JPH0694718A - 免疫クロマト試験方法およびこれに用いる試験具 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 【構成】 金コロイドを結合した抗原または抗体を利用
し、検体を展開支持体に展開させた後、金コロイドの集
積の有無により抗原抗体反応の生成を判定する免疫クロ
マト法において、細胞成分と液性成分の展開速度が相違
する展開支持体を用いたことを特徴とする免疫クロマト
法およびこれに用いる試験具。 【効果】 本発明は、展開支持体として、細胞成分と液
性成分の展開速度が相違するものを選択使用しているた
め、免疫クロマト法を行うにあたり、細胞成分を分離す
る必要がない。 従って、緊急を要する場合や、充分な
設備のない状況下においても容易に全血を用い、血液中
成分の分析をおこなうことができるので、各種の疾患の
診断に極めて有用である。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【産業上の利用分野】本発明は、免疫クロマト試験方法
およびこれに用いる試験具に関し、更に詳細には、全血
試料から細胞成分を分離しなくても目的物質の存在を肉
眼的に判定することの出来る免疫クロマト試験方法およ
びこれに用いる試験具に関する。

【０００２】

【従来の技術】従来より、エンザイムリンクドイムノソ
ルベントアッセイ（ＥＬＩＳＡ）、エンザイムイムノア
ッセイ（ＥＩＡ）、ラジオイムノアッセイ（ＲＩＡ）、
凝集法、免疫クロマト試験法等の抗原抗体反応を利用し
た生体内成分の分析法は良く知られている。このうち、
免疫クロマト試験法として、抗原または抗体と結合した
金コロイド（以下、「金コロイド試薬」という）を利用
した方法が知られている。

【０００３】しかし、この方法は、金コロイド試薬が一
定の部分に集まったことにより目的物質の存在を判断す
るものであるため、全血試料への適用は極めて難しいと
されていた。 すなわち、全血試料は、赤血球、白血
球、血小板等の細胞成分と、液性成分から構成されてい
るが、全血試料を用いた場合、金コロイドの存在が肉眼
で判定できないという欠点があり、遠心分離等により液
性成分を分離することが必須とされていた。

【０００４】このような分離は、設備の整った病院等で
はなんら問題無く行なうことが可能であるが、そのよう
な設備のない環境で、緊急に試験を行なわなくてはなら
ない場合も多くその解決が求められていた。

【０００５】近年、全血試料を用いた免疫クロマト試験
方法として、抗原または抗体を固定化させた試験バンド
を有する展開支持体の下端と試験バンドの間に全血試料
をスポットし、次いで下端から金コロイド試薬を含む緩
衝液を展開させ、試験バンドでの金コロイドの集積を判
定する方法が報告されている（特開昭 ６３−２５５５
３号）。

【０００６】

【発明が解決しようとする課題】しかしながら、この方
法では、全血試料のスポット量により結果が変化する虞
があり、しかもそのスポット量が少ないため、かなりな
熟練が要求され、簡易な方法とはいい難く、より簡便で
実用性の高い方法の提供が求められていた。

【０００７】

【課題を解決するための手段】本発明者は上記の実情に
鑑み、免疫クロマト試験方法を改良すべく鋭意研究を行
なった結果、特定の展開支持体は血液中の細胞成分と液
性成分の展開速度に大きな相違があること、そして、当
該展開支持体の液性成分は展開するが細胞成分は展開し
ない位置に判定部位を設けることにより、細胞成分にお
おわれる事なく金コロイドの集積を肉眼で観察が可能と
なり全血試料そのままでも免疫クロマト試験方法が行な
えることを見出し、本発明を完成した。

【０００８】すなわち、本発明の第一の目的は、金コロ
イドを結合した抗原または抗体を利用し、検体を展開支
持体に展開させた後、金コロイドの集積の有無により抗
原抗体反応の生成を判定する免疫クロマト法において、
細胞成分と液性成分の展開速度が相違する展開支持体を
用いたことを特徴とする免疫クロマト法を提供するもの
である。また、本発明の第二の目的は、上記方法の実施
に利用することのできる試験具を提供するものである。

【０００９】本発明において使用される細胞成分と液性
成分の展開速度が相違する展開支持体の例としては、一
般にインスタント薄層クロマトグラフィーとして知られ
るガラス繊維にシリカゲルを含浸させて調製された展開
支持体や有機バインディング処理を施したガラス繊維濾
紙により調製された展開支持体が挙げられ、これらの具
体例としては、インスタント薄層クロマトグラフィー
（ＩＴＬＣ；ゲルマンサイエンス社製）やガラス繊維濾
紙ＧＳ−２５（アドバンテックトーヨー社製）として市
販されているもの等が挙げられる。

【００１０】また、本発明で用いる金コロイド試薬は既
に免疫クロマト試験方法で採用されているものを利用す
ることができる。 この金コロイド試薬の調製は、市販
されている金コロイドに、抗体または抗原を吸着させれ
ば良い。

【００１１】展開支持体に対する抗原または抗体の固定
は、抗原または抗体溶液をスポットし、非特異的に吸着
させれば良い。

【００１２】本発明において、抗原または抗体溶液をス
ポットした位置（以下、「スポット位置」という）は、
細胞成分が展開する位置であっては、肉眼による金コロ
イド試薬の凝集の判別が困難になり、意味がないので、
スポット位置は、測定すべき物質と金コロイド試薬の複
合体は通過し、かつ、細胞成分が到達しない位置とする
ことが必要である。 また、展開支持体に展開された金
コロイド試薬は、その全部が展開支持体の上端まで上昇
するのでなく、展開支持体上に均一に分散されながら上
昇していくのであるから、スポット位置をより多くの金
コロイドが通過するなるべく低い位置（細胞成分の上昇
する最上端の近く）とする方が感度が良く、好ましい。

【００１３】この位置決定に関連する要素としては、サ
ンプル量（展開液量）、サンプルの種類（ヘマトクリッ
ト値、種差等）、金コロイド試薬液量、展開支持体の幅
と厚さ、測定時間等が挙げられ、好ましくは実験的に定
められるべきである。

【００１４】なお、本発明方法においては、測定試料中
の抗原または抗体の非特異的吸着を少なくするため、抗
原または抗体溶液をスポットした展開支持体全体を、例
えば、牛血清アルブミン、脱脂粉乳、カゼイン等でブロ
ッキングすることが好ましい。

【００１５】本発明方法で用いる展開支持体は、破損し
やすいので、その実施に当っては図１に示すような試験
具を用いることが好ましい。

【００１６】同図中、Ａは展開支持体を、Ｂはそれを保
護する鞘を、Ｃは展開支持体を鞘に収納した状態（本発
明試験具）を示す。また、図１中、１はスポット位置
を、２は展開支持体を、３は鞘をそれぞれ示す。本図中
の鞘は、斜めの切れ込みをいれ、検体の展開（吸収）を
よくしているが、このような形状に限らず、隙間を形成
したり１個ないし複数個の穴を設け検体の展開を良くし
ても良い。

【００１７】図２は、本発明試験具の断面を示す図面で
ある。 鞘３の断面はほぼレモン形をしているので、中
に入っている展開支持体を有効に保護するとともに展開
支持体の平面部での意図しない毛管現象を防ぐことが可
能となる。

【００１８】図３は、本発明の試験具の使用状態を示す
図面である。 図中、５は試験管であり、その中に所定
量の全血試料と金コロイド試薬の混合検体６を取り、こ
れに本発明試験具４を入れ、検体を下端から展開させ
る。

【００１９】図４は、上記の本発明試験具を用いて行う
免疫クロマト法を模式的に示した図面である。

【００２０】同図中、Ａは、被検試料中の抗体を測定す
る場合を示したものである。 この図の場合は、被検試
料中に存在する測定すべき抗体８（被検抗体）に対する
抗原９をまず取得し、これの一部は金コロイドと結合さ
せ、他の１部は展開支持体２にスポットし固定する。
次いで、金コロイドと結合した抗原９（金コロイド試
薬）を被検試料中に加えて検液とすると、この系内で被
検抗体８と金コロイド試薬が反応し、金コロイド-抗体
複合体が形成される。 更に、この検液を本発明試験具
の下端につけると、検液は展開支持体中を展開するが、
前記の金コロイド-抗体複合体はスポット位置に到達し
たとき、更に複合体中の抗体８が固定された抗原９と結
合するので、ここで展開を止める。 そして、検体中に
一定量以上の抗体８が存在した場合、スポット位置に金
コロイドが蓄積し、肉眼でも判別できるようになり、被
検試料中の抗体８の存在が示される。

【００２１】また、図中Ｂは、被検試料中の抗原を測定
する場合を示したものである。 この図の場合は、被検
試料中に存在する抗原１０（被検抗原）に対する抗体１
１をまず取得し、以下、上記と同様にすれば、被検試料
中の被検抗原が測定できる。

【００２２】本発明方法によれば、血液中に存在する各
種の成分、例えば、ホルモン、酵素、免疫グロブリン
（種々の抗原に対する抗体）、ビタミン類、リポ多糖
類、タンパク質および核酸、アミノ酸類、ポリペプチド
類、アルカロイド類、ステロイド類、アミノグルコシド
類、補体因子および血液凝固因子、上記以外の医薬代謝
物、中間代謝産物およびその誘導体とそれらのレセプタ
ーまたは結合物質等を全血中から検出、分析することが
可能である。

【００２３】

【発明の効果】本発明は、展開支持体として、細胞成分
と液性成分の展開速度が相違するものを選択使用してい
るため、免疫クロマト法を行うにあたり、細胞成分を分
離する必要がない。 従って、緊急を要する場合や、充
分な設備のない状況下においても容易に全血を用い、血
液中成分の分析をおこなうことができるので、各種の疾
患の診断に極めて有用である。

【００２４】

【実施例】次に実施例を挙げ、本発明を更に詳しく説明
するが、本発明はこれら実施例になんら制約されるもの
ではない。

【００２５】実 施 例 １ マウスイムノグロブリン結合金コロイドの調製： 粒径１５ｎｍの金コロイド溶液（ザイメッド社製）６０
０μｌに、０.２Ｍ炭酸カリウム溶液１１μｌを添加し
てｐＨ９.０とした。このｐＨ調製金コロイド溶液６１
１μｌに、マウスイムノグロブリン溶液（２.５ｍｇ／
ｍｌ、ザイメッド社製、０.０２Ｍリン酸緩衝液、ｐＨ
６.４、０.０２％アジ化ナトリウムを含む）を蒸留水で
０.１ｍｇ／ｍｌに調製した物を６０μｌ添加（必要量
の２倍量）した。

【００２６】この混合物を振盪撹拌後、安定化剤として
１０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ６.４、１％牛血清アルブ
ミン、０.０５％アジ化ナトリウムを含む）６００μｌ
を添加した。高速遠心機（クボタ６８００）にて１４５
００回転／分で６０分間遠心し、上澄みを除去した。沈
澱物を１０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ６.４、１％牛血清
アルブミン、０.０５％アジ化ナトリウムを含む）１０
０μｌに再浮上させ、マウスイムノグロブリン結合金コ
ロイドを得た。

【００２７】実 施 例 ２ 本発明試験具の調製：インスタント薄層クロマトグラフ
ィー（２００ｍｍ×５０ｍｍ：ゲルマンサイエンス社
製）上に１１０ｍｍ×５ｍｍの切取線を書き、１０キッ
ト分を同時作製した。一端から６ｃｍの所にマウスイム
ノグロブリン（２.５ｍｇ／ｍｌ、ザイメッド社製、０.
０２Ｍリン酸緩衝液、ｐＨ６.４、０.０２％アジ化ナト
リウムを含む）をピペッターを用いて３μｌ滴下した。
滴下したマウスイムノグロブリンが乾燥する前にこれ
を０.０２Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ６.４、１％牛血清アル
ブミン、４％サッカロースを含む）中に約３０分間浸し
た。

【００２８】蒸留水中で３回洗浄後、乾燥器（約４０
℃）中にて２時間ほど乾燥させた後、インスタント薄層
クロマトグラフィーを１１０ｍｍ×５ｍｍに切り離し
た。同時に直径４ｍｍ、長さ１３０ｍｍの円筒状のポリ
エチレン製チューブをインスタント薄層クロマトグラフ
ィーのサイズに合せてその断面がほぼレモン型ないし紡
錘型になる鞘状に圧変した。尚、鞘は全血試料と接触す
る部分に切り込みが入れてあり、その部分を下端とし
た。 下から６ｃｍの所に抗体のコーティングポイント
がくる向きに展開用支持体を鞘中に装着し、本発明試験
具を調製した。

【００２９】実 施 例 ３ 細胞成分を含む全血試料を用いての家兎抗マウス抗体測
定試験：実施例１で調製したマウスイムノグロブリン結
合金コロイドと実施例２で調製した本発明試験具を用い
て、以下に示す方法により家兎抗マウス抗体の検出試験
を行った。

【００３０】（ 測定方法 ） 家兎（ニュージーランドホワイト種）耳介動脈より採取
した全血（ヘパリン処理）を用い、アフィニティー精製
された家兎抗マウス抗体溶液（１ｍｇ／ｍｌ、カッペル
社製、＃０６１１−００８２）を６０倍、２５０倍、１
０００倍に希釈して計３種類の被検試料を調製した。
また、家兎抗マウス抗体を添加しないものを対照試料と
した。

【００３１】ポリスチレン製チューブ（φ：１４ｍｍ、
Ｈ：７０ｍｍ）を４本用意し、それぞれに被検試料およ
び対照試料２００μｌを添加した。 続いて、これに実
施例１で調製したマウスイムノグロブリン結合金コロイ
ド２０μｌを添加し、軽く混和した。 実施例２で調製
した本発明試験具をチューブ内に立て、室温放置した。
約３０分放置後、金コロイドの凝集程度（紫色として
出現）を観察した。 この結果を表１に示す。

【００３２】（ 測定結果 ）

【００３３】上記試験においては、細胞成分は下端から
５ｃｍ、液性成分は１１ｃｍまで上昇し金コロイドの凝
集位置と細胞成分を区別でき、明確に判定できた。マウ
スイムノグロブリンのスポット位置は下端から６ｃｍの
所であり、その部分に金コロイドの凝集（紫色として出
現）を確認したものを陽性と判定した。

【図面の簡単な説明】

【図１】 本発明試験具の構成を示す図面。図中、Ａは
展開支持体を、Ｂはそれを保護する鞘を、Ｃは展開支持
体を鞘に収納した状態（本発明試験具）を示す。

【図２】 本発明試験具の断面を示す図面。

【図３】 本発明の試験具の使用状態を示す図面。

【図４】 本発明の免疫クロマト法の機構を模式的に示
した図面。

【符号の説明】

１ スポット位置 ７ 金コロイド ２ 展開支持体 ８ 抗体 ３ 鞘 ９ ８の抗原 ４ 本発明試験具 １０ 抗原 ５ 試験管 １１ １０に対する
抗体 ６ 検体 以 上

Claims (7)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 金コロイドを結合した抗原または抗体を
   利用し、検体を展開支持体に展開させた後、金コロイド
   の集積の有無により抗原抗体反応の生成を判定する免疫
   クロマト法において、細胞成分と液性成分の展開速度が
   相違する展開支持体を用いたことを特徴とする免疫クロ
   マト法。
2. 【請求項２】 測定すべき物質に対する抗体を結合した
   金コロイドを用い、展開支持体の適当な位置に測定すべ
   き物質に対する抗体を固定したことを特徴とする請求項
   第１項記載の免疫クロマト試験方法。
3. 【請求項３】 測定すべき抗体に対する抗原を結合した
   金コロイドを用い、展開支持体の適当な位置に測定すべ
   き抗体に対する抗原を固定したことを特徴とする請求項
   第１項記載の免疫クロマト試験方法。
4. 【請求項４】 被検試料が全血試料である請求項第１項
   記載の免疫クロマト試験方法。
5. 【請求項５】 細胞成分と液性成分の展開速度が相違す
   る展開支持体が、ガラス繊維にシリカゲルを含浸させて
   調製されたものである請求項第１項記載の免疫クロマト
   試験方法。
6. 【請求項６】 細胞成分と液性成分の展開速度が相違す
   る展開支持体が、有機バインディング処理を施したガラ
   ス繊維濾紙である請求項第１項記載の免疫クロマト試験
   方法。
7. 【請求項７】 細胞成分と液性成分の展開速度が相違す
   る展開支持体の適当な位置に測定すべき物質と抗原抗体
   反応を起こす抗体または抗原を固定し、当該展開支持体
   をその断面がほぼレモン型ないし紡錘型である鞘に収納
   してなる試験具。