JPH0692996A - Ｃ型肝炎ウィルス粒子を構成する蛋白質およびその発現 - Google Patents
Ｃ型肝炎ウィルス粒子を構成する蛋白質およびその発現Info
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- JPH0692996A JPH0692996A JP35963691A JP35963691A JPH0692996A JP H0692996 A JPH0692996 A JP H0692996A JP 35963691 A JP35963691 A JP 35963691A JP 35963691 A JP35963691 A JP 35963691A JP H0692996 A JPH0692996 A JP H0692996A
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Abstract
(57)【要約】
【目的】 本発明は、Ｃ型肝炎ウィルス（ＨＣＶ）粒子
表面に存在し、中和抗体の標的となるエンベロープ蛋白
質を同定し、ひいてはウィルス感染の診断と発症予防に
利用するワクチン試作に役立てようとするものである。 【構成】 Ｃ型肝炎ウィルス（ＨＣＶ）ゲノムの転写解
読枠にコードされるＮ末端９８０アミノ酸残基からプロ
セシングされる、ＨＣＶゲノムの転写解読枠のＮ末端１
９２番目から３８３番目までのアミノ酸配列を有する、
分子量が約３５０００の、及び３８４番から始まり、約
３５０のアミノ酸配列を有する、分子量が約７００００
の二つのＨＣＶのエンベロープ蛋白質、またＮ末端１番
目から１９１番目までのアミノ酸配列を有する、分子量
が約２２０００のＨＣＶのコア蛋白質。
表面に存在し、中和抗体の標的となるエンベロープ蛋白
質を同定し、ひいてはウィルス感染の診断と発症予防に
利用するワクチン試作に役立てようとするものである。 【構成】 Ｃ型肝炎ウィルス（ＨＣＶ）ゲノムの転写解
読枠にコードされるＮ末端９８０アミノ酸残基からプロ
セシングされる、ＨＣＶゲノムの転写解読枠のＮ末端１
９２番目から３８３番目までのアミノ酸配列を有する、
分子量が約３５０００の、及び３８４番から始まり、約
３５０のアミノ酸配列を有する、分子量が約７００００
の二つのＨＣＶのエンベロープ蛋白質、またＮ末端１番
目から１９１番目までのアミノ酸配列を有する、分子量
が約２２０００のＨＣＶのコア蛋白質。
Description
【０００１】
【産業上の利用分野】本発明は、輸血後非Ａ非Ｂ型肝炎
の主要な原因ウィルスであり、肝ガン発症と密接に関連
することが明らかになってきているＣ型肝炎ウィルス
（ＨＣＶ；以下ＨＣＶという）粒子を構成する蛋白質お
よびその発現、同定に関する。詳しくは、本発明はクロ
ーン化したＨＣＶゲノムのｃＤＮＡを用いてウィルス蛋
白質をｉｎ ｖｉｔｒｏで発現させることにより、ウィ
ルス粒子表面に存在し、中和抗体の標的となるエンベロ
ープ蛋白質を同定し、ひいてはこれをウィルス感染の診
断と発症予防に利用するワクチン試作に役立てようとす
るものである。
の主要な原因ウィルスであり、肝ガン発症と密接に関連
することが明らかになってきているＣ型肝炎ウィルス
（ＨＣＶ；以下ＨＣＶという）粒子を構成する蛋白質お
よびその発現、同定に関する。詳しくは、本発明はクロ
ーン化したＨＣＶゲノムのｃＤＮＡを用いてウィルス蛋
白質をｉｎ ｖｉｔｒｏで発現させることにより、ウィ
ルス粒子表面に存在し、中和抗体の標的となるエンベロ
ープ蛋白質を同定し、ひいてはこれをウィルス感染の診
断と発症予防に利用するワクチン試作に役立てようとす
るものである。
【０００２】
【従来の技術・発明が解決しようとする課題】Ｃ型肝炎
（ｈｅｐａｔｉｔｉｓ Ｃ）は輸血後肝炎を構成するウ
ィルス性肝炎の１種である。Ｃ型肝炎の原因ウィルスで
あるＨＣＶは、感染者が多く問題化している。ＨＣＶ感
染は、これまでアルコール性、自己免疫性と考えられて
いた肝炎、肝硬変や原発性胆汁性肝硬変にも多く見られ
ることがわかり、Ｂ型肝炎（ＨＢＶ）同様、慢性肝炎か
ら肝硬変への移行や、さらには肝細胞ガン発生のリスク
が高いことが明らかになってきた。肝ガン患者のうち約
３分の２以上にＨＣＶ抗体あるいはＨＣＶのゲノムＲＮ
Ａが検出されている。現在、かかるＣ型肝炎自体の治療
には、インターフェロン（ＩＦＮ）が有効であることが
わかり、ウィルス消失データもあるが、いわゆる特効薬
としては難しい面もあり、その診断、治療薬、輸血用血
液の浄化剤、ワクチン等の開発が望まれている状況であ
る。
（ｈｅｐａｔｉｔｉｓ Ｃ）は輸血後肝炎を構成するウ
ィルス性肝炎の１種である。Ｃ型肝炎の原因ウィルスで
あるＨＣＶは、感染者が多く問題化している。ＨＣＶ感
染は、これまでアルコール性、自己免疫性と考えられて
いた肝炎、肝硬変や原発性胆汁性肝硬変にも多く見られ
ることがわかり、Ｂ型肝炎（ＨＢＶ）同様、慢性肝炎か
ら肝硬変への移行や、さらには肝細胞ガン発生のリスク
が高いことが明らかになってきた。肝ガン患者のうち約
３分の２以上にＨＣＶ抗体あるいはＨＣＶのゲノムＲＮ
Ａが検出されている。現在、かかるＣ型肝炎自体の治療
には、インターフェロン（ＩＦＮ）が有効であることが
わかり、ウィルス消失データもあるが、いわゆる特効薬
としては難しい面もあり、その診断、治療薬、輸血用血
液の浄化剤、ワクチン等の開発が望まれている状況であ
る。
【０００３】Ｃ型肝炎は、最近になりようやくその原因
となるウィルス遺伝子が発見され、診断と予防に道が開
かれつつある。ＨＣＶの遺伝子の一部分は、１９８９年
米国カイロン社により分離された [Choo et al., Scien
ce, 244, 359 (1984)]。その情報が基となってＨＣＶの
研究が加速化し、わが国においては日本人患者血清から
ｃＤＮＡが分離され、そのクローン化が行われ、日本人
に特有のＨＣＶ遺伝子配列が明らかにされた。本発明者
らは、日本人の非Ａ非Ｂ型慢性患者に多いＨＣＶ（ＨＣ
Ｖ−Ｊ）の遺伝子を解析し、その全構造を明らかにして
いる [Kato etal. Proc. Acad. Natl. Sci. USA 87, 9
524 (1990)]。それによるとＨＣＶは約１０ＫｂのＲＮ
Ａウィルスであり、当該一本鎖ＲＮＡは約９５００塩基
から成り、アミノ酸に読み取られる領域（転写解読枠：
ＯＲＦ）が９０３０塩基で、アミノ酸数は３０１０であ
る。しかしながら、このようにＨＣＶは遺伝子の全容は
明らかになっているものの、ウィルス粒子は認められて
おらず、ウィルス粒子を構成する蛋白質の同定・解析に
は至っていない。
となるウィルス遺伝子が発見され、診断と予防に道が開
かれつつある。ＨＣＶの遺伝子の一部分は、１９８９年
米国カイロン社により分離された [Choo et al., Scien
ce, 244, 359 (1984)]。その情報が基となってＨＣＶの
研究が加速化し、わが国においては日本人患者血清から
ｃＤＮＡが分離され、そのクローン化が行われ、日本人
に特有のＨＣＶ遺伝子配列が明らかにされた。本発明者
らは、日本人の非Ａ非Ｂ型慢性患者に多いＨＣＶ（ＨＣ
Ｖ−Ｊ）の遺伝子を解析し、その全構造を明らかにして
いる [Kato etal. Proc. Acad. Natl. Sci. USA 87, 9
524 (1990)]。それによるとＨＣＶは約１０ＫｂのＲＮ
Ａウィルスであり、当該一本鎖ＲＮＡは約９５００塩基
から成り、アミノ酸に読み取られる領域（転写解読枠：
ＯＲＦ）が９０３０塩基で、アミノ酸数は３０１０であ
る。しかしながら、このようにＨＣＶは遺伝子の全容は
明らかになっているものの、ウィルス粒子は認められて
おらず、ウィルス粒子を構成する蛋白質の同定・解析に
は至っていない。
【０００４】したがって、本発明の課題は、ＨＣＶの感
染細胞への作用のあり方を、ウィルスの産生蛋白質レベ
ルで究明するために、ウィルス粒子を構成する蛋白質、
就中、ウィルス表面に存在し、中和抗体の標的となるエ
ンベロープ蛋白質に注目し、その同定・解析をおこなう
ことにある。
染細胞への作用のあり方を、ウィルスの産生蛋白質レベ
ルで究明するために、ウィルス粒子を構成する蛋白質、
就中、ウィルス表面に存在し、中和抗体の標的となるエ
ンベロープ蛋白質に注目し、その同定・解析をおこなう
ことにある。
【０００５】
【課題を解決するための手段】本発明者らは、当該目的
を達成するために種々の研究を重ねてきたところ、クロ
ーン化したＨＣＶゲノムのｃＤＮＡを用いてウィルス蛋
白質をｉｎ ｖｉｔｒｏで発現させることにより、ＨＣ
Ｖ遺伝子にコードされているＨＣＶタンパク質のうち、
ウィルス粒子を構成する蛋白質、就中、ウィルス表面に
存在し、中和抗体の標的となるエンベロープ蛋白質が正
確にプロセシングされて産生されることを見い出した。
すなわち、このプロセシングにはミクロソーム膜画分に
存在するシグナレースの作用が必須であり、ウィルス粒
子の膜蛋白質として２種類の蛋白質が発現されることを
発見し、さらにウィルスコア蛋白質も本プロセシング作
用により産生されることを明らかにし、これらウィルス
粒子構成蛋白質をコードするＨＣＶ遺伝子上の領域を同
定した。
を達成するために種々の研究を重ねてきたところ、クロ
ーン化したＨＣＶゲノムのｃＤＮＡを用いてウィルス蛋
白質をｉｎ ｖｉｔｒｏで発現させることにより、ＨＣ
Ｖ遺伝子にコードされているＨＣＶタンパク質のうち、
ウィルス粒子を構成する蛋白質、就中、ウィルス表面に
存在し、中和抗体の標的となるエンベロープ蛋白質が正
確にプロセシングされて産生されることを見い出した。
すなわち、このプロセシングにはミクロソーム膜画分に
存在するシグナレースの作用が必須であり、ウィルス粒
子の膜蛋白質として２種類の蛋白質が発現されることを
発見し、さらにウィルスコア蛋白質も本プロセシング作
用により産生されることを明らかにし、これらウィルス
粒子構成蛋白質をコードするＨＣＶ遺伝子上の領域を同
定した。
【０００６】本発明は、クローン化したＨＣＶゲノムの
ｃＤＮＡを用いてウィルス蛋白質をｉｎ ｖｉｔｒｏで
発現させることにより、ＨＣＶゲノムの転写解読枠にコ
ードされるＮ末端９８０アミノ酸残基からプロセシング
されるＨＣＶ粒子を構成する主要蛋白質うち、ＨＣＶゲ
ノムの転写解読枠のＮ末端１番目から１９１番目までの
アミノ酸配列を有する、分子量が約２２０００のＨＣＶ
のコア蛋白質（ｐ２２）、ＨＣＶゲノムの転写解読枠の
Ｎ末端１９２番目から３８３番目までのアミノ酸配列を
有する、分子量が約３５０００の、及び３８４番から始
まり、約３５０のアミノ酸配列を有する、分子量が約７
００００の二つのＨＣＶのエンベロープ蛋白質（ｇｐ３
５，ｇｐ７０）を同定した（後記図８参照）。
ｃＤＮＡを用いてウィルス蛋白質をｉｎ ｖｉｔｒｏで
発現させることにより、ＨＣＶゲノムの転写解読枠にコ
ードされるＮ末端９８０アミノ酸残基からプロセシング
されるＨＣＶ粒子を構成する主要蛋白質うち、ＨＣＶゲ
ノムの転写解読枠のＮ末端１番目から１９１番目までの
アミノ酸配列を有する、分子量が約２２０００のＨＣＶ
のコア蛋白質（ｐ２２）、ＨＣＶゲノムの転写解読枠の
Ｎ末端１９２番目から３８３番目までのアミノ酸配列を
有する、分子量が約３５０００の、及び３８４番から始
まり、約３５０のアミノ酸配列を有する、分子量が約７
００００の二つのＨＣＶのエンベロープ蛋白質（ｇｐ３
５，ｇｐ７０）を同定した（後記図８参照）。
【０００７】本発明においては、ＨＣＶの推定される構
造蛋白質のプロセシングを、in vitro発現系を用いて調
べた。すなわち、ウィルスポリタンパク前駆体のＮ末端
９８０残基をコードする領域を含むｃＤＮＡから無細胞
系翻訳に用いるＲＮＡ転写物を調製し、続いてミクロソ
ーム膜存在下で翻訳させた（in vitro転写／翻訳）。in
vitro翻訳産物のプロセシングは、ミクロソーム膜存在
下で共翻訳的に（翻訳とともに）進み、４つの主要な産
物（ｐ２２，ｇｐ３５，ｇｐ７０，ｐ１９）を生じた。
なお、ｐ１９は、ｉｎ ｖｉｔｒｏ翻訳系に用いたｍＲ
ＮＡの３’末端が人工的に切断された結果の産物であ
る。当該産物は、Ｎ末端９８０残基より短い型（欠失
体）のｃＤＮＡ構築物から同様にして翻訳され、プロセ
シングされた蛋白の分析との比較により、ポリタンパク
前駆体のＮ末端からNH2-p22-gp35-gp70-p19-COOHの順序
で配列されていることが示唆された。プロセシング後の
蛋白分析にはポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＳＤＳ
−ＰＡＧＥ）後、フルオログラフィーを用いて行うこと
ができる。また、Ｎ末端アミノ酸配列決定は、エドマン
法により行う。
造蛋白質のプロセシングを、in vitro発現系を用いて調
べた。すなわち、ウィルスポリタンパク前駆体のＮ末端
９８０残基をコードする領域を含むｃＤＮＡから無細胞
系翻訳に用いるＲＮＡ転写物を調製し、続いてミクロソ
ーム膜存在下で翻訳させた（in vitro転写／翻訳）。in
vitro翻訳産物のプロセシングは、ミクロソーム膜存在
下で共翻訳的に（翻訳とともに）進み、４つの主要な産
物（ｐ２２，ｇｐ３５，ｇｐ７０，ｐ１９）を生じた。
なお、ｐ１９は、ｉｎ ｖｉｔｒｏ翻訳系に用いたｍＲ
ＮＡの３’末端が人工的に切断された結果の産物であ
る。当該産物は、Ｎ末端９８０残基より短い型（欠失
体）のｃＤＮＡ構築物から同様にして翻訳され、プロセ
シングされた蛋白の分析との比較により、ポリタンパク
前駆体のＮ末端からNH2-p22-gp35-gp70-p19-COOHの順序
で配列されていることが示唆された。プロセシング後の
蛋白分析にはポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＳＤＳ
−ＰＡＧＥ）後、フルオログラフィーを用いて行うこと
ができる。また、Ｎ末端アミノ酸配列決定は、エドマン
法により行う。
【０００８】各翻訳産物が、ウィルスエンベロープ蛋白
質またはウィルスコア蛋白質であると推定・解析するに
は、他の類似フラビウィルスのゲノム上の遺伝子構成お
よびアミノ酸配列の親水性プロフィールの比較、糖鎖付
加シグナル（Ｎ−Ｘ−Ｔ／Ｓ）の在否などから可能であ
る。
質またはウィルスコア蛋白質であると推定・解析するに
は、他の類似フラビウィルスのゲノム上の遺伝子構成お
よびアミノ酸配列の親水性プロフィールの比較、糖鎖付
加シグナル（Ｎ−Ｘ−Ｔ／Ｓ）の在否などから可能であ
る。
【０００９】シグナル配列に相当する部分は、ｇｐ３５
およびｇｐ７０にＮ末端上流に見出された[J. Mol. Bio
l.184, 99-105 (1985)] 。また疎水性アミノ酸配列が続
く領域に対して膜貫通部分があることにより、ｇｐ３５
及びｇｐ７０のＣ末端上流領域に膜貫通部分を推定し
た。かかる膜貫通部分はこれを介してｇｐ３５及びｇｐ
７０を小胞体内へ送り込む役割を果たしていると考えら
れる。さらにＮ−Ｘ−Ｔ／Ｓ配列に対してＮ位糖鎖付加
が起こりやすい部位があることによりグリコシレーショ
ンの可能性のある部位を判断した。
およびｇｐ７０にＮ末端上流に見出された[J. Mol. Bio
l.184, 99-105 (1985)] 。また疎水性アミノ酸配列が続
く領域に対して膜貫通部分があることにより、ｇｐ３５
及びｇｐ７０のＣ末端上流領域に膜貫通部分を推定し
た。かかる膜貫通部分はこれを介してｇｐ３５及びｇｐ
７０を小胞体内へ送り込む役割を果たしていると考えら
れる。さらにＮ−Ｘ−Ｔ／Ｓ配列に対してＮ位糖鎖付加
が起こりやすい部位があることによりグリコシレーショ
ンの可能性のある部位を判断した。
【００１０】
【発明の効果】本発明は、ＨＣＶ粒子表面に存在し、中
和抗体の標的となるエンベロープ蛋白質を同定し、ひい
てはウィルス感染の診断と発症予防に利用するワクチン
試作に役立てようとするものである。
和抗体の標的となるエンベロープ蛋白質を同定し、ひい
てはウィルス感染の診断と発症予防に利用するワクチン
試作に役立てようとするものである。
【００１１】
実施例１ （１）発現プラスミドの構築 ＨＣＶ ｃＤＮＡ配列の８１塩基対の５’非コード領域
と２９４０塩基対のコード領域を含む、すなわちＨＣＶ
の転写解読枠（ＯＲＦ）のＮ末端９８０残基をコードす
る発現ベクターｐＣ９８０、その一連の欠失変異株を以
下のように構築した。まず、ＨＣＶ−Ｊクローン２ [Ka
to, N. et al. Proc. Natl.Acad. Sci.USA 87, 9524-95
28 (1990)] の EcoRI断片をマルチクローニング領域の
すぐ上流にＴ７ファージプロモーターを含有するｐＴＺ
１８Ｕベクター [東洋紡（株）]の EcoRI部位にサブク
ローンして、発現ベクターｐＣ１６３を構築した。次
に、ｐＣ１６３のNarI- HindIII 断片をＨＣＶ−Ｊクロ
ーン３（同上）のNarI- HindIII で置換し、ｐＣ５１１
を作製した。ｐＣ５１１のMluI-HindIII断片をＨＣＶ−
Ｊ（同上）に対するｃＤＮＡクローンの一部を含むクロ
ーン33（同上）のMluI-HindIII断片で置換し、ｐＣ７４
０を得た。そしてｐＣ７４０のBssHII-HindIII断片をＨ
ＣＶ−Ｊクローン６（同上）のBssHII-HindIII断片で置
換し、ｐＣ９８０を構築した。ｐＣ９８０からNruI-Cla
I 断片およびSmaI-BamHI断片をそれぞれ欠失し、ＤＮＡ
ポリメラーゼＩのクレノウ断片を用いて制限酵素切断突
出末端を埋めた後、Sph-I リンカー（宝酒造社製）を用
いて結合して、ｐＮ１２４およびｐＮ３４０を構築し
た。ｐＮ１２４はさらにSphIで切断して187 塩基対の
３’末端を欠失させた。尚、ｐＣ９８０の構築図を図
１、図２に示す。
と２９４０塩基対のコード領域を含む、すなわちＨＣＶ
の転写解読枠（ＯＲＦ）のＮ末端９８０残基をコードす
る発現ベクターｐＣ９８０、その一連の欠失変異株を以
下のように構築した。まず、ＨＣＶ−Ｊクローン２ [Ka
to, N. et al. Proc. Natl.Acad. Sci.USA 87, 9524-95
28 (1990)] の EcoRI断片をマルチクローニング領域の
すぐ上流にＴ７ファージプロモーターを含有するｐＴＺ
１８Ｕベクター [東洋紡（株）]の EcoRI部位にサブク
ローンして、発現ベクターｐＣ１６３を構築した。次
に、ｐＣ１６３のNarI- HindIII 断片をＨＣＶ−Ｊクロ
ーン３（同上）のNarI- HindIII で置換し、ｐＣ５１１
を作製した。ｐＣ５１１のMluI-HindIII断片をＨＣＶ−
Ｊ（同上）に対するｃＤＮＡクローンの一部を含むクロ
ーン33（同上）のMluI-HindIII断片で置換し、ｐＣ７４
０を得た。そしてｐＣ７４０のBssHII-HindIII断片をＨ
ＣＶ−Ｊクローン６（同上）のBssHII-HindIII断片で置
換し、ｐＣ９８０を構築した。ｐＣ９８０からNruI-Cla
I 断片およびSmaI-BamHI断片をそれぞれ欠失し、ＤＮＡ
ポリメラーゼＩのクレノウ断片を用いて制限酵素切断突
出末端を埋めた後、Sph-I リンカー（宝酒造社製）を用
いて結合して、ｐＮ１２４およびｐＮ３４０を構築し
た。ｐＮ１２４はさらにSphIで切断して187 塩基対の
３’末端を欠失させた。尚、ｐＣ９８０の構築図を図
１、図２に示す。
【００１２】（２）ｉｎ ｖｉｔｒｏ転写 すべての精製したプラスミドを、挿入ｃＤＮＡの下流に
あるマルチクローニング領域の唯一のHindIII で部位で
切断するか、または挿入物内の適当な制限酵素部位で切
断して、直鎖状にした。これらをin vitro転写用の鋳型
として用いた。既報に従いＴ７ＲＮＡポリメラーゼ(Uni
ted States Biochemical) を用いてin vitroでＲＮＡ転
写物を合成した[Hijikata et al., J. Virol. 64, 4632
-4639 (1990)] 。BamHI またはHincIIで短くしたｐＣ５
１１と、BssHIIまたはNotIで短くしたｐＮ３４０を鋳型
として使用し、in vitroで転写して、Ｃ２８１, Ｃ３８
１, Ｎ３４０Ｂ, Ｎ３４０Ｎを得た。上記の処理で得ら
れ、ｉｎ ｖｉｔｒｏプロセシング分析に用いる各欠失
構築物の地図および発現プラスミド構築方策の一覧図を
図３に示す。
あるマルチクローニング領域の唯一のHindIII で部位で
切断するか、または挿入物内の適当な制限酵素部位で切
断して、直鎖状にした。これらをin vitro転写用の鋳型
として用いた。既報に従いＴ７ＲＮＡポリメラーゼ(Uni
ted States Biochemical) を用いてin vitroでＲＮＡ転
写物を合成した[Hijikata et al., J. Virol. 64, 4632
-4639 (1990)] 。BamHI またはHincIIで短くしたｐＣ５
１１と、BssHIIまたはNotIで短くしたｐＮ３４０を鋳型
として使用し、in vitroで転写して、Ｃ２８１, Ｃ３８
１, Ｎ３４０Ｂ, Ｎ３４０Ｎを得た。上記の処理で得ら
れ、ｉｎ ｖｉｔｒｏプロセシング分析に用いる各欠失
構築物の地図および発現プラスミド構築方策の一覧図を
図３に示す。
【００１３】（３）ｉｎ ｖｉｔｒｏプロセシングアッ
セイと蛋白分析 イヌ膵臓ミクロソーム膜（Promega)の存在下または非存
在下で、標識用に[35S] メチオニン(Amersham)を加え、
ウサギ網状赤血球溶解物(Amersham)を使用して、ｐＣ９
８０の転写物を翻訳した。そして翻訳混合物試料を界面
活性剤（１％デオキシコール酸ナトリウム／１％トライ
トンＸ−１００）の存在下または非存在下で０℃にて30
分間プロテイナーゼＫ（200 μｇ／ｍｌ）で処理した。
混合物を10,000×g にて20分間遠心分離後、沈澱および
上清の試料をＳＤＳ／ＰＡＧＥ後、フルオログラフィー
で分析した。
セイと蛋白分析 イヌ膵臓ミクロソーム膜（Promega)の存在下または非存
在下で、標識用に[35S] メチオニン(Amersham)を加え、
ウサギ網状赤血球溶解物(Amersham)を使用して、ｐＣ９
８０の転写物を翻訳した。そして翻訳混合物試料を界面
活性剤（１％デオキシコール酸ナトリウム／１％トライ
トンＸ−１００）の存在下または非存在下で０℃にて30
分間プロテイナーゼＫ（200 μｇ／ｍｌ）で処理した。
混合物を10,000×g にて20分間遠心分離後、沈澱および
上清の試料をＳＤＳ／ＰＡＧＥ後、フルオログラフィー
で分析した。
【００１４】ｐＣ９８０を用いたin vitroプロセシング
アッセイの結果を図４に示す。in vitroでの翻訳中にミ
クロソーム膜が存在しているときだけ、ｐＣ９８０の翻
訳産物（Ｃ９８０）はプロセシングされ、ａ（最大70 k
Da），ｂ（35 kDa），ｃ（22kDa），ｄ（19 kDa）の４
つの主要分解産物を生じた（図４、レーン５）。ミクロ
ソーム非存在下で合成されたプロセシングされない型
は、ゲルの泳動開始点に留まりうる型として以外には検
出されなった（図４、レーン３）。これらの４つの主要
産物ａ，ｂ，ｃ，ｄは沈澱したミクロソーム膜分画にす
べて見られた。産物ａ，ｂはプロテイナーゼＫ処理に耐
性であったが、産物ｃ，ｄは当該酵素で分解された（図
４、レーン７）。プロテイナーゼ処理に対する耐性は界
面活性剤処理により失われ（図４、レーン９）、これは
産物ａおよびｂはミクロソーム内に移動することを示唆
している。
アッセイの結果を図４に示す。in vitroでの翻訳中にミ
クロソーム膜が存在しているときだけ、ｐＣ９８０の翻
訳産物（Ｃ９８０）はプロセシングされ、ａ（最大70 k
Da），ｂ（35 kDa），ｃ（22kDa），ｄ（19 kDa）の４
つの主要分解産物を生じた（図４、レーン５）。ミクロ
ソーム非存在下で合成されたプロセシングされない型
は、ゲルの泳動開始点に留まりうる型として以外には検
出されなった（図４、レーン３）。これらの４つの主要
産物ａ，ｂ，ｃ，ｄは沈澱したミクロソーム膜分画にす
べて見られた。産物ａ，ｂはプロテイナーゼＫ処理に耐
性であったが、産物ｃ，ｄは当該酵素で分解された（図
４、レーン７）。プロテイナーゼ処理に対する耐性は界
面活性剤処理により失われ（図４、レーン９）、これは
産物ａおよびｂはミクロソーム内に移動することを示唆
している。
【００１５】（４）プロセシングされた産物のＨＣＶゲ
ノム上における遺伝子マッピング ＨＣＶ ＯＲＦにコードされた４つのプロセシングされ
た産物の配列順序を決定するため、上記（２）で得られ
たＣ９８０の種々の欠失変異体を用い、（３）と同様に
して前駆体タンパクのin vitroプロセシングを行った。
すなわち、Ｃ９８０の種々の欠失変異体の各転写物をミ
クロソーム膜存在下または非存在下にinvitroで翻訳
し、反応生成物のプロテイナーゼＫに対する感受性を調
べた（図５）。in vitroの翻訳産物であるＣ７４０，Ｃ
５１１，Ｃ３８１，Ｃ２８１，Ｃ１６３はＣ９８０の一
連のＣ末端欠失を有し、それぞれ７４０，５１１，３８
１，２８１，１６３残基のＮ末端配列を含んでいた。ｐ
Ｎ１２４およびｐＮ３４０の翻訳産物であるＮ１２４お
よびＮ３４０は、Ｃ９８０の１２３および３３９残基の
Ｎ末端配列がアミノ酸配列Met-Pro と置換されている。
ｐＮ１２４−ＯＲＦはｐＣ９８０の５９Ｃ末端残基に対
する塩基配列を欠いている。また、Ｎ３４０ＢとＮ３４
０Ｎは、それぞれＮ３４０の２５２，４３８残基のＣ末
端配列を欠いていた。
ノム上における遺伝子マッピング ＨＣＶ ＯＲＦにコードされた４つのプロセシングされ
た産物の配列順序を決定するため、上記（２）で得られ
たＣ９８０の種々の欠失変異体を用い、（３）と同様に
して前駆体タンパクのin vitroプロセシングを行った。
すなわち、Ｃ９８０の種々の欠失変異体の各転写物をミ
クロソーム膜存在下または非存在下にinvitroで翻訳
し、反応生成物のプロテイナーゼＫに対する感受性を調
べた（図５）。in vitroの翻訳産物であるＣ７４０，Ｃ
５１１，Ｃ３８１，Ｃ２８１，Ｃ１６３はＣ９８０の一
連のＣ末端欠失を有し、それぞれ７４０，５１１，３８
１，２８１，１６３残基のＮ末端配列を含んでいた。ｐ
Ｎ１２４およびｐＮ３４０の翻訳産物であるＮ１２４お
よびＮ３４０は、Ｃ９８０の１２３および３３９残基の
Ｎ末端配列がアミノ酸配列Met-Pro と置換されている。
ｐＮ１２４−ＯＲＦはｐＣ９８０の５９Ｃ末端残基に対
する塩基配列を欠いている。また、Ｎ３４０ＢとＮ３４
０Ｎは、それぞれＮ３４０の２５２，４３８残基のＣ末
端配列を欠いていた。
【００１６】プロテイナーゼ耐性産物ａ（70 kDa) は、
Ｃ７４０，Ｎ１２４，Ｎ３４０，Ｎ３４０Ｂのプロセシ
ングされた型においてのみ検出されたので（図５、レー
ン３，18，21，24）、この蛋白質はＨＣＶ ＯＲＦのＮ
末端残基おおよそ３４０から７４０に位置し、その領域
は当該蛋白のシグナル配列になりうる配列を含む。ま
た、別のプロテイナーゼ耐性産物ｂ（35 kDa) は、Ｃ２
８１，Ｃ１６３，Ｎ３４０，Ｎ３４０Ｂ，Ｎ３４０Ｎの
プロセシングされた型の中で検出されず（図５、レーン
12, 15，21, 24, 27）、それより小さいプロテイナーゼ
耐性産物（30 kDa) がＣ２８１のプロセシングされた型
の中で検出されたことにより、この蛋白質は、ＨＣＶ
ＯＲＦのＮ末端残基おおよそ１６３から３８１に位置す
ることを示す。産物ｃ（22 kDa) に対するバンドはＮ−
末端欠失変異株であるＮ１２４，Ｎ３４０，Ｎ３４０
Ｂ，Ｎ３４０Ｎのプロセシングされた型には失われてい
たので（図５、レーン17，20，23，26) 、この蛋白質は
ＨＣＶ ＯＲＦのＮ末端由来である。産物ｄ（19 kDa)
は、Ｃ９８０およびＣ９８０と同じＣ末端配列を有する
Ｎ３４０のプロセシングされた型においてのみ検出され
たことは（図５、レーン20) 、この蛋白質がＣ９８０−
ＯＲＦのＣ末端領域にコードされていることを示唆す
る。これらの結果からＨＣＶ ＯＲＦにおけるプロセシ
ングされた蛋白質の配列順序は、NH2-ｃ（22 kDa)-ｂ
（35 kDa)-ａ（70 kDa)-ｄ（19 kDa)-COOHであると結論
づけられる。
Ｃ７４０，Ｎ１２４，Ｎ３４０，Ｎ３４０Ｂのプロセシ
ングされた型においてのみ検出されたので（図５、レー
ン３，18，21，24）、この蛋白質はＨＣＶ ＯＲＦのＮ
末端残基おおよそ３４０から７４０に位置し、その領域
は当該蛋白のシグナル配列になりうる配列を含む。ま
た、別のプロテイナーゼ耐性産物ｂ（35 kDa) は、Ｃ２
８１，Ｃ１６３，Ｎ３４０，Ｎ３４０Ｂ，Ｎ３４０Ｎの
プロセシングされた型の中で検出されず（図５、レーン
12, 15，21, 24, 27）、それより小さいプロテイナーゼ
耐性産物（30 kDa) がＣ２８１のプロセシングされた型
の中で検出されたことにより、この蛋白質は、ＨＣＶ
ＯＲＦのＮ末端残基おおよそ１６３から３８１に位置す
ることを示す。産物ｃ（22 kDa) に対するバンドはＮ−
末端欠失変異株であるＮ１２４，Ｎ３４０，Ｎ３４０
Ｂ，Ｎ３４０Ｎのプロセシングされた型には失われてい
たので（図５、レーン17，20，23，26) 、この蛋白質は
ＨＣＶ ＯＲＦのＮ末端由来である。産物ｄ（19 kDa)
は、Ｃ９８０およびＣ９８０と同じＣ末端配列を有する
Ｎ３４０のプロセシングされた型においてのみ検出され
たことは（図５、レーン20) 、この蛋白質がＣ９８０−
ＯＲＦのＣ末端領域にコードされていることを示唆す
る。これらの結果からＨＣＶ ＯＲＦにおけるプロセシ
ングされた蛋白質の配列順序は、NH2-ｃ（22 kDa)-ｂ
（35 kDa)-ａ（70 kDa)-ｄ（19 kDa)-COOHであると結論
づけられる。
【００１７】（４）プロテイナーゼ耐性産物のエンドグ
リコシダーゼＨ処理 Ｃ９８０の欠失変異体のプロテイナーゼ耐性翻訳産物
を、Ruiz-Linaresらの報告に従い[Ruiz-Linares et a
l., J. Virol., 63, 4199-4209 (1990)] 、エンドグリ
コシダーゼＨ(Boehringer Mannheim）処理を行った。当
該処理により結合されうる、Ｎ−結合高マンノース型グ
リカンを除去した後、ＳＤＳ／ＰＡＧＥで分析した結果
を図６に示す。図６に示すように、プロテインナーゼ耐
性産物ａ，ｂの大きさはエンドグリコシダーゼＨ処理後
減少し、これは両産物は糖蛋白であることを示唆してい
る。ａ，ｂの脱糖化型の分子量はそれぞれ約21 kDaおよ
び38 kDaと推定された（図６、レーン２，４，６，８，
12) 。欠失体の分析から予想されたように、Ｃ２８１と
Ｎ３４０Ｎの産物は脱糖化によりそれぞれ約10 kDaおよ
び22 kDaに減少した（図６、レーン10, 14) 。産物ａ，
ｂをそれぞれｇｐ３５，ｇｐ７０と命名した。
リコシダーゼＨ処理 Ｃ９８０の欠失変異体のプロテイナーゼ耐性翻訳産物
を、Ruiz-Linaresらの報告に従い[Ruiz-Linares et a
l., J. Virol., 63, 4199-4209 (1990)] 、エンドグリ
コシダーゼＨ(Boehringer Mannheim）処理を行った。当
該処理により結合されうる、Ｎ−結合高マンノース型グ
リカンを除去した後、ＳＤＳ／ＰＡＧＥで分析した結果
を図６に示す。図６に示すように、プロテインナーゼ耐
性産物ａ，ｂの大きさはエンドグリコシダーゼＨ処理後
減少し、これは両産物は糖蛋白であることを示唆してい
る。ａ，ｂの脱糖化型の分子量はそれぞれ約21 kDaおよ
び38 kDaと推定された（図６、レーン２，４，６，８，
12) 。欠失体の分析から予想されたように、Ｃ２８１と
Ｎ３４０Ｎの産物は脱糖化によりそれぞれ約10 kDaおよ
び22 kDaに減少した（図６、レーン10, 14) 。産物ａ，
ｂをそれぞれｇｐ３５，ｇｐ７０と命名した。
【００１８】（５）ｇｐ３５およびｇｐ７０のＮ末端ア
ミノ酸配列の決定 ＨＣＶポリタンパク前駆体の正確な切断点を決定するた
め、Ｃ２８１とＮ３４０Ｎのプロテイナーゼ耐性in vit
ro翻訳産物を用いて、ｇｐ３５およびｇｐ７０のＮ末端
アミノ酸配列をそれぞれ調べた。3H- 標識アミノ酸で標
識したプロテイナーゼ耐性翻訳産物をエンドグリコシダ
ーゼＨで脱糖化してＳＤＳ／ＰＡＧＥで泳動後、Immobi
lon 膜(Millipore) 上にエレクトロブロットした。膜上
の放射能ラベルされた産物を取り出し、手動エドマン分
解にかけた。分解の各サイクルにおける放射活性アミノ
酸放出をプロットした（図７）。エドマン分解サイクル
における3H- 標識アミノ酸のピークから決定したアミノ
酸配列をＣ９８０−ＯＲＦから解読されたアミノ酸配列
と比較した。Ｃ２８１とＮ３４０Ｎ由来のin vitroでプ
ロセシングされた産物の配列決定により、ｇｐ３５およ
びｇｐ７０のＮ末端残基は、Ｃ９８０−ＯＲＦから解読
された配列のTyr-192 とHis-384 であるとそれぞれ同定
された。
ミノ酸配列の決定 ＨＣＶポリタンパク前駆体の正確な切断点を決定するた
め、Ｃ２８１とＮ３４０Ｎのプロテイナーゼ耐性in vit
ro翻訳産物を用いて、ｇｐ３５およびｇｐ７０のＮ末端
アミノ酸配列をそれぞれ調べた。3H- 標識アミノ酸で標
識したプロテイナーゼ耐性翻訳産物をエンドグリコシダ
ーゼＨで脱糖化してＳＤＳ／ＰＡＧＥで泳動後、Immobi
lon 膜(Millipore) 上にエレクトロブロットした。膜上
の放射能ラベルされた産物を取り出し、手動エドマン分
解にかけた。分解の各サイクルにおける放射活性アミノ
酸放出をプロットした（図７）。エドマン分解サイクル
における3H- 標識アミノ酸のピークから決定したアミノ
酸配列をＣ９８０−ＯＲＦから解読されたアミノ酸配列
と比較した。Ｃ２８１とＮ３４０Ｎ由来のin vitroでプ
ロセシングされた産物の配列決定により、ｇｐ３５およ
びｇｐ７０のＮ末端残基は、Ｃ９８０−ＯＲＦから解読
された配列のTyr-192 とHis-384 であるとそれぞれ同定
された。
【００１９】ＨＣＶ ９８０−ＯＲＦから解読されるア
ミノ酸配列、およびＨＣＶ ＯＲＦにおけるプロセシン
グされた蛋白質に相当する領域を図８に示す。ｇｐ３５
およびｇｐ７０のＮ末端のすぐ上流の、ＨＣＶ ＯＲＦ
の解読配列における残基１７５−１９１位および３７０
−３８３位にシグナル配列に相当する配列が認められた
（図８，二重線）。また、ｇｐ３５およびｇｐ７０のＣ
末端領域に膜貫通部分として作用する２つの部分が認め
られ（図８，下線）、これはｇｐ３５，ｇｐ７０両産物
はＩ型膜結合蛋白質であることが示唆される。
ミノ酸配列、およびＨＣＶ ＯＲＦにおけるプロセシン
グされた蛋白質に相当する領域を図８に示す。ｇｐ３５
およびｇｐ７０のＮ末端のすぐ上流の、ＨＣＶ ＯＲＦ
の解読配列における残基１７５−１９１位および３７０
−３８３位にシグナル配列に相当する配列が認められた
（図８，二重線）。また、ｇｐ３５およびｇｐ７０のＣ
末端領域に膜貫通部分として作用する２つの部分が認め
られ（図８，下線）、これはｇｐ３５，ｇｐ７０両産物
はＩ型膜結合蛋白質であることが示唆される。
【図１】ｐＣ９８０の構築図を示す。
【図２】ｐＣ９８０の構築図（続き）を示す。
【図３】発現プラスミドの構築方策の一覧図とｉｎ ｖ
ｉｔｒｏプロセシング分析に用いた欠失構築物の地図を
示す。
ｉｔｒｏプロセシング分析に用いた欠失構築物の地図を
示す。
【図４】ｐＣ９８０のｉｎ ｖｉｔｒｏ転写翻訳物のＳ
ＤＳ／ＰＡＧＥによるプロセシングアッセイ結果を示
す。 レーン１；ＲＮＡを加えずにミクロソーム膜非存在下翻
訳した産物（コントロール） レーン２；ＲＮＡを加えずにミクロソーム膜存在下翻訳
した産物（コントロール） レーン３；ｐＣ９８０のｉｎ ｖｉｔｒｏ転写物をミク
ロソーム膜非存在下翻訳した産物 レーン４；ｐＣ９８０のｉｎ ｖｉｔｒｏ転写物をミク
ロソーム膜存在下翻訳した産物の上清画分 レーン５；ｐＣ９８０のｉｎ ｖｉｔｒｏ転写物をミク
ロソーム膜存在下翻訳した産物の沈澱画分 レーン６；ｐＣ９８０のｉｎ ｖｉｔｒｏ転写物をミク
ロソーム膜存在下翻訳した後、界面活性剤非存在下、プ
ロテイナーゼＫ処理した産物の上清画分 レーン７；ｐＣ９８０のｉｎ ｖｉｔｒｏ転写物をミク
ロソーム膜存在下翻訳した後、界面活性剤非存在下、プ
ロテイナーゼＫ処理した産物の沈澱画分 レーン８；ｐＣ９８０のｉｎ ｖｉｔｒｏ転写物をミク
ロソーム膜存在下翻訳した後、界面活性剤存在下、プロ
テイナーゼＫ処理した産物の上清画分 レーン９；ｐＣ９８０のｉｎ ｖｉｔｒｏ転写物をミク
ロソーム膜存在下翻訳した後、界面活性剤存在下、プロ
テイナーゼＫ処理した産物の沈澱画分
ＤＳ／ＰＡＧＥによるプロセシングアッセイ結果を示
す。 レーン１；ＲＮＡを加えずにミクロソーム膜非存在下翻
訳した産物（コントロール） レーン２；ＲＮＡを加えずにミクロソーム膜存在下翻訳
した産物（コントロール） レーン３；ｐＣ９８０のｉｎ ｖｉｔｒｏ転写物をミク
ロソーム膜非存在下翻訳した産物 レーン４；ｐＣ９８０のｉｎ ｖｉｔｒｏ転写物をミク
ロソーム膜存在下翻訳した産物の上清画分 レーン５；ｐＣ９８０のｉｎ ｖｉｔｒｏ転写物をミク
ロソーム膜存在下翻訳した産物の沈澱画分 レーン６；ｐＣ９８０のｉｎ ｖｉｔｒｏ転写物をミク
ロソーム膜存在下翻訳した後、界面活性剤非存在下、プ
ロテイナーゼＫ処理した産物の上清画分 レーン７；ｐＣ９８０のｉｎ ｖｉｔｒｏ転写物をミク
ロソーム膜存在下翻訳した後、界面活性剤非存在下、プ
ロテイナーゼＫ処理した産物の沈澱画分 レーン８；ｐＣ９８０のｉｎ ｖｉｔｒｏ転写物をミク
ロソーム膜存在下翻訳した後、界面活性剤存在下、プロ
テイナーゼＫ処理した産物の上清画分 レーン９；ｐＣ９８０のｉｎ ｖｉｔｒｏ転写物をミク
ロソーム膜存在下翻訳した後、界面活性剤存在下、プロ
テイナーゼＫ処理した産物の沈澱画分
【図５】Ｃ９８０の種々の欠失変異体のＳＤＳ／ＰＡＧ
Ｅによるｉｎ ｖｉｔｒｏプロセシングアッセイ結果を
示す。 レーン1, 4, 7, 10, 13, 16, 19, 22, 25 : ミクロソー
ム膜非存在下翻訳 レーン2, 5, 8, 11, 14, 17, 20, 23, 26 : ミクロソー
ム膜存在下翻訳 レーン3, 6, 9, 12, 15, 18, 21, 24, 27 : ミクロソー
ム膜存在下翻訳後、プロテイナーゼＫ処理
Ｅによるｉｎ ｖｉｔｒｏプロセシングアッセイ結果を
示す。 レーン1, 4, 7, 10, 13, 16, 19, 22, 25 : ミクロソー
ム膜非存在下翻訳 レーン2, 5, 8, 11, 14, 17, 20, 23, 26 : ミクロソー
ム膜存在下翻訳 レーン3, 6, 9, 12, 15, 18, 21, 24, 27 : ミクロソー
ム膜存在下翻訳後、プロテイナーゼＫ処理
【図６】Ｃ９８０の欠失変異体のプロテインナーゼ耐性
翻訳産物産物（−，レーン1, 3, 5, 7, 9, 11, 13)、エ
ンドグリコシダーゼＨ（ｅＨ）処理後（＋，レーン2,
4, 6, 8, 10, 12, 14) のＳＤＳ／ＰＡＧＥによる分析
結果を示す。
翻訳産物産物（−，レーン1, 3, 5, 7, 9, 11, 13)、エ
ンドグリコシダーゼＨ（ｅＨ）処理後（＋，レーン2,
4, 6, 8, 10, 12, 14) のＳＤＳ／ＰＡＧＥによる分析
結果を示す。
【図７】Ｃ２８１とＮ３４０Ｎ由来のin vitroでプロセ
シングされた産物のエドマン分解の各サイクルにおける
放射活性アミノ酸放出のプロットを示す。
シングされた産物のエドマン分解の各サイクルにおける
放射活性アミノ酸放出のプロットを示す。
【図８】Ｃ９８０−ＯＲＦから解読されるアミノ酸配
列、およびＨＣＶ ＯＲＦにおけるプロセシングされた
蛋白質を示す。
列、およびＨＣＶ ＯＲＦにおけるプロセシングされた
蛋白質を示す。
Claims (3)
- 【請求項１】 Ｃ型肝炎ウィルスゲノムの転写解読枠の
Ｎ末端１９２番目から３８３番目までのアミノ酸配列を
有する、分子量が約３５０００のＣ型肝炎ウィルスのエ
ンベロープ蛋白質。 - 【請求項２】 Ｃ型肝炎ウィルスゲノムの転写解読枠の
Ｎ末端３８４番からから始まり、約３５０個のアミノ酸
配列を有する、分子量が約７００００のＣ型肝炎ウィル
スのエンベロープ蛋白質。 - 【請求項３】 Ｃ型肝炎ウィルスゲノムの転写解読枠の
Ｎ末端１番目から１９１番目までのアミノ酸配列を有す
る、分子量が約２２０００のＣ型肝炎ウィルスのコア蛋
白質。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP35963691A JPH0692996A (ja) | 1991-12-28 | 1991-12-28 | Ｃ型肝炎ウィルス粒子を構成する蛋白質およびその発現 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP35963691A JPH0692996A (ja) | 1991-12-28 | 1991-12-28 | Ｃ型肝炎ウィルス粒子を構成する蛋白質およびその発現 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH0692996A true JPH0692996A (ja) | 1994-04-05 |
Family
ID=18465517
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP35963691A Pending JPH0692996A (ja) | 1991-12-28 | 1991-12-28 | Ｃ型肝炎ウィルス粒子を構成する蛋白質およびその発現 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JPH0692996A (ja) |
Cited By (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO1996010997A1 (en) * | 1994-10-05 | 1996-04-18 | Apollon, Inc. | Hepatitis virus vaccines |
| US6025341A (en) * | 1995-06-06 | 2000-02-15 | The General Hospital Corporation | Chimeric hepatitis B/hepatitis C virus vaccine |
| US6235888B1 (en) * | 1994-10-05 | 2001-05-22 | The General Hospital Corporation | Hepatitis C virus vaccine |
-
1991
- 1991-12-28 JP JP35963691A patent/JPH0692996A/ja active Pending
Cited By (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO1996010997A1 (en) * | 1994-10-05 | 1996-04-18 | Apollon, Inc. | Hepatitis virus vaccines |
| US6235888B1 (en) * | 1994-10-05 | 2001-05-22 | The General Hospital Corporation | Hepatitis C virus vaccine |
| US6831169B2 (en) | 1994-10-05 | 2004-12-14 | The General Hospital Corporation | Hepatitis C virus vaccine |
| US6025341A (en) * | 1995-06-06 | 2000-02-15 | The General Hospital Corporation | Chimeric hepatitis B/hepatitis C virus vaccine |
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