JPH0697998B2 - 固定化リパーゼ調製品の製造方法 - Google Patents

Description

【発明の詳細な説明】 〔産業上の利用分野〕 本発明は固定化リパーゼ調製品の製造方法に関する。

〔従来技術〕

脂肪のエステル交換用に適合した固定化リパーゼ調製品
は公知である。即ち、米国特許4,275,081においては、
固定化リパーゼ調製品が開示され、こゝにおいてはリパ
ーゼはリゾプス（Rhizopups）属ジオトリクム（Geotric
hum）属又はアスペルギルス（Aspergillus）属に属する
種を発酵させることにより得、次いで得られたリパーゼ
を珪藻土又はアルミナの不活性の個々の担体に結合させ
る。これ等の担体は非常に高い比表面積を示す。高い酵
素活性を得る為には非常に高い比表面積（即ち、小さく
かつ多孔性の担体粒子）を有する固定化リパーゼ調製品
を用いることが必要であると信じられていた。

エステル交換は、この様な固定化リパーゼ調製品を用い
溶剤なしでバッチ式にて行うことが出来るけれども、カ
ラムでの連続的エステル交換は溶剤（これは後に除去し
なければならない）の存在なしで工業的規模で行えな
い。何故ならばカラム操作中小粒子から成る調製品が許
容出来ない程高い圧力降下を発生せしめるからである。
ヨーロッパ特許出願公告069599においては、脂肪の酵素
的転位が、例えばセライトの如き担体に支持されたアス
ペルギルス（Aspergillus）種、リゾプス（Rhizopus）
種、ムコールジャバニクス（Mucor javanicus）又はム
コールマイヘイ（Mucor miehei）起源のリパーゼを用い
て行われることが記載されており、カラムでの連続的エ
ステル交換に関する実施例は全て溶剤を用いていること
は注目すべきである。溶剤を用いないで脂肪をエステル
交換するカラム操作に適合した固定化リパーゼは、当業
者に歓迎されるであろう。

勿論当業者は、イオン結合、共有結合及び取り込みによ
る、多数の固定化を研究して来ている。例えば、米国特
許4,170,696の発明者等は以下の内容を認識している。
即ち巨視孔のイオン交換樹脂の制御された大きさの分布
及び物理的特性は、酵素の支持目的の為の利点を与え
る。しかしこれ等の発明者等はイオン交換樹脂担体の単
位重量当りの結合し得る少量の酵素に対し異議を唱えて
おり更に酵素を支持する目的の為樹脂のジエチルアミノ
エチル（DEAE）誘導体の使用を提案している。特有の酵
素固定化法が非常に多くの酵素系に適用出来るという効
果についての米国特許4,170,696に主張される如き教示
は、当業者に誤解させるので批評出来る。酵素と酵素の
違い及び基質と基質の違いは、実際上酵素／基質／反応
条件のシステムを例外的なものにしており、広く適用出
来ると述べられた技術は殆んど或いは全く適用出来ない
であろう。

特にリパーゼは以下の点で例外的な酵素である。即ちそ
れ等の酵素活性は二種の相（水及び油）の界面で機能
し、それ単独の場合は他の酵素に十分適合する固定化法
はリパーゼには殆んど或いは全く適用が期待出来ないこ
とが分かる。当業者はリパーゼの固定は特別な困難性を
伴うことを承知している。例えば、J.ラバイレ（Lavayr
e）等による「プレパレイション アンド プロパティ
オブ イ モビライズド リパーゼ」バイオテクノロ
ジーアンド バイオエンジニアリング、24巻、1007〜10
13頁（1982年）、ジョン ウィレイ アンド サンズを
参照。業界のある研究家は、吸着又はイオン結合によ
り、共有結合により及び取り込みによりリパーゼの特異
的固定化を研究し、（セライト上の）吸着及びそれに続
くセライト粒子の取り込みははるかに最良の結果を示す
ことを結論づけた;1981年９月20〜25日カシコジマ（日
本）Enz.Eng.6で示されたポスター及びEuropean Journa
l of Applied Microbiology and Biotechnology,NO14、
１〜５頁（1982年）に記載されるそれ等の対応論文、並
び同じジャーナルのNO17、107〜112頁（1983年）におけ
る一連の論文を参照のこと。

先に説明した従来技術は、手軽なカラム操作による工業
的使用に適合した固定化リパーゼを得る為当業者により
なされた例示的なものである。本発明者がこれまで知る
限りにおいてはデンマーク特許出願4025/83及び4167/84
に記載されたリパーゼ製品はカラム操作に対し実質的に
優れたリパーゼ製品を構成する。今やデンマーク特許出
願4025/83及び4167/84に記載された教示を拡張すること
が可能であり更に本発明におけるリパーゼ製品は先に記
載したリパーゼ製品とは幾分異なったものであり、それ
らの優秀性において従来技術のリパーゼ製品を上まわる
ものである。

〔発明の構成及び効果〕

今や驚くべきことに本発明によれば以下の内容が見い出
された。即ち固定化リパーゼ調製品の製造が、単にリパ
ーゼ水溶液と粒状の巨視孔のフェノールホルムアルデヒ
ド吸着樹脂と混合ししかる後樹脂を回収し次いで乾燥す
ることにより容易に行われ得る。最終固定化調製品にお
いて含水率を特定割合とすることにより、溶剤を用いず
経済的に容易な方法で脂肪の連続的エステル交換が可能
となる。スペントリパーゼ溶液を除去した後樹脂を水洗
することが有利である。

本発明方法の好ましい態様によれば、熱安定性微生物リ
パーゼが用いられ、高温性ムコール（Mucor）種、特に
ムコールマイヘイ（Mucor miehei）生産リパーゼが好ま
しい。ムコールマイヘイ（Mucor miehei）は1,3−特異
的リパーゼの良好な生産菌であり、従って低コスト生産
が達成出来る。

本発明方法の好ましい態様によれば、マクロポーラスフ
ェノールホルムアルデヒド吸着剤樹脂粒子の90％以上が
約100〜1000μｍ、好ましくは400〜800μｍの粒径を有
する。この粒径間隔において、エステル交換に対する高
単位活性と低いカラム圧力降下との間の良好な歩み寄り
が得られる。

本発明方法の好ましい態様によれば、微生物リパーゼの
水溶液の量と吸着剤樹脂の重量との割合は、1gの樹脂
（乾燥重量）当り、5,000〜50,000LUに相当する。この
範囲において、商業的に入手可能な樹脂に対する十分な
リパーゼが得られる。

微生物リパーゼが高熱性ムコール（Mucor）種、特にム
コールマイヘイ（Mucor miehei）から生産される微生物
リパーゼがある場合の、本発明方法における好ましい態
様において、吸着剤と水性リパーゼ溶液との接触中のpH
は５〜７の間である。リパーゼと吸着剤樹脂との強い結
合が確保出来る。

本発明方法の好ましい態様によれば、接触時間は0.5〜
８時間である。この時間範囲において、樹脂はリパーゼ
の飽和に近づく。少なくとも75％のリパーゼ活性がリパ
ーゼ溶液から除かれる。

本発明方法の好ましい態様によれば、濾過法により分離
を行い、簡単な手順が工業的実施に十分適合し得る。

本発明方法の好ましい態様によれば、分離した固定化リ
パーゼを水分が約２〜40％、更に好ましくは５〜20％の
含水率まで乾燥する。これにより高いエステル交換作用
を有する最終リパーゼ調製品が得られる。

かくして、固定化リパーゼ調製品を製造する本発明方法
は、異なった樹脂を除いてデンマーク特許出願4025/83
及び4167/84に記載したと同様である。即ち該デンマー
ク出願においては微生物リパーゼの水溶液を粒状のマク
ロポーラス樹脂と接触させるが、本発明ではフェノール
ホルムアルデヒドマトリックスの吸着剤樹脂と接触させ
る。過剰の圧力降下がなくカラム操作に対し適当な最終
製品を得る為に、比較的大きな平均樹脂粒径が用いられ
る。リパーゼが吸着剤に結合する反応条件及び反応時間
は、所望量のリパーゼを吸着剤樹脂に結合させるのに十
分であり、しかる後形成された固定化リパーゼを水性相
から分離し次いで分離した吸着剤樹脂を含有するリパー
ゼを好ましくは約２〜20％の所望含水率に乾燥する。乾
燥操作は真空により、流動床乾燥プロセス又は固定化リ
パーゼを該リパーゼが失活する様な温度レベルにおかな
い様な大規模操作に適した如何なる他の乾燥工程であっ
てもよい。

本発明で用いられる如く語句吸着剤樹脂は、イオン交換
樹脂業界から選ばれるものである。イオン交換樹脂の製
造者等は、以下の内容を見い出している。即ちアニオン
又はカチオン交換活性をもたらす活性基に作用した特定
の形態樹脂製品は、商業的に有用性のない活性基を有す
る。この様な樹脂形態は商業的に「吸着剤樹脂」として
提供される。これ等の商業的材料及び他の同様のもの即
ち物理的及び化学的性質において等価なものは、本発明
において語句吸着剤樹脂として意図している。吸着剤樹
脂の官能的特性は、主にイオン性よりも結合力に帰因す
る。

本発明者に公知の吸着剤樹脂には、種々のポリスチレン
マトリックス及びフェノールホルムアルデヒドマトリッ
クスが含まれる。本発明の実施は、フェノールホルムア
ルデヒドクラスの吸着剤樹脂を意図している。ポリスチ
レンクラスの吸着剤樹脂は意図していない。それ等はリ
パーゼに対し有利性が少ない担体だからである。

本発明のリパーゼ製品はデンマーク特許出願4025/83及
び4167/84に記載した製品に匹敵する熱及び物理的安定
性を示し更にその代りに使用出来る。

酵素を失活させない為に、従来技術のエステル交換反応
は、高融点脂肪を溶解することの出来る溶剤の存在によ
り可能となる比較的低温度レベルで行われる。本発明に
より生産される固定化リパーゼ調製品は溶融脂肪中で十
分に安定性を示し従って比較的高温度でエステル交換を
触媒する。又、本発明方法によって得られた固定化リパ
ーゼ調製品を充填したエステル交換カラムは十分に低く
てエステル交換に対する円滑なカラム操作をなさしめ
る。又、驚くべきことに以下の内容が見い出された。即
ち接触条件、フェノールホルムアルデヒドマトリックス
を有する吸着剤樹脂及び固定化リパーゼ調製品中制御さ
れた最終含水率の組み合わせにより、溶融脂肪混合物中
高い特異的リパーゼ活性が得られる。

本発明の実施により製造される製品は、本明細書中で記
載した製品に対し、デンマーク特許出願4025/83及び416
7/84で用いたと同じ賞賛の言葉で先に記載した。該製品
は匹敵し得るものでありかつ一般的に同等な製品である
が、双方とも当業界において利点を示している。しか
し、相違は存在し更にその様な相違は特定のリパーゼ触
媒プロセスにおいて一つの製品形式を使用に対し好まし
いものとする。

本発明の実施により生産される固定化リパーゼ調製品
は、高い酵素回収率をもって調製出来、この結果は低コ
ストの（連続的）エステル交換プロセスを達成するのに
重要である。

リパーゼ溶液中に存在する初期のリパーゼ活性の75％以
上が吸着剤樹脂により溶液から除去出来、及び除去され
るべきである。ある程度まで、樹脂によるリパーゼ吸収
は時間依存性である。というのは多分マクロポーラスな
樹脂粒子中に酵素分子が分散するのに一定時間必要とす
るからであろう。８時間の混合（反応）時間の後少なく
とも吸着剤樹脂の平衡状態に近づくであろう。0.5時間
程短い少ない時間でも許容出来る結果が得られる。最適
接触時間を選択するための合理的方法は、リパーゼ溶液
からリパーゼ活性の除去にある。リパーゼ溶液から75％
以上のリパーゼ活性を除去するのに必要ないかなる接触
時間も本発明の大規模実施に対する反応時間となりう
る。

以下の内容が注目される。即ち利用出来る実験的証拠
は、最適接触時間が５〜35℃の範囲内で接触時間と殆ん
ど無関係であることを示しており、更に５〜35℃の温度
範囲が本発明の実施に企図される。

種々のフェノールホルムアルデヒド吸着剤樹脂間の物理
的及び化学的相違は、勿論固定化反応及び固定化リパー
ゼ調製品の双方に影響することが期待出来る。予期され
る如く、本発明を達成する為になされた全ての実験的研
究には、商業的に入手可能なマクロポーラス吸着剤樹脂
が含まれるが、本発明者等が知らなかった制限的事項が
商業的樹脂に入り込んでいるであろう。本発明の実施に
より得られる最終固定化リパーゼ製品は、5,000〜50,00
0LU/gm（乾燥基準）を有するリパーゼ活性を示し、これ
は好ましい範囲を構成する。10BIU/g以上の単位活性が
得られる。

スペントリパーゼ溶液から分離した、未だ湿潤の樹脂粒
子を水洗する特徴的事項は、利用出来るリパーゼが比較
的粗製のリパーゼを含む場合特に有利である。

米国特許4,275,081に記載された従来技術のプロセス
は、使用可能な固定化リパーゼ調製品を提供する為精製
されたリパーゼを必要とした。驚くべきことに、以下の
内容が見い出された。即ち本発明の実施により得られる
固定化リパーゼ調製品は相当に粗製のリパーゼ製品から
直接製造することが出来る。明らかに、従来技術におい
てリパーゼから除去されることが望まれていた不純物は
吸着剤には結合しておらず、従ってスペントリパーゼ溶
液中及び／又は洗浄水中で除去される。

何よりも、次の手順から著しく有利な結果が得られる。
即ち基本的には、粒状の吸着剤樹脂をpH5〜７の相当に
粗製リパーゼ溶液に室温で混合することだけを必要と
し、有機溶剤（時として提案されている如き）の使用さ
え必要でなく、更にスペント溶液を廃棄し次いで好まし
くは樹脂を水洗し引き続き樹脂を制御された含水率まで
乾燥する。乾燥前に分離した固定化酵素を水洗すること
は著しく製品を改善することが繰り返される。

以下の内容が見出された。すなわち、本発明の実施によ
り得られる固定化リパーゼ調製品は悪いpHおよび／又は
温度条件以外では簡単には失活せず、又は調製品から離
れない。例えば、リパーゼ活性は洗液中には表われな
い。

以下の内容が言及されている。すなわち、本発明の好ま
しい態様は、熱安定性リパーゼ、特にムコールマイヘイ
（Mucor miehei）リパーゼを固定化することを企図して
いる。勿論、リパーゼに対する熱安定性は溶剤を用いな
い、高融点脂肪のエステル交換に対して重要である。最
も合理的な昇温下でエステル交換を行う場合、他の利
点、例えば細菌汚染の減少可能性および脂肪粘度低下を
も生じる。

実際、先に記載した従来技術を上まわる多くの利点は大
規模での本発明実施に対する実用性に対し事実上損なわ
れない。同様の利点は、デンマーク出願4025/83および4
167/84中、本発明者によって記載した発明の実施に対し
て存在する。該発明も代りに実施できるであろう。

本発明の大規模実施に関する決定は、デンマーク出願40
25/83および4167/84の発明に対し実施の好ましい形態に
比較してその相対的利点次第で決まるであろう。従っ
て、好ましい形式のプロセスおよび製品の条件は、本発
明の実施に対し独断的に範囲を制限したとしても、実用
的なものとして認められうる。明確に、吸着剤により水
性処理溶液からリパーゼ活性の除去は75％を超えるべき
である。固定化酵素製品のリパーゼ活性単位は5000LU/g
m（乾燥基準）（NOVU法 AF 95.1/2-GB）を超えるべきで
ある。すでに言及した5,000〜50,000LU/gmの範囲が好ま
しい。BIU/g（NOVO法AF-26）は10を超えるべきである。
製品の半減期は60℃で2500時間を超えるべきである。

上記数値範囲は、本発明によって明確には予期しなかっ
た実施、例えばポリスチレン吸着剤樹脂の使用並びに以
下の本発明の説明から導びかれる方法と本発明とを区別
するのにも有効である。

デンマーク出願4025/83および4167/84に記載された有利
な固定化リパーゼ製品が製造できる機構を調べてみる
と、必ずしも全てのそれらの利点がリパーゼが固定化さ
れる樹脂の弱アニオン交換能に寄与し得るわけでないこ
とが分かった。リパーゼに対する樹脂の結合能力は一部
アニオン交換に寄与し、一部はリパーゼと樹脂との他の
物理的な力に寄与し、更に一部は樹脂マトリックスの化
学的および物理的構造に寄与し得ると思われる。

三種の典型的に商業的に入手可能な物質についての固定
から得られる試験結果は、存在するものと確信されてい
る関係を例示している。

多くの関係が含まれているので、本発明の実施に対する
（任意の）多くの規準は、多くの関係を大ざっぱに反映
している。固定化リパーゼ調製品の最少単位活性5000LU
/gm（乾燥基準）および10BIU/gm（乾燥基準）は、比較
的大きな担体粒子に対しての活性を得るため一定の最少
ローディングの必要性を反映している。

担体中のアニオン性引力、特定の相互作用およびマトリ
ックス材料の累積的効果により、固定化リパーゼ製品形
成のための従来技術の提案は変化していることが理解で
きる（例えば、米国特許4,275,081;4,272,503および4,4
51,565、例12）。実際どのような担体物質にリパーゼを
固定化しても明らかに、不ぞろいの生成物が得られるで
あろう。しかし、本発明のパラメーターによって設定さ
れた標準、すなわち75％収率、5,000LU/gmおよび10BIU/
gは似た担体であるが、本発明又はその親特許出願番号6
46,752の請求の範囲外では容易に達成できないと考えら
れる。典型的ポリスチレン基材吸着剤樹脂により得られ
た低収率および活性は上記表に示される。同様の試験に
おいて強塩基のポリスチレンアニオン交換樹脂について
12BIU/g製品が得られたが、収率はわずか50％であっ
た。

本発明並びにデンマーク出願4025/83および4167/84中で
説明された樹脂は、本発明の実施に適した孔径および多
孔性を有していることが今や見出された。大孔径のアニ
オン交換および吸着剤樹脂による試験は、収率結果から
予知し得たような単位活性の小さい製品をもたらした。
リパーゼは非常に大きな孔径のアニオン交換および吸着
剤の孔に深く入り、その中で作用を失うと考えられてい
る。特定の物理的相互作用およびアニオン性結合は、樹
脂に対し、結合能力の独立した源であるように思われ
る。上記第１表中に示される製品はＡ（１％のトリトン
X-100）およびＣ（1Mの酢酸ナトリウム、pH6）で抽出さ
れた。条件Ａは非イオン的結合リパーゼのみを取出す傾
向にあり、更に条件Ｃはイオン的に結合されたリパーゼ
のみを取出す傾向にある。結果を下記に示す。

上記第２表に記載された部分抽出の結果にするどく対比
して、セライトに吸着されたリパーゼは、2,3分以内で
純水により事実上100％抽出された。

本発明によって得られる最も広いプロセス適応性および
／又は最良の収率および最高の単位活性の製品が弱アニ
オン交換樹脂により、すなわちデンマーク出願4025/83
および4167/84の実施により生起するけれども、良好な
収率で許容できる高単位活性製品を、フェノールホルム
アルデヒドマトリックスのマクロポーラス吸着剤樹脂に
より得ることができる。そのような吸着剤樹脂に関す
る、例示的な最良の形態のリパーゼ製品は3000時間以上
の半減期を示した（デュライトS761、この樹脂に対し暗
示が先の表にすでになされていた）。どちらかと言え
ば、本発明者はデンマーク出願4025/83および4167/84で
記載した発明の実施に対し適度な選択を有するであろう
が、全ての事情は決して等しくはない。其の第２表は製
品の事実上の差異が存在することを実証している。製品
の相違は、本発明の実施に一致して得られた製品の幾つ
かのリパーゼ触媒反応に対しより好ましいものとするで
あろう。本発明の実施およびデンマーク出願4025/83お
よび4167/84の実施は、近い又は等しい立場の近密に関
連した発明として業界に提供される。

本発明方法によるエステル交換を行うための温度範囲
は、25℃〜85℃、好ましくは50℃〜80℃、特に55℃〜75
℃である。添付の図面を参照されたい。この図面中に
は、後に述べる充填した床（カラム）連続エステル交換
用の例証的に好ましい態様の固定化酵素の重要な特徴事
項が画かれている。第１図は、60℃での操作において時
間（時）に対し図示した流速（g/hr）の対数を示す。

本発明方法を詳細に説明するため以下の例に掲げるリパ
ーゼ活性単位（LU）は、ノボインダストリーA/S（ノボ
アレ、2880 バスグバエルト、デンマーク）から入手可
能な刊行物83−01−03のAF95.1/2-GBに記載した如く測
定される。

〔実施例〕

例１ この例は、本発明に係るリパーゼの固定化並びに固定化
酵素の特徴を説明する。

固定 124,000LU/gのムコールマイヘイ（Mucor miehei）1gを1
0mlの水に溶解し次いで水性懸濁液中で予じめpH6.0に調
整したジュオライトS-761樹脂4.25g（乾燥体）と混合し
た（バッチD.E. 3.12.7002,ロット81312 E4、85％粒径4
25〜825μｍ）。次いでpHを6.0に調節し更に混合物を含
有するビンを室温で２時間撹拌し、この間において回転
１時間後pHを再調整した。

樹脂をロ過し、10mlの水で２回洗浄し、更に室温で一昼
真空乾燥した。

pH6.3の一緒にしたロ液31mlは700LU/mlを有し、これは
最初の全酵素の約17.5％である。

固定化リパーゼの収率は94.3％の乾燥体で4.91％であっ
た。計算したロードは22,000LU/g（乾燥）であった。

バッチエステル交換活性 この分析は、後記の国際ノボ法AF206に従って行なわれ
た。活性は20.3BIU/gであった。

カラム試験 プレカラム 30gのジュオライトA561、水21gで水和した86％の乾燥体
を石油エーテルと共に2.5×25cmのカラムに充填する。

リパーゼカラム 3.5gの上記固定化リパーゼを石油エーテルと共に1.5×2
5cmカラムに充填する。

基質 0.1％BHTで安定化した、2.5対1w/w比のオリーブ油（シ
グマ0-1500）／デカン酸（メルク）を用いる。基質を溜
め内で60℃で撹拌し、次いで水で飽和する。トリオレイ
ン（オリーブ中主なトリグリセリド）中デカンD00-トリ
グリセリドへの導入を行う。基質を石油エーテルと置換
しながらカラム内を下方にポンプ送入する。

分析 OOO＋ＰのDOO＋Ｐへの65％変換に相当する、製品流中約
23％DOOを得るように流速を調整する。７〜8mlの試料を
秤量し次いで流れをg/hで計算する。

トリグリセリド（TG）組成分析に対し、試料の７滴を4m
lのヘプタンに溶解し次いでヘプタン中活性Al₂O₃12gを
カラムに充填する。15mlのエーテルで溶離を行い、該エ
ーテルを蒸発させ次いで残留物を1.5mlのヘプタンに再
溶解する。以下に説明する如きAF206のHPLCで操作する
と、DOOおよびDODのピークがそれぞれ5.6および3.9分に
現われる。

製品流の含水率はカールフィッシャー滴定法でチェック
する。

カラム操作 試料を２日および３日間隔で採取した。１時間当たりの
1gの基質の流速を、活性単位としてgTG/h・ｇ酵素
（Ｆ）単位に再計算した。また、gTG/g酵素（Ｐの単位
の生産性を計算した。温度は0.4℃の標準偏差を有し平
均で60.3℃であった。

製品中の含水率は、400時間後0.36％から0.28％に降下
した。次いでプレカラムを取り替え更に水は400時間に
わたって0.50から0.31％に降下した。23±１％DOOの変
換範囲内の結果を流速対時間の半対数プロット用に用い
た。このプロットから、初期活性はFinit＝1.94gTG/h・
ｇ酵素製品触媒であると推定したがこれは60℃で3100時
間の半減期を有する。第１図はこの試験結果のプロット
である。

２つの半減期の操作時間とした生産性は、1kgの酵素製
品触媒当たり6.5トンTGであるべきである。

例２ この例は、固定化中に高イオン強度を有する又は有しな
い二種の類似のフェノール性樹脂に対し、本発明に係る
リパーゼの固定を示す。

ノボ法AF206によるリパーゼエステル交換活性（BIU）の
測定原理は、純粋トリオレイン（OOO）中遊離パルミチ
ン酸（Ｐ）の導入であり、ここにおいて初期速度はこの
平衡割合に対し計算される： OOO＋ＰPOO＋Ｏ POO＋ＰPOP＋Ｐ もしもリパーゼ（例えばルコールマイヘイリパーゼとし
て）が1,3特異的である場合、PPPは形成されない。

値Pincはトリグリセリドの１位および３位のパルミチン
酸の量として与えられた反応時間で計算される： この曲線は指数モデルに適合し、初期活性は40℃〜1BIU
で毎分OOOに導入されたＰの１μmoleとして計算する。

12mlの石油エーテル中678μmoleのOOOと678μmoleのＰ
とを、10％の水に水和した、250mgの乾燥体と混合す
る。この混合物を15分および／又は30分間40℃で振とう
し、更にOOO,POOおよびPOPの関係組成物をHPLCにより測
定する。

Pinc,eqは平衡Pinc（モル分率）であり、〜0.22であ
る。

Pincはモル分率で記載した如く計算される。

ＭはOOOおよびＰのモル量であり、〜678μmoleである。

ｔは時間（分）である。

Ｍは触媒の乾燥重量（0.250g）である。

変換、活性、半減期およびカラムテストの生産性の計算 カラム又は流れ活性 Ｆ＝Fo・exp（−ln2−t/t1/2）〔gTG/h・触媒（ｇ）〕 Fo:初期活性、t1/2＝半減期 トリグリセリド（ｇ）／時間・触媒（ｇ）の単位は、基
質中のトリグリセリドの量およびカラム内の触媒の量を
知ることにより、g/hrで表わした基質の流れから誘導さ
れる。

【図面の簡単な説明】

第１図は基質の流れと時間との関係を示すグラフであ
る。

Claims (5)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】脂肪のエステル変換に適した固定化酵素調
   製品の製造方法であって、ムコールマイヘイリパーゼの
   水溶液と、90％以上の樹脂粒子が100〜1000μｍであ
   る、粒状のマクロポーラスフェノールホルムアルデヒド
   吸着剤樹脂とを、少なくとも75％のリパーゼ活性を溶液
   から除去するのに十分な時間５〜７の範囲のpHで接触さ
   せ、これにより所望量のリパーゼを樹脂に結合させ、し
   かる後、このように形成された固定化酵素を水相のスペ
   ントリパーゼ溶液から分離し、次いでその後分離した固
   定化酵素を乾燥して含水率約５〜20％とし、得られた調
   製品が1gの乾燥基準当たり少なくとも10BIUおよび1gの
   乾燥基準当たり少なくとも5000LUを有する、前記方法。
2. 【請求項２】固定化リパーゼを、スペントリパーゼ溶液
   から分離後水洗する、特許請求の範囲第１項記載の方
   法。
3. 【請求項３】マクロポーラス吸着剤樹脂の90％以上の粒
   子が、約400〜約800μｍの粒径を有する、特許請求の範
   囲第１項記載の方法。
4. 【請求項４】ムコールマイヘイリパーゼの水溶液が、乾
   燥吸着剤樹脂1g当り5,000〜20,000LUを有する、特許請
   求の範囲第１項記載の方法。
5. 【請求項５】接触時間が0.5〜４時間である、特許請求
   の範囲第１項記載の方法。