JPH0696601B2 - 新規な多糖物質ｌｋ−１００及びその製造法並びに抗腫瘍剤 - Google Patents

Description

【発明の詳細な説明】 （産業上の利用分野） 本発明は新規な多糖物質LK−100とこれを有効成分とす
る抗腫瘍剤に関するものである。

（発明の背景及び従来技術） 従来、多糖物質の生理作用はきのこ類の多糖物質を中心
に数多く研究されているが、最近になって乳酸菌の産生
する多糖物質についても抗腫瘍作用が数例報告されてい
る（公開特許公報（Ａ）昭58−204001、Agric.Biol.Che
m.47（７）1623〜1625.1983）．発明者は、醗酵乳・乳
酸菌飲料の食餌効果の研究を進める中で、ある種の乳酸
桿菌が多糖物質を産生していることを見い出し、単離す
ることに成功した。本多糖物質LK−100は従来しられて
いない新規な多糖物質であることを確認し、その生理作
用を調べたところ顕著な抗腫瘍活性を有していることを
見い出し、本発明を完成したものである。

（発明の目的） 本発明の目的は、ラクトバチルス属に属する微生物の培
養物より新規な多糖物質LK−100を分離・採取すること
にある。

又、本発明の目的は新規な多糖物質LK−100を有効成分
とする抗腫瘍剤を提供することにある。

（発明の構成） ＜微生物＞ 本発明において用いる微生物は、新規な多糖物質LK−10
0生産能を有するものであり、ラクトバチルス属に属す
る菌種である。その一例として、ラクトバチルス・スピ
ーシーズ・グリコ1569（Lactobacillus sp.Glico1569）
は上記の特性を有し、本発明の多糖物質LK−100を有利
に生産するものであり、本発明に有効に利用し得るもの
である。前記ラクトバチルス・スピーシーズ・グリコ15
69（以下「1569株」という）は、工業技術院微生物工業
技術研究所へ寄託されており、その受託番号は、微工研
菌寄第8887号（FERM P−8887）である。

1569株は、次ぎの菌学的性質を有する。なお、菌学的性
質の試験及び分類は、バージェイズ マニュアル オブ
デターミネイティブ バクテリオロジィー８版（Berg
ey's Manual of Determinative Bacteriology 8th E
d,）及び光岡の方法（臨床検査、18,1163,1974）に従っ
た。

（１） 形態学的性質 MRS寒天平板上に、二酸化炭素置換した嫌気条件下で、
湿潤コロニーを形成する。グラム染色陽性の桿状菌で、
運動性、胞子形成能がない。

（２） 生理学的性質 カタラーゼの生成 − 牛乳からの酸生成 − 乳酸 DL 15℃における生育 ＋ 45℃における生育 − アルギニンからアンモニアの産生 ＋ グルコースからのガスの産生 ＋ グルコン酸からのガスの産生 ＋ 糖の資化性 アミグダリン − アラビノース ＋ ヒロビオース − エスクリン − フルクトース ＋ ガラクトース ＋ グルコース ＋ グルコン酸 ＋ ラクトース ＋ マルトース ＋ マンニトール − マンノース − メレジトース − メリビオース ＋ ラフィノース − ラムノース − リボース ＋ サリシン − ソルビトール − シュークロース − トレハロース − キシロース − 以上の微生物の菌学的諸性質を前記文献の分類方法に従
って検索するとラクトバチルス属（Lactobacillus）に
属する乳酸桿菌であった。

＜培養条件＞ 多糖物質LK−100は、LK−100生産菌を培養した後、培養
物の液体区分及び菌体区分から分離採取することができ
る。培養培地としては、乳酸菌用の培地であればどのよ
うな培地でもよいが、脱脂乳、ホエー等を含有する乳性
原料による培地が好ましい。培養条件として、二酸化炭
素置換下の嫌気培養が有利であるが、好気的な静置培養
でも充分培養可能である。培養温度は15〜35℃が好まし
い。また、培地のpHは6.0〜6.5の弱酸性が好ましい。培
養期間は好気培養か嫌気培養か、培地の組成、培養温度
等の諸条件により変動するが、一般的には３〜５日程度
でよく、培養終了後に目的の多糖物質LK−100は、培養
物中に蓄積されるのである。

＜分離、精製＞ 培養により、産生、蓄積されたLK−100は、次の処理工
程で分離、精製される。

多糖物質LK−100生産菌の培養物から、遠心分離に
より液体区分及び菌体区分が得られる。

液体区分にエチルアルコール、アセトン等の有機溶媒を
添加し、沈殿物を得る。一方、菌体区分は熱水抽出を行
い、次いで遠心分離にて抽出上澄液を得て、この上澄液
に有機溶媒を添加し、沈殿物を得る。このように液体区
分、菌体区分より得られた沈殿物を熱水にて再溶解さ
せ、同様にエチルアルコール、アセトン等の有機溶媒を
添加し、再沈殿させる。

再沈殿させた沈殿物質をイオン交換水（蒸留水でも
可）に溶解したのち、陰イオン交換樹脂を充填したカラ
ムに注加し、負荷する。更にイオン交換水をカラムに長
し、陰イオン交換樹脂に吸着されない通過液区分を回収
し、これを透折膜（ユニオンカーバイト社製）を用い
て、イオン交換水に対して透折する。透折内液を減圧下
で凍結乾燥したものが所望とする精製された、多糖物質
LK−100である。

かくして得られた多糖物質LK−100は以下のとおりの理
化学的性質を有する新規物質である。

＜LK−100の理化学的性質＞ 元素分折値 C: 38.46％ H: 6.35％ N: 0.04％ O: 55.15％ 分子量 セファロース2B（ファルマシア・ヘァインケミカルズ社
製）によるゲル濾過法にて測定した。カラムサイズ1.5
×95cm:流速0.3ml/min:フラクション1.5ml:試料3mgを負
荷：展開剤0.1モル塩化ナトリウム溶液の条件により本
物質はゲル粒子外部容積（Void Volume）に分画され
る。

比施光度 ［α▲］²⁵ _D▼＝＋72.5゜ （Ｃ＝0.5％） 融点 本物質は230℃付近から変色がはじまり、260℃付近で溶
解しはじめ、280℃付近で黒褐色に分解する。

赤外部吸収スペクトル（KBr法） 第１図に示す通りである。

溶剤に対する溶解度 水に可溶、メタノール、エタノール、アセトン、エーテ
ルに不溶。

呈色反応 i.モーリッシュ反応 ＋ ii.アンスロン反応 ＋ iii.システイン−硫酸反応 − iv.アニリン−塩酸反応 − v.カルバゾール−硫酸反応 − vi.エルソン−モルガン反応 − vii.ニンヒドリン反応 − 塩基性、酸性、中性の別 本物質の0.5％水溶液のpHは5.0付近である。

物質の色 本物質の凍結乾燥物は、白色繊維状である。

構成糖の種類及び組成比 試料3mgに0.5N硫酸1mlを加えて100℃にて14時間加水分
解し、炭酸バリウムで中和後濾過し、その瀘液に含まれ
る糖をアルジトールアセテートの形に変えた後、ガスク
ロマトグラフィーによって分析した。

ガスクロマトグラフィーの条件 カラム： ３％ Silar 10C on Uniport B （100〜200メッシュ）ガラスカラム （0.3×200cm） カラム温度： 200℃→220℃（２℃/min） キャリヤーガス： 窒素、50ml/min その結果グルコースとガラクトースが検出され、その比
率はグルコース：ガラクトース＝1:0.8であった。

本発明の制癌剤の製剤形態としては、例えば、注射剤、
点滴剤、錠剤、カプセル剤、顆粒剤、散剤あるいは坐剤
などがあげられる。それらの製剤の調整は、通常の方法
に従って行うことができる。又、当該技術分野で通常用
いられる補薬、例えば安定剤などを適宜配合したりある
いは皮膜を施していてもよい。

本発明の制癌剤の投与方法としては、例えば静脈内注
射、皮下注射、経口投与あるいは直腸投与などがあげら
れる。本発明の薬剤の投与量は、患者の年令、体重、疾
患の程度投与方法によっても異なるが、通常成人におい
て１日当りLK−100を0.1〜15g投与することが好まし
い。これらの用量を一度にあるいは適宜の回数に分けて
投薬を行う。又、LK−100を各種食品、特に醗酵乳、乳
酸菌飲料、医療食あるいは医薬品に添加してもよい。

以下、本発明を実施例、製剤例及び試験例によって更に
詳述する。

実施例 ＜LK−100の分離精製例＞ ホエー培地 ホエー 100ml （組 成） ペプトン 1.0g 肉エキス 1.0g 酵母エキス 0.5g ツゥイーン80 0.1ml リン酸二カリウム 0.2g 酢酸ナトリウム 0.5g クエン酸アンモニウム 0.2g 硫酸マグネシウム 0.02g 硫酸マンガン 0.005g pH 6.4g ホエー培地（組成）10に、多糖物質LK−100生産菌156
9株［微工研菌寄第8887号，（FERM P−8887）］を接種
し32℃にて４日間二酸化炭素下で静置培養し、培養終了
後pHを6.0に調節し、90℃にて30分間の加熱処理をし
た。この加熱処理で菌体に付着している多糖物質LK−10
0を培養液区分に抽出することができた。

加熱処理後、遠心分離（10,000rpm、15分）にて培養上
澄液9580mlを得た。この上澄液を分子量100万の限外濾
過膜（ミリポア社製）にて脱塩濃縮し、濃縮液300mlを
得た。この濃縮液にエチルアルコールを最終濃度として
45％（v/v）となる様に添加した。本操作により、沈殿
物質が認められる様になり、この沈殿物質を遠心分離
（10,000rpm、５分）にて回収し、沈殿物質1.18gを得
た。

この沈殿物質をイオン交換水に加熱溶解させ、不溶物質
を遠心分離（10,000rpm、15分）し除去した。本操作を
３回繰り返すことによって1.12gの粗精製多糖物質が得
られた。ここに得られた粗精製物をイオン交換水に加熱
溶解し、Cl−型に負荷したジエチルアミノエチルセファ
デックス（DEAE−Sephadex）を充填したカラムに注加し
た。イオン交換水を流し、DEAE−セファデックスに非吸
着性物質を含む通過液区分を回収した。

これを濃縮しイオン交換水に対して、透折膜を用いて10
℃にて３日間透折した。透折後、透折内液を減圧下で凍
結乾燥して白色繊維状の多糖物質LK−100の凍結乾燥標
品0.52gを得た。収率は52mg/培養液1000mlであった。

製剤例１（注射・点滴剤） LK−100 500mgを含有するように粉末ぶどう糖5gを加え
てバイヤルに無菌的に分配し、密封し、窒素、ヘリウム
等の不活性ガスを封入し、冷暗所に保存した。使用前に
滅菌生理食塩水100mlを添加して静脈内注射剤とした。

製剤例２（錠 剤） ［Ａ］ LK−100 25 ｇ 乳 糖 300 ｇ ヒドロキシプロピルセルロース 1.8g ステアリン酸マグネシウム 6.0g ［Ｂ］ 酢酸フタル酸セルロース 18g ヒドロキシプロピルメチルセルロースフタレート 18g ［Ａ］の成分を各々とり、よく混合した。それを直接に
加圧するか又は、更によく練合した後、押し出し型製粒
機のスクリーンを通して顆粒成型を行い、充分によく乾
燥したものを加圧して錠剤を製造した。

次に成型された錠剤によく溶解させた［Ｂ］の基剤を被
覆して腸溶剤錠剤500錠を得た。

製剤例３（顆粒剤） ［Ａ］ LK−100 50g 乳 糖 500g ［Ｂ］ ヒドロキシプロピルセルロース 20g エタノール 250g ［Ａ］の成分を各々とり、よく混合し、真空練合機に入
れて脱気する。次に窒素ガスで置換後［Ｂ］の成分を加
え充分ねり合わせる。これを押し出し型製粒機のスクリ
ーンを通して顆粒成型を行って顆粒剤510gを得た。

試験例１ ddY系６週齢の雄性マウスを用い、一群７匹で試験し
た。予めddY系雌性マウスで７日毎に移植、継代してい
るザルコーマ180（Sarcoma 180）をマウス腹水に移植
６日後に採取し、2.5×10⁷cells/mlの濃度になる様に滅
菌生理食塩水で稀釈し、その稀釈液0.2mlをマウスの肩
胛骨間に皮下注射した。

移植翌日より１日１回連続20日間、対照群には生理食塩
水を試験群には生理食塩水に溶解した実施例で得た多糖
物質LK−100を腹腔内に投与した。投与量は100mg/kg及
び250mg/kgの２段階とした。多糖物質LK−100最終投与
翌日に腫瘍を切除しその重量を測定した。腫瘍細胞増殖
抑制率は以下の式に従って求めた。

結果を表−１に示した。

試験例２ ddY系６週齢の雄性マウスを用い、一群７匹で試験し
た。予めddY系雌性マウスで７日毎に移植、継代してい
るザルコーマ180（Sarcoma 180）をマウス腹水に移植
６日後に採取し、2.5×10⁷cells/mlの濃度になる様に滅
菌生理食遠水で稀釈し、その稀釈液0.2mlをマウスの肩
胛骨間に皮下注射した。

移植翌日より、１日１回連続20日間、試験群には3.0％
の濃度に生理食塩水に溶解した多糖物質LK−100溶液0.1
mlを、ゾンデにより直接胃へ強制的に投与した。同様の
方法で対照群には生理食塩水0.1mlを投与した。多糖物
質LK−100最終投与翌日に腫瘍を切除し、その重量を測
定した。腫瘍細胞増殖抑制率は試験例１の式に従って求
めた。

結果を表−２に示した。

（発明の効果） 本発明の多糖物質LK−100は優れた抗腫瘍活性を示す。
又、多糖物質LK−100は毒性が極めて低く、ヒトや動物
に副作用のない抗腫瘍剤を提供するものである。

【図面の簡単な説明】

第１図は、本発明の多糖物質LK−100の赤外部吸収スペ
クトル図を示す図面である。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (72)発明者 長沼 清 東京都昭島市大神町967−１ 暁寮 審査官 弘實 謙二

Claims (6)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】次の理化学的性質を有する多糖物質LK−10
   0 元素分析値 Ｃ ： 38.46％ Ｈ ： 6.35％ Ｎ ： 0.04％ Ｏ ： 55.15％ 分子量 高分子のため測定できない。 比施光度 ［α▲］²⁵ _D▼＋72.5゜ （Ｃ＝0.5％） 融点 本物質は230℃付近から変色がはじまり、260℃付近で溶
   解しはじめ、280℃付近で黒褐色に分解する。 赤外部吸収スペクトル（KBr） 第１図に示す通りである。 溶剤に対する溶解度 水に可溶、メタノール、エタノール、アセトン、エーテ
   ルに不溶。 呈色反応 i.モーリッシュ反応 ＋ ii.アンスロン反応 ＋ iii.システイン−硫黄反応 − iv.アニリン−塩酸反応 − v.カルバゾール−硫酸反応 − vi.エルソン−モルガン反応 − vii.ニンヒドリン反応 − 塩基性、酸性、中性の別 本物質の0.5％水溶液のpHは、5.0付近である。 物質の色 本物質の凍結乾燥物は、白色繊維状である。 構成糖の種類及び組成比 グルコース：ガラクトース＝1:0.8である。
2. 【請求項２】ラクトバチルス（Lactobacillus）属に属
   する多糖物質LK−100生産菌を培養し、その培養物より
   多糖物質LK−100を分離・採取することを特徴とする多
   糖物質LK−100の製造法。
3. 【請求項３】ラクトバチルス属に属する多糖物質LK−10
   0生産菌が、ラクトバチルス・スピーシーズ・グリコ156
   9（Lactobacillus sp.Glico 1569）である特許請求の
   範囲第２項記載の製造法。
4. 【請求項４】多糖物質LK−100を有効成分とする抗腫瘍
   剤。
5. 【請求項５】経口投与形態である特許請求範囲第４項記
   載の抗腫瘍剤。
6. 【請求項６】非経口投与形態である特許請求範囲第４項
   記載の抗腫瘍剤。