JPS6361002A - 新規な多糖物質ｌｋ−１００及びその製造法並びに抗腫瘍剤 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 （産業上の利用分野） 本発明は新規な多糖物質ＬＫ−１００とこれを有効成分
とする抗腫瘍剤に関するしのである。

（発明の背景及び従来技術） 従来、多糖物質の生理作用はきのこ類の多糖物質を中心
に数多く研究されているが、最近になって乳酸菌の産生
する多糖物質についても抗腫瘍作用が数例報告されてい
る（公開特許公報（Ａ）昭５８−２０４００１、＾ｇｒ
ｉｃ、Ｂｉｏ１．ｃｈｅｍ、　４７（７）１６２３〜１
６２５、１９８３）、発明者は、醗酵孔・乳酸菌飲料の
食餌効果の研究を進める中で、ある種の乳酸桿菌が多糖
物質を産生じていることを見い出し、単離することに成
功した。本多糖物質ＬＫ−１００は従来しられていない
新規な多糖物質であることを確認し、その生理作用を調
べたところ顕著な抗腫瘍活性を有していることを見い出
し、本発明を完成したものである。

（発明の目的） 本発明の目的は、ラクトバチルス属に属する微生物の培
養物より新規な多糖物質ＬＫ−１００を分離・採取する
ことにある。

又、本発明の目的は新規な多糖物質ＬＫ−１００を有効
成分とする抗腫瘍剤を提供ずろことにある。

（発明の構成） 〈微生物〉 本発明において用いる微生物は、新規な多糖物質　ＬＫ
−１００生産能を佇するものであり、ラクトバチルス属
に属する菌種である。その−例として、ラクトバチルス
・スピーシーズ・グリコ１５６９　（Ｌａｃｔｏｂａｃ
ｉｌｌｕｓ　　ｓｐ、Ｇ１１ｃｏ１５６９）は上記の特
性を有し、本発明の多糖物質ＬＫ−１００を有利に生産
するものであり、本発明に有効に利用し得るものである
。

前記ラクトバチルス・スピーシーズ・グリコ１５６９（
以下ｒ１５６９株」という）は、工業技術院微生物工業
技術研究所へ寄託されており、その受託番号は、微工研
菌寄第８８８７号（ＦＥＲＭ　Ｐ−８８８７）である。

１５６９株は、次ぎの菌学的性質を有する。なお、菌学
的性質の試験及び分類は、パージエイズ　マニュアル　
オブ　デターミネイティブ　バクテリオウジイー８版（
Ｂｅｒｇｅｙ’ｓ　Ｍａｎｕａｌｏｒ　Ｄｅｔｅｒｍｉ
ｎａｔｉｖｅ　Ｂａｃｔｅｒｔｏ＋ｏｇｙ　８ｔｈ　Ｅ
ｄ、）及び売国の方法（臨床検査、１８．１１６３．１
９７４）に従った。

（１）形態学的性質 ＭｒｔＳ寒天平板上に、二酸化炭素置換した嫌気条件下
で、湿潤コロニニを形成する。ダラム染色陽性の桿状間
で、運動性、胞子形成能がない。

（２）生理学的性質 グルコースからのガスの産生　　　　　十グルコン酸か
らのガスの産生　　　　　十糖の資化性 アミグダリン　　　　　　　　　　　−アラビノース　
　　　　　　　　　　＋セミビオース　　　　　　　　
　　　　−エスクリン　　　　　　　　　　　　　−フ
ルクトース　　　　　　　　　　　　＋ガラクトース　
　　　　　　　　　　＋グルコース　　　　　　　　　
　　　　＋グルコン酸　　　　　　　　　　　　　十ラ
クトース　　　　　　　　　　　　＋マルトース　　　
　　　　　　　　　＋マンニトール　　　　　　　　　
　− マンノース　　　　　　　　　　　　　−フルクトース
　　　　　　　　　　　−メリヒオース　　　　　　　
　　　　＋ラフィノース　　　　　　　　　　　−ラム
ノース　　　　　　　　　　　　　−リボース　　　　
　　　　　　　　　＋サリンン　　　　　　　　　　　
　　−ソルビトール　　　　　　　　　　　−ンユーク
ロース　　　　　　　　　　−トレハロース　　　　　
　　　　　　　−キシロース　　　　　　　　　　　　
　−以上の微生物の菌学的諸性質を前記文献の分類方法
に従って検索するとラクトバチルス属（Ｌａｃｔｏｂａ
ｃｉｌｌａｓ）に属する乳酸Ｉ？閑であった。

〈培養条件〉 多糖物質ＬＫ−１００は、ＬＫ−１００生産菌を培養し
た後、培養物の液体区分及び菌体区分から分離採取する
ことができる。培養培地としては、乳酸菌用の培地であ
ればどのような培地でもよいが、脱脂乳、ホエー等を含
有する乳性原料による培地が好ましい。培養条件として
、二酸化炭素置換下の嫌気培養が有利であるが、好気的
な静置培養でも充分培養可能である。培養温度は１５〜
３５℃が好ましい。

また、培地の１）ＩＩは６．０〜６．５の弱酸性が好ま
しい。培養期間は好気培養か嬶気培養か、培地の組成、
培養温度等の諸条件により変動するが、一般的には３〜
５日程度でよく、培養終了後に目的の多糖物質ＬＫ−１
００は、培養物中に蓄積されるのである。

（分離、精製〉 培養により、産生、蓄積されたＬＫ−１００は、次の処
理工程で分離、精製される。

■　多糖物質ＬＫ−１００生産閑の培養物から、遠心分
離により液体区分及び菌体区分が得られる。

液体区分にエチルアルコール、アセトン等の有機溶媒を
添加し、沈殿物を得る。一方、菌体区分は熱水抽出を行
い、次いで遠心分離にて抽出上澄液を得て、この上澄液
に有機溶媒を添加し、沈殿物を得る。このように液体区
分、菌体区分より得られた沈殿物を熱水にて再溶解さ仕
、同様にエチルアルコール、アセトン等の有機溶媒を添
加し、再沈殿させる。

■　再沈殿させた沈殿物質吃イオン交換水（蒸留水でも
可）に溶解したのち、陰イオン交換樹脂を充用したカラ
ムに圧加し、負荷する。更にイオン交換水をカラムに流
し、陰イオン交換樹脂に吸着されない通過液区分を回収
し、これを透析膜（ユニオンカーバイト社製）を用いて
、イオン交換水に対して透析する。透析内液を減圧下で
凍結乾燥したものが所望とする精製された、多糖物質　
ＬＫ−１００である。

かくして得られた多糖物質ＬＫ−１００は以下のとおり
の理化学的性質を存する新規物質である。

＜ＬＫ−１００の理化学的性質〉 ■　元素分析値 Ｃ・　３８．４６％ Ｈ：　　　６．３５％ Ｎ：　　　０．０４％ ０：　　５５．１５％ ■　分子量 セファロース２Ｂ（ファルマンア・ファインケミカルズ
社製）によるゲル濾過法にて測定した。カラムサイズ１
５Ｘ９５ｃｍ　：流速０．３ｍＣ／ａ＋ｉｎ　：フラク
ンヨン１．５ｍＮ　＋試料３ｍｇを負荷：展開剤０．１
モル塩化ナトリウム溶液の条件により本物質はゲル粒子
外部容積（Ｖｏｉｄ　　Ｖｏｌｕｍｅ）に分画される。

０　比施光度 〔α君−−７２５°　（Ｃ＝０．５％）■融点 本物質は２３０°Ｃ付近から変色がはじまり、２６０°
Ｃ付近で溶解しはじめ、２８０°Ｃ付近で黒褐色に分解
する。

■　赤外部吸収スペクトル（ＫＢｒ法）第１図に示す通
りである。

■　溶剤に対する溶解度 水に町名、メタノール、エタノール、アセトン、エーテ
ルに不溶。

■　呈色反応 １、モーリッンユ反応　　　　　　　　　　十１１　　
アンスロン反応　　　　　　　　　　　モ…　ノステイ
ノ□硫酸反応　　　　　　　−１ｖ　　アニリン□塩酸
反応　　　　　　　　−■　カルバゾール−硫酸反応　
　　　　　−ｖｊ　　エルソンーモルガン反応　　　　
　　−〜１１　　ニンヒドリン反応　　　　　　　　　
　−■　塩基性、酸性、中性の別 本物質の０．５％水溶液のＩ）＋１は５０付近である。

■　物質の色 本物質の凍結乾燥物は、白色繊維状である。

［株］　構成糖の種類及び組成比 試料３ｍｇに０．５Ｎ硫酸１ｍｃを加えて１００℃にて
１４時間加水分解し、炭酸バリウムで中和後濾過し、そ
の＋８．＆に含まれる糖をアルジトールアセテートの形
に変えた後、ガスクロマトグラフィーによって分析した
。

ガスクロマトグラフィーの条件 カラム＝　３％　５ｉｌａｒ　　ＩＯｃ　　ｏｎ　　Ｕ
ｎｉｐｏｒｔ　Ｂ（１００〜２００メツツユ）ガラスカ
ラム（０，３ｘ２００ｃｍ） カラム温度：２００℃→２２０℃（２℃／ｍ１ｎ）キャ
リヤーガス・　　窒素、５０ｍＣ／ｍｉｎその結果　グ
ルコースとガラクトースが検出され、その比率はグルコ
ースガラクトース−１０，８であった。

本発明の制癌剤の製剤形態としては、例えば、注射剤、
点滴剤、錠剤、カプセル剤、顆粒剤、散剤あるいは坐剤
などがあげられる。それらの製剤の調整は、通常の方法
に従って行うことができる。又、当該技術分野で通常用
いられる補薬、←ｊえば安定剤などを適宜配合したりあ
るいは皮膜を施していてもよい。

本発明の制癌剤の投与方法としては、例えば静脈内注射
、皮下注射、経口投与あるいは直腸投与などがあげられ
る。

本発明の薬剤の投与量は、但者の年令、体重、疾屯の程
度投与方法によっても異なるが、通常成人において１日
当りＬＫ−１００を０．１〜１５ｇ投与することか好ま
しい。これらの用量を一度にあるいは適宜の回数に分け
て投薬を行う。

又、ＬＫ−１００を各種食品、特に醗酵孔、乳酸菌飲料
、医療食あるいは医薬品に添加してもよい。

以下、本発明を実施例、製剤例及び試験例によって更に
詳述する。

実施例 〈ＬＫ−１００の分離精製例〉ホ エー培地　　ホエー　　　　　　　　　　　　１００ｍ
ジ（組　成）　　　ペプトン　　　　　　　　　　　１
．０ｇ肉エキス　　　　　　　　　　　１．０ｇ酵母エ
キス　　　　　　　　　　０．５ｇツウイーン８０　　
　　　　　　０．１ｍρリン酸二カリウム　　　　　　
　０２ｇ酢酸ナトリウム　　　　　　　　０．５ｇクエ
ン酸アンモニウム　　　　　０．２ｇ硫酸マグネンウム
　　　　　　　００２ｇ随酸マンガン　　　　　　　　
　０．００５ｇｐＨ６，４ｇ ホエー培地（組成’）　ｌｏＱに、多糖物質ＬＫ−１０
０生産菌１５６９株［微工研閑寄第８８８７号、（Ｆ　
ＥｆｌＭ　Ｐ　　８８８７）３をｊり種し３２°Ｃにて
４０間二酸化炭素下て静置培養し、培養終了後ｐＨを６
．０に凋節し、９０′Ｃにて３０分間の加熱処理をした
。この加熱処理で菌体に付着している多糖物質ＬＫ−１
ｏｏを培養液区分に抽出することができた。

加熱処理後、遠心分離（ｉｏ、ｏｏｏｒｐｍ、１５分）
にて培養上澄液９５８０ｍＱを得た。この上澄液を分子
量１００万の限外濾過膜（ミリボア社製）にて脱塩濃縮
し、濃縮液３００ｍＱを得た。この濃縮液にエヂルアル
コールを最終濃度として４５％（Ｖ／Ｖ）となる様に添
加した。本浄作により、沈殿物質が認められろ様になり
、この沈殿物質を遠心分１（１０，ＯＯＯｒｐｍ、５分
）にて回収し、沈殿物質］、１８ｇを得た。

この沈殿物質をイオン交換水に加熱溶解させ、不溶物質
を遠心分離（ｔｏ、０００ｒｐｍ、１５分）し除去した
。本操作を３回繰り返すことによって１．１２ｇの粗精
製多糖物質が得られた。ここに得られた粗精製物をイオ
ン交換水に加熱溶解し、ＣＩ−型に負荷したジエチル・
アミノエチルセファデックス（Ｄ　Ｅ　Ａ　Ｅ　−Ｓ　
ｅｐｈａｄｅｘ）を充填したカラムに圧加した。イオン
交換水を流し、ＤＥＡＥ−セファデックスに非吸着性物
質を含む通過液区分を回収した。

これを濃縮しイオン交換水に対して、透析膜を用いて１
０℃にて３日間透析した。透析後、透析内液を減圧下で
凍結乾燥して白色繊維状の多糖物質ＬＫ−１００の凍結
乾燥標品０．５２ｇを得た。

収率は５２ｍｇ／培養液１０００耐であった。

製剤例１（注射・点滴剤） ＬＫ　−１００５００ｍｇを含有するように粉末ぶどう
糖５ｇを加えてバイヤルに無菌的に分配し、密封し、窒
素、ヘリウム等の不活性ガスを封入し、冷暗所に保存し
た。使用前に滅菌生理食塩水ＩＱＯ＋ｎＱを添加して静
脈内注射剤とした。

製剤例２（錠　剤） ［Ａコ ＬＫ−１００２５ｇ 乳糖　　　　　　　　　　　３００ｇ ヒドロキノプロピルセルロース　　　　　　　　　　　
　　１．８ｇステアリン酸マグネシウム　　　　　　　
　　　　　　　　６．０ｇ［Ｂ］ 酢酸フタル酸セルロース　　　　　　　　　　　　　　
　　１８ｇヒドロキシプロピルメチルセルロースフタレ
ート　　　　　１８ｇ［、へコの成分を各々とり、よく
、混合した。それを直接に加圧するか又は、更によく練
合した後、押し出し型製粒機のスクリーンを通して顆粒
成型を行い、充分によく乾燥したものを加圧して錠剤を
製造した。

次に成型された錠剤によく溶解させた［Ｂ１の基剤を被
覆して腸溶性錠剤５００錠を得た。

製剤例３（顆粒剤） ［Ａ］ ＬＫ−１００５０ｇ 乳糖　　　　　　　　　　　　５００ｇ［Ｂ］ ヒドロキシプロピルセルロース　　　　　　　　　　　
　　　２０ｇエタノール　　　　　　　　　　　　　　
　　　　　　　　　　２５０ｇ［Ａｉの成分を各々とり
、よく混合し、真空練合機に入れて脱気する。次に窒素
ガスで置換後［＋３］の成分を加え充分ねり合わせろ。

これを押し出し型製粒機のスクリーンを通して顆粒成型
を行って顆粒剤５１０ｇを得た。

試験例！ ｄｄＹ系６週齢の雄性マウスを用い、−群７匹で試験し
た。予めｄｄＹ系雌性マウスで７日毎に移植、継代して
いるザルコーマｔｇｏ　（Ｓａｒｃｏｍａ　１８０）を
マウス腹水に移植６日後に採取し、２．５Ｘ　１０７ｃ
ｅｌ　Ｉｓ／ｍσの濃度になる様に滅菌生理食塩水で稀
釈し、その稀釈液０．２＋ｎＱをマウスの肩胛骨間に皮
下注射した。

移植翌日より１日１回連続２０日間、対照群には生理食
塩水を試験群には生理食塩水に溶解した実施例で得た多
糖物質ＬＫ−１００を腹腔内に投与した。投与量は１０
０ｍｇ／ｋｇ及び２５０ｍｇ／ｋｇの２段階とした。多
糖物質ＬＫ−１００最終投与翌日に腫瘍を切除しその重
量を測定した。腫瘍細胞増殖抑制率は以下の式に従って
求めた。

（対照群平均腫瘍重量） 結果を表−１に示した。

表−１ 試験例２ ｄｄＹ系６ｉ１！齢の雄性マウスを用い、−群７匹で試
験した。

予めｄｄＹ系雌性マウスで７日毎に移植、継代している
ザルコ−ｖ１８０　（Ｓａｒｃｏｍａ　１８０）をマウ
ス腹水に移植６日後に採取し、２．５Ｘ　１０’ｃｅｌ
ｌｓ／ｍ１２の濃度になる槌に滅菌生理食塩水で稀釈し
、その稀釈液０．２ｍ１２をマウスの肩胛骨間に皮下注
射した。

移植翌日より、１日１回連続２０日間、試験群には３．
０％の４度に生理食塩水に溶解した多糖物質ＬＫ−１０
０溶液０．１ｍ１２を、ゾンデにより直接胃へ強制的に
投与した。同様の方法で対照群には生理食塩水０．１ｍ
１２を投与した。多糖物質ＬＫ−１００最終投与翌日に
腫瘍を切除し、その重量を測定した。腫瘍細胞増殖抑制
率は試験例１の式に従って求めた。

結果を表−２に示した。

表−２ （発明の効果） 本発明の多糖物質ＬＫ−１００は優れた抗腫瘍活性を示
す。

又、多糖物ｆｆＬＫ−１００は毒性が極めて低（、ヒト
や動物に副作用のない抗腫瘍剤を提供するものである。

【図面の簡単な説明】

第１図は、本発明の多糖物質ＬＫ−１００の赤外部吸収
スペクトル図を示す図面である。 特許出願人　　グリコ協同乳業株式会社理化学研究所

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １、次の理化学的性質を有する多糖物質ＬＫ−１００（
   １）元素分析値 Ｃ：３８．４６％ Ｈ：６．３５％ Ｎ：０．０４％ Ｏ：５５．１５％ （２）分子量 高分子物質のため測定できない。 （３）比施光度 〔α〕＾２＾５＿Ｄ＝＋７２．５゜（Ｃ＝０．５％）（
   ４）融点 本物質は２３０℃付近から変色がはじまり、２６０℃付
   近で溶解しはじめ、２８０℃付近で黒褐色に分解する。 （５）赤外部吸収スペクトル（ＫＢｒ法） 第１図に示す通りである。 （６）溶剤に対する溶解度 水に可溶、メタノール、エタノール、アセトン、エーテ
   ルに不溶。 （７）呈色反応 ｉ、モーリッシュ反応　＋ ｉｉ、アンスロン反応　＋ ｉｉｉ、システイン−硫酸反応　− ｉｖ、アニリン−塩酸反応　− ｖ、カルバゾール−硫酸反応　− ｖｉ、エルソン−モルガン反応　− ｖｉｉ、ニンヒドリン反応　− （８）塩基性、酸性、中性の別 本物質の０．５％水溶液のｐＨは、５．０付近である。 （９）物質の色 本物質の凍結乾燥物は、白色繊維状である。 （１０）構成糖の種類及び組成比 グルコース：ガラクトース＝１：０．８である。 ２、ラクトバチルス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ）属
   に属する多糖物質ＬＫ−１００生産菌を培養し、その培
   養物より多糖物質ＬＫ−１００を分離・採取することを
   特徴とする多糖物質ＬＫ−１００の製造法。 ３、ラクトバチルス属に属する多糖物質ＬＫ−１００生
   産菌が、ラクトバチルス・スピーシーズ・グリコ１５６
   ９（Ｌａｃｔｏｂａｃｉ−ｌｌｕｓ　ｓｐ．Ｇｌｉｃｏ
   １５６９）である特許請求の範囲第２項記載の製造法。 ４、特許請求の範囲第１項記載の多糖物質ＬＫ−１００
   を有効成分とする抗腫瘍剤。 ５、経口投与形態である特許請求範囲第４項記載の抗腫
   瘍剤。 ６、非経口投与形態である特許請求範囲第４項記載の抗
   腫瘍剤。