のHT
−９のようなヒトＴ細胞ラインとの共培養によって、HT
LV−III抗原が試験管内で検出された。次にHTLV−III抗
原の存在は、逆転写酵素活性に対する試験によるか又は
免疫螢光抗体又はサンドイツチ酵素免疫検定技術によっ
て細胞培養中検出されている。この方法の場合の問題
は、それが極端に技術に敏感、労力集約型であり、かつ
特別の実験設備及び結果を得るのに２〜８週の温置期間
を必要とすることである。
マクドゴール、J.Immunol.Methods,76:171−183（198
5）、らはLAV感染ヒトリンパ球培養の上澄物（supernat
es）中のリンパ節腫症関連ウイルス（LAV）を検出する
する方法を記載している。LAVは、HTLV−IIIと同様に、
エイズの作因であると考えられているヒトレトロウイル
スの原型系と考慮されている。
5）、らはLAV感染ヒトリンパ球培養の上澄物（supernat
es）中のリンパ節腫症関連ウイルス（LAV）を検出する
する方法を記載している。LAVは、HTLV−IIIと同様に、
エイズの作因であると考えられているヒトレトロウイル
スの原型系と考慮されている。
マクドゴールらの方法では、LAVをリンパ芽球中で成長
させ、そしてその培養上澄物を直接免疫蛍光、酵素免疫
測定捕獲検定法（enzyme-linked immunosorbent （ELIS
A） capture assay）により及び上澄物の逆転写酵素活
性によりウイルス感染についてモニターする。LAV−ELI
SA捕獲検定法（capture assay）では、マイクロタイタ
ープレート反応ウエルをヒト抗−LAV・IgGで被覆し、こ
のウエルに試験すべき培養上澄物を加え、温置し、そし
て洗浄して、次いで西洋ワサビペルオキシダーゼを結合
したヒト抗−LAV・IgGをウエルに加える。温置及び洗浄
の後、ｏ−フェニレンジアミン（OPD）/H2O2溶液を加え
て、発色させ、そして反応ウエル中の光学濃度を自動マ
イクロタイタープレート読み器で490nmでの読みを取
る。
させ、そしてその培養上澄物を直接免疫蛍光、酵素免疫
測定捕獲検定法（enzyme-linked immunosorbent （ELIS
A） capture assay）により及び上澄物の逆転写酵素活
性によりウイルス感染についてモニターする。LAV−ELI
SA捕獲検定法（capture assay）では、マイクロタイタ
ープレート反応ウエルをヒト抗−LAV・IgGで被覆し、こ
のウエルに試験すべき培養上澄物を加え、温置し、そし
て洗浄して、次いで西洋ワサビペルオキシダーゼを結合
したヒト抗−LAV・IgGをウエルに加える。温置及び洗浄
の後、ｏ−フェニレンジアミン（OPD）/H2O2溶液を加え
て、発色させ、そして反応ウエル中の光学濃度を自動マ
イクロタイタープレート読み器で490nmでの読みを取
る。
マクドゴールらの方法における問題点は、その方法が組
織培養上澄物の検定に対してのみしか適用できないこ
と、及び誤りの陽性（偽陽性）を検出する可能性がある
ため、ヒトの生物試料について行うことができないこと
にある。マクドゴールらの方法で偽陽性がおこる理由
は、反応ウエルの被覆のために使用され且つ複合体中で
使用されるヒト抗体が、リウマチ因子のようなヒト試料
中の他の抗原と反応することにある。
織培養上澄物の検定に対してのみしか適用できないこ
と、及び誤りの陽性（偽陽性）を検出する可能性がある
ため、ヒトの生物試料について行うことができないこと
にある。マクドゴールらの方法で偽陽性がおこる理由
は、反応ウエルの被覆のために使用され且つ複合体中で
使用されるヒト抗体が、リウマチ因子のようなヒト試料
中の他の抗原と反応することにある。
すなわち、マクドゴールらに記載されている検定法は組
織培養培地（tissue culture media）を試験するために
捕獲抗体とプローブ抗体との両者にヒト抗体を使用する
マイクロタイタープレート検定法である。このように同
じ種の抗体（即ち、同じ動物源からの抗体）の使用が、
偽陽性試験試料（false positive test sample）を検出
する可能性があるために、ヒト試験試料を試験するため
の方法としてのこの検定法の使用を妨げている。この従
来法に対して、本発明は第一の動物種からの捕獲抗体お
よび第二の動物種（即ち、第一の動物種とは異なる種）
からのプローブ抗体を使用する検定法を明らかにした。
本発明の検定法によれば、捕獲抗体及びプローブ抗体用
に非交差反応性抗体種を使用するために偽陽性試験試料
結果を避けることができる。さらに、本発明の検定法
は、マクドゴールらの検定法に比べて、結果を得る迄の
操作時間を著しく短縮でき（マクドゴールらの検定法の
２〜３週間に対して1.5日である）、作業感度を低く
し、さらに必要な感受性を第二の動物種からの抗体プロ
ーブを使用することにより達成することができる。
織培養培地（tissue culture media）を試験するために
捕獲抗体とプローブ抗体との両者にヒト抗体を使用する
マイクロタイタープレート検定法である。このように同
じ種の抗体（即ち、同じ動物源からの抗体）の使用が、
偽陽性試験試料（false positive test sample）を検出
する可能性があるために、ヒト試験試料を試験するため
の方法としてのこの検定法の使用を妨げている。この従
来法に対して、本発明は第一の動物種からの捕獲抗体お
よび第二の動物種（即ち、第一の動物種とは異なる種）
からのプローブ抗体を使用する検定法を明らかにした。
本発明の検定法によれば、捕獲抗体及びプローブ抗体用
に非交差反応性抗体種を使用するために偽陽性試験試料
結果を避けることができる。さらに、本発明の検定法
は、マクドゴールらの検定法に比べて、結果を得る迄の
操作時間を著しく短縮でき（マクドゴールらの検定法の
２〜３週間に対して1.5日である）、作業感度を低く
し、さらに必要な感受性を第二の動物種からの抗体プロ
ーブを使用することにより達成することができる。
試料から直接HTLV−IIIウイルス抗体を検出する比較的
容易な方法が望まれる。しかし、HTLV−IIIウイルス抗
体は、若干の生物試料中、どの点から見ても、非常に低
い濃度で存在しているので、容易には検出可能でないこ
とが示唆されている。従って、有効にウイルス抗原を検
出するためには、リンパ球分離の後溶菌、或いは小規模
リンパ球培養のような全血試料の何れかの加工が必要な
ことがある。生物試料中HTLV−IIIウイルス抗原の検出
における他の潜在的な問題は、抗HTLV−IIIの同時の存
在、その結果免疫コンプレツクスの形成及びHTLV−III
抗原の可能性のあるマスキングである。免疫コンプレツ
クスからHTLV−III抗原を解離させる方法は、抗原の検
出を可能にするが、試料の追加処理を必要とする。
容易な方法が望まれる。しかし、HTLV−IIIウイルス抗
体は、若干の生物試料中、どの点から見ても、非常に低
い濃度で存在しているので、容易には検出可能でないこ
とが示唆されている。従って、有効にウイルス抗原を検
出するためには、リンパ球分離の後溶菌、或いは小規模
リンパ球培養のような全血試料の何れかの加工が必要な
ことがある。生物試料中HTLV−IIIウイルス抗原の検出
における他の潜在的な問題は、抗HTLV−IIIの同時の存
在、その結果免疫コンプレツクスの形成及びHTLV−III
抗原の可能性のあるマスキングである。免疫コンプレツ
クスからHTLV−III抗原を解離させる方法は、抗原の検
出を可能にするが、試料の追加処理を必要とする。
発明の要約 本発明は、生物試料中HTLV−III抗原の検出のための直
接免疫検定操作である。この検定法は、標識された第２
の抗体を利用して低い水準のHTLV−IIIウイルス抗原の
検出のために必要な感度を達成する。本発明は次の工程
からなる生物試料中のHTLV−IIIウイルス抗原の検出の
ための免疫検定法を提供する。すなわち、 （ａ） 第一動物種からのHTLV−IIIに対する抗体で固
体支持体を被覆し； （ｂ） 被覆された該固体支持体を生物試料と接触させ
て複合体を形成し； （ｃ） 該複合体を第二動物種（即ち、第一動物種とは
異なる種）からのHTLV−IIIに対する抗体と接触させ； （ｄ） 該複合体を該第二動物種の抗体に特異的な標識
された抗体と接触させ； （ｅ） 試料中のHTLV−IIIウイルス抗原の存在の尺度
として標識を検出する； ことからなる生物試料中のHTLV−IIIウイルス抗原を検
出する免疫検定法を提供する。
接免疫検定操作である。この検定法は、標識された第２
の抗体を利用して低い水準のHTLV−IIIウイルス抗原の
検出のために必要な感度を達成する。本発明は次の工程
からなる生物試料中のHTLV−IIIウイルス抗原の検出の
ための免疫検定法を提供する。すなわち、 （ａ） 第一動物種からのHTLV−IIIに対する抗体で固
体支持体を被覆し； （ｂ） 被覆された該固体支持体を生物試料と接触させ
て複合体を形成し； （ｃ） 該複合体を第二動物種（即ち、第一動物種とは
異なる種）からのHTLV−IIIに対する抗体と接触させ； （ｄ） 該複合体を該第二動物種の抗体に特異的な標識
された抗体と接触させ； （ｅ） 試料中のHTLV−IIIウイルス抗原の存在の尺度
として標識を検出する； ことからなる生物試料中のHTLV−IIIウイルス抗原を検
出する免疫検定法を提供する。
本発明の方法によって容易に試験される生物試料は、ヒ
ト及び動物の体液及び組織、組織培養倍地及び遺伝子組
替えDNA材料を含む。本発明の免疫検定法中使用される
固形支持体は、反応トレーのウエル、試験管、ビーズ、
ストリツプその他の当該技術熟練者に周知である固形支
持体を含む。
ト及び動物の体液及び組織、組織培養倍地及び遺伝子組
替えDNA材料を含む。本発明の免疫検定法中使用される
固形支持体は、反応トレーのウエル、試験管、ビーズ、
ストリツプその他の当該技術熟練者に周知である固形支
持体を含む。
ポリクロナール及びモノクロナール抗体は共に、本発明
中試剤として有用である。又、IgG及びIgM抗体を使用す
ることができる。
中試剤として有用である。又、IgG及びIgM抗体を使用す
ることができる。
発明の詳細な説明 次の実施例は、本発明の免疫検定法を例示する。
例 Ｉ 本例は、ヒトの生物試料中HTLV−III抗原についての免
疫検定法を示す。
疫検定法を示す。
1. ヒト抗HTLV−III IgGで被覆された1/4インチのポリ
スチレンビーズを、２〜24時間、好適には約14〜18時
間、20℃〜45℃の範囲の温度、好適には室温において20
0μｌの血清、血しょうその他の生物溶液のような試料
と接触させる。次にビーズを5mlの蒸留水で３回洗浄し
て非結合試料を除く。
スチレンビーズを、２〜24時間、好適には約14〜18時
間、20℃〜45℃の範囲の温度、好適には室温において20
0μｌの血清、血しょうその他の生物溶液のような試料
と接触させる。次にビーズを5mlの蒸留水で３回洗浄し
て非結合試料を除く。
2. 洗浄したビーズを、200μｌのウサギ抗HTLV−III I
gGと接触させ、２〜24時間、好適には約２時間、約20℃
〜45℃の範囲の温度、好適には約40℃〜45℃において温
置する。次にビーズを、工程１中説明したとおり洗浄し
て非結合試剤を除く。
gGと接触させ、２〜24時間、好適には約２時間、約20℃
〜45℃の範囲の温度、好適には約40℃〜45℃において温
置する。次にビーズを、工程１中説明したとおり洗浄し
て非結合試剤を除く。
3. 洗浄したビーズを、西洋ワサビのペルオキシダーゼ
に複合されているヤギ抗ウサギIgG200μｌと接触させ、
１〜４時間、好適には２時間、20℃〜45℃の範囲の温
度、好適には40℃〜45℃において温置する。ビーズを再
び工程１中説明したとおり洗浄する。
に複合されているヤギ抗ウサギIgG200μｌと接触させ、
１〜４時間、好適には２時間、20℃〜45℃の範囲の温
度、好適には40℃〜45℃において温置する。ビーズを再
び工程１中説明したとおり洗浄する。
4. 洗浄したビーズを、300μｌのｏ−フエニレンジア
ミン過酸化水素溶液と接触させ、それは西洋ワサビのペ
ルオキシダーゼの存在下に黄色の生成物を生成し、約30
分間室温において温置して後、1N H2SO4 1mlを添加す
る。
ミン過酸化水素溶液と接触させ、それは西洋ワサビのペ
ルオキシダーゼの存在下に黄色の生成物を生成し、約30
分間室温において温置して後、1N H2SO4 1mlを添加す
る。
5. 標準分光光度計を使用して492nmにおいて吸光度を
読む。
読む。
例Ｉの検定法の工程２及び３は、随意には組み合わせて
１工程とし、検定操作を容易にすることができる。又、
IgM抗体を、工程１及び３のIgG抗体の代わりに用いるこ
とができる。
１工程とし、検定操作を容易にすることができる。又、
IgM抗体を、工程１及び３のIgG抗体の代わりに用いるこ
とができる。
例 II エイズ患者、エイズ関連コンプレツクス（ARC）、エイ
ズ患者の無症候性の性接触、並びにエイズの危険性のな
い他の基礎疾患患者からの血清を、例Ｉ中記載された検
定法、並びにHTLV−IIIに対する抗体のための市販の検
定法（アボツトラボラトリーズ、ノース シカゴ イリ
ノイ州）を用いて試験した（表１）。26名のエイズ患者
からの70コの血清試料の91％は抗体陽性であり、67％は
抗原陽性であつた。26名のエイズ患者のうち18名からの
少なくとも１コの血清試料中抗原が検出され、この人の
範囲では69％の抗原陽性率が得られた。エイズ患者から
の70コの血清のうち６コ（8.6％）は抗原陽性／抗体陰
性であつたが、６コはすべて26名のエイズ患者のうち１
名（3.8％）からであつた。全体として、エイズ、ARC及
びエイズ接触よりなる群において、5.3％は抗原陽性／
抗体陰性であり、これらの群において86名中２名（2.3
％）に相当した。同様に、サラフジンら、Lancet, 1984
−II:1418〜1420（1984）は、抗HTLV−III陰性であつた
96名のエイズ、ARC患者、或いはエイズを獲得する危険
性の高い無症候性固体のうち４名（4.2％）のリンパ球
からHTLV−IIIウイルスを単離することができた。
ズ患者の無症候性の性接触、並びにエイズの危険性のな
い他の基礎疾患患者からの血清を、例Ｉ中記載された検
定法、並びにHTLV−IIIに対する抗体のための市販の検
定法（アボツトラボラトリーズ、ノース シカゴ イリ
ノイ州）を用いて試験した（表１）。26名のエイズ患者
からの70コの血清試料の91％は抗体陽性であり、67％は
抗原陽性であつた。26名のエイズ患者のうち18名からの
少なくとも１コの血清試料中抗原が検出され、この人の
範囲では69％の抗原陽性率が得られた。エイズ患者から
の70コの血清のうち６コ（8.6％）は抗原陽性／抗体陰
性であつたが、６コはすべて26名のエイズ患者のうち１
名（3.8％）からであつた。全体として、エイズ、ARC及
びエイズ接触よりなる群において、5.3％は抗原陽性／
抗体陰性であり、これらの群において86名中２名（2.3
％）に相当した。同様に、サラフジンら、Lancet, 1984
−II:1418〜1420（1984）は、抗HTLV−III陰性であつた
96名のエイズ、ARC患者、或いはエイズを獲得する危険
性の高い無症候性固体のうち４名（4.2％）のリンパ球
からHTLV−IIIウイルスを単離することができた。
例 III 肝炎マーカー及び抗HTLV−III陰性の無差別の供血者か
らの、200コのヒト血しょう及び血清試料、並びに47コ
の対照患者試料を使用して検定の特異性を決定した（表
１）。抗原の誤りの陽性は見られなかつた。すべての負
の値は、陰性の対照の平均の２標準偏差内であり、カツ
トオフは、陰性の対照の平均の５標準偏差であつた。
らの、200コのヒト血しょう及び血清試料、並びに47コ
の対照患者試料を使用して検定の特異性を決定した（表
１）。抗原の誤りの陽性は見られなかつた。すべての負
の値は、陰性の対照の平均の２標準偏差内であり、カツ
トオフは、陰性の対照の平均の５標準偏差であつた。
HTLV−III抗原に対して陽性であるがHTLV−IIIに対して
陰性である生物試料の同定は、ヒト供血者のスクリーニ
ング及び保護において重要である。この検定法は、抗HT
LV−III陰性であり、従って現在利用できる抗体スクリ
ーニング試験によつてHTLV−III陽性として示されな
い、HTLV−IIIウイルス感染固体を検出する迅速スクリ
ーニング操作を可能にする。又、本発明の検定法による
HTLV−III抗原の検出は、エイズ患者について診断及び
予後の価値を有することができ、又抗ウイルス治療を受
けている患者をモニターするのに有用となることができ
る。
陰性である生物試料の同定は、ヒト供血者のスクリーニ
ング及び保護において重要である。この検定法は、抗HT
LV−III陰性であり、従って現在利用できる抗体スクリ
ーニング試験によつてHTLV−III陽性として示されな
い、HTLV−IIIウイルス感染固体を検出する迅速スクリ
ーニング操作を可能にする。又、本発明の検定法による
HTLV−III抗原の検出は、エイズ患者について診断及び
予後の価値を有することができ、又抗ウイルス治療を受
けている患者をモニターするのに有用となることができ
る。
特定の実施例を示して本発明を例示したが、当該技術熟
練者は、本発明の精神及び範囲から離れることなしに改
変を知ると理解されるべきである。
練者は、本発明の精神及び範囲から離れることなしに改
変を知ると理解されるべきである。
Claims (6)
- 【請求項１】（ａ） 第一動物種からのHTLV−IIIに対
する抗体で固体支持体を被覆し； （ｂ） 被覆された該固体支持体を生物試料と接触させ
て複合体を形成し； （ｃ） 該複合体を第二動物種からのHTLV−IIIに対す
る抗体と接触させ； （ｄ） 該複合体を該第二動物種の抗体に特異的な標識
された抗体と接触させ； そして （ｅ） 試料中のHTLV−IIIウイルス抗原の存在の尺度
として標識を検出する； ことからなる生物試料中のHTLV−IIIウイルス抗原を検
出する免疫検定法。 - 【請求項２】工程（ｃ）及び（ｄ）が同時に行われる特
許請求の範囲第１項記載の免疫検定法。 - 【請求項３】工程（ａ）及び（ｃ）の抗体がIgG抗体又
はIgM抗体である特許請求の範囲第１項記載の免疫検定
法。 - 【請求項４】標識が西洋ワサビペルオキシダーゼである
特許請求の範囲第１項記載の免疫検定法。 - 【請求項５】標識が酵素、放射性同位体及び蛍光標識か
らなる群から選ばれる特許請求の範囲第１項記載の免疫
検定法。 - 【請求項６】（ａ） ヒト抗HTLV−III IgGでポリスチ
レンビーズを被覆し； （ｂ） 被覆された該ビーズを試料と接触させ、温置
し、そして洗浄し； （ｃ） 該ビーズをウサギ抗HTLV−III IgGと接触さ
せ、温置し、そして洗浄し； （ｄ） 該ビーズを西洋ワサビペルオキシダーゼを結合
したヤギ抗ウサギIgGと接触させ； （ｅ） 該ビーズをｏ−フェニレンジアミン−過酸化水
素溶液と接触させ；そして （ｆ） 生成した着色生成物の光吸度を492nmで測定し
て試料中のHTLV−IIIウイルス抗原の存在を決定する； ことからなるヒト生物試料中のHTLV−IIIウイルス抗原
を検出する特許請求の範囲第１項記載の免疫検定法。
Applications Claiming Priority (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| US779892 | 1985-09-25 | ||
| US06/779,892 US4748110A (en) | 1985-09-25 | 1985-09-25 | Immunoassay for HTLV-III antigens |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPS6275266A JPS6275266A (ja) | 1987-04-07 |
| JPH0692972B2 true JPH0692972B2 (ja) | 1994-11-16 |
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ID=25117913
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| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP61225051A Expired - Lifetime JPH0692972B2 (ja) | 1985-09-25 | 1986-09-25 | Ｈｔｌｖ−▲ｉｉｉ▼抗原用免疫検定法 |
Country Status (5)
| Country | Link |
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| US (1) | US4748110A (ja) |
| EP (1) | EP0216191B1 (ja) |
| JP (1) | JPH0692972B2 (ja) |
| CA (1) | CA1268419A (ja) |
| DE (1) | DE3679877D1 (ja) |
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|---|---|---|---|---|
| JPH081438B2 (ja) * | 1986-05-13 | 1996-01-10 | 三洋化成工業株式会社 | 酵素免疫測定法 |
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| FR2615623B1 (fr) * | 1987-05-22 | 1992-06-19 | Transgene Sa | Test de diagnostic du sida base sur la mise en evidence d'une diversite de la reponse isotypique, vaccins et serotherapies |
| US4886742A (en) * | 1987-06-15 | 1989-12-12 | Coulter Corporation | Enzyme immunoassay for detecting HIV antigens in human sera |
| US4870003A (en) * | 1987-06-15 | 1989-09-26 | Coulter Corporation | Simultaneous enzyme immunoassay for detecting antigen and/or antibody in humans |
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| ATE132267T1 (de) * | 1987-10-30 | 1996-01-15 | Abbott Lab | Immuntest unter verwendung von antigenen, produziert in heterologen organismen |
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| US5202264A (en) * | 1989-10-27 | 1993-04-13 | Health Research, Incorporated | ELISA using multi-species antibodies for detection of von Willebrand factor in multiple species |
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| DE4313975A1 (de) * | 1993-04-28 | 1994-11-03 | Cytech Biomedical Inc | Immunisierungsmittel und Affinitätschromatographie-Trägermaterial |
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1985
- 1985-09-25 US US06/779,892 patent/US4748110A/en not_active Expired - Lifetime
-
1986
- 1986-08-29 DE DE8686111951T patent/DE3679877D1/de not_active Expired - Lifetime
- 1986-08-29 EP EP86111951A patent/EP0216191B1/en not_active Expired
- 1986-09-18 CA CA000518543A patent/CA1268419A/en not_active Expired - Lifetime
- 1986-09-25 JP JP61225051A patent/JPH0692972B2/ja not_active Expired - Lifetime
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