JPH069690A - ラクトコッカスラクチス亜種ラクチス由来の新規のバクテリオシン - Google Patents

ラクトコッカスラクチス亜種ラクチス由来の新規のバクテリオシン

Info

Publication number
JPH069690A
JPH069690A JP4197719A JP19771992A JPH069690A JP H069690 A JPH069690 A JP H069690A JP 4197719 A JP4197719 A JP 4197719A JP 19771992 A JP19771992 A JP 19771992A JP H069690 A JPH069690 A JP H069690A
Authority
JP
Japan
Prior art keywords
polypeptide
dna
bacteria
purified
precursor
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Granted
Application number
JP4197719A
Other languages
English (en)
Other versions
JP2637879B2 (ja
Inventor
Ebenezer R Vedamuthu
エベニーザー・アール・ベーダムス
James T Henderson
ジエームズ・テイー・ヘンダーソン
John D Marugg
ジヨン・デー・マルツフ
Pieter D Vanwassenaar
ピーテル・デー・フアン・ワツセナール
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Givaudan Nederland Services BV
Original Assignee
Quest International BV
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Family has litigation
First worldwide family litigation filed litigation Critical https://patents.darts-ip.com/?family=24899255&utm_source=google_patent&utm_medium=platform_link&utm_campaign=public_patent_search&patent=JPH069690(A) "Global patent litigation dataset” by Darts-ip is licensed under a Creative Commons Attribution 4.0 International License.
Application filed by Quest International BV filed Critical Quest International BV
Publication of JPH069690A publication Critical patent/JPH069690A/ja
Application granted granted Critical
Publication of JP2637879B2 publication Critical patent/JP2637879B2/ja
Anticipated expiration legal-status Critical
Expired - Lifetime legal-status Critical Current

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/195—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from bacteria
    • C07K14/315—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from bacteria from Streptococcus (G), e.g. Enterococci
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A23—FOODS OR FOODSTUFFS; TREATMENT THEREOF, NOT COVERED BY OTHER CLASSES
    • A23B—PRESERVATION OF FOODS, FOODSTUFFS OR NON-ALCOHOLIC BEVERAGES; CHEMICAL RIPENING OF FRUIT OR VEGETABLES
    • A23B11/00—Preservation of milk or dairy products
    • A23B11/60—Preservation of cheese or cheese preparations
    • A23B11/65—Preservation of cheese or cheese preparations by addition of preservatives
    • A23B11/67—Preservation of cheese or cheese preparations by addition of preservatives of antibiotics
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A23—FOODS OR FOODSTUFFS; TREATMENT THEREOF, NOT COVERED BY OTHER CLASSES
    • A23B—PRESERVATION OF FOODS, FOODSTUFFS OR NON-ALCOHOLIC BEVERAGES; CHEMICAL RIPENING OF FRUIT OR VEGETABLES
    • A23B2/00—Preservation of foods or foodstuffs, in general
    • A23B2/70—Preservation of foods or foodstuffs, in general by treatment with chemicals
    • A23B2/725—Preservation of foods or foodstuffs, in general by treatment with chemicals in the form of liquids or solids
    • A23B2/729—Organic compounds; Microorganisms; Enzymes
    • A23B2/762—Organic compounds containing nitrogen
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A23—FOODS OR FOODSTUFFS; TREATMENT THEREOF, NOT COVERED BY OTHER CLASSES
    • A23B—PRESERVATION OF FOODS, FOODSTUFFS OR NON-ALCOHOLIC BEVERAGES; CHEMICAL RIPENING OF FRUIT OR VEGETABLES
    • A23B2/00—Preservation of foods or foodstuffs, in general
    • A23B2/70—Preservation of foods or foodstuffs, in general by treatment with chemicals
    • A23B2/725—Preservation of foods or foodstuffs, in general by treatment with chemicals in the form of liquids or solids
    • A23B2/729—Organic compounds; Microorganisms; Enzymes
    • A23B2/783—Microorganisms; Enzymes
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A23—FOODS OR FOODSTUFFS; TREATMENT THEREOF, NOT COVERED BY OTHER CLASSES
    • A23C—DAIRY PRODUCTS, e.g. MILK, BUTTER OR CHEESE; MILK OR CHEESE SUBSTITUTES; PREPARATION THEREOF
    • A23C9/00—Milk preparations; Milk powder or milk powder preparations
    • A23C9/12—Fermented milk preparations; Treatment using microorganisms or enzymes
    • A23C9/13—Fermented milk preparations; Treatment using microorganisms or enzymes using additives
    • A23C9/1322—Inorganic compounds; Minerals, including organic salts thereof, oligo-elements; Amino-acids, peptides, protein-hydrolysates or derivatives; Nucleic acids or derivatives; Yeast extract or autolysate; Vitamins; Antibiotics; Bacteriocins
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
    • A61P31/04—Antibacterial agents
    • Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y10—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC
    • Y10S—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y10S435/00—Chemistry: molecular biology and microbiology
    • Y10S435/80—Elimination or reduction of contamination by undersired ferments, e.g. aseptic cultivation
    • Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y10—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC
    • Y10S—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y10S435/00—Chemistry: molecular biology and microbiology
    • Y10S435/8215—Microorganisms
    • Y10S435/822—Microorganisms using bacteria or actinomycetales
    • Y10S435/853—Lactobacillus
    • Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y10—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC
    • Y10S—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y10S435/00—Chemistry: molecular biology and microbiology
    • Y10S435/8215—Microorganisms
    • Y10S435/822—Microorganisms using bacteria or actinomycetales
    • Y10S435/885—Streptococcus

Landscapes

  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Polymers & Plastics (AREA)
  • Food Science & Technology (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Nutrition Science (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Oncology (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Communicable Diseases (AREA)
  • Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
  • Peptides Or Proteins (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
  • General Preparation And Processing Of Foods (AREA)
  • Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
  • Dairy Products (AREA)
  • Saccharide Compounds (AREA)

Abstract

(57)【要約】 【構成】Ｌａｃｔｏｃｏｃｃｕｓ ｌａｃｔｉｓ亜種ｌ
ａｃｔｉｓ ＮＲＲＬ−Ｂ−１８８０９から誘導される
バクテリオシンまたはポリペプチド（ＬＬ−２，配列番
号：２）、配列決定されたＤＮＡ及びそれによってコー
ドされる前駆ポリペプチド（配列番号：１）、並びに該
ポリペプチドＬＬ−２の使用及び製造方法。 【効果】食品等を処理するのに有効である、特定のグラ
ム陽性細菌を阻害するバクテリオシンが提供される。

Description

【発明の詳細な説明】
【０００１】
【産業上の利用分野】本発明は、特定のグラム陽性細菌
に対して阻害性を示すＬａｃｔｏｃｏｃｃｕｓ ｌａｃ
ｔｉｓ亜種ｌａｃｔｉｓによって産生される、バクテリ
オシンとも称される新規のポリペプチド、該バクテリオ
シンを用いてグラム陽性細菌を阻害する方法、及び該バ
クテリオシンを生産する方法に係わる。特に本発明は、
Ｌａｃｔｏｃｏｃｃｕｓ ｌａｃｔｉｓ亜種ｌａｃｔｉ
ｓ ＮＲＲＬ−Ｂ−１８８０９由来のＤＮＡによってコ
ードされるバクテリオシン、及びＤＮＡの発現後に翻訳
後修飾される前駆ポリペプチドに係わる。
【０００２】
【従来の技術】乳酸菌は、通常は非病原性及び発酵性で
ある一群のグラム陽性球菌及び桿菌からなる。この群に
含まれる属は、Ｌａｃｔｏｃｏｃｃｕｓ、Ｓｔｒｅｐｔ
ｏｃｏｃｃｕｓ、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ及びＰｅ
ｄｉｏｃｏｃｃｕｓである。これらの属の多くの菌が伝
統的に食品発酵に使用されており、“ｇｅｎｅｒａｌｌ
ｙ ｒｅｇａｒｄｅｄ ａｓ ｓａｆｅ（ＧＲＡＳ）”
と考えられている。乳酸菌による拮抗性物質及びバクテ
リオシンの産生は広範に報告されている〔Ｋｌａｅｎｈ
ａｍｍｅｒ，Ｔ．Ｒ．，Ｂｉｏｃｈｉｍｉｅ．７０：３
３７−３４９（１９８８）〕。かかる細菌によって産生
されるバクテリオシンの或るものはかなり狭域性（例え
ば極めて近縁の種）であり、また、或るものは、属を越
えるほどの広域性を示す。発酵食品における出発培養体
として一般に使用されるＬａｃｔｏｃｏｃｃｕｓ属の菌
は、Ｌａｃｔｏｃｏｃｃｕｓ ｌａｃｔｉｓ亜種ｌａｃ
ｔｉｓ、及びＬａｃｔｏｃｏｃｃｕｓ ｌａｃｔｉｓ亜
種ｃｒｅｍｏｒｉｓである。これらの種はいずれもバク
テリオシンを産生する。Ｌａｃｔｏｃｏｃｃｕｓ ｌａ
ｃｔｉｓ亜種ｌａｃｔｉｓ由来の十分に特性分析され且
つ学術的に認識されているバクテリオシンはナイシン
（ｎｉｓｉｎ）である。Ｌａｃｔｏｃｏｃｃｕｓｌａｃ
ｔｉｓ亜種ｃｒｅｍｏｒｉｓはジプロコッシン（ｄｉｐ
ｌｏｃｏｃｃｉｎ）を産生する。ナイシンは広域の抗菌
スペクトルを有するが〔Ｈｕｒｓｔ，Ａ．，Ａｄｖａｎ
ｃｅｓ Ａｐｐｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．２７：８５−
１２３（１９８１）〕、ジプロコッシンは主に、Ｌａｃ
ｔｏｃｏｃｃｕｓ ｌａｃｔｉｓ亜種ｌａｃｔｉｓ及び
他のバクテリオシン非産生Ｌａｃｔｏｃｏｃｃｕｓ ｌ
ａｃｔｉｓ亜種ｃｒｅｍｏｒｉｓ株に対して活性を示す
〔Ｆｏｓｔｅｒ，Ｅ．Ｍ．，Ｆ．Ｅ．Ｎｅｌｓｏｎ，
Ｍ．Ｌ．Ｓｐｅｃｋ，Ｒ．Ｎ．Ｄｏｅｔｓｃｈ，及び
Ｊ．Ｃ．Ｏｌｓｏｎ，Ｊｒ．，Ｄａｉｒｙ Ｍｉｃｒｏ
ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｐｒｅｎｔｉｃｅ−Ｈａｌｌ Ｉｎ
ｃ．，Ｅｎｇｌｅｗｏｏｄ Ｃｌｉｆｆｓ，Ｎ．Ｊ．
ｐ．１５（１９５７）〕。ナイシンの広範な抗菌活性及
びその潜在用途のため〔Ｈｕｒｓｔ，Ａ．，Ａｄｖａｎ
ｃｅｓ Ａｐｐｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．２７：８５−
１２３（１９８１）；Ｄｅｌｖｅｓ−Ｂｒｏｕｇｈｔｏ
ｎ，Ｊ．Ｆｏｏｄ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，４４：１０
０−１１２，１１７（１９９０）〕、広域抗菌スペクト
ルを有する異なるバクテリオシンを産生するこの群内の
他の株について調査が行われた。
【０００３】ナイシンの構造特性は幾つかの文献で十分
に考察されている〔Ｋｌａｅｎｈａｍｍｅｒ，Ｔ．
Ｒ．，Ｂｉｏｃｈｉｍｉｅ，７０：３３７−３４９（１
９８８）；Ｇｅｉｓ，Ａ．，Ｋｉｅｌｅｒ Ｍｉｌｃｈ
ｗｉｒｔｓｃｈａｆｔｌｉｃｈｅＦｏｒｓｃｈｕｎｇｓ
ｂｅｒｉｃｈｔｅ ４１：９７−１０４（１９８
９）〕。ナイシン遺伝子のヌクレオチド配列は公知であ
り〔Ｂｕｃｈｍａｎ，Ｇ．Ｗ．，ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｂ
ｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６３：１６２６０−１６２６６
（１９８８）〕、その翻訳後修飾〔Ｋａｌｅｔｔａ，
Ｃ．ａｎｄ Ｋ−Ｄ Ｅｎｔｉａｎ．，Ｊ．Ｂａｃｔｅ
ｒｉｏｌ．１７１：１５９７−１６０１（１９８９）〕
及び分解生成物〔Ｃｈａｎ．Ｗ．Ｃ．，ｅｔ ａｌ．，
ＦＥＢＳ Ｌｅｔｔ．２５２：２９−３６（１９８
９）；Ｂａｒｂｅｒ，Ｍ．，ｅｔ ａｌ．，Ｅｘｐｅｒ
ｅｎｔｉａ ４４：２６６−２７０（１９８８）〕につ
いても記述されている。ナイシンの溶解コンフォーメー
ション〔Ｓｌｉｊｐｅｒ，Ｍ．，ｅｔ ａｌ．，ＦＥＢ
Ｓ Ｌｅｔｔ．２５２：２２−２８（１９８９）〕及び
他の物理的及び化学的特性〔Ｌｉｕ，Ｗ．及びＪ．Ｎ．
Ｈａｎｓｅｎ，Ａｐｐｌ．Ｅｎｖｉｒｏｎ．Ｍｉｃｒｏ
ｂｉｏｌ．５６：２５５１−２５５８（１９９０）〕も
決定されている。
【０００４】ナイシンは、エピデルミン（ｅｐｉｄｅｒ
ｍｉｎ）〔Ｓｃｈｎｅｌｌ，Ｎ．，ｅｔ ａｌ．，Ｎａ
ｔｕｒｅ ３３３：２７６−２７８（１９８８）〕、ｐ
ｅｐ５〔Ｗｅｉｌ，Ｈ−Ｐ．，ｅｔ ａｌ．，Ｅｕｒ．
Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．１９４：２１７−２２３（１９９
０）〕、ランチオペプチン（ｌａｎｔｈｉｏｐｅｐｔｉ
ｎ）〔Ｗａｋａｍｉｙａ，Ｔ．，ｅｔ ａｌ．，Ｔｅ
ｔ．Ｌｅｔｔ．２９：４７７１−４７７２（１９８
８）〕、アンコベニン（ａｎｃｏｖｅｎｉｎ）〔Ｗａｋ
ａｍｉｙａ，Ｔ．，ｅｔ ａｌ．，Ｔｅｔ．Ｌｅｔｔ．
２９：４７７１−４７７２（１９８８）〕、ズブチリン
（ｓｕｂｔｉｌｉｎ）〔Ｂｕｃｈｍａｎ，Ｇ．Ｗ．，ｅ
ｔ ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６３：１６２
６０−１６２６６（１９８８）〕及びガリデルミン（ｇ
ａｌｌｉｄｅｒｍｉｎ）〔Ｋｅｌｌｎｅｒ Ｒ．ａｎｄ
Ｇ．Ｊｕｎｇ．，Ｐｒｏｃ．２０ｔｈ Ｅｕｒｏｐ．
Ｐｅｐｔｉｄｅ Ｓｙｍ．３６６−３６８（１９８
８）〕を含む他の公知のランチオニン含有バクテリオシ
ンと類似である。前述の抗生物質は、グラム陽性細菌に
限定される阻害範囲を有する、小さくて（３５００Ｄ
ａ）塩基性（ｐＩ＞１０）の翻訳後修飾タンパク質の特
性を有する。ナイシンは、Ｂａｃｉｌｌｉ及びＣｌｏｓ
ｔｒｉｄｉａの胞子形成を制限する能力を有すると考え
られている。
【０００５】Ｇｏｎｚａｌｅｚの米国特許第４，８８
３，６７３号はペジオシンを記載している。Ｖａｎｄｅ
ｎｂｅｒｇｈらの米国特許第４，９２９，４４５号はペ
ジオシンをコードするＤＮＡを記載している。Ｇｏｎｚ
ａｌｅｚらの米国特許第４，７４０，５９３号及び第
４，７１６，１１５号は、種々のＤＮＡ操作技術を使用
してナイシン非産生微生物に移入されたナイシン産生微
生物由来のＤＮＡを含む微生物を記載している。従来技
術においては更に、Ｌａｃｔｏｃｏｃｃｕｓ及びＰｅｄ
ｉｏｃｏｃｃｕｓ由来の抗菌物質の生産も記述されてい
るが、これは本発明とは関係ない。
【０００６】共通譲受人に譲渡された米国特許出願第０
７９／４９２，９６９号は、Ｌａｃｔｏｃｏｃｃｕｓ
ｌａｃｔｉｓ ＮＲＲＬ−Ｂ−１８５３５由来のバクテ
リオシンＬＬ−１を記載している。この株はナイシンに
近縁のバクテリオシンを産生するのに対して、本発明の
バクテリオシンＬＬ−２はナイシンとは異なる。
【０００７】
【発明が解決しようとする課題】本発明の目的は、Ｌａ
ｃｔｏｃｏｃｃｕｓ ｌａｃｔｉｓ亜種ｌａｃｔｉｓＮ
ＲＲＬ−Ｂ−１８８０９のＤＮＡから誘導される新規の
バクテリオシンを提供することである。本発明の別の目
的は、該バクテリオシンの前駆ポリペプチドをコードす
るＤＮＡを提供することである。本発明の更に別の目的
は、該バクテリオシンを使用して、特定のグラム陽性細
菌を阻害する方法を提供することである。本発明の最後
の目的は、該バクテリオシンを生産する方法を提供する
ことである。本発明の上記目的及び他の目的は以下の説
明及び添付の図面を参照することにより明らかとなるで
あろう。
【０００８】
【課題を解決するための手段】本発明は、感受性グラム
陽性細菌に対する阻害活性を有し且つアミノ酸配列：
【０００９】
【化３】 〔ここで、Ｘａａは、Ｓｅｒ、Ａｌａ−またはＤｈａか
ら選択され、Ｘａｂは、Ａｂｕ−またはＤｈｂから選択
され、且つＸａｃはＡｌａ−Ｓ−から選択され（但しＡ
ｌａ−は３−置換アラニン（−（ＣＯ）ＣＨ（ＮＨ−）
ＣＨ2−）であり、Ａｂｕ−は３−置換２−アミノブタ
ン酸（−（ＣＯ）ＣＨ（ＮＨ−）ＣＨ（ＣＨ3）−）で
あり、Ａｌａ−Ｓ−は（３−アラニル）−チオであり、
Ａｂｕは２−アミノブタン酸であり、Ｄｈａは２−アミ
ノプロペン酸であり、Ｄｈｂは２−アミノブト−２−エ
ノン酸である）、これらのサブユニットは感受性菌に対
して実質的に等価の阻害活性を有する〕を有するポリペ
プチドに係わる。
【００１０】本発明は特に、増殖培地中でＬａｃｔｏｃ
ｏｃｃｕｓ ｌａｃｔｉｓ亜種ｌａｃｔｉｓ ＮＲＲＬ
−Ｂ−１８８０９によって産生され、感受性グラム陽性
細菌に対する阻害活性を有するポリペプチドに係わる。
【００１１】本発明は更に、特定のグラム陽性細菌に対
する阻害活性を有するポリペプチドの前駆ポリペプチド
をコードする遺伝子を含むＤＮＡを生産する方法であっ
て、前記ポリペプチドの前駆ポリペプチドをコードする
ＤＮＡ配列を含むＬａｃｔｏｃｏｃｃｕｓ ｌａｃｔｉ
ｓ亜種ｌａｃｔｉｓ ＮＲＲＬ−Ｂ−１８８０９由来の
ＤＮＡを準備し、前記ＤＮＡに、センスプライマーとし
て５’−ＣＧＣＧＡＧＣＡＴＡＡＴＡＡＡＣＧＧＣＴ−
３’及びアンチセンスプライマーとして５’−ＧＧＡＴ
ＡＧＴＡＴＣＣＡＴＧＴＣＴＧＡＡＣ−３’を使用する
ポリメラーゼ連鎖反応を実施して、前記前駆ポリペプチ
ドをコードする遺伝子を含むＤＮＡ配列を生産すること
からなる方法にも係わる。
【００１２】本発明は特に、ポリヌクレオチド１−３２
１：
【００１３】
【化４】 である、前駆ポリペプチドをコードするＤＮＡ配列に係
わる。
【００１４】更に本発明は、配列：
【００１５】
【化５】 を有する前駆ポリペプチドにも係わる。
【００１６】本発明は更に、感受性グラム陽性細菌に対
する活性を有するポリペプチドを生産する方法であっ
て、Ｌａｃｔｏｃｏｃｃｕｓ ｌａｃｔｉｓ亜種ｌａｃ
ｔｉｓＮＲＲＬ−Ｂ−１８８０９中に担持されるような
ＤＮＡを含む乳酸菌を、炭素源、窒素源及び無機塩類を
含む増殖培地中に、特定の細菌に対する阻害活性を有す
るポリペプチドを発現するような条件下に与え、必要に
よっては、前記ポリペプチドを前記増殖培地から単離す
ることからなる方法にも係わる。特に本発明は、Ｌａｃ
ｔｏｃｏｃｃｕｓ ｌａｃｔｉｓ亜種ｌａｃｔｉｓ Ｎ
ＲＲＬ−Ｂ−１８８０９の培養体によって産生されるポ
リペプチドを精製する方法であって、前記培養体によっ
て発酵されたブロスを、好ましくはアニオン交換樹脂を
使用するクロマトグラフィーカラムに通し、精製形態の
ポリペプチド含有製品を前記クロマトグラフィーカラム
から、好ましくは制御された溶出によって回収すること
により精製を実施する方法にも係わる。
【００１７】本発明は更に、前記ポリペプチドを使用し
て感受性グラム陽性細菌を阻害する方法にも係わる。特
に本発明は、細菌を、阻害量の前述のポリペプチドに暴
露し、それによって該細菌を阻害することからなる、感
受性グラム陽性細菌を阻害する方法にも係わる。
【００１８】Ｌａｃｔｏｃｏｃｃｕｓ ｌａｃｔｉｓ亜
種ｌａｃｔｉｓ ＮＲＲＬ−Ｂ−１８８０９は、ブタペ
スト条約に則り、イリノイ州ペオリアにあるｔｈｅ Ｎ
ｏｒｔｈｅｒｎ Ｒｅｇｉｏｎａｌ Ｒｅｓｅａｒｃｈ
Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙに寄託されており、名称及び受
託番号による請求により入手可能である。バクテリオシ
ンＬＬ−２をコードするプラスミドｐＳＲＱ４００もこ
の寄託に含まれている。この株は、スクロース陽性、ラ
クトース陽性、凝乳及びアルギニンデアミナーゼ陽性と
いう顕著な発酵特性を有する。
【００１９】プラスミドｐＳＲＱ４００は、交配する
か、または微生物間でプラスミドを移入する種々の公知
の方法によって他のＬａｃｔｏｃｏｃｃｕｓ種に移入す
ることができる。バクテリオシンに対する前駆ポリペプ
チドをコードするＤＮＡも、当業者には公知のごときベ
クターを用いる組換え遺伝子技術を使用し、種々の微生
物に移入することができる。
【００２０】バクテリオシンを培養して生産した場合、
単離及び精製することが好ましい。バクテリオシンは約
１００，０００ダルトンに凝集し、まずは、バクテリオ
シンを被保持物とする限外濾過によって精製することが
できる。次いでバクテリオシンをＨＰＬＣによって精製
することができる。
【００２１】バクテリオシンは、下記のものを含む特定
のグラム陽性細菌を阻害するために使用される：Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｐｌａｎｔａｒｕｍ；Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｃａｓｅｉ；Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｂｒｅｖｉｓ；Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｂｕｌｇａｒｉｃｕｓ；Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｆｅｒｍｅｎｔｕｍ；Ｐｅｄｉｏｃｏｃｃｕｓ ａｃｉｄｉｌａｃｔｉｃｉ；Ｐｅｄｉｏｃｏｃｃｕｓ ｐｅｎｔｏｓａｃｅｕｓ；Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｍｕｔａｎｓ；Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ；及びＬａｃｔｏｃｏｃｃｕｓ ｌａｃｔｉｓ。
【００２２】粗ＬＬ−２は、ＨＰＬＣによって精製され
たバクテリオシンほど有効ではなく、これは、精製バク
テリオシンは単位容積当たりの活性がより高いためと推
定される。ＬＬ−２はＬＬ−２ＡとＬＬ−２Ｂとに分離
可能であり、前者のポリペプチドは後者から誘導され
る。
【００２３】バクテリオシンの活性は、１ｍｌ当たりの
任意単位（Ａｒｂｉｔｒａｒｙ Ｕｎｉｔｓ，ＡＵ）で
表される。ＡＵは、この場合にはＰｅｄｉｏｃｏｃｃｕ
ｓｐｅｎｔｏｓａｃｅｕｓ ＦＢＢ６３Ｃである指標株
に対して明らかな増殖阻害域を与える最高希釈度の培養
液上清５μｌと定義される。力価は、阻害を示す最高希
釈度の逆数で示される。
【００２４】培養液上清は、１ｍｌ当たり約１６００Ａ
Ｕのバクテリオシンを含む。ＨＰＬＣ精製バクテリオシ
ンは約２，５００，０００ＡＵ／ｍｌを示した。一般
に、試験した材料１ｇ当たり約１５〜１００ＡＵであれ
ば、阻害を与えるに十分である。
【００２５】阻害を与えるように処理される材料は食品
であるのが好ましいが、他の非食品材料をバクテリオシ
ンで処理することもできる。
【００２６】
【実施例】
実施例１ この実施例は、Ｌａｃｔｏｃｏｃｃｕｓ ｌａｃｔｉｓ
亜種ｌａｃｔｉｓ ＮＲＲＬ−Ｂ−１８８０９及びそれ
から産生されるバクテリオシンの単離及び特性分析を示
す。
【００２７】乳酸菌の単離 乳酸菌の天然“野生”株を幅広く選択するために、生
乳、発酵野菜及び果物、並びに新鮮な野菜といったかか
る細菌の自然繁殖試料を、集積（ｅｎｒｉｃｈｍｅｎ
ｔ）のまたは無集積の適当な培地に置いた〔Ｓｐｅｃ
ｋ，Ｍ．Ｌ．，Ｃｐｍｐｅｎｄｉｕｍ ｏｆ Ｍｅｔｈ
ｏｄｓ ｆｏｒ ｔｈｅ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｉｃ
ａｌ Ｅｘａｍｉｎａｔｉｏｎ ｏｆ Ｆｏｏｄｓ，Ａ
ｍｅｒｉｃａｎＰｕｂｌｉｃ Ｈｅａｌｔｈ Ａｓｓｏ
ｃｉａｔｉｏｎ，Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ，Ｄ．Ｃ．，ｐ
ｐ．１８４−１９４（１９８４）〕。集積は通常、ブロ
ス培養液中に高濃度、即ち２％〜６％の食塩（ＮａＣ
ｌ）を使用し、同じ量のＮａＣｌを含む固相培地上で平
板培養することを含む。
【００２８】抗菌活性についてのスクリーニング 寒天プレート上に現れたコロニーを、通常は広域の抗菌
スペクトルを示す特定の指標菌に対する抗菌活性につい
てスクリーニングした。選択した指標菌はＰｅｄｉｏｃ
ｏｃｃｕｓ ｐｅｎｔｏｓａｃｅｕｓ ＦＢＢ６３Ｃ
〔Ｇｏｎｚａｌｅｚ，Ｃ．Ｆ．，ａｎｄ Ｂ．Ｓ．Ｋｕ
ｎｋａ，Ａｐｐｌ．Ｅｎｖｉｒｏｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏ
ｌ．５３：２５３４−２５３８（１９８７）及びＧｏｎ
ｚａｌｅｚの米国特許第４，８８３，６７３号〕であっ
た。コロニーを拾い上げて、緩衝液として１．９％ナト
リウムβ−グリセロホスフェートを含む寒天プレート上
にレプリカを作り、コロニー出現後に、指標菌で覆うこ
とにより抗菌活性を測定した。
【００２９】抗菌単離体の特性分析 抗菌活性を示す培養体のグラム染色反応、細胞形態及び
構造、主要な炭水化物発酵を、特別な炭水化物を含むパ
ープルベースブロスを用いて調査し、更に凝乳能につい
ても調査した。
【００３０】バクテリオシンアッセイ 抗菌物質が液体培地中に分泌されているか確認するため
に、培養体をＭＲＳブロス中で増殖させ、濃密な培養液
の無細胞濾液をつくり、濾液を、指標菌を播種した半固
体寒天の重層の上に置いた。任意単位を割り当てること
により抗菌活性を定量化した。１任意単位（ＡＵ）は、
一面の指標菌上に明確な阻害域を与える５μｌの培養液
上清と定義した。力価は、阻害を示す上清の最高希釈度
の逆数で表わした。
【００３１】粗バクテリオシンの予備特性分析 サイズ、分子量、最適ｐＨ、酵素の影響、バクテリオシ
ン力価に及ぼす補充栄養素の影響についてのバクテリオ
シンの予備特性分析を、Ｇｏｎｚａｌｅｚ及びＫｕｎｋ
ａによって記載されている方法〔Ｇｏｎｚａｌｅｚ，
Ｃ．Ｆ．，ａｎｄＢ．Ｓ．Ｋｕｎｋａ，Ａｐｐｌ．Ｅｎ
ｖｉｒｏｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．５３：２５３４−２
５３８（１９８７）〕を使用して行なった。
【００３２】プラスミドの単離、電気泳動及びキュアリ
ング（ｃｕｒｉｎｇ） 培養液のプラスミド含有量を、Ｇｏｎｚａｌｅｚ及びＫ
ｕｎｋａによって記載されている方法〔Ｇｏｎｚａｌｅ
ｚ，Ｃ．Ｆ．ａｎｄ Ｂ．Ｓ．Ｋｕｎｋａ，Ａｐｐｌ．
Ｅｎｖｉｒｏｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．４６：８１−８
９（１９８３）〕を使用して調査した。
【００３３】プラスミドキュアリング 既に記載されている方法〔Ｇｏｎｚａｌｅｚ，Ｃ．Ｆ．
ａｎｄ Ｂ．Ｓ．Ｋｕｎｋａ，Ａｐｐｌ．Ｅｎｖｉｒｏ
ｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．４６：８１−８９（１９８
３）〕に従う高温及びキュアリング剤を使用し、プラス
ミドキュアリングを行なった。
【００３４】バクテリオシンの大規模培養及び精製方法 ４リットルのＭＲＳブロス（Ｄｉｆｃｏ，Ｄｅｔｒｏｉ
ｔ，ＭＩ）に、ＭＲＳブロス中で８時間増殖させた培養
株ＮＲＲＬ−Ｂ−１８８０９を１％で接種し、３２℃で
２４時間静置して増殖させた。１６，３００×ｇ，４℃
で１５分間遠心することにより細胞を除去した。孔径
０．２μｍのポリビニリデンジフルオリド（ＰＶＤＦ）
膜を備えたＭｉｎｉｔａｎ遠心濾過（ｔａｎｇｅｎｔｉ
ａｌ ｆｉｌｔｒａｔｉｏｎ）装置（Ｍｉｌｌｉｐｏｒ
ｅ，Ｂｅｄｆｏｒｄ，ＭＡ）を使用し、上清を濾過し
た。バクテリオシン産生を前述のごとく評価した。培地
のｐＨは５．０より低かった。
【００３５】ＬＬ−２の精製 遠心濾過して得た濾液を、１０％塩酸を使用してｐＨ
４．０に調整し、次いで、表面積１平方フィート及び分
子量カットオフ３０００ダルトンの螺旋形セルロースベ
ース限外濾過カートリッジ（Ａｍｉｃｏｎ Ｓ１Ｙ３，
Ｂｅｖｅｒｌｙ，ＭＡ）を使用し、約２倍に濃縮した。
濃縮は、蠕動ポンプ（Ｃｏｌｅ−Ｐａｒｍｅｒ，Ｃｈｉ
ｃａｇｏ，ＩＬ）を使用し、膜の両側の差を２０ｌｂ／
ｉｎ2に維持して４℃で実施した。
【００３６】濃縮上清のアリコート１６００ｍｌを、
０．１Ｍ酢酸ナトリウム緩衝液，ｐＨ４．０で平衡化し
ておいたＤＥＡＥ−６５０Ｍアニオン交換樹脂（Ｔｏｓ
ｏ−Ｈａａｓ，Ｐｈｉｌａｄｅｌｐｈｉａ，ＰＡ）の１
０ｃｍ×２０ｃｍカラム（１．５７リットル）に、流量
１０ｍｌ／分でアプライした。２８０ｎｍにおける溶出
液の吸収をモニターし、最初にベースライン吸収から増
加したときから再びベースライン吸収に戻るまでの溶出
液を回収した。溶出液容量は３１５０ｍｌであり、活性
は１６００ＡＵ／ｍｌであった。
【００３７】カチオン交換樹脂に対するバクテリオシン
の最大結合を得るためには、前濃縮処理及びアニオン交
換クロマトグラフィーが必要である。
【００３８】アニオン交換クロマトグラフィーから得た
溶出液の全量を、０．１Ｍ酢酸ナトリウム緩衝液，ｐＨ
４．０で平衡化しておいたＣＭ−６５０Ｍカチオン交換
樹脂（Ｔｏｓｏ−Ｈａａｓ，Ｐｈｉｌａｄｅｌｐｈｉ
ａ，ＰＡ）の１０ｃｍ×３５ｃｍカラム（２．７５リッ
トル）にアプライした。１Ｍ塩化ナトリウムを含む同じ
緩衝液，ｐＨ４．０を使用して活性を溶出させた。導電
率が最初にベースライン導電率（０．１５９マイクロジ
ーメンス／ｃｍ）から増加した時点から溶出液を回収し
た。
【００３９】２８０ｎｍにおける吸収がベースライン吸
収に戻ったときに回収を止めた。溶出量は２０００ｍｌ
であり、活性は１６００ＡＵ／ｍｌであった。
【００４０】カチオン交換クロマトグラフィーからの溶
出液を、限外濾過によって約２０倍に濃縮して１１０ｍ
ｌとした（Ａｍｉｃｏｎ Ｓ１Ｙ３，Ｂｅｖｅｒｌｙ，
ＭＡ）。５００ｍｌの脱イオン水を加えることにより、
塩化ナトリウム含有量を約５分の１に減らし、次いでも
う一度１１０ｍｌまで濃縮した。カートリッジを空に
し、５０ｍｌの脱イオン水で洗浄した。濃縮液を洗浄液
と混ぜて、２５，６００ＡＵ／ｍｌの活性を有する１５
０ｍｌのバクテリオシンを得た。
【００４１】バクテリオシン濃縮物の量を真空遠心分離
装置（Ｓａｖａｎｔ，Ｆａｒｍｉｎｇｄａｌｅ，ＮＹ）
を使用して更に減らし、１２ｍｌとした。この濃縮物の
アリコートを、０．１％トリフルオロ酢酸（ＴＦＡ）水
溶液で平衡化しておいた２．５ｃｍ×２５ｃｍ ＯＤＳ
カラム（Ｖｙｄａｃ，Ｈｉｓｐｅｒｉａ，ＣＡ）にアプ
ライした。典型的には０．１％トリフルオロ酢酸を含む
４５％アセトニトリルまで３０分間で直線形に変化させ
る濃度勾配を使用し、活性を溶出させた。流量は１０ｍ
ｌ／分とした。フラクションを０．５分間隔で回収し、
各フラクションからとった５μｌをＰ．ｐｅｎｔｏｓａ
ｃｅｕｓ ＦＢＢ６３Ｃ指標菌プレートに直接滴下する
ことにより、クロマトグラム内に活性を位置付けた。Ｕ
Ｖ検出器（Ｂｅｃｋｍａｎ １６６，ＳａｎＲａｍｏ
ｎ，ＣＡ）を使用し、波長２３０ｎｍにいてタンパク質
溶出をモニターした。
【００４２】２７．５〜２８．５分に溶出した第１の活
性域及び３２〜３７分に溶出した第２の活性域の２つの
活性域が一貫して観察された。真空遠心分離を使用して
全てのフラクションを脱水し、活性フラクションを０．
１ｍｌの脱イオン水中で再生し、次のように混合した。
即ち、２７．５分〜２８．５分の間に溶出した活性フラ
クションをＬＬ−２Ａとして混合し、３２．５分〜３３
分の間に溶出した活性フラクションをＬＬ−２Ｂとして
混合した。
【００４３】ＬＬ−２Ａ成分を、２．５ｃｍ×２５ｃｍ
ＯＤＳカラム（Ｖｙｄａｃ，Ｈｉｓｐｅｒｉａ，Ｃ
Ａ）に前述のごとくアプライすることにより更に精製し
た。０．１％ＴＦＡを含み且つ３０分間で２０％から４
０％まで直線形に増加するアセトニトリル濃度勾配を実
施した。活性は２６．５分〜２８．０分の間に溶出した
ことが認められた。これらの溶出範囲内のフラクション
を真空遠心分離によって脱水し、精製ＬＬ−２Ａとして
混合した。
【００４４】ＨＰＬＣ分析 ２３０ｎｍにおける吸収をモニターするようにセットし
たＵＶ検出器を用い、０．４５×２５ｃｍのＯＤＳカラ
ム（Ｖｙｄａｃ，Ｈｉｓｐｅｒｉａ，ＣＡ）を使用する
ＨＰＬＣクロマトグラフィーにおけるピークの出現によ
り、精製タンパク質の特性を分析した。０．１％ＴＦＡ
から０．１％ＴＦＡを含む４５％アセトニトリルまでの
濃度勾配を使用し、溶出プロフィールを得た。
【００４５】アミノ酸分析 加水分解用試料を真空脱水によって脱水し、０．１ｍｌ
の６Ｎ ＨＣｌ（Ｐｉｅｒｃｅ，Ｒｏｃｋｆｏｒｄ，Ｉ
Ｌ）中で再生し、再び脱水し、Ｒｅａｃｔｉ−Ｔｈｅｒ
ｍ加熱ブロック（Ｐｉｅｒｃｅ，Ｒｏｃｋｆｏｒｄ，Ｉ
Ｌ）内に置いた８ｍｍ×６０ｍｍの加水分解試験管（Ｐ
ｉｅｒｃｅ，Ｒｏｃｋｆｏｒｄ，ＩＬ）において１１０
℃で２４時間、真空下に加水分解した。Ｐｉｃｏ−Ｔａ
ｇ誘導体化システム（Ｗａｔｅｒｓ，Ｍｉｌｆｏｌｄ，
ＭＡ）に与えられた指示のもとにＰＩＴＣ誘導体を製造
し、逆相カラムは専売品のＰｉｃｏ−Ｔａｇカラムに代
えて０．４５ｃｍ×２５０ｃｍ Ｃ18カラム（Ｂｅｃｋ
ｍａｎ，ＳｕｎＲａｍｏｉｎ，ＣＡ）としたことを除い
ては指示されたＰｉｃｏ−Ｔａｇプロトコルを使用し
て、２５４ｎｍにおいてＰＴＣ誘導体を検出した。
【００４６】酵素反応 粗及び精製バクテリオシンのトリプシン及びキモトリプ
シン感受性を調査した。酵素はＳｉｇｍａ（Ｓｔ．Ｌｏ
ｕｉｓ，ＭＯ）から購入し、使用するまで−２０℃で凍
結乾燥して保管した。０．１ｍＭ塩化カルシウムを含む
０．１Ｍ重炭酸アンモニウム緩衝液，ｐＨ７．８中で、
酵素反応を実施した〔Ｄｅｕｔｃｈｅｒ，Ｍ．Ｐ．，Ｍ
ｅｔｈ．Ｅｎｚｙｍｏｌ．１８２：６１１−６１２（１
９９０）〕。感受性であるとは、細菌を含む寒天プレー
トの表面にバクテリオシンを容量５μｌ中に１６単位の
活性の割合で与えたときに、バクテリオシンが指標菌集
団の増殖を阻害できないことと定義した。
【００４７】アミノ酸配列 気相配列決定装置（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅ
ｍｓ，ＦｏｓｔｅｒＣｉｔｙ，ＣＡ）を用い、製造業者
によって提供されたプロトコルに従って配列情報を得
た。
【００４８】ＳＤＳポリアクリルアミドゲル電気泳動 １２．５％の固定アクリルアミド濃度及び１０％から２
５％までの直線濃度勾配を有するゲルを準備した。架橋
剤はピペリジンジアクリルアミド（ＢｉｏＲａｄ，Ｒｉ
ｃｈｍｏｎｄ，ＣＡ）であった。ゲルをクーマシーブリ
リアントブルーＧで染色し次いで銀で染色するか（Ｂｉ
ｏＲａｄ，Ｒｉｃｈｍｏｎｄ，ＣＡ）、または指標菌
Ｐ．ｐｅｎｔｏｓａｃｅｕｓ ＦＢＢ−６３Ｃ細胞〔Ｂ
ｈｕｎｉａ，Ｊ．Ｉｎｄ．Ｍｉｃｒｏ．Ｂｉｏｌ．２：
３１９−３２２（１９８７）〕を含む軟質寒天をゲルの
上に層状に重ねることにより活性分析を行なうために無
染色とした。無染色ゲルは、予備染色標準物質〔Ｂｉｏ
Ｒａｄ，Ｒｉｃｈｍｏｎｄ，ＣＡ〕を用いて較正した。
【００４９】バクテリオシン産生Ｌａｃｔｏｃｏｃｃｉ
の単離及び特性分析 スクリーニングの間に、優れた抗菌活性を示すコロニー
が認められた。コロニーを画線培養し、単離したコロニ
ーを増殖させ、阻害活性について再試験し、保存した。
培養体は、単鎖をなすグラム陽性球菌であると判明し、
細胞形態は楕円であり、乳酸連鎖球菌の特性を示した。
培養体は凝乳を惹起し、スクロース発酵に対して陽性で
あった。この培養体は、Ｌａｃｔｏｃｏｃｃｕｓ ｌａ
ｃｔｉｓ亜種ｌａｃｔｉｓと同定され、ＮＲＲＬ−Ｂ−
１８８０９と表示した。
【００５０】培養体は、単一の大きなプラスミドｐＳＲ
Ｑ４００（大きさ６９Ｋｂ）を有していた。高温インキ
ュベーション（４２〜４３℃）を使用してプラスミドを
キュアリングすると、阻害活性及びラクトース発酵能が
失われた。キュアリング剤（ａｃｒｉｆｌａｖｉｎ、ｐ
ｒｏｆｌａｖｉｎ、ｎｏｖｏｂｉｏｃｉｎ）を使用して
数回繰り返した実験では、スクロースを発酵できないコ
ロニーは得られなかった。これらの結果から、バクテリ
オシン産生（Ｂａｃ+）及びラクトース発酵表現型（Ｌ
ａｃ+）は同じプラスミドにおいてコードされており、
スクロース発酵（Ｓｕｃ+）は染色体において決定され
ると結論された。しかしながらバクテリオシン陰性（Ｂ
ａｃ-）及びラクトース陰性（Ｌａｃ-）誘導体は、親に
よって産生されるバクテリオシンに耐性を示した（Ｂａ
ｃr）。従って、Ｂａｃr（または免疫性）は染色体上に
コードされていた。
【００５１】無細胞濾液中の粗バクテリオシンの予備特
性分析の結果を表１から表６にまとめて示す。
【００５２】表１から、無細胞濾液中の粗バクテリオシ
ンは１００，０００Ｄａより大きく、これは複数のタン
パク質分子の凝集を示していることは明らかである。
【００５３】
【表１】 バクテリオシンを最大に産生させるためには、表２から
判るように、１％酵母抽出物で増強したＭＲＳブロス及
び０．５％酵母抽出物を含む７％乳清が適していた。最
高バクテリオシン力価は２４℃及び３２℃で得られ、３
７℃のインキュベーションにおいては力価はより低かっ
た。
【００５４】
【表２】 表３に示すように、オートクレーブ処理（１２１℃で１
５分間）を含む使用した全ての温度において、粗バクテ
リオシンはｐＨ４．１で安定であった。
【００５５】
【表３】 表４に示すように、粗バクテリオシンはｐＨ２．０〜
３．０では安定であったが、より高いｐＨ値においては
次第にその活性を失っていった。
【００５６】
【表４】 表５から判るように、粗バクテリオシンは、Ｌｉｓｔｅ
ｒｉａ ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓ及びＳｔａｐｈｙ
ｌｏｃｏｃｃｕｓ ａｕｒｅｕｓを除く広範なグラム陽
性細菌に対して活性であった。また、Ｅ．ｃｏｌｉ即ち
グラム陰性種に対して活性を示さなかった。
【００５７】
【表５】 表６から判るように、粗バクテリオシンは５％トリプシ
ン及びα−キモトリプシンを用いた処理に耐性を示し
た。精製ＬＬ−２バクテリオシンと精製ナイシンのトリ
プシン及びキモトリプシン感受性を比較した。ナイシン
と比較して、ＬＬ−２はキモトリプシンにはより感受性
であり、トリプシンにはより耐性であった。
【００５８】
【表６】 キモトリプシン消化は、バクテリオシン濃度を３２００
〜６４００ＡＵ／ｍｌとして４０℃で２時間インキュベ
ートすることにより行なった。
【００５９】トリプシン消化は、バクテリオシン濃度を
３２００〜６４００ＡＵ／ｍｌとして４０℃で２０時間
インキュベートすることにより行なった。
【００６０】粗培地は未知のプロテアーゼ阻害活性また
は結果を混同させがちな他の現象を含み得るが故に、酵
素感受性試験には精製バクテリオシンを使用することが
好ましい。
【００６１】表７に示すように、精製ＬＬ−２は優れた
収率及び高純度で得られた。
【００６２】
【表７】 表７に示したように、ＬＬ−２Ｂは活性の９０％以上を
占めた。当初存在した活性の２５％が回収された。ＨＰ
ＬＣ精製の結果得られた２種のバクテリオシンＬＬ−２
Ａ及びＬＬ−２Ｂは、図２に示したように分子量６５０
０ダルトンに対応する領域を中心とする活性によって上
層をなすゲルに作用した。
【００６３】ＨＰＬＣ分析結果は、ＬＬ−２Ａ及びＬＬ
−２Ｂが近縁であることを示している。精製ＬＬ−２Ｂ
は時間とともにＬＬ−２Ａを産生するが、精製ＬＬ−２
ＡはＬＬ−２Ｂを産生しない。ナイシンも、親タンパク
質の他に数種の分子種からなることが公知である。最も
多いのは、親構造から２つのカルボキシ末端残基を欠き
且つ末端Ｖａｌ−ＮＨ2を含む構造である。かかる結果
は、ＬＬ−２ＡがＬＬ−２Ｂの分解生成物であり、この
分解生成物はナイシンの分解生成物と同様に形成される
という仮定と一致している。しかしながらナイシンの分
解生成物はバクテリオシンとしては不活性であると報告
されており、一方、ＬＬ−２Ａは広域のバクテリオシン
活性スペクトルを保有している。
【００６４】ＬＬ−２Ａ、ＬＬ−２Ｂ及びナイシンの混
合物のＨＰＬＣ分析結果は、分子間に分子差が存在する
ことを示している。かかる差から、僅かではあるが有意
な差がＨＰＬＣ溶出時間に現われ、このことは図１Ａ及
び図１Ｂに示したＬＬ−２Ａ、ＬＬ−２Ｂ及びナイシン
の混合物のクロマトグラムにおいて容易に明らかであ
る。ナイシンの前にＬＬ−２Ｂが溶出することは、ナイ
シンと比較してＬＬ−２Ｂがより親水性であることを示
している。
【００６５】実施例２ ＤＮＡ中でＣＡＴがＡＡＴに変異していることからＨｉ
ｓ27がＡｓｎ27で置き換えられたことを除いてはナイシ
ンの配列に対応するポリペプチドを産生するＤＮＡ配列
が、ＮＲＲＬ−Ｂ−１８８０９細胞において認められ
た。表８に示すアミノ酸組成結果から、ＬＬ−２Ｂのア
ミノ酸構成から１つのＨｉｓ残基が欠失していることが
確認される。ＬＬ−２Ｂのアミノ酸配列決定の結果は、
恐らく第２残基のところでＮ末端がブロックされている
ため、アミノ末端のイソロイシン残基のあとに他の残基
はないことを示している。この結果は、第２残基、即ち
デヒドロブチリン残基が、前の残基のエドマン分解の後
に環化して更なる配列決定をブロックしたことから、ナ
イシンに対しても認められた。
【００６６】下記のデータは、結果がどのように得られ
たかを示している。
【００６７】
【表８】 全ＤＮＡ単離 Ｌａｃｔｏｃｏｃｃｕｓ ｌａｃｔｉｓ ＮＲＲＬ−Ｂ
−１８８０９由来の全ゲノムＤＮＡを、他に記載されて
いる方法〔ｖａｎ ｄｅｒ Ｖｏｓｓｅｎ，Ｊ．Ｍ．
Ｂ．Ｍ．，ｖａｎ ｄｅｒ Ｌｅｌｉｅ，Ｄ．，ａｎｄ
Ｖｅｎｅｍａ，Ｇ．，Ａｐｐｌ．Ｅｎｖｉｒｏｎ．Ｍ
ｉｃｒｏｂｉｏｌ．５３：２４５２−２４５７（１９８
７）〕に従って単離した。
【００６８】ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ） デオキシオリゴヌクレオチドＰＣＲプライマーは、Ｌａ
ｃｔｏｃｏｃｃｕｓｌａｃｔｉｓ Ｆ１５８７６〔Ｄｏ
ｄｄ，Ｈ．Ｍ．，Ｈｏｒｎ，Ｎ．，ａｎｄＧａｓｓｏ
ｎ，Ｍ．Ｊ．，Ｊ．Ｇｅｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．１３
６：５５５−５６６（１９９０）〕によって産生される
バクテリオシン、即ちナイシンの前駆体に対する構造遺
伝子にフランキング配置するヌクレオチド配列に基づく
ものであった。ＤＮＡ合成装置（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉ
ｏｓｙｓｔｅｍｓ ３８０Ａ，Ｆｏｓｔｅｒ Ｃｉｔ
ｙ，ＣＡ）においてＰｈｏｓｐｈｏ−ａｍｉｄｉｔ法
〔Ｂａｒｏｎｅ，Ａ．Ｄ．，ｅｔ ａｌ．，Ｎｕｃｌｅ
ｉｃ Ａｃｉｄ Ｒｅｓｅａｒｃｈ，１２：４０５１−
４０６１（１９８４）〕を使用して、２つのプライマー
を合成した。２０塩基のプライマーＮｓ−Ａ（５’−Ｃ
ＧＣＧＡＧＣＡＴＡＡＴＡＡＡＣＧＧＣＴ−３’、セン
スプライマー）はＡＴＧ開始コドンの１００塩基上流か
ら始まり、２１塩基のプライマーＮｓ−Ｂ（５’−ＧＧ
ＡＴＡＧＴＡＴＣＣＡＴＧＴＣＴＧＡＡＣ−３’、アン
チセンスプライマー）はＴＡＡ終結コドンの４７塩基下
流から始まる。
【００６９】ＡｍｐｌｉＴａｑ Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ Ｃｅｔｕｓ ＤＮＡ Ｔｈ
ｅｒｍａｌ Ｃｙｃｌｅｒ（Ｐｅｒｋｉｎ−Ｅｌｍｅｒ
／Ｃｅｔｕｓ Ｃｏｒｐ．，Ｎｏｒｗａｌｋ，ＣＴ）に
おいて、組換えＴａｑ ＤＮＡポリメラーゼ（Ｐｅｒｋ
ｉｎ−Ｅｌｍｅｒ／Ｃｅｔｕｓ Ｃｏｒｐ．，Ｎｏｒｗ
ａｌｋ，ＣＴ）を使用してＰＣＲを実施した。僅かに改
変したが、製造業者の推奨に従った。各１００μｌの反
応混合物は、１００ｐｍｏｌの各プライマーと約１０ｎ
ｇの鋳型ＤＮＡとを含んでいた。プライマーのあまり厳
密でないアニーリングによって惹起される領域合成を最
小化するために、反応混合物を９４℃で５分間インキュ
ベートしてからサイクル１を実施した。各サイクルは、
９４℃で１分間、５５℃で１．５分間、そして７２℃で
２分間インキュベートすることからなり、これを３０回
実施した。最後のサイクル後、重合を７２℃で５分間だ
け延長し、全ての鎖の合成を完了させた。
【００７０】電気泳動 ＰＣＲ生成物（１０μｌ画分）を、Ｔｒｉｓ−ホウ酸−
ＥＤＴＡ緩衝液中の１．５％アガロースゲル〔Ｍａｎｉ
ａｔｉｓ，Ｔ．，Ｆｒｉｔｓｃｈ，Ｅ．Ｆ．，ａｎｄ
Ｓａｍｂｒｏｏｋ，Ｊ．，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏ
ｎｉｎｇ：ＡＬａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ．Ｃ
ｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ，Ｎ．Ｙ．，（１
９８２）〕において電気泳動することにより分析した。
【００７１】配列分析 配列決定する前に、ＰＣＲ生成物を電気溶出ステップ
〔Ｍａｎｉａｔｉｓ，Ｔ．，Ｆｒｉｔｓｃｈ，Ｅ．
Ｆ．，ａｎｄ Ｓａｍｂｒｏｏｋ，Ｊ．，Ｍｏｌｅｃｕ
ｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ
Ｍａｎｕａｌ．Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏ
ｒ，Ｎ．Ｙ．，（１９８２）〕によって精製した。Ｓｅ
ｑｕｅｎａｓｅ２．０キット〔Ｕ．Ｓ．Ｂｉｏｃｈｅｍ
ｉｃａｌｓ，Ｃｌｅｖｅｌａｎｄ，Ｏｈｉｏ〕を使用
し、下記のごとく改変したチェーンターミネーター法
（ｄｉｄｅｏｘｙ ｃｈａｉｎ ｔｅｒｍｉｎａｔｉｏ
ｎ ｐｒｏｃｅｄｕｒｅ）〔Ｓａｎｇｅｒ，Ｆ．，Ｎｉ
ｃｋｌｅｎ，Ｓ．，ａｎｄ Ｃｏｕｌｓｏｎ，Ａ．
Ｒ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳ
Ａ，７４：５４６３−５４６７（１９７７）〕によって
ＰＣＲ生成物の配列を決定した。熱変性ステップ（９５
℃で３分間）の直後に、−７０℃の短時間アニーリング
ステップを行なった。標識反応混合物を３７℃で３０〜
４５秒間インキュベートした。伸長反応生成物を、Ｂｉ
ｇｇｉｎらよってに記載されているような緩衝液勾配
〔Ｂｉｇｇｉｎ，Ｍ．Ｄ．，ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．
Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８０：３９６３
−３９６５（１９８３）〕を用いて変性ポリアクリルア
ミドゲル上で分離した。
【００７２】Ｌａｃｔｏｃｏｃｃｕｓ ｌａｃｔｉｓ
ＮＲＲＬ−Ｂ−１８８０９由来のバクテリオシン前駆体
をコードする遺伝子の核酸配列の決定 バクテリオシンＬＬ−２が、数種の他のＬａｃｔｏｃｏ
ｃｃｕｓ ｌａｃｔｉｓ株〔Ｄｏｄｄ，Ｈ．Ｍ．，Ｈｏ
ｒｎ，Ｎ．，ａｎｄ Ｇａｓｓｏｎ，Ｍ．Ｊ．，Ｊ．Ｇ
ｅｎ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．１３６：５５５−５６６
（１９９０）〕によって産生されるバクテリオシンであ
るナイシンとの相同性を有するか判定するために、Ｌａ
ｃｔｏｃｏｃｃｕｓ ｌａｃｔｉｓ ＮＲＲＬ−Ｂ−１
８８０９由来の全ＤＮＡにおいてＰＣＲ（ポリメラーゼ
連鎖反応）分析を実施した。ナイシンの前駆体に対する
遺伝子の周辺にあるヌクレオチド配列〔Ｄｏｄｄ，Ｈ．
Ｍ．，Ｈｏｒｎ，Ｎ．，ａｎｄ Ｇａｓｓｏｎ，Ｍ．
Ｊ．，Ｊ．Ｇｅｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．１３６：５５
５−５６６（１９９０）〕に基づく２種のナイシン特異
性プライマー（Ｎｓ−Ａ及びＮｓ−Ｂ）を合成し、Ｌａ
ｃｔｏｃｏｃｃｕｓ ｌａｃｔｉｓ ＮＲＲＬ−Ｂ−１
８８０９の全ＤＮＡ調製物を鋳型として用いるＰＣＲに
使用した。ＰＣＲにより、アガロースゲル電気泳動によ
って決定された予定の寸法（即ち３２１ｂｐ）を有する
分子が生成された。この分子の寸法は、米国特許出願第
０７／４９２，９６９号に記載のごときＬａｃｔｏｃｏ
ｃｃｕｓｌａｃｔｉｓ株ＮＲＲＬ−Ｂ−１８５３５の全
ゲノムＤＮＡにおいて同じプライマーを使用して生成さ
れたＤＮＡ分子の寸法と同じであった。プライマーまた
は鋳型ＤＮＡのいずれかを欠く対照はＤＮＡ分子を生成
しなかった。配列決定プライマーとしてＮｓ−Ａ及びＮ
ｓ−Ｂ両方を使用してＰＣＲ生成されたＬａｃｔｏｃｏ
ｃｃｕｓ ｌａｃｔｉｓ ＮＲＲＬ−Ｂ−１８８０９由
来の分子の配列決定からは、構造遺伝子内に１つの塩基
の相違があることを除いて、ナイシン前駆体をコードす
る遺伝子及びそのフランキング領域の配列〔Ｄｏｄｄ，
Ｈ．Ｍ．，Ｈｏｒｎ，Ｎ．，ａｎｄ Ｇａｓｓｏｎ，
Ｍ．Ｊ．，Ｊ．Ｇｅｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．１３６：
５５５−５６６（１９９０）〕と同じヌクレオチド配列
が得られた。位置２３６２（Ｌａｃｔｏｃｏｃｃｕｓ
ｌａｃｔｉｓ Ｆ１５８７６〔Ｄｏｄｄ，Ｈ．Ｍ．，Ｈ
ｏｒｎ，Ｎ．，ａｎｄ Ｇａｓｓｏｎ，Ｍ．Ｊ．，Ｊ．
Ｇｅｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．１３６：５５５−５６６
（１９９０）〕のマップ位置）には、前駆ポリペプチド
に対する遺伝子中の対応する位置にはシトシン（Ｃ）が
存在する代わりに、アデノシン（Ａ）が存在する（配列
番号：１）。ＮＲＲＬ−Ｂ−１８５３５ ＰＣＲ生成分
子中の対応領域のヌクレオチド配列はこの変異を示さな
かった。ＮＲＲＬ−Ｂ−１８８０９のゲノムＤＮＡにお
けるこの変異のため、成熟バクテリオシンの位置２７に
はアミノ酸アスパラギン（Ａｓｎ）が推定される。ナイ
シンにおいては、この位置には代わりにヒスチジン（Ｈ
ｉｓ）がコードされる。これは、バクテリオシンＬＬ−
２がナイシンと、同一ではないが類似であることを示し
ている。かかる結果から、表８に示したような、アスパ
ラギン：ヒスチジン比が成熟ナイシンにおいては１：２
であるのに対して、バクテリオシンＬＬ−２のアミノ酸
組成においては２：１であるというデータが確認され
る。
【００７３】表９は、配列番号：２に示すＸａａ残基に
対するアミノ酸を示す。Ｘａａの可能性は制限されてい
る（配列番号：２における記載以外では、ＣｙｓはＸａ
ｃとし、ＳｅｒはＸａａとし、ＴｈｒはＸａｂとしてあ
る）。
【００７４】
【表９】 表９から判るように、配列番号：２の各配列位置にある
Ｘａａは、この細胞系に起こると推定される翻訳後修飾
のタイプに基づく２つまたは３つの選択肢の１つを表し
ている。アミノ酸分析からは、システイン及びトレオニ
ンは見られず、セリン残基はただ１つのみが見られた。
これら３種の残基タイプに対してはナイシンも同一であ
った。Ｃｙｓ及びＴｈｒから生じるＸａａは、これらの
未修飾アミノ酸がＬＬ−２にある可能性はないので、２
つの可能性うちの一方を表わすのみである。
【００７５】ポリペプチドは暫定的な式：
【００７６】
【化６】 〔式中、Ｄｈａは２−アミノプロペン酸であり、Ｄｈｂ
は２−アミノブト−２−エノン酸であり、部分化学式の
下方のかっこ内のアミノ酸名は、かかる非定型アミノ酸
が形成されるまえのもとのアミノ酸を示している〕を有
すると推定される。配列は配列番号：２に示し、Ｘａａ
は前述の通りである。
【００７７】実施例３ 凍結乾燥して粉末状にした実施例１の粗ＬＬ−２バクテ
リオシンを種々の量で加えることの、１２℃に維持した
ヨーグルトの酸敗（腐敗）に及ぼす影響 液体に戻した無菌の１１％脱脂乳にヨーグルト出発培養
体を接種し、３５℃で１６時間インキュベートすること
によりヨーグルトを製造した。インキュベーションが終
了したら、ヨーグルトを氷浴中で冷やした。均一に混合
した後、１００ｇの画分を５つのねじ蓋付き広口壜に移
し、０（対照）、２％、３％、４％及び５％とラベル付
けした。０と記した壜には何も加えなかった。２％、３
％、４％及び５％とラベル付けした壜にはそれぞれ２
ｇ、３ｇ、４ｇ及び５ｇの（８０００ＡＵ／ｇのバクテ
リオシン力価を含む）凍結乾燥した粗ＬＬ−２バクテリ
オシン粉末を加えた。粉末を均一に混合した後、ヨーグ
ルトのｐＨを測定し、１２℃を維持するように調整した
インキュベーター内に壜を入れた。６日後及び１３日後
に、それぞれの壜のｐＨ値を測定して記録した。結果を
プロットし、図３に示す。
【００７８】上記説明は本発明を説明するためのもので
あり、本発明は特許請求の範囲によってのみ制限され
る。
【００７９】
【配列表】 配列番号：１ （ｉ）配列特性： （Ａ）長さ：３２１塩基対 （Ｂ）型：核酸 （Ｃ）鎖の数：二本鎖 （Ｄ）トポロジー：直鎖状 （ii）配列の種類：他のＤＮＡ （iii）ハイポセティカル配列：Ｎｏ （iv）アンチセンス：Ｎｏ （vi）起源： （Ａ）生物名：Ｌａｃｔｏｃｏｃｃｕｓ ｌａｃｔｉｓ
亜種ｌａｃｔｉｓ （Ｂ）株名：ＮＲＲＬ−Ｂ−１８８０９ （Ｃ）個体名：ＬＬＡ−２．０ （Ｇ）細胞の種類：単細胞生物 （ix）配列の特徴： （Ａ）名称／キー：バクテリオシンコーディングＤＮＡ （Ｂ）存在位置：１０１〜２７１ （Ｃ）特徴を決定した方法：配列決定 （xi）配列：ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１ CGCGAGCATA ATAAACGGCT CTGATTAAAT TCTGAAGTTT GTTAGATACA ATGATTTCGT 60 TCGAAGGAAC TACAAAATAA ATTATAAGGA GGCACTCAAA ATG AGT ACA AAA GAT 155 Met Ser Thr Lys Asp
−２０ TTT AAC TTG GAT TTG GTA TCT GTT TCG AAG AAA GAT TCA GGT GCA TCA 163 Phe Asn Leu Asp Leu Val Ser Val Ser Lys Lys Asp Ser Gly Ala Ser -15 -10 -5 CCA CGC ATT ACA AGT ATT TCG CTA TGT ACA CCC GGT TGT AAA ACA GGA 211 Pro Arg Ile Thr Ser Ile Ser Leu Cys Thr Pro Gly Cys Lys Thr Gly 1 5 10 GCT CTG ATG GGT TGT AAC ATG AAA ACA GCA ACT TGT AAT TGT AGT ATT 259 Ala Leu Met Gly Cys Asn Met Lys Thr Ala Thr Cys Asn Cys Ser Ile １５ ２０
２５ ３０ CAC GTA AGC AAA TAACC AAATCAAAGG ATAGTATTTT GTTAGTTCAG ACATGGATAC 316 His Val Ser Lys ＴＡＴＣＣ
321 配列番号：２ （ｉ）配列特性： （Ａ）長さ：３４アミノ酸 （Ｂ）型：アミノ酸 （Ｄ）トポロジー：直鎖状 （ii）配列の種類：タンパク質 （ix）配列の特徴： （Ａ）名称／キー：バクテリオシン （Ｂ）存在位置：１〜３４ （Ｃ）特徴を決定した方法：配列決定 （Ｄ）その他の情報：ポリペプチドバクテリオシン （xi）配列：ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２ Ile Xaa Xaa Ile Xaa Leu Xaa Xaa Pro Gly Xaa Lys Xaa Gly Ala 1 5 10 15 Leu Met Gly Xaa Asn Met Lys Xaa Ala Xaa Xaa Asn Xaa Xaa Ile 20 25 30 His Val Xaa Lys
【図面の簡単な説明】
【図１】 Ａ．ＬＬ−２Ａの高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬ
Ｃ）のクロマトグラフを示す。 Ｂ．ＬＬ−２Ｂ及びナイシンの高速液体クロマトグラフ
ィー（ＨＰＬＣ）のクロマトグラフを示す。
【図２】指標菌として感受性Ｐｅｄｉｏｃｏｃｃｕｓ
ｐｅｎｔｏｓａｃｅｕｓ ＦＢＢ６３Ｃを使用し、ＨＰ
ＬＣ精製バクテリオシンＬＬ−２Ａ及びＬＬ−２Ｂによ
り上層ゲル上に生成された阻害ゾーンを示す微生物の増
殖形態を示す写真である。
【図３】ヨーグルトにおける種々の割合の粗バクテリオ
シンの影響を示すグラフである。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.5 識別記号 庁内整理番号 ＦＩ 技術表示箇所 Ｃ１２Ｐ 21/02 Ａ 8214−4Ｂ // Ａ６１Ｋ 37/02 ＡＤＺ 8314−4Ｃ (Ｃ１２Ｎ 1/20 Ｃ１２Ｒ 1:01） (Ｃ１２Ｐ 21/02 Ｃ１２Ｒ 1:01） (72)発明者 ジエームズ・テイー・ヘンダーソン アメリカ合衆国、フロリダ・34207、ウエ スト・ブラデントン、フイフス・ストリー ト・6719 (72)発明者 ジヨン・デー・マルツフ オランダ国、3524・ベー・エル・ユトレヒ ト、フイーベリンゴ・141 (72)発明者 ピーテル・デー・フアン・ワツセナール オランダ国、3146・ベー・ベー・マースル イス、チヤーチル・ドレーフ・５

Claims (42)

    【特許請求の範囲】
  1. 【請求項１】 感受性グラム陽性細菌に対する阻害活性
    を有し且つ配列： Ile Thr Ser Ile Ser Leu Cys Thr Pro Gly Cys Lys Thr Gly Ala Leu Met Gly Cys Asn Met Lys Thr Ala Thr Cys Asn Cys Ser Ile His Val Ser Lys を含む前駆ポリペプチドから得られ得るポリペプチド。
  2. 【請求項２】 ２７番目の位置にＡｓｎを有する請求項
    １に記載のポリペプチド。
  3. 【請求項３】 感受性グラム陽性細菌に対する阻害活性
    を有し且つアミノ酸配列： Ile Xab Xaa Ile Xaa Leu Xac Xab Pro Gly Xac Lys Xab Gly Ala Leu Met Gly Xac Asn Met Lys Xab Ala Xab Xac Asn Xac Xaa Ile His Val Xaa Lys 〔ここで、Ｘａａは、Ｓｅｒ、Ａｌａ−またはＤｈａか
    ら選択され、Ｘａｂは、Ａｂｕ−またはＤｈｂから選択
    され、且つＸａｃはＡｌａ−Ｓ−から選択され（但しＡ
    ｌａ−は３−置換アラニン（−（ＣＯ）ＣＨ（ＮＨ−）
    ＣＨ2−）であり、Ａｂｕ−は３−置換２−アミノブタ
    ン酸（−（ＣＯ）ＣＨ（ＮＨ−）ＣＨ（ＣＨ3）−）で
    あり、Ａｌａ−Ｓ−は（３−アラニル）−チオであり、
    Ａｂｕは２−アミノブタン酸であり、Ｄｈａは２−アミ
    ノプロペン酸であり、Ｄｈｂは２−アミノブト−２−エ
    ノン酸である）、これらのサブユニットは感受性細菌に
    対して実質的に等価の阻害活性を有しており、活性を賦
    与するアミノ酸間に硫黄架橋がある〕を有するポリペプ
    チド。
  4. 【請求項４】 増殖培地中でＬａｃｔｏｃｏｃｃｕｓ
    ｌａｃｔｉｓ亜種ｌａｃｔｉｓ ＮＲＲＬ−Ｂ−１８８
    ０９によって産生され、感受性グラム陽性細菌に対する
    阻害活性を有するポリペプチド。
  5. 【請求項５】 実質的に純粋な形態である請求項４に記
    載のポリペプチド。
  6. 【請求項６】 限外濾過によって精製されており、該限
    外濾過において被保持物である請求項５に記載のポリペ
    プチド。
  7. 【請求項７】 アニオン交換樹脂を使用するクロマトグ
    ラフィーによって精製されている請求項５に記載のポリ
    ペプチド。
  8. 【請求項８】 更に限外濾過によって精製されている請
    求項７に記載のポリペプチド。
  9. 【請求項９】 凍結乾燥形態である請求項４に記載のポ
    リペプチドまたは該ポリペプチドを含む製品。
  10. 【請求項１０】 感受性グラム陽性細菌を阻害する方法
    であって、該細菌を阻害量の請求項１に記載のポリペプ
    チドに暴露し、それによって該細菌を阻害することから
    なる方法。
  11. 【請求項１１】 感受性グラム陽性細菌を阻害する方法
    であって、該細菌を阻害量の請求項２に記載のポリペプ
    チドに暴露し、それによって該細菌を阻害することから
    なる方法。
  12. 【請求項１２】 感受性グラム陽性細菌を阻害する方法
    であって、該細菌を、Ｌａｃｔｏｃｏｃｃｕｓ ｌａｃ
    ｔｉｓ亜種ｌａｃｔｉｓ ＮＲＲＬ−Ｂ−１８８０９由
    来のＤＮＡによってコードされる前駆ポリペプチドから
    誘導される、阻害量のポリペプチドに暴露し、それによ
    って該細菌を阻害することからなる方法。
  13. 【請求項１３】 前記ＤＮＡがプラスミド上に存在して
    おり、前記プラスミドがｐＳＲＱ４００である請求項１
    ０に記載の方法。
  14. 【請求項１４】 前記ポリペプチドが、該調製物１ｇ当
    たり約１６００〜２，５００，０００任意単位のポリペ
    プチドを含む調製物中にある請求項１２に記載の方法。
  15. 【請求項１５】 前記前駆ポリペプチドが、乳酸菌中に
    存在するＤＮＡ配列の発現によって産生され、次いで、
    該前駆ポリペプチドが乳酸菌によって前記ポリペプチド
    に変換される請求項１２に記載の方法。
  16. 【請求項１６】 前記ポリペプチドが実質的に純粋な形
    態である請求項１５に記載の方法。
  17. 【請求項１７】 前記ポリペプチドが限外濾過によって
    精製されており、該ポリペプチドが限外濾過において被
    保持物である請求項１５に記載の方法。
  18. 【請求項１８】 前記ポリペプチドが、アニオン交換樹
    脂を使用するクロマトグラフィーによって精製されてい
    る請求項１５に記載の方法。
  19. 【請求項１９】 前記ポリペプチドが更に限外濾過によ
    って精製されている請求項１５に記載の方法。
  20. 【請求項２０】 前記ポリペプチドが、１ｍｌ当たり最
    低１６００任意単位を有する溶液中にある請求項１２に
    記載の方法。
  21. 【請求項２１】 前記ポリペプチドまたは前記ポリペプ
    チドを含む製品が凍結乾燥されている請求項１２に記載
    の方法。
  22. 【請求項２２】 感受性グラム陽性細菌に対する活性を
    有するポリペプチドを生産する方法であって、 （ａ）Ｌａｃｔｏｃｏｃｃｕｓ ｌａｃｔｉｓ亜種ｌａ
    ｃｔｉｓ ＮＲＲＬ−Ｂ−１８８０９を、炭素源、窒素
    源及び無機塩類を含む増殖培地中に、Ｌａｃｔｏｃｏｃ
    ｃｕｓ ｌａｃｔｉｓが、特定の細菌に対する阻害活性
    を有するポリペプチドを発現するような条件下に与え、
    必要によっては、 （ｂ）前記ポリペプチドを前記増殖培地から、好ましく
    は濃縮物の形態で単離することからなる方法。
  23. 【請求項２３】 感受性グラム陽性細菌に対する活性を
    有するポリペプチドを生産する方法であって、 （ａ）Ｌａｃｔｏｃｏｃｃｕｓ ｌａｃｔｉｓ亜種ｌａ
    ｃｔｉｓ ＮＲＲＬ−Ｂ−１８８０９中に担持されるよ
    うなＤＮＡを含む乳酸菌を、炭素源、窒素源及び無機塩
    類を含む増殖培地中に、特定の細菌に対する阻害活性を
    有するポリペプチドを発現するような条件下に与え、必
    要によっては、 （ｂ）前記ポリペプチドを前記増殖培地から単離するこ
    とからなる方法。
  24. 【請求項２４】 前記ポリペプチドを精製する請求項２
    ３に記載の方法。
  25. 【請求項２５】 前記ポリペプチドを、該ポリペプチド
    を被保持物とする限外濾過によって精製する請求項２３
    に記載の方法。
  26. 【請求項２６】 前記ポリペプチドを、イオン交換樹脂
    を使用するクロマトグラフィーによって精製する請求項
    ２３に記載の方法。
  27. 【請求項２７】 前記ポリペプチドを更に限外濾過によ
    って精製する請求項２５に記載の方法。
  28. 【請求項２８】 Ｌａｃｔｏｃｏｃｃｕｓ ｌａｃｔｉ
    ｓ亜種ｌａｃｔｉｓＮＲＲＬ−Ｂ−１８８０９の培養体
    によって産生されるポリペプチドを精製する方法であっ
    て、前記培養体によって発酵されたブロスを限外濾過
    し、得られた限外濾過被保持物を回収して、精製形態の
    ポリペプチドを得ることにより精製を実施する方法。
  29. 【請求項２９】 Ｌａｃｔｏｃｏｃｃｕｓ ｌａｃｔｉ
    ｓ亜種ｌａｃｔｉｓＮＲＲＬ−Ｂ−１８８０９の培養体
    によって産生されるポリペプチドを精製する方法であっ
    て、前記培養体によって発酵されたブロスを、好ましく
    はカチオン交換樹脂を使用するクロマトグラフィーカラ
    ムに、ｐＨが約５より小さくなるまで通し、精製形態の
    ポリペプチド含有製品を前記クロマトグラフィーカラム
    から、好ましくはイオン強度のより高い緩衝液を使用す
    る制御された溶出によって回収することにより精製を実
    施する方法。
  30. 【請求項３０】 前記クロマトグラフィーカラムから得
    たポリペプチドに更に限外濾過を実施し、このように生
    成された精製形態のポリペプチド含有製品を、限外濾過
    被保持物として回収する請求項２９に記載の方法。
  31. 【請求項３１】 前記限外濾過被保持物を更に、逆相高
    速液体クロマトグラフィーカラムから溶出することによ
    り濃縮及び精製して均質にする請求項２８に記載の方
    法。
  32. 【請求項３２】 特定のグラム陽性細菌に対する阻害活
    性を有するポリペプチドの前駆ポリペプチドをコードす
    る遺伝子を含むＤＮＡを生産する方法であって、 （ａ）請求項１に記載のポリペプチドの前駆ポリペプチ
    ドをコードするＤＮＡ配列を含むＬａｃｔｏｃｏｃｃｕ
    ｓ ｌａｃｔｉｓ亜種ｌａｃｔｉｓ ＮＲＲＬ−Ｂ−１
    ８８０９由来のＤＮＡを準備し、 （ｂ）前記ＤＮＡに、センスプライマーとして５’−Ｃ
    ＧＣＧＡＧＣＡＴＡＡＴＡＡＡＣＧＧＣＴ−３’及びア
    ンチセンスプライマーとして５’−ＧＧＡＴＡＧＴＡＴ
    ＣＣＡＴＧＴＣＴＧＡＡＣ−３’を使用するポリメラー
    ゼ連鎖反応を実施し、前記前駆ポリペプチドをコードす
    る遺伝子を含むＤＮＡ配列を生産することからなる方
    法。
  33. 【請求項３３】 特定のグラム陽性細菌に対する阻害活
    性を有するポリペプチドの前駆ポリペプチドをコードす
    る遺伝子を含むＤＮＡを生産する方法であって、 （ａ）請求項２に記載のポリペプチドの前駆ポリペプチ
    ドをコードするＤＮＡ配列を含むＬａｃｔｏｃｏｃｃｕ
    ｓ ｌａｃｔｉｓ亜種ｌａｃｔｉｓ ＮＲＲＬ−Ｂ−１
    ８８０９由来のＤＮＡを準備し、 （ｂ）前記ＤＮＡに、センスプライマーとして５’−Ｃ
    ＧＣＧＡＧＣＡＴＡＡＴＡＡＡＣＧＧＣＴ−３’及びア
    ンチセンスプライマーとして５’−ＧＧＡＴＡＧＴＡＴ
    ＣＣＡＴＧＴＣＴＧＡＡＣ−３’を使用するポリメラー
    ゼ連鎖反応を実施し、前記前駆ポリペプチドをコードす
    る遺伝子を含むＤＮＡ配列を生産することからなる方
    法。
  34. 【請求項３４】 特定のグラム陽性細菌に対する阻害活
    性を有するポリペプチドをコードするＤＮＡを生産する
    方法であって、 （ａ）前記ポリペプチドの前駆ポリペプチドをコードす
    るＬａｃｔｏｃｏｃｃｕｓ ｌａｃｔｉｓ ＮＲＲＬ−
    Ｂ−１８８０９由来のＤＮＡを準備し、 （ｂ）前記ＤＮＡに、センスプライマーとして５’−Ｃ
    ＧＣＧＡＧＣＡＴＡＡＴＡＡＡＣＧＧＣＴ−３’及びア
    ンチセンスプライマーとして５’−ＧＧＡＴＡＧＴＡＴ
    ＣＣＡＴＧＴＣＴＧＡＡＣ−３’を使用するポリメラー
    ゼ連鎖反応を実施することからなる方法。
  35. 【請求項３５】 前記ＤＮＡを別の乳酸菌中に組込み、
    それを、前記前駆ポリペプチドを産生し、該前駆ポリペ
    プチドをポリペプチドに変換する条件下に培養する請求
    項３４に記載の方法。
  36. 【請求項３６】 請求項１に記載のポリペプチドに変換
    され得る前駆ポリペプチドをコードするＤＮＡ配列。
  37. 【請求項３７】 請求項３に記載のポリペプチドに変換
    され得る前駆ポリペプチドをコードするＤＮＡ配列。
  38. 【請求項３８】 アミノ酸配列： Ile Thr Ser Ile Ser Leu Cys Thr Pro Gly Cys Lys Thr Gly Ala Leu Met Gly Cys Asn Met Lys Thr Ala Thr Cys Asn Cys Ser Ile His Val Ser Lys を含む前駆ポリペプチドをコードするＤＮＡ配列。
  39. 【請求項３９】 ポリヌクレオチド１−３２１： 【化１】 である、前駆ポリペプチドをコードするＤＮＡ配列。
  40. 【請求項４０】 アミノ酸配列： Ile Thr Ser Ile Ser Leu Cys Thr Pro Gly Cys Lys Thr Gly Ala Leu Met Gly Cys Asn Met Lys Thr Ala Thr Cys Asn Cys Ser Ile His Val Ser Lys を含む前駆ポリペプチド。
  41. 【請求項４１】 配列： 【化２】 を有する前駆ポリペプチド。
  42. 【請求項４２】 Ｌａｃｔｏｃｏｃｃｕｓ ｌａｃｔｉ
    ｓ亜種ｌａｃｔｉｓＮＲＲＬ−Ｂ−１８８０９の生物学
    的に純粋な培養体。
JP4197719A 1991-07-01 1992-07-01 ラクトコッカスラクチス亜種ラクチス由来の新規のバクテリオシン Expired - Lifetime JP2637879B2 (ja)

Applications Claiming Priority (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US721774 1991-07-01
US07/721,774 US5173297A (en) 1991-07-01 1991-07-01 Bacteriocin from lactococcus lactis subspecies lactis

Publications (2)

Publication Number Publication Date
JPH069690A true JPH069690A (ja) 1994-01-18
JP2637879B2 JP2637879B2 (ja) 1997-08-06

Family

ID=24899255

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
JP4197719A Expired - Lifetime JP2637879B2 (ja) 1991-07-01 1992-07-01 ラクトコッカスラクチス亜種ラクチス由来の新規のバクテリオシン

Country Status (9)

Country Link
US (2) US5173297A (ja)
EP (1) EP0521240B1 (ja)
JP (1) JP2637879B2 (ja)
AT (1) ATE162851T1 (ja)
AU (1) AU639638B2 (ja)
CA (1) CA2061177C (ja)
DE (1) DE69224237T2 (ja)
DK (1) DK0521240T3 (ja)
NZ (1) NZ243159A (ja)

Cited By (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US4960371A (en) * 1989-01-30 1990-10-02 Bassett H Eugene Rotary compressor for heavy duty gas services
JP2015526095A (ja) * 2012-08-22 2015-09-10 クラフト・フーズ・グループ・ブランズ・エルエルシー 発酵乳成分を有するプロセスチーズ及びその製造方法
US9426999B2 (en) 2009-03-30 2016-08-30 Meiji Co., Ltd. Method for culturing lactic acid bacterium and method for producing fermented milk

Families Citing this family (14)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
EP0579730B1 (en) * 1991-04-11 2003-02-26 Stichting Nederlands Instituut Voor Zuivelonderzoek (Nizo) Lantibiotics similar to nisin a, lactic acid bacteria which produce such lantibiotics, method for constructing such lactic acid bacteria and method for preserving foodstuffs with the aid of these lantibiotics and these lactic acid bacteria producing lantibiotics
US5861376A (en) * 1991-07-01 1999-01-19 Quest International Flavors & Food Ingredients Company, Division Of Indopco, Inc. Synthetically derived peptide
EP0574681A1 (en) * 1992-06-15 1993-12-22 Quest International B.V. Yogurt product containing bacteriocin from pediococcus adilactici
US6218362B1 (en) 1997-09-08 2001-04-17 Universite Laval Lantibiotic from Streptococcus mutans and uses thereof
SE511828C2 (sv) * 1997-09-26 1999-12-06 Medipharm Ab Bakteriestam av typen Lactococcus för användning vid ensilering av grönfoder
US6613364B2 (en) 1999-08-31 2003-09-02 Kraft Foods Holdings, Inc. Stabilization of cooked meat and meat-vegetable compositions using whey from nisin-producing cultures and product thereof
EP1294851A2 (en) 2000-06-19 2003-03-26 Regents Of The University Of Minnesota Siderophores-producing bifidobacteria thereby and uses thereof
US6797308B2 (en) 2001-02-08 2004-09-28 Kraft Foods Holdings, Inc. Stabilization of cooked pasta compositions using whey from nisin-producing cultures
US7186426B2 (en) 2001-02-23 2007-03-06 Kraft Foods Holdings, Inc. Prevention of lactic acid bacteria spoilage of beer through use of bacteriocin-containing fermented wort
EP1579772A1 (en) * 2004-03-25 2005-09-28 Ajinomoto Co., Inc. Method for the production of koji
EP2229432A4 (en) * 2007-09-05 2011-05-11 Inst Nat Rech Scient ANTIMICROBIAL ACTIVITY OF BACTERIOCIN-PRODUCING MILKY ACID BACTERIA
BR112019018935B1 (pt) 2017-03-13 2023-04-25 Société des Produits Nestlé S.A. Composição vegetal e seu processo de produção
EP3922309A1 (en) * 2020-06-12 2021-12-15 Innovación en Gestón y Conservación de Ungulados S.L. (Ingulados) Novel lactococcus lactis strain for the production of bioactive compounds having antimicrobial effect
CN112114062A (zh) * 2020-08-03 2020-12-22 河北圣雪大成制药有限责任公司 一种用高效液相色谱检测乳酸链球菌素的方法

Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JPS6420096A (en) * 1982-10-19 1989-01-24 Cetus Corp Mutein and its production

Family Cites Families (7)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US4740593A (en) * 1983-09-06 1988-04-26 Microlife Technics, Inc. Derived nisin producing microorganisms, method of production and use and products obtained thereby
US4716115A (en) * 1983-09-06 1987-12-29 Microlife Technics, Inc. Derived nisin producing microorganisms, method of production and use and products obtained thereby
US4883673A (en) * 1987-02-09 1989-11-28 Microlife Technics, Inc. Method for inhibiting bacterial spoilage and resulting compositions
US4929445A (en) * 1988-01-25 1990-05-29 Microlife Technics, Inc. Method for inhibiting Listeria monocytogenes using a bacteriocin
NZ236795A (en) * 1990-03-13 1992-05-26 Microlife Technics Bacteriocin from lactococcus with molecular weight about 6000 and devices and foods containing it
NZ238515A (en) * 1990-06-18 1994-03-25 Norwegian Dairies Ass Synthetic or isolated bacteriocin, derivatives and fragments
EP0579730B1 (en) * 1991-04-11 2003-02-26 Stichting Nederlands Instituut Voor Zuivelonderzoek (Nizo) Lantibiotics similar to nisin a, lactic acid bacteria which produce such lantibiotics, method for constructing such lactic acid bacteria and method for preserving foodstuffs with the aid of these lantibiotics and these lactic acid bacteria producing lantibiotics

Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JPS6420096A (en) * 1982-10-19 1989-01-24 Cetus Corp Mutein and its production

Cited By (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US4960371A (en) * 1989-01-30 1990-10-02 Bassett H Eugene Rotary compressor for heavy duty gas services
US9426999B2 (en) 2009-03-30 2016-08-30 Meiji Co., Ltd. Method for culturing lactic acid bacterium and method for producing fermented milk
JP2015526095A (ja) * 2012-08-22 2015-09-10 クラフト・フーズ・グループ・ブランズ・エルエルシー 発酵乳成分を有するプロセスチーズ及びその製造方法

Also Published As

Publication number Publication date
EP0521240A3 (en) 1993-08-18
CA2061177A1 (en) 1993-01-02
AU639638B2 (en) 1993-07-29
EP0521240A2 (en) 1993-01-07
AU1609992A (en) 1993-03-11
DE69224237D1 (de) 1998-03-05
NZ243159A (en) 1994-11-25
EP0521240B1 (en) 1998-01-28
ATE162851T1 (de) 1998-02-15
JP2637879B2 (ja) 1997-08-06
DK0521240T3 (da) 1998-09-23
US5173297A (en) 1992-12-22
DE69224237T2 (de) 1998-05-28
US5231165A (en) 1993-07-27
CA2061177C (en) 1999-05-11

Similar Documents

Publication Publication Date Title
JP2637879B2 (ja) ラクトコッカスラクチス亜種ラクチス由来の新規のバクテリオシン
Tichaczek et al. Characterization of the bacteriocins curvacin A from Lactobacillus curvatus LTH1174 and sakacin P from L. sake LTH673
Aymerich et al. Biochemical and genetic characterization of enterocin A from Enterococcus faecium, a new antilisterial bacteriocin in the pediocin family of bacteriocins
Kawai et al. Primary amino acid and DNA sequences of gassericin T, a lactacin F-family bacteriocin produced by Lactobacillus gasseri SBT2055
RU2172324C2 (ru) Бактериоцин, способ его получения, штамм micrococcus varians, нуклеотидный фрагмент, сигнальный пептид
RU2279481C2 (ru) Лантибиотик
MXPA96003127A (en) Bacterioc
RU2153505C2 (ru) Смесь бактериоцинов, штамм streptococcus thermophilus - продуцент бактериоцинов и способ их получения
RU2250267C2 (ru) Бактериоцин против листерий
US5232849A (en) Bacteriocin from lactococcus lactis subspecies lactis
CN101848723B (zh) 细菌素诱导者肽
JPH10500012A (ja) 溶解素による乳酸バクテリアの培養物を溶解する方法および得られる溶解培養物の使用
Kuipers et al. Expression of wild-type and mutant nisin genes in
WO1997023619A1 (en) Sequences coding for new bacteriocins
JP3472804B2 (ja) 新規バクテリオシン及びその製造方法
Holzapfel et al. Characterization and Cloning of the Genes