JPH07502045A - 新規なビオチン化試薬 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 新規なビオチン化試薬 発明の記載 本発明は、新規なビオチン化試薬、その製造方法、遊離の第一および／または第 二アミノ基を有する物質のビオチン化のためのその使用、およびビオチン化試薬 とアミノ基を有する物質との反応により形成される抱合体に関する。さらに、本 発明は本発明による抱合体を使用するアナライト（ａｎａｌｙｔｅ）の測定法並 びに本発明による抱合体を含むアナライトの測定のための試薬に関する。

結合パートナ−であるビオチンとストレプトアビジン／アビジンから成る結合対 は、医学、生化学、分子生物学および免疫学の分野での方法として非常に重要で ある。この理由は、他の物質と結合しているビオチンまたはビオチン誘導体は、 ストレプトアビジンまたはアビジンとなお高親和性の相互作用を有し、この方法 で形成されるビオチン　ストレプトアビジン／アビジン抱合体は生物学的物質の 有用な検知システムとなるからである。

ビオチン化試薬を使用する、タンパク質、ペプチド、核酸、ヌクレオチドまたは ハプテンのような種々の物質のビオチン化が長年に渡って知られてきた。今日、 ビオチン活性エステル、特にビオチン−Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステル （ビオチン−ＮＨ３）（Ｅ、Ａ、Ｂａｙｅｒ　ａｎｄ　Ｍ、Ｗｉｌｃｈｅｋ　ｉ ｎ　Ｍｅｔｈｏｄｓ　ｏｆ　Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ　Ａｎａｌｙｓｉｓ、　Ｖ ｏｌ、　２６　（Ｅｄｉｔｏｒ：　Ｄ、　Ｇ１１ｃｋ）、Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎ ｃｅ　Ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎ、　Ｊ、　Ｗｉｌｅｙ　＆　５ｏｎｓ、　ｐ、　 ２−４５）およびビオチン−ε−アミノーカブロン酸−Ｎ−ヒドロキシスクシン イミドエステル（ビオチン−Ｘ−ＮＨ３）（Ｒ，Ｈ，Ｂｕｒｄｏｎ　ａｎｄ　Ｐ ］、　ｖａｎ　Ｋｎｉｐｐｅｎｂｅｒｇ　ｉｎ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　Ｔｅｃ ｈｎｉｑｕｅｓ　ｉｎ　Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ　ａｎｄ　Ｍｏ１ｅｃｕｌａ ｒ　Ｂｉｏｌｏｇｙ、　Ｖｏｌ、　１５　（Ｅｄｉｔｏｒ：　Ｐ、　Ｔｉｊｓｓ ｅｎ）、　Ｅｌｓｅｖｉｅｒ、　ｐ、２３−３８；　Ｓ、　Ｍ、　Ｃｏ５ｔｅｌ ｌｏ　ｅｔ　ａｌ、、　Ｃｌ１ｎ、　Ｃｈｅｉ、　２５／９　（１９７９）、　 ｐ、１５７２−１５８０）が最も一般的なビオチン化試薬である。これらの活性 エステルの形態のビオチンは安定なアミド結合を介して、アビジン／ストレプト アビジンとの結合能力に関連する複素二環部分を構造的に損なうことなく、第一 および／または第二アミノ官能基を有する反応パートナ−と結合することができ る。特に、リジン側鎖のε−アミノ基の形態の第一アミノ官能基はほとんどすべ てのタンパク質に生じるので、活性エステルのアミノ分解は、抗体または酵素的 に活性なタンパク質およびステロイドホルモンのようなハブテンのようなタンパ ク質のビオチン化の選択方法として確立されている（Ｌ、−Ｘ、　Ｔｉｅｆｅｎ ａｕｅｒａｎｄ　Ｒ，Ｙ、　Ａｎｄｒｅｓ、　Ｊ、　５ｔｅｒｏｉｄ　Ｂｉｏｃ ｈｅｍ、　３５　（１９９０）、　ｐ、　６３３−６３９）。それ故ビオチン− ＮＨ５とビオチン−Ｘ−Ｎｌ（Ｓは多数の精製薬品および生化学試薬製造業者に より販売されている。

長年に渡って知られているように、ビオチン化試薬では、ビオチン単位とビオチ ン化される反応パートナ−の間にスペーサーを導入すると有利であると証明され ている（Ｎ、Ｍ、　Ｇｒｅｅｎ　ｅｔ　ａｌ、、　Ｂｉｏｃｈｅｍ、　Ｊ、　１ ２５　（１９７１）、　ｐ、　７８１−７９１）　。これには、両親媒性構造を 有するスペーサーが特に有用であると証明されている（例えば、ＥＰ　０４１０ ２８ＯＡ１．　ＥＰ　０４５１８１０　Ａｌを参照されたい）。

しかしながら、これまでに知られているビオチン活性エステルの欠点は、低溶解 性または、ある場合はほとんど全ての一般の有機溶媒に不溶でさえあることであ る。例えば、ビオチン−ＮＨ３および特にビオチン−Ｘ−ＮＨ３はＤＭＳＯおよ びＤＭＦ以外は有機溶媒にわずかに溶解するだけである。前記の２種のビオチン 化試薬は水と水性緩衝液にもわずかに溶解するだけである。ビオチン−Ｘ−ＮＨ ３のスルホン化変異体である、市販のビオチン化試薬スルホ−Ｎｌ（Ｓ−ＬＣ− ビオチン（１，Ｍ、Ｇｒｕｍｂａｃｈ　ａｎｄ　Ｒ，Ｗ、　Ｖｅｈ、　Ｊ、Ｉｍ ｍｕｎｏｌ、　Ｍｅｔｈ、１４０　（１９９１）、　１１．２０５−２１０）は 水性媒体には良好な溶解性を示すが、しかしながら一方、有機溶媒には所望する 濃度では溶解しない。後者は、好ましくはジオキサン、ＤＭＦなどのような有機 溶媒中で実施されるハプテン−ビオチン抱合体の合成で特に不利な結果となる（ Ｌ、　−Ｘ、Ｔｉｅｆｅｎａｕｅｒ　ａｎｄ　Ｒ，Ｙ、　Ａｎｄｒｅｓ、　、１ ．５ｔｅｒｏｉｄ　Ｂｉｏｃｈｅｍ、　３５　（１９９０）、　ｐ、６３３−６ ３９＋　ＥＰ　Ｏ４５１８１０Ａｌ）。

欧州特許出願ＢＰ−Ａ−０１５６２８７には式・のビオチン化試薬が記載されて いる。この物質を、水溶性のカルボジイミドの存在下て室温でアミノメチルトリ オキザレンハイドロクロリドと反応させてビオチン化ブソラレン（ｐｓｏｒａｌ ｅｎ）誘導体を製造できる。ＥＰ−Ａ−０１５６２８７のｐ、２０．２３−２５ 行に、これとは別に、上記の物質のカルボキシル基をＮ−ヒドロキシスクシンイ ミドのような活性エステルに変換し、その後アミノメチルトリオキザレンハイド ロクロリドと反応できると記載されている。しかしながら、上記の化合物と式： を有するＮ−ヒドロキシスクシンイミドとの反応により形成される物質は、コハ ク酸−アミド活性エステルの一般的な不安定性のために、ヒドロキシスクシンイ ミドの開裂と環化を伴う分子内反応により以下の物質： に自然分解するので、反応は実施例の形では記載されていない。

それ故、安定な単離できるビオチン活性エステルはＥＰ−Ａ　Ｏ１５６２８７の 教示によっては得ることはできない。

それ故、本発明の基本となる目的は、当業界の現況の前記の欠点を少なくとも部 分的に排除するビオチン化試薬を提供することであった。特に、すでに既知の試 薬より良好な溶解性を有するビオチン化試薬の提供を意図する。

本発明の目的は、一般式ｌ Ｏｏ　Ｏ。

し式中、旧はビオチンまたはビオチン誘導体からのカルボキシル基の開裂に由来 する残基を意味し、 Ｒ’とＲ２は独立してお互いに水素またはＣ，−Ｃ，アルキルを意味し、ｎは４ −１０の整数を意味し、そして Ｘは、１個または数個の酸素および／またはイオウ原子で置換された鎖長が原子 数５−２０個のアルキレン残基を意味する］の化合物により達成される。

式ＩのＢｉは、カルボキシル基の開裂によりビオチンまたはビオチン誘導体に由 来する残基を意味する。Ｂｉは好ましくは、ビオチン、デチオビオチンまたはイ ミノビオチンそして特に好ましくはビオチンに由来する残基を意味する。

Ｒ１とＲ２は独立してお互いに水素またはＣ＋−Ｃじアルキルを意味し、Ｒ１と Ｒ２は好ましくは水素またはメチルそして特に好ましくは水素を意味する。

ｎは４−ＩＯの整数、特に好ましくは６−８の整数を意味する。

Ｘは、１個または数個の酸素および／またはイオウ原子、好ましくは１個または 数個の酸素原子で置換されている、鎖長が原子数５−２０個の、好ましくは原子 ５−１１個のアルキレン残基を意味する。

Ｘは好ましくは直鎖の残基であるが、メチルのような側鎖を含むこともできる。

残基Ｘの酸素および／またはイオウ原子の数は好ましくはｌ−５、特に好ましく はｌ−３であり、そして最も好ましくは２である。さらに、Ｘは好ましくは、例 えば、ブチレンオキシド（ＣＩＨＩＯ−）、プロピレンオキシド（Ｃ，Ｆｌ、０ −）そして特に好ましくはエチレンオキシド（Ｃ２１（，０−）単位を含むポリ アルキレンオキシド誘導体を意味する。ｘは特に好ましくは、（Ｃ）Ｉ！−Ｃ） １２０）、　ＣＨｔ−ＣＨ＊残基し式中、ｎは１５の整数を意味し、特に好まし くは１３の整数であり、最も好ましくは２である］を意味する。

本発明の特に最も好ましい主題は、式：を有するビオテノイル−アミノ−３，６ −シオキサオクタニルーアミノカルボニルーへブタン酸−Ｎ−ヒドロキシスクシ ンイミドエステル（ビオチン−ＤＡＤＯＯ−Ｉ）３３またはビオチン−ＤＤＳ） である。

本発明の化合物は、ビオチンまたはビオチン誘導体を１工程で、さらに試薬を添 加することなく、タンパク質、ペプチド、核酸、ヌクレオチド、ハブテンなどの ような反応パートナ−の第一および／または第二アミノ基に結合させることがで きるので、ビオチン化試薬として高度に適切である。この工程でのビオチン基の 導入は、これまでいずれの他の既知の試薬でも不可能であった驚くべき高収率で 達成される。

さらに、本発明の化合物は意外にも、当分野の現況のビオチン化試薬より、水お よび有機溶媒のような溶媒に実質的に広範囲の溶解性を有しているので、本発明 の物質は普遍的に使用できる。

本発明は、一般式（ＩＩ）： の化合物を無水中性溶媒中で塩基の存在下で、一般式（ＩＩＩ）：の化合物と反 応させ、そしてＢｉ、　Ｒ’、　Ｒ”、Ｘおよびｎが式（１）に記載された意味 を持つ反応生成物を単離することを特徴とする新規なビオチン化試薬の製造方法 にも関する。

式（１１）の化合物の例は市販のビオナノイル−１，８−ジアミノ−３，６−シ オキサオクタン（ビオチン−ＤＡＤＯＯ，Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ　Ｍａｎｎｈｅ ｉｍ　ＧｍｂＨ、カタログ番号１１１２０４７）である。式（ＩＩＩ）の化合物 の実施例は市販のジスクシンイミジルスベレート（ＤＳＳ、　Ｂｏｅｈｒｉｎｇ ｅｒ　Ｍａｎｎｈｅｉｍ　ＧｍｂＨ，カタログ番号１０８１７３０）である。こ れらの２種の物質の反応により本発明の特に好ましい化合物ビオチン−ＤＡＤＯ Ｏ−ＤＳＳが形成される。

反応は無水中性溶媒、好ましくはＤＭＦ中で、塩基、好ましくは第三アミン（例 えば、トリエチルアミン）の存在下で、そして好ましくは室温で実施する。生成 物は、真空で溶媒を除去し水で温浸し、そして過剰の出発製品を濾過することに より反応混合物がら単離てきる。必要であれば、シリカゲルクロマトグラフィー によりさらに精製を実施できる。

さらに本発明は、遊離の第一および／または第二アミノ基を有する物質をビオチ ン化するための新規なビオチン化試薬の使用に関する。このような物質の好まし い例は、抗体（例えば、完全（モノクローナルまたはポリクローナル）抗体また は抗体断片）のようなタンパク質、酵素的に活性なタンパク質（例えば、ペルオ キシダーゼ、β−ガラクトシダーゼまたはアルカリホスファターゼ）、核酸（例 えば、ＤＮＡ　、　ＲＮＡ　、オリゴヌクレオチド）、ヌクレオチド（例えば、 ＵＴＰ　、　ｄＵＴＰＳｄｄＵＴＰ　５ＡＴＰ％ｄＡＴＰ、　ｄｄＡＴＰ）また は、ハブテン（例えば、フルオレセイン、エストラジオール、ジゴキシゲニンな どのようなステロイドホルモン）またはペプチドである。

本発明は、さらに一般式（ｍ： ［式中、Ｐは少なくとも１個の第一および／または第二アミノ基ＮＨＲ３を有す る物質を意味し、 Ｒ３は水素および／または所望により置換されているアルキル残基を意味し、 ｐは１以上の整数を意味し、 Ｂｉ、　Ｒ’、Ｒ２、Ｘおよびｎは式１に定義されている］の抱合体に関する。

物質Ｐは好ましくはタンパク質、ペプチド、核酸、ヌクレオチドまたはハブテン 、特に好ましくは、抗体のようなタンパク質または酵素的に活性なタンパク質で ある。物質Ｐのビオチン化の度合に相当する記号ｐは１以上の整数を意味し、そ して物質Ｐの構造、すなわち物質Ｐの反応アミノ基の数に依存する。それ故、た だ１個の遊離のアミノ基を有するペプチドまたはヌクレオチドの場合はｐはｌを 意味することができ、一方タンパク質または核酸のような高分子の場合はｐは１ ００までの、好ましくは２０までの、そして特に好ましくは１０までの数を意味 できる。抗体の場合は、例えば、ｌ　：１−１　：１０、そして特に１：２−１ ニア、５のビオチン化の度合が好ましい。

本発明は、本発明による抱合体を使用するアナライトの測定法にも関する。この ような方法は公知の方法で実施でき、そして当業界の現況の方法とは、新規な抱 合体を使用するという点でのみ異なることが明らかであろう。

アナライトの測定法における本発明のビオチン抱合体の使用の、当業界の現況の 抱合体に比較して意外にも有利な点は、電気化学発光系において、および球状の 固体相を使用する他の全ての免疫学試験においても、新規なビオチン化試薬（ビ オチン−〇ＡＤＯＯ−ＤＳＳ）を用いて生成された抱合体は、ビオチン−Ｘ−Ｎ Ｏ３を用いて得られるものより１．３倍良好で、ビオチン−ＮＯ３を用いて得ら れるものより約３．５倍良好である結果となることである。

最後に、本発明は本発明の抱合体を含むアナライトの測定試薬にも関する。本発 明の試薬は、好ましくは溶液、粉末または凍結乾燥品の形態である。

以下の実施例により、本発明をさらに説明することを意図する。

実施例１ ビオチノイルーアミノー３，６−ジオキサオクタニルアミノーカルボニル−へブ タン酸−Ｎ−ヒトワキシスクシンイミドエステル（ビオチン−ＤＡＤＯＯ−ＤＳ Ｓまたはビオチン−ＤＤｓ）の合成桁たに蒸留したジメチルホルムアミド（ＤＭ Ｆ）　２５　ｍｌ中のビオナノイル−１，８−ジアミノ−３，６−シオキサオク タン（ビオチン−ＤＡＤＯＯ。

Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ　Ｍａｎｎｈｅｉｍ　、カタログ番号１１１２０７４）　 ５６１　ｍｇ（１，５ｍｉ＋ｏｌ）の溶液をトリエチルアミン０．２１　ｍｌ（ １，５ｍｍｏｌ）と混合し、攪拌しながら、新たに蒸留したＤＭＦ　５０ＩＩＩ ｌ中のジスクシンイミジルスベレート（ＤＳＳ、　Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ　Ｍａ ｎｎｈｅｉｍ　、カタログ番号１０８１７３０）５．５２　ｇ（１５ｍｍｏＪ） 溶液に徐々に滴下する。室温で１８時間攪拌する。その後、溶液をロータリーエ バポレータで油ポンプ真空で蒸発させ、半固体残留物を水約７０ｍ１に温浸し、 過剰のＤＳＳを濾過して分離する。透明な溶液を凍結乾燥し、その後、凍結乾燥 物を少量のＴＨＥに温浸する。固体生成物を吸引濾過後、高真空下で乾燥する。

収量：無色粉末６２０　ｍｇ ＴＬＣ：　シリカゲル６０　（Ｍｅｒｃｋ）：酢酸エチル／氷酢酸ノ水６ノ３／ ｌ（Ｖ／Ｖ／Ｖ）：　ＡＬエタノール中（１）２％　ＨｘＳＯ４およびＢ）ｚタ ノール中（７）０．２％４−ジメチルアミノ−シンナムアルデヒドのｌ／ｌ　（ Ｖ／Ｖ）混合物を噴霧し、そしてその後、１００℃で１０分間乾燥させると、Ｒ ，＝０．５１に暗赤紫色の生成物のスポットを生じる。

’Ｈ−ＮＭＲ（ｄ＠−ＤＭＳＯ）：δ”１．ｌｏ−１，８０（ｍ、　１４　Ｈ） 、　２．０５　（ｔ、　４Ｈ）、　２．６５（ｔ、　２Ｈ）、　２．８０　（ｓ 、　４）１）、　２．６０−３．６０　（ｍ、　ＩＩＨ）、　３．５０　（ｓ、 　４Ｈ）。

４．０５−４．４０　（ｍｌ　２８）、　６．３６　（ｄ、　ｂｒ、　２Ｈ）、 　７．８０　（ｔ、　ｂｒ、　２Ｈ）。

実施例２ ウサギＩｇＧのビオチン化 ウサギＩｇＧ　１００　ｍｇをＰ８ｓ緩衝液ｐＨ８，５に５　ｍｇ／ｍｌの濃度 で溶解し、ソシテＤＭＦ中ノｌθ倍モル量ノビオチン−ＤＳＳ（ｅ＝５０　ｍｇ ／ｍｌ）と混合する。溶液を室温で１時間攪拌する。その後、０．１　ｍｏｌ／ １酢酸アンモニウム溶液１０　ｍｌを添加して反応を停止する。ＰＢＳ　４ｉＩ 衝液ｐ）１７．５に対して１６時間透析し、その後凍結乾燥する。

実施例３ ビオチン化試薬の溶解性 ２０℃での溶解性（ｍｇｌｏｌ） ＮＨ３−ＬＣ−ビオチン：　Ｐｉｅｒｃｅ番号２１３３５ビオチン−Ｘ−ＮＨ３ ：　ビオチノイルーアミノヵブロン酸−Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステル 、Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ　Ｍａｎｎｈｅｉｍ番号１００３９３３当業界の現況の ビオチン化試薬と比較した、ビオチン−〇ＡＤＯＯ−ＤＳＳの溶解性実験の結果 により、本発明のビオチン化試薬は既知の化合物よりかなり広範囲の溶解性スペ クトルを有することが示される。とりわけ、強い極性（水）並びに無極性（ジク ロロメタン）溶媒に良好な溶解性を示す。

実施例４ チロトロピン（ＴＳＩ＋）に対するモノクローナル抗体のビオチン化モノクロー ナル抗体　抗−ＴＳＨＭ　１．２０　（ＭＡＢ　＜ｈＴｓ）Ｉ＞　Ｍ−１２０Ｐ Ｋ３０、ＥＣＡＣＣ８７１２２２０２）を、０．１　ｍｏｌ／Ｉ　リン酸カリウ ム緩衝液ｐＨ８，４に濃度１０　ｍｇ／ｍｌで溶解する。３．５倍または８倍モ ル量のビオチン−ＤＯ５（または、比較のためそれぞれ濃度９．５　ｍｇ／ｍｆ でジメチルスルホキシドに溶解したビオチン−Ｘ−Ｎｌ（Ｓまたはビオチン−Ｎ Ｈ５）を添加後、２５℃で９０分攪拌し、その後、１ｍｏｌ／Ｉリジン１０μｍ を添加して反応を停止する。２５　ｍｍｏｌ／Ｉ　リン酸カリウム／　５０　ｍ ｍｏｌ／ｌ塩化ナトリウムｐＨ７，０に対して透析後、生成物を凍結乾燥する。

実施例５ 電気化学発光法による、ＴＳＨとＢ型肝炎表面抗原（ＨＢｓ）の免疫学的測定 ａ）ルテニウム−標識ｐ（ａｂ’　）を断片の製造電気化学発光測定においては 、ＴＳＨとＨＢｓは、ＴＳＨまたはＨＢｓに対するルテニウム−標識抗体断片に より検知する。これらの断片を製造するために、モノクローナル抗体、抗−＜Ｔ ＳＨ＞−Ｍ−Ａ８（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ　Ｍａｎｎｈｅｉｍ　Ｇｍｂｌｌ、カ タログ番号１３６７９７８）または抗−＜ＨＢｓ＞−Ｍ−５ＡＩＯ（Ｂｏｅｈｒ ｉｎｇｅｒ　Ｍａｎｎｈｅｉｍ　ＧｍｂＨ，カタログ番号１１２４９８６−１２ ２）１００　ｍｇをＪＯｈｎＳＩＯｎｅ　とＴｈｏｒｐｅ（Ｉｍｍｕｎｏｃｈｅ ｍｉｓｔｒｙ　ｉｎ　Ｐｒａｃｔｉｃｅ、　ｐ。

６１、　Ｂｌａｃｋｗｅｌｌ　５ｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、　１９８７）に従ってペ プシンで切断し、そして生じたＦ（ａｂ’　）＋断片をセファロースＳ　２００ １１Ｒ（ＰｈａｒｍａｃｉａＬＫＢ）クロマトグラフィーにかけ精製する。各々 の場合、これらの精製断片５　ｍｇを０．１５　ｍｏｌ／Ｉ　リン酸カリウム緩 衝液１０．１５ｍ。

１／Ｉ塩化ナトリウムｐＨ７，８１ｎｌに溶解する。使用直前に、Ｒｕ（ｂｐｙ ）＊”−ＮＨ３（ルテニウム（２，２’−ビピリジル）２（４−［３−（Ｎ−ヒ ドロキシ−スクシンイミジルカルボキシ）−プロピル］−４′−メチル−２，２ ’−ビピリジン）２４）　（ＢＰ−Ａ　０２６５５１９に従って製造）　５　ｍ ｇを無水ジメチルスルホキシド０．７５＋ｎｌに溶解する。この活性エステルを Ｆ（ａｂ’　）２断片　に対して？、５：ｌのエステルのモル比（Ｒｕ（ｂｌ） Ｖ）ｓ””　−ＮＨ８Ｏ，３９６ｍｇ／　Ｆ（ａｂ　’　）ｔ５　＋ｎｇに相当 する）で攪拌しながらピペットで添加する。その後、２５℃で６０分間インキュ ベートし、そしてｌ　ｍｏｌ／Ｉ　リジンｌｏμｍを添加して反応を停止する。

２５ｍｍｏｌ／Ｊ　リン酸カリウム緩衝液１０．１　ｍｏｌ／ｌ塩化ナトリウム ｐＨ７゜０に対して２４時間透析後、生成物を凍結乾燥する。

ｂ）電気化学発光測定の手順 実施例４に従って得られたビオチン化抗体、抗＜ＴＳＨ＞Ｍ　１．２０並びに同 様の方法で製造したＢ型肝炎表面抗原に対する抗体、抗〈ＨＢｓ＞Ｍ−５ＡｌＯ を、ウサギ血清２０％を含有するインキュベーション緩衝液に濃度２．２５μｇ ／ｍｌで溶解する。

インキュベーション緩衝液： １１２　＋ｎｏ＋ｏｌ／］　ＫＨ２ＰＯ５８８ｍｍｏｌ／ｌ　Ｋ２ＨＰＯ＋ ０．０５　ｍｍｏｌ／Ｉ塩化ナトリウム６．５ｍｍｏｌノＩ　ＮａＮ５ ０．８　μｍｏｌ／Ｉ　トリトンＸ−１０００，４ｍｍｏｌ／Ｉ　ツイーン２０ １００　ｍｍｏｌ／Ｉ　トリプロピルアミン水に溶解（ｐＨ７，５５−７，６５ ）。

モノクローナル抗体、抗＜ＴＳＨ＞Ｍ−Ａ８または抗＜ＨＢｓ＞Ｍ−５Ａ１０　 ノＪＬ／テニウムー標識Ｐ（ａｂ’　）２断片を、２０％ウサギ血清添加物を含 有するインキュベーション緩衝液に濃度ｌμｇ／ｍｌで溶解する。ストレプトア ビジン磁気粒子（ｍａｇｎｅＨｃ　ｐａｒｔｉｃｌｅ）（直径２．８μｍのスー パーパラマグネッティック（ｓｕｐｅｒｐａｒａｍａｇｎｅ　ｔ　ｉ　ｃ）ポリ スチレン粒子、Ｄｙｎａｌ　Ａ、Ｓ、、オス咀ノルウェー）を濃度６００　μｇ ／ｍｌでインキュベージコン緩衝液／２０％ウサギ血清に懸濁し、そして振盪し て均質の分散に保つ。電気化学発光測定のために、以下を各ポリスチレン管に分 注する。

５０μｌ磁気粒子懸濁液 ５０μｍビオチン化抗体 ５ｏμｍルテニウム−標識（Ｐａｂ’　）ｇ断片５０μＩＴＳＨ標準液（６０μ Ｕ／ｍｌ）またはＨＢｓＡｇ標準液１２単位／ｎｌ、Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ　Ｍ ａｎｎｈｅｉｍ　ＧｍｂＨ、カタログ番号１１２４９８６−１２２）管を振盪し ながら室温で１６分間インキュベートする。その後、インキュベーション緩衝液 ５００μ■を添加し、混合後、磁気粒子に結合しているルテニウム−標識２２５ μ■の部分標本を、Ｉｇｅｎ　Ｉｎｃ、　、会社、ｏ、ｙクビル、アメリカ（Ｇ 、Ｆ、　Ｂｌａｃｋｂｕｒｎ　ｅｔ　ａｌ、、　Ｃ１１ｎｉｃａｌ　Ｃｈｅｍｉ ｓｔｒｙ　３７　（１９９１）、１５３４も参照されたい）からの電気化学発光 測定機器Ｏｒｉｇｏｎ　１．０を用いて測定する。これらの測定結果を以下の表 に示す。

（本頁以下余白） 本本発明による試料 データにより、電気化学発光測定においてビオチン−ＤＯ３またはビオチン−Ｘ −ＮＨ５を用いてビオチン化した抗体を使用すると、スペーサー無しのビオチン −ＮＨ３を用いたビオチン化によるものよりがなり高いシグナルが得られること が示される。各場合、ビオチン化の度合が低いと高いシグナルとなる。この実験 において、２５．７％以上高いシグナルはビオチン−Ｘ−ＮＨ３を介してビオチ ン化した抗体を用いたものよりビオチン−Ｘ−ＤＯ３を介してビオチン化した抗 体を用いて得られる。ビオチン化抗体の表面特性は高度のビオチン化の場合より 変化が少ないので、低度のビオチン化での最適のシグナルが好ましい。

実施例６ ストレプトアビジン磁気粒子および光度シグナル測定を使用するＴＳＨの免疫学 的測定 ＴＳ）Ｉ試験を、ペルオキシダーゼ（ＰＯＤ）と結合している抗−ＴＳＨ−Ｍ− Ａ８　Ｆａｂ断片を使用する光度測定について実施する。この抱合体並びにＴＳ Ｈ標準液、洗浄液およびＡＢＴＳ基質はＥｎｚｙｍｕｎ　ＴＳＨ試験キット（Ｂ ｏｅｈｒｉｎｇｅｒ　Ｍａｎｎｈｅｉｍ　ＧｍｂＨ、カタログ番号１４８８６３ ５）から利用する。

試験手順： 実施例４に従ってビオチン化した抗体　抗−ＴＳＨ−Ｍ−１，２０をインキュベ ート緩衝液に濃度３μｇ／ｍｌで溶解する。

インキュベージジン緩衝液：（１１当たりの重量明細）ＮＩＬＨ！ＰＯ４２，５ ｇ ＮａｔＨＰＯ＜　１２．８　ｇ 酒石酸Ｄｉ−Ｎａ　４６　ｇ シンペロニック（Ｓｙｎｐｅｒｏｎｉｃ）　Ｆ　６８　５　ｇｐＨ値をＮａＯＨ で７．４に調整する。

Ｅｎｚｙｍｕｎ　ＴＳＨ試験キットの酵素抱合体ＭＡＲ＜ＴＳＨ＞Ｍ−Ａ８−Ｆ ａｂ−ＰＯＤの濃縮液をインキュベーション緩衝液でｌ：５０に希釈する。

ストレプトアビジン磁気粒子（Ｄｙｎａｂｅａｄｓ　Ｍ　２８０）を濃度６００ 　μｇ／ｌでインキュベーション緩衝液に懸濁し、そして振盪して均質の分散に 保つ。

吸着結合部位を飽和させるために、マイクロタイタープレート（Ｎｕｎｃ　Ｍａ ｘｉ　５ｏｒｐ）の穴に、５０　ｍＭ　ＨＥＰＥＳ緩衝液１０．１５　Ｍ　Ｎａ Ｃ１ｐＨ７，９中のクロティン（Ｃｒｏｔｅｉｎ）　Ｃの１％溶液を入れ室温で １時間インキュベートする。溶液を吸引後、以下を穴に分注する：５０μｌ磁気 粒子懸濁液 ５０μＩ抱合体溶液ＭＡＢ−Ａ８−ＰＯＤ５０μｌビオチン化抗体 ５０μＩ　ＴＳＨ標準液（４０μＵ） 反応混合物を、振盪しながら室温で４５分間インキュベートする。

その後、各穴の磁気粒子を適当な磁石を使用して底に集め、それぞれの上澄みを 検温し、磁石を取り去って、粒子上にそれぞれ洗浄液０．３ｍｌを分注する。

再び磁石で粒子を収集した後、洗浄液を流し去る。洗浄手順を２回繰り返す。

３回目の洗浄後、ＡＢＴＳ基質溶液０．２ｍｌを各穴に添加し、そして振盪しな がら室温でインキュベートする。

１６分後、マイクロタイタープレートについて、穴の４０５　ｎｍでの吸光度を 光度計で測定する。

これらの測定結果を以下の表に示す。

（本貫以下余白） ビオチン化抗体　ビオチン化の　４０５　ｎｍでの度合　吸収 ＭＡＢ＜ＴＳＨ＞Ｍ−１，２０−１ｇＧ−Ｂｉ（ＤＤＳ）　ｌ　：３．５　１． ４８４ＭＡＲ＜ＴＳＨ＞Ｍ−１，２０−１ｇＧ−Ｂ　ｉ　（Ｘ−ＮＨ３）　１　 ：３．５　１．２２５ＭＡＲ＜ＴＳＨ＞Ｍ−１，２０−１ｇＧ−Ｂ　ｉ　（ＤＤ Ｓ）　ｌ　：８　１．４００ＭＡＢ＜ＴＳＨ＞Ｍ−１，２０−１ｇＧ−Ｂｉ（Ｘ −ＮＨ３）　１：８　１．２９１データにより、抗体−ＰＯＤ複合体を用いた磁 気粒子免疫学試験において光度測定する場合でさえも、ビオチン−ＤＤＳ標識抗 体を使用すると、ビオチン−Ｘ−ＮＨ３を用いてビオチン化した抗体と比較して 、有意に高いシグナルが生じることが示される。

ビオチン−ＤＤＳは再び低いビオチン化の度合において最適のシグナルを生じる 。

フロントベージの続き （７２）発明者　ツィンク、ブルーノ ドイツ連邦共和国　ディー−８２４９９ウーフィック、シープリツクシュトラー セ ４番地 （７２）発明者　レンツ、ヘルムート ドイツ連邦共和国　ディー−８２３２７チュトツィンク　フオンークールマンー シュトラーセ　１４番地 （７２）発明者　ホエス、工ヴア ドイツ連邦共和国　ディー−８２３１９スターンバーク　アム　ミュールバーク 　１エイ番地

Claims (18)

【特許請求の範囲】
1. １．一般式（Ｉ） ▲数式、化学式、表等があります▼（Ｉ）［式中、Ｂｉはビオチンまたはビオチ ン誘導体のカルボキシル基の開裂に由来する残基を意味し、 Ｒ１とＲ２は独立してお互いに水素またはＣ１−Ｃ４アルキルを意味し、ｎは４ −１０の整数を意味し、 Ｘは、１個または数個の酸素および／またはイオウ原子により置換されている、 鎖長が原子数５−２０個のアルキレン残基を意味する］の化合物。
2. ２．Ｂｉは、ビオチン、デチオビオチンまたはイミノビオチンに由来する残基を 意味する、請求項１に記載の化合物。
3. ３．Ｒ１およびＲ２は水素を意味する、請求項１または２に記載の化合物。
4. ４．ｎは６−８の整数を意味する、請求項１から３までのいずれか一項に記載の 化合物。
5. ５．Ｘは、１個または数個の酸素原子で置換されているアルキル残基を表す、請 求項１から４までのいずれか一項に記載の化合物。
6. ６．Ｘは、（ＣＨ２−ＣＨ２Ｏ）ｍＣＨ２−ＣＨ２残基［式中、ｍは１−５の整 数を意味する］を表す、請求項１から５のいずれか一項に記載の化合物。
7. ７．Ｘは、鎖長が原子数５−１１個の残基を意味する、請求項１から６までのい ずれか一項に記載の化合物。
8. ８．ビオチノイル−アミノ−３，６−ジオキサオクタニル−アミノカルボニル− ヘプタン酸−Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステル。
9. ９．一般式（ＩＩ）： ▲数式、化学式、表等があります▼（ＩＩ）［式中、Ｂｉ、Ｒ１、Ｒ２、Ｘおよ びｎは請求項１に記載の意味を持つ］の化合物を、無水中性溶媒中で、そして塩 基の存在下で、一般式（ＩＩＩ）； ▲数式、化学式、表等があります▼（ＩＩＩ）の化合物と反応させ、そして反応 生成物を単離する、請求項１から８までのいずれか一項に記載の化合物の製造方 法。
10. １０．遊離の第一および／または第二アミノ基を有する物質のビオチン化のため の、請求項１から８までのいずれか一項に記載の化合物の使用。
11. １１．タンパク質、ペプチド、核酸、ヌクレオチドまたはハプテンのビオチン化 のための請求項１０に記載の使用。
12. １２．一般式（ＩＶ）： ▲数式、化学式、表等があります▼（ＩＶ）［式中、Ｐは少なくとも１個の第一 および／または第二アミノ基ＮＨＲ３を意味し、Ｒ３は水素および／または、所 望により置換されているアルキル残基を意味し、 ｐは１以上の整数を意味し、そして Ｂｉ、Ｒ１、Ｒ２、Ｘおよびｎは請求項１に定義される］の抱合体。
13. １３．Ｐはタンパク質、ペプチド、核酸、ヌクレオチドまたはハプテンである、 請求項１１に記載の抱合体。
14. １４．Ｐはタンパク質である、請求項１３に記載の抱合体。
15. １５．Ｐは抗体または酵素的に活性なタンパク質である、請求項１４に記載の抱 合体。
16. １６．請求項１２から１５までのいずれか一項に記載の抱合体を使用するアナラ イト（ａｎａｌｙｔｅ）の測定法。
17. １７．請求項１２から１５までのいずれか一項に記載の抱合体を含む、アナライ トの測定試薬。
18. １８．溶液、粉末、または凍結乾燥品の形態の、請求項１７に記載の試薬。