JPH069684A

JPH069684A - グリコシル−ホスファチジルイノシトールタンパク質およびコラン酸誘導体を含有する複合体、それらの調製方法およびそれらの使用

Info

Publication number: JPH069684A
Application number: JP5037622A
Authority: JP
Inventors: Stefan Dr Muellner; シユテフアン・ミユルナー; Guenter Mueller; ギユンター・ミユラー
Original assignee: Hoechst AG
Current assignee: Hoechst AG
Priority date: 1992-02-29
Filing date: 1993-02-26
Publication date: 1994-01-18
Anticipated expiration: 2017-12-16
Also published as: DE59310171D1; JP3356478B2; CA2090530A1; EP0559064A2; ES2159283T3; EP0559064B1; US5268272A; PT559064E; DK0559064T3; ATE201442T1; EP0559064A3; GR3036120T3

Abstract

(57)【要約】【構成】少なくとも一種のグリコシル−ホスファチジ
ルイノシトールタンパク質および少なくとも一種の式Ｉ【化１】（式中Ｒ¹は−ＮＨ−ＣＨ₂−ＣＨ₂−ＳＯ₃または−ＮＨ
−ＣＨ₂−ＣＯＯＨであり、Ｒ²は−ＮＲ³Ｒ⁴または−Ｏ
Ｒ⁵であり、Ｒ³、Ｒ⁴またはＲ⁵は水素原子、（Ｃ₁〜
Ｃ₅）−アルキル、（Ｃ₃〜Ｃ₆）−シクロアルキル、置
換アセチル、ハロゲン、スクシニル、置換ベンジルまた
は置換ベンゾイルである。）で示されるコラン酸誘導体
を含有する水溶性の複合体に関する。【効果】本複合体は、酵素試験におよび化学反応助剤
として適している。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】ポリペプチド鎖の一以上のセクションによ
って脂質二重層に包埋された完全体膜タンパク質は概し
て非水溶性であり、また可溶化剤、いわゆる洗剤によっ
て構造を保持しつつ水溶性型に転化され得るにすぎな
い。

【０００２】多くの可能性としての洗剤の中にコラン酸
誘導体も知られており（ＤＥ３６２３７４７）、これ
により一部の膜タンパク質を水溶性型に変えることがで
きる。さらに、これらのコラン酸誘導体が好ましくは原
形質膜(plasma membranes)からのタンパク質を水溶性型
に変える（可溶化する）ことも知られている。これまで
特定の膜タンパク質に対する選択性は知られてしない。

【０００３】従来より、グリコシル−ホスファチジルイ
ノシトールアンカー(anchor)により原形質膜に共有結合
的に結合した一群の膜タンパク質が知られている(G. A.
M.Cross(1987) Cell 48, pp. 179〜181；M. G. Low（1
987) Biochem. J. 244, 1〜13)。これらの膜タンパク
質、例えば機能型のアルカリ性ホスファターゼの可溶化
はこれまで、プロテアーゼ例えばトリプシンまたはパパ
インによる処理により、あるいは細菌性ホスホリパーゼ
−Ｃによる放出の後で達成されるにすぎなかった(I. F.
Thomposon et al. (1987) Biochem. Biophys. Res. Co
mmun. 145, 118〜125)。しかしこの場合、膜タンパク質
の親水性部分だけが得られるにすぎない。しかしなが
ら、構造および機能研究には完全な膜アンカーを有する
両親媒性型が存在した方がよい。グリコシル−ホスファ
チジルイノシトールアンカーを有する膜タンパク質（Ｇ
ＰＩタンパク質）は慣用の洗剤による場合、他の膜タン
パク質と共にのみ可溶化され得る。このためｎ−ブタノ
ールも抽出によく用いられる(A. S. Malik および M.
G. Low(1986) Biochem. J. 240, pp. 519〜527)。しか
しながら、この抽出方式では、これら膜タンパク質構造
のもとの空間構造がしばしば失われる。このことは、例
えば、ＧＰＩ−特異的ホスホリパーゼによる分解に対す
るＧＰＩ−膜アンカーのアクセス能の低下という形で現
れる。

【０００４】今般、ＧＰＩタンパク質をコラン酸誘導体
を用いて細胞膜から水溶性型に穏やかに変えればそれら
はもとの空間構造およびそれらの活性および機能を本質
的に保持することを見出した。このようにして得られた
これらの水溶性複合体はホスホリパーゼにより選択的に
かつ高収率で、ホスホイノシトール−グリカン−タンパ
ク質部とジアシルグリセロールとに分解することができ
る。さらに、グリコシル−ホスファチジルイノシトール
タンパク質（ＧＰＩタンパク質）はコラン酸誘導体を用
いて他の膜タンパク質から選択的に分離することができ
る。

【０００５】従って本発明は、少なくとも一つのグリコ
シル−ホスファチジルイノシトールタンパク質と少なく
とも一つのコラン酸誘導体を含有する水溶性複合体に関
する。

【０００６】本発明による水溶性複合体は、１００,０
００×重力加速度（ｇ）よりも高くして３０分間遠心分
離器で回転した場合にのみ中性pHの水溶液中で沈降性凝
集物を形成するという性質を有する。

【０００７】コラン酸誘導体は、式Ｉ

【化２】〔式中、記号Ｒ¹およびＲ²は次の意味を有する。

【０００８】Ｒ¹は次のとおりである：ａ） −ＮＨ−ＣＨ₂−ＣＨ₂−ＳＯ₃またはｂ） −ＮＨ−ＣＨ₂−ＣＯＯＨＲ²は次のとおりである：ａ） −ＮＲ³Ｒ⁴またはｂ） −Ｏ−Ｒ⁵ （ここでＲ³、Ｒ⁴またはＲ⁵は同一であるかまたは異な
り、そして相互に独立的に、次の意味を有する：１）水素原子、２）直鎖状または分枝鎖状の（Ｃ₁〜Ｃ₅）−アルキ
ル、３）（Ｃ₃〜Ｃ₆）−シクロアルキル、４）アセチル５) 5.1 ハロゲン例えば弗素、塩素または臭素により
モノ置換またはポリ置換されたアセチル、６）ハロゲン例えば弗素、塩素または臭素、７）スクシニル８) 8.1 水素原子、 8.2 −ＮＯ₂、 8.3 −Ｎ₃、 8.4 −ＮＣＳ、 8.5 −ＮＨ₂、 8.6 −Ｎ（Ｒ⁷)₂（式中Ｒ⁷はｂ１）〜ｂ７）の意味を
有する）、 8.7 ハロゲン例えば弗素、塩素または臭素によりモノ
置換またはポリ置換されたベンゾイル、または９） b
8.1〜b8.7に挙げた基によりモノ置換またはポリ置換さ
れたベンジル）〕で示される化合物および／または式Ｉ
の化合物の生理学的に許容される塩である。

【０００９】好ましいのは式Ｉにおいて、Ｒ¹が−ＮＨ
−ＣＨ₂−ＣＨ₂−ＳＯ₃であり、そしてＲ²が−ＮＨＲ⁴
（ここでＲ⁴は次の意味を有する：ａ）（Ｃ₁〜Ｃ₅）−アルキル、ｂ）１）水素原子２）ＮＯ₂ ３）ＮＨ₂または４）ハロゲン例えば弗素、塩素または臭素によりモノ
置換またはポリ置換されたベンゾイル、ｃ）ｂ１)〜ｂ４)に挙げた基によりモノ置換またはポ
リ置換されたベンジル)である化合物である。

【００１０】特に好ましいのは式ＩにおいてＲ¹が−Ｎ
Ｈ−ＣＨ₂−ＣＨ₂−ＳＯ₃であり、そしてＲ²が−ＮＨ−
Ｒ⁴（式中Ｒ⁴は次の意味を有する：ａ）ベンゾイルまたはｂ）ＮＨ₂により置換されたベンゾイル）である化合物である。

【００１１】コラン酸誘導体として格別に好ましいのは
４′−アミノ−７−ベンズアミド−３α,１２α−５β
−タウロコラン酸

【化３】である。

【００１２】本発明によるコラン酸誘導体の適切な生理
学的に許容される塩は、例えば、アルカリ金属、アルカ
リ土類金属またはアンモニウム塩、および生理学的に許
容される有機アンモニウムまたはトリエチルアミン塩基
との塩である。グリコシル−ホスファチジルイノシトー
ルタンパク質（ＧＰＩタンパク質）という用語は、それ
らのグリコシル−ホスファチジルイノシトール部によっ
て、微生物、植物細胞、真菌細胞または動物細胞の細胞
膜に係留され、そしてタンパク質部を有する化合物を意
味するものと解される。ＧＰＩタンパク質の例は、５′
−ヌクレオチダーゼ、アルカリ性ホスホファターゼおよ
びアセチルコリンエステラーゼである。

【００１３】前記のコール酸誘導体は文献（ＤＥ３６
２３７４７）に知られた方法により調製することがで
きる。

【００１４】７−アミノ−コール酸の調製には、例え
ば、FieserおよびRajagopolan(JACS 71, 3935)に従って
コール酸を７位酸化し、Redelら(Bull. Soc. Chin. Fr.
1949,p. 877)に従ってオキシムに変え、Tserngら(J. L
ipid Res. 18, 404, 1977)に従ってタウリンと接合さ
せ、次いで白金触媒を用い加圧下に水素添加してアミン
とする。次にそのアミンを、ジメチルホルムアミド中の
Ｎ−エトキシカルボニル−２−エトキシ−１,２−ジヒ
ドロキノリン（ＥＥＤＱ）を添加しつつニトロアリール
アルコールまたは芳香族ニトロカルボン酸好ましくは４
−ニトロ安息香酸とカップリングさせ、そしてその４−
ニトロベンズアミドを酢酸で酸性化したメタノール性溶
液中、ＰｔＯ₂×Ｈ₂Ｏを触媒として用いてアミノ化合
物、好ましくは４−アミノ安息香酸誘導体に水素添加す
る。

【００１５】３−および／または７−ヒドロキシ−タウ
ロコール酸エステルの合成も同様にして、ＤＭＦ中のＥ
ＥＤＱを添加しつつ、相当するヒドロキシ化合物をニト
ロアリールアルコールまたは芳香族ニトロカルボン酸、
好ましくは４−ニトロ安息香酸と反応することにより行
われる。次いで、前述の如く、その化合物をＰｔＯ₂触
媒で水素添加する。

【００１６】本発明による水溶性複合体の調製は、例え
ば、ａ）ＧＰＩタンパク質を含有する膜を単離し、ｂ）それら膜を少なくとも一つのコラン酸誘導体と共
にインキュベートし、そしてｃ）少なくとも一つのＧＰＩタンパク質および少なく
とも一つのコラン酸誘導体を含有する水溶性複合体を単
離することにより行われる。

【００１７】ＧＰＩタンパク質は多くの生物、例えばラ
ット、ブタまたは家畜(cattle)から得ることができる。
例えば、ラット脂肪細胞からの原形膜は５′−ヌクレオ
チダーゼの取得に、またウシ赤血球からの膜はアセチル
コリンエステラーゼの取得に適している。

【００１８】工程ａ）における最良の手順は次のとおり
である：ＧＰＩタンパク質含有膜は例えば、コラゲナー
ゼ消化によりラット副睾丸脂肪組織から脂肪細胞を分離
することによって単離される(J. Gliemann, Diabetolog
ia，1967, 3, pp. 382〜388）。単離された細胞はホモ
ジナイザーで分解され、そして原形質膜は分画遠心によ
り濃縮され、次いでスクロース勾配遠心（１５〜４０％
スクロース）により精製される(D. W. McKeelおよびL.
Jarret, J. Cell. Biol., 1970, 44, pp. 417〜432）。

【００１９】工程ｂ）における最良の手順は、単離され
た膜をコラン酸誘導体例えば４′−アミノ−７β−ベン
ズアミド−３α,１２α,５β−タウロコール酸（ＢＡＴ
Ｃ）と共にインキュベートすることである。コラン酸誘
導体の濃度は約０.０１〜０.５％、好ましくは０.０２
〜０.２％、特に好ましくは０.０５〜０.１％である。
温度は０℃〜４０℃、好ましくは０℃〜１５℃である。
インキュベーション時間は１０分間〜２時間、好ましく
は１５分間〜１時間、特に好ましくは２０分〜４０分で
ある。

【００２０】工程ｃ）における最良の手順は工程ｂ）で
得られた反応混合物を３５,０００〜１５０,０００×
ｇ、好ましくは５０,０００〜１００,０００×ｇで遠心
分離することである。一回以上の遠心分離を行ってもよ
く、そして１回の遠心工程中の遠心加速度は同じであっ
ても、あるいは異なってもよい。複数回の遠心分離にお
ける遠心加速度は同じであっても、あるいは異なっても
よい。遠心時間は広範囲にわたり変えてもよく、１５分
間〜３時間、好ましくは３０分間〜１時間の遠心時間が
好ましいことが判明している。本発明による水溶性複合
体は遠心工程後の上清中に存在する。それらは溶液とし
てそのまま用いることができ、あるいは所望により凍結
してあるいはさらに精製して用いることができる。適切
な方法は文献に知られている。例えば：Brodbeck, U.；
Gentinetta, R.；Ott, P. (1981) in “Membrane Prote
ins" (Azzi A., Brodbeck U., Zahler P. eds.）Spring
er-Verlag, Berlin, 85〜96。Stieger, S.；Brodbeck,
U. (1985), J. Neurochem. 44, 48〜56；Butikofer,
P.；Kuypers, F. A.；Shackleton, C.；Brodbeck, U.,
Stieger, S. (1990), J. Biol. Chem. 265, 18983〜189
87。Ott, P.；Jenny, B.；Brodbeck, U. (1975), Eur.
J. Biochem 57, 469〜480。

【００２１】このようにして得られた水溶性複合体は、
例えば酵素試験として、化学合成における基質の定性的
または定量的測定に、あるいは各々ＧＰＩタンパク質が
存在する試験系の安定化に、またＧＰＩタンパク質の精
製に適している。

【００２２】本発明はさらに本発明による水溶性複合体
の選択的調製方法に関する。前述の本発明による水溶性
複合体の調製は、ＧＰＩタンパク質に対するコラン酸誘
導体の高選択性によって区別される。他の洗剤、例えば
オクチルグルコシドまたはTriton Ｘ−１００はＧＰＩ
タンパク質に対し著しく劣った選択性を示す。

【００２３】以下の実施例中の％値は特に断っていなけ
れば各々容量％に関する。

【００２４】実施例１水溶性５′−ヌクレオチダーゼ−ＢＡＴＣ複合体ａ） (J. Gliemann(1967) Diabetologia 3, pp. 382〜
388に従って）ラット副睾丸脂肪組織からコラゲナーゼ
消化により脂肪細胞を単離し、洗浄しそしてガラスホモ
ジナイザー(B. Braun, Melsungen AG, Apparatebau)で
均質化する。ホモジネートの分画遠心後（１０００×ｇ
で５分間、次に１６,０００×ｇで２０分間）、得られ
る原形質膜ペレットを水性２５mM Tris／HCl緩衝液（pH
７.４、２５０mMスクロース、１mM ＥＤＴＡ）に懸濁
し、そしてスクロース勾配遠心分離（２５mM Tris／HCl
中１５〜４０％スクロースの直線勾配）により精製する
(D.W. MckeelおよびL. Jarrett(1970) J. Cell. Biol.
44, pp. 417〜432)。

【００２５】ｂ）ａ）で得た原形質膜を０.１％４′
−アミノ−７β−ベンズアミド−３α,１２α,５β−タ
ウロコール酸（ＢＡＴＣ）とインキュベートする。反応
時間は４℃で３０分間である。

【００２６】ｃ）ｂ）で得たインキュベーション混合
物を１５０,０００×ｇで３０分間遠心分離し、沈殿原
形質膜を捨て、次に上清を１００,０００×ｇで３０分
間もう２回遠心分離し、そしてその都度沈殿膜を捨て
る。上清は水溶性５′−ヌクレオチダーゼ−ＢＡＴＣ複
合体を含有する。

【００２７】５′−ヌクレオチダーゼ活性は放射性５′
−ＡＭＰの加水分解により実証される。未加水分解ＡＭ
Ｐを０.３ＮＢａ（ＯＨ)₂により沈殿させた後、生成ア
デノシンの放射能を上清について測定する(E. M. Baily
es et al. (1982) Biochem.J. 203, pp. 245〜251)。

【００２８】実施例２水溶性アルカリ性ホホスファターゼ−ＢＡＴＣ複合体実施例１ａ）〜１ｃ）の記載と同様にして調製を行う。

【００２９】アルカリ性ホスファターゼ活性は、ｐ−ニ
チロフェニルホスフェートの加水分解により分光的に測
定する（Y. Ikehara et al. (1977) Biochem. Biophys.
Acta 470, pp. 202〜211)。

【００３０】実施例３水溶性アセチルコリンエステラーゼ−ＢＡＴＣ複合体ウシ赤血球（Sigma Chemie GmbH, Diesenhofen, ドイ
ツ）を実施例１ｂ）および１ｃ）の記載と同様にしてイ
ンキュベートする。このために、１mgの乾燥ウシ赤血球
を０.１％ＢＡＴＣ（容量基準）を含む１mlの緩衝液（T
ris／HCl、２５mM、pH７.４）中、４℃で３０分間イン
キュベートし、次いで実施例１ｃ）と同様に遠心分離す
る。

【００３１】アセチルコリンエステラーゼ(T. L. Rosen
berry およびD. M. Scoggin(1984)J. Biol. Chem. 259,
pp. 5643〜5652)は、放射性アセチルコリンの加水分解
により測定する。遊離放射性酢酸の放射能は、酸性pHで
相分離により未加水分解放射性アセチルコリンを除去し
た後に測定する。

【００３２】実施例４細胞膜よりＧＰＩタンパク質の選択的濃縮膜生化学に慣用される洗剤と対比したＧＰＩ−係留膜タ
ンパク質のＢＡＴＣによる選択的濃縮は次のようにして
行われる：（実施例１ａ）または３ａ）と同様にして調製された）
ウシ赤血球膜およびラット脂肪細胞原形質膜をＢＡＴＣ
（０.１％）、オクチルグルコシド（０.５％）およびTr
iton ＴＸ−１００（０.５％）の存在下にインキュベー
トする。遠心分離（３０分間、１００,０００×ｇ）
後、上清中の５′−ヌクレオチダーゼ、アルカリ性ホス
ファターゼおよびアセチルコリンエステラーゼの比酵素
活性を測定し、そして各場合について遠心分離前の洗剤
で可溶化されたインキュベーション混合物中の全比活性
に対する濃度ファクターとして計算する。表１に結果を
示す。

【００３３】

【表１】

【００３４】実施例５ＧＰＩ−タンパク質５′−ヌクレオチダーゼの脂肪分解
的分解ＢＡＴＣの存在下における細菌性ＰＩ（ホスファチジル
イノシトール）−特異的ホスホリパーゼによるＧＰＩタ
ンパク質の効率的脂肪分解的分解を実証するために、ラ
ット脂肪細胞原形質膜（実施例１）を０.１％ＢＡＴ
Ｃ、０.５％デオキシコレートまたは０.１％Nonidet Ｐ
−４０の存在下にＰＩ−ＰＬＣ（バチルス・セレウス(B
acillus cereus)、Sigma Chemie GmbH）とインキュベー
トする。

【００３５】バチルス・セレウスからの(Ｇ)ＰＩ−ＰＬ
Ｃ(Ｄ)による５′−ヌクレオチアーゼのグリコール−ホ
スファチジルイノシトール膜アンカーの分解に続いて
（酵素活性によって確認される）タンパク質が洗剤（Ｔ
Ｘ−１１４）相と水相間に分配される。両親媒性膜アン
カー含有型は洗剤相に蓄積し、親水性膜アンカー不含型
は水相に濃縮される。

【００３６】ＴＸ−１１４による相分離は、C. Bordier
(1981) J. Biol. Chem. 256, pp. 1604〜1607；J. G. P
rydeおよびJ. H. Phillips(1986) Biochem. J. 233, p
p. 525〜533；B. R. GanongおよびJ. P. Delmore(1991)
Anal. Biochem. 193, pp. 35〜37に従って行われる
が、以下の改変を行う：１mlの氷冷ＴＸ−１１４（２
％）および１４４mM ＮａＣｌを５０μｌのインキュベ
ーション混合物に添加する。３７℃への加温および遠心
分離（１０,０００×ｇで２分間）により相分離を誘導
する。洗剤相を２回再抽出する。水相を合一した。表２
に結果を示す。

【００３７】

【表２】

【００３８】Nonidet Ｐ−４０またはデオキシコレート
に比べ、ＢＡＴＣ（０.１％）の存在下の方が、(Ｇ)Ｐ
Ｉ−ＰＬＣによるＧＰＩ−膜アンカーの脂肪分解的分解
は、より速やかにかつはるかに高い効率で行われる。

Claims

【特許請求の範囲】

【請求項１】少なくとも一種のグリコシル−ホスファ
チジルイノシトールタンパク質および少なくとも一種の
式Ｉ【化１】〔式中、記号Ｒ¹およびＲ²は次の意味を有する。Ｒ¹は
次のとおりである：ａ） −ＮＨ−ＣＨ₂−ＣＨ₂−ＳＯ₃またはｂ） −ＮＨ−ＣＨ₂−ＣＯＯＨＲ²は次のとおりである：ａ） −ＮＲ³Ｒ⁴またはｂ） −Ｏ−Ｒ⁵ （ここでＲ³、Ｒ⁴またはＲ⁵は同一であるかまたは異な
り、そして相互に独立的に、次の意味を有する：１）水素原子、２）直鎖状または分枝鎖状の（Ｃ₁〜Ｃ₅）−アルキ
ル、３）（Ｃ₃〜Ｃ₆）−シクロアルキル、４）アセチル５) 5.1 ハロゲン例えば弗素、塩素または臭素により
モノ置換またはポリ置換されたアセチル、６）ハロゲン例えば弗素、塩素または臭素、７）スクシニル８)8.1 水素原子、 8.2 −ＮＯ₂、 8.3 −Ｎ₃、 8.4 −ＮＣＳ、 8.5 −ＮＨ₂、 8.6 −Ｎ（Ｒ⁷)₂（式中Ｒ⁷はｂ１）〜ｂ４）の意味を
有する）、 8.7 ハロゲン例えば弗素、塩素または臭素によりモノ
置換またはポリ置換されたベンゾイル、または９） b8.1〜b8.7に挙げた基によりモノ置換またはポリ
置換されたベンジル）〕で示されるコラン酸誘導体およ
び／または式Ｉの化合物の生理学的に許容される塩を含
む水溶性複合体。
【請求項２】Ｒ¹が−ＮＨ−ＣＨ₂−ＣＨ₂−ＳＯ₃であ
り、Ｒ²が−ＮＨＲ⁴（ここでＲ⁴は次の意味を有する：ａ）（Ｃ₁〜Ｃ₅）−アルキル、ｂ）１）水素原子２）ＮＯ₂ ３）ＮＨ₂または４）ハロゲン例えば弗素、塩素または臭素によりモノ
置換またはポリ置換されたベンゾイル、またはｃ）ｂ１)〜ｂ４)に挙げた基によりモノ置換またはポ
リ置換されたベンジル)である、請求項１記載の水溶性
複合体。
【請求項３】Ｒ¹が−ＮＨ−ＣＨ₂−ＣＨ₂−ＳＯ₃であ
り、そしてＲ²が−ＮＨ−Ｒ⁴（式中Ｒ⁴は次の意味を有
する：ａ）ベンゾイルまたはｂ）ＮＨ₂で置換されたベンゾイル）である請求項１または２記載の水溶性複合体。
【請求項４】４′−アミノ−７−ベンズアミド−３
α,１２α−５β−タウロコール酸をコラン酸誘導体と
して含有する請求項１〜３のいずれか１項に記載の水溶
性複合体。
【請求項５】５′−ヌクレオチダーゼ、アルカリ性ホ
スファターゼまたはアセチルコリンエステラーゼをグリ
コシル−ホスファチジルイノシトールタンパク質として
含有する請求項１〜４のいずれか１項に記載の水溶性複
合体。
【請求項６】ａ）グリコシル−ホスファチジルイノ
シトールタンパク質を含有する膜を単離し、ｂ) それら膜を少なくとも一つのコラン酸誘導体とイ
ンキュベートし、そしてｃ) 少なくとも一つのグリコシル−ホスファチジルイ
ノシトールタンパク質と少なくとも一つのコラン酸誘導
体を含有する水溶性複合体を単離することより成る請求
項１〜５のいずれか１項に記載の水溶性複合体の調製方
法。
【請求項７】請求項１〜５のいずれか１項に記載の少
なくとも一種の水溶性複合体の、酵素試験または化学合
成、あるいはグリコシル−ホスファチジルイノシトール
タンパク質精製への使用。