DK153762B - Fremgangsmaade til fremstilling af et immobiliseret lipasepraeparat - Google Patents

Description

DK 153762 B

Immobiliserede lipasepræparater, som er egnede til omestring af fedtstoffer, er kendt. Således beskrives i US patentskrift nr. 4.275.081 immobiliserede lipasepræparater, hvor lipasen fremstilles ved gæring af arter hørende til slægterne 5 Rhizopus, Geotrichum eller Aspergillus, og hvor lipasen er fikse-ret på en indifferent, partikelformet bærer, som kan være diato-mejord eller alumina. Disse bærere udviser et meget højt specifikt overfladeareal. Man har antaget, at det var nødvendigt at anvende et immobiliseret lipasepræparat med meget højt specifikt 10 overfladeareal (d.v.s. små og porøse bærerpartikler) for at opnå høj enzymatisk aktivitet.

Skønt man kan gennemføre omestring diskontinuerligt uden noget opløsningsmiddel med sådanne immobiliserede lipasepræparater, kan man ikke gennemføre kontinuerlig omestring i en 15 søjle og i industriel målestok uden tilstedeværelse af opløsningsmiddel (som må fjernes senere), fordi præparatet består af små partikler, som under søjledrift frembringer et uakceptabelt højt trykfald. Det er bemærkelsesværdigt, at alle eksempler i europæisk patentansøgning med publikationsnummeret 069599, hvori 20 en enzymatisk omlejring af fedtstoffer beskrives med lipase fra Aspergillus-arter, Rhizopus-arter, Mucor javanicus eller Mucor miehei, understøttet på en bærer, f.eks. Celite®, i forbindelse med kontinuerlig omestring i en søjle, gør brug af et opløsningsmiddel. Der foreligger et behov for en immobiliseret lipase, der 25 er velegnet til omestring ved søjledrift af opløsningsmiddelfrie fedtstoffer.

Man har på dette tekniske område naturligvis undersøgt immobilisering af talrige enzymer ved ionbinding, kovalent binding og indeslutning. I US patentskrift nr. 4.170.696 er 30 f.eks. bemærket, at den kontrollerede partikelstørrelsesfordeling og de fysiske egenskaber hos makroporøse ionbyttere frembyder fordele i forbindelse med anvendelsen som enzymbærer. Der fremsættes dog en indvending mod den ringe mængde enzym, som kan bæres på en vægtenhed af ionbytterbæreren, og foreslås, at man 35 anvender et derivat af diethylaminoethyl (DEAE) af ionbytterne som enzymbærere. Angivelser af den art, der er fremsat i US patentskrift nr. 4.170.696, og som omfatter, at en bestemt enzymimmobiliseringsteknik udviser bred anvendelighed hvad angår

2 DK 153762 B

mange forskellige enzymsystemer, kan kritiseres for at være misvisende. De forskelle, der foreligger mellem forskellige enzymer og forskellige substrater, gør praktisk talt hvert system omfattende enzym/substrat/reaktionsbetingelser til en undtagelse, 5 i forbindelse med hvilken en teknik, som påstås at kunne anvendes over et bredt område, kun kan anvendes med ringe resultat, hvis overhovedet.

Især er lipaser exceptionelle enzymer i den forstand, at deres enzymatiske aktivitet fungerer på mellemfladen mellem to 10 væskefaser (vand og olie), idet alene dette forhold er en indikation for, at immobiliseringsteknikker, som er velegnet i forbindelse med andre enzymer, ikke kan forventes at kunne anvendes med et godt resultat i forbindelse med lipase, hvis de overhovedet kan anvendes. Det er kendt, at immobilisering af lipaser fremby-15 der særlige vanskeligheder. Der kan f.eks. henvises til J. Lavayre et al., "Preparation and Properties of Immobilized Lipases", Biotechnology and Bioengineering, bind XXIV, side 1007 - 1013 (1982), John Wiley & Sons. Nogle forskere på området har specifikt undersøgt immobilisering af lipase ved adsorption eller 20 ionbinding, ved kovalent binding og ved indeslutning, og de har konkluderet, at adsorption (på Celite®) efterfulgt af indeslutning af Celite®-partiklerne frembragte langt de bedste resultater; der kan henvises til en publikation, der blev præsenteret ved Enz.Eng. 6, Kashikojima, Japan, 20 - 25 Sept.

25 1981 og den tilsvarende artikel i European- Journal of Applied Microbiology and Biotechnology, nr. 14, side 1-5 (1982), samt en efterfølgende artikel i det samme tidsskrift, nemlig i nr. 17, side 107 - 112 (1983).

Det har nu overraskende ifølge opfindelsen vist sig, at 30 man på en meget simpel måde kan fremstille et immobiliseret lipasepræparat ved simpel blanding af en vandig opløsning af lipase og en partikelformet, makroporøs, adsorberende harpiks af phenol-formaldehyd-typen, hvorefter man udvinder harpiksen, som derpå tørres. Et specificeret vandindhold i det sluttelige, 35 immobiliserede præparat muliggør herefter den kontinuerlige, omestring af fedtstoffer på en i økonomisk henseende attraktiv måde og uden noget opløsningsmiddel. Vaskning med vand af harpiksen efter fjernelse af opløsningen med restlipase er

DK 153762 B

3 fordelagtig. Fremgangsmåden ifølge opfindelsen er i overensstemmelse hermed ejendommelig ved det i krav l's kendetegnende del anførte.

Ved en foretrukken udførelsesform for fremgangsmåden 5 ifølge opfindelsen anvendes en thermostabil, mikrobiel lipase, med fordel en lipase fra en thermophil Mucor-art, især Mucor miehei. Mucor miehei er en god producent af 1,3-specifik lipase, og man kan således opnå et billigt produkt.

Ved en foretrukken udførelsesform for fremgangsmåden 10 ifølge opfindelsen har over 90% af partiklerne af den makropo-røse, adsorberende harpiks af phenol-formaldehyd-typen en parti-kelstørrelse på mellem 400 og 800 μπι. I dette partikelstørrelsesinterval opnås et godt kompromis mellem høj specifik aktivitet for omestring og lavt trykfald i søjlen.

15 Ved en foretrukken udførelsesform for fremgangsmåden ifølge opfindelsen svarer forholdet mellem mængden af vandig opløsning af den mikrobielle lipase og vægten af den adsorberende harpiks til 5000 - 20.000 LU/g harpiks (tørvægt). I dette interval foreligger der tilstrækkelig lipase til harpikser, som 20 kan købes på markedet.

Ved en foretrukken udførelsesform for fremgangsmåden ifølge opfindelsen, hvor den mikrobielle lipase er afledet af en thermophil Mucor-art, især Mucor miehei, ligger pH under kontakten mellem den adsorberende harpiks og den vandige lipaseopløs-25 ning mellem 5 og 7. Herved sikres en stærk binding mellem lipasen og den adsorberende harpiks.

Ved en foretrukken udførelseform for fremgangsmåden ifølge opfindelsen er kontakttiden mellem 0,5 og 4 timer. I løbet af dette tidsinterval nærmer harpiksen sig mætning med lipase.

30 Mindst 75% af lipaseaktiviteten fjernes fra lipaseopløsningen.

Ved en foretrukken udførelsesform for fremgangsmåden ifølge opfindelsen udføres separationen ved filtrering, hvilket er en simpel metode, som let kan udføres industrielt.

Ved en foretrukken udførelsesform for fremgangsmåden 35 ifølge opfindelsen tørres den separerede immobiliserede lipase til et vandindhold mellem 5 og 20% vand. Herved opnås et slutteligt lipasepræparat med en høj omestringsaktivitet.

DK 153762 B

4 Tørreoperationen kan udføres ved hjælp af vacuum, som tørring med fluidiseret masse eller i form af en hvilken som helst anden tørreproces, som er velegnet til stordrift, og som ikke udsætter den immobiliserede lipase for temperaturniveauer, 5 ved hvilke lipasen bliver inaktiveret.

Fra beskrivelsen til dansk patentansøgning nr. 4167/84 må en fremgangsmåde til fremstilling af et immobiliseret lipasepræparat til omestring af fedtstoffer anses for kendt, hvilken fremgangsmåde er ejendommelig ved, at man bringer en 10 vandig opløsning af en mikrobiel lipase i kontakt med en partikelformet, makroporøs, svag anionbytter, der indeholder primære og/eller sekundære og/eller tertiære aminogrupper, og hvis partikler for mere end 90% af partiklernes vedkommende har en partikelstørrelse på mellem 100 og 1000 μιη, fortrinsvis 15 mellem ca. 200 og 400 pm, under betingelser, ved hvilke lipasen bindes til anionbytteren, i et tidsrum, der er tilstrækkeligt langt til at binde den ønskede lipasemængde til anionbytteren, hvorefter den således dannede immobiliserede lipase separeres fra den vandige fase og den separerede 20 immobiliserede lipase tørres til et vandindhold på mellem ca.

2 og 40%. Ved fremgangsmåden ifølge den foreliggende opfindelse anvendes en adsorberende harpiks og ikke en svag anionbytterharpiks. Det her anvendte udtryk "adsorberende harpiks" er taget fra det tekniske område, der omfatter' 25 ionbytterharpikser. Fabrikanterne af ionbytterharpikser har fundet, at de harpiksprodukter i partikelform, i hvilke de ved reaktion har indført de aktive grupper, der frembringer anion-eller kationbytteraktivitet, har kommerciel anvendelighed uden de aktive grupper, sådanne harpiksformer tilbydes på markedet under 30 betegnelsen "adsorberende harpikser". De funktionelle egenskaber af adsorberende harpikser skyldes hovedsageligt andre bindingskræfter end ioniske bindingskræfter.

De adsorberende harpikser, som opfinderen er bekendt med, består enten af en polystyren-matrix eller en phenol-35 formaldehyd-matrix. Kun adsorberende harpikser, som omfatter en phenol-formaldehyd-matrix kan anvendes ved fremgangsmåden ifølge

5 DK 153762 B

opfindelsen, idet den klasse af adsorberende harpikser, som omfatter en polystyren-matrix, er mindre velegnet som bærer for . lipase.

For ikke at inaktivere enzymet gennemføres kendte 5 omestringsreaktioner ved de relativt lave temperaturniveauer, som muliggøres ved tilstedeværelsen af et opløsningsmiddel, der er i stand til at opløse højtsmeltende fedtstoffer. De immobiliserede lipasepræparater, som fremstilles ved udøvelsen af opfindelsen, udviser tilstrækkelig stabilitet i smeltet fedt til at katalysere 10 omestringen ved relativt høje temperaturer. Desuden er trykfaldet gennem en omestringssøjle, som er ladet med de immobiliserede lipasepræparater, som fremstilles ved udøvelsen af opfindelsen, tilstrækkeligt lavt til at muliggøre problemfri søjledrift af omestringsreaktioner. Det har også overraskende vist sig, at den 15 enestående kombination af kontaktbetingelser, adsorberende harpiks med en phenol-formaldehyd-matrix og kontrolleret slutteligt vandindhold i det immobiliserede lipasepræparat frembringer en høj specifik lipaseaktivitet i den smeltede fedtblanding.

20 De immobiliserede lipasepræparater, som fremstilles ved udøvelsen af opfindelsen, kan fremstilles med et højt enzymudbytte, og dette resultat er vigtigt med henblik på opnåelsen af en billig (kontinuerlig) omestringsproces.

Mere end 75% af den lipaseaktivitet, som initialt er 25 tilstede i lipaseopløsningen, kan og bør fjernes fra opløsningen af den adsorberende harpiks. I en vis udstrækning er lipaseop-tagelsen af harpiksen tidsafhængig, sandsynligvis fordi der kræves et betydeligt tidsrum for at muliggøre, at enzymmolekylerne diffunderer gennem de makroporøse harpikspartikler. En blande-30 tid (reaktionstid) på 8 timer vil i det mindste approksimere ligevægtsmætningen af den adsorberende harpiks. Et mindre tidsrum, der kan være så kort som 0,5 timer, frembringer akceptable resultater. Et rimeligt mål for udvælgelse af en optimal kontakttid er fjernelse af lipaseaktivitet fra lipaseopløsningen. Den 35 kontakttid, som kræves for at fjerne mere end 75% af lipaseakti-viteten fra lipaseopløsningen, er reaktionstiden i forbindelse med udøvelsen af opfindelsen i industriel målestok.

DK 153762 B

6

Det kan anføres, at de foreliggende eksperimentelle data viser, at den optimale kontakttid vil være næsten uafhængig af kontakttemperaturen inden for intervallet 5 - 35°C, og det tilstræbes, at opfindelsen udøves inden for dette temperatur-5 interval.

De sluttelige, immobiliserede lipaseprodukter, som er fremstillet ved udøvelsen af opfindelsen, skal udvise en lipaseaktivitet på mindst 5000 LU/g, og et foretrukket interval ligger mellem 5000 og 50.000 LU/g (på tør basis). Man skal opnå 10 en aktivitet på mere end 10 BlU/g.

Det træk, der omfatter vandvaskning af de endnu våde harpikspartikler, der er separeret fra den efter kontaktperioden foreliggende lipaseopløsning, er særligt fordelagtig, når den foreliggende lipase omfatter en relativt rå lipase.

15 Kendte processer af den art, der er beskrevet i US

patentskrift nr. 4 275 081, har krævet en renset lipase for at tilvejebringe brugbare immobiliserede lipasepræparater. Det har overraskende vist sig, at de immobiliserede lipasepræparater, som fremstilles ifølge opfindelsen, kan fremstilles direkte fra et 20 temmeligt råt lipaseprodukt. Tilsyneladende bindes sådanne urenheder, som man i forbindelse med kendt teknik ønskede at fjerne fra lipasen, ikke til den adsorberende harpiks, og derpå fjernes de med den efter kontaktperioden foreliggende lipaseopløsning og/eller med vaskevandet.

25 Der opnås således i høj grad fordelagtige resultater ved hjælp af en fremgangsmåde, som kun kræver, at man blander partikelformet, adsorberende harpiks med en relativt rå lipaseopløsning med pH 5 - 7 ved stuetemperatur, hvorved man endog undgår anvendelsen af et organisk opløsningsmiddel (hvilket 30 undertiden har været foreslået), at man derpå kasserer den efter kontaktperioden foreliggende opløsning, og at man derpå om ønsket vandvasker harpiksen, hvorpå man tørrer harpiksen til et kontrolleret vandindhold. Det skal her gentages, at vandvaskning af det separerede, immobiliserede enzym før tørringen i betydeligt 35 omfang forbedrer produktet.

DK 153762B

7

Det har vist sig, at lipasen i de immobiliserede lipa-sepræparater, som er fremstillet ifølge opfindelsen, ikke let inaktiveres eller fjernes fra præparaterne, når værdien af pH og/eller temperaturen er passende. Der foreligger f.eks. næsten 5 ikke nogen lipaseaktivitet i vaskevandet.

Det har været anført, at foretrukne udførelsesformer for opfindelsen er rettet mod immobilisering af thermostabile lipaser, især lipasen hidrørende fra Mucor miehei. Thermisk stabilitet af lipasen er naturligvis af afgørende betydning for 10 omestring af højere smeltende fedtstoffer, når der ikke foreligger noget opløsningsmiddel. Der fremkommer også andre fordele, når man omestrer ved den højest mulige temperatur, f.eks. formindsket sandsynlighed af bakteriel kontaminering og lavere viskositet af fedtstoffet.

15 Forsøgsresultaterne vist nedenfor hidrørende fra immobilisering på tre typiske, kommercielt rekvirerbare materialer viser immobilisering på en svag anionbytter (ES 562), en adsorberende harpiks ved fremgangmåden ifølge opfindelsen og en adsorberende harpiks med polystyren-matrix.

20 Tabel 1

Funk- Parti- Total Immobiliseret lipase tionel- kel- kapa- le grup- størr. citet Udbytte Ladning Aktivitet

Harpiks Type Matrix per_(μτη) (ækv./l)_(¾) (LU/mg) BlU/g 25 Duolite® Svag Phenol- Tert. 200 1,1 97 25 30 ES562 base formal- amin - 400 dehyd

Duolite® Næsten Phenol- Pheno- 400 - 76 20 20 S761 ikke- formal- lisk - 800 30 ionisk dehyd

Duolite® Ikke- Poly- Ingen 500 - 52 15 4 S861 ionisk styren

Ved et lignende forsøg med en stærkt basisk anionbytterharpiks på polystyren-basis (Dowex® XY-40008-03) 35 opnåede man et produkt med 12 BlU/g, men kun 50% udbytte.

DK 153762 B

8

Porsøg med anionbyttere og adsorberende harpikser med store porestørrelser resulterede i produkter med mindre specifik aktivitet end hvad der kunne forudsiges på basis af udbytteresultaterne. Det antages, at lipasen træder dybt ind i 5 porerne af anionbyttere og adsorberende harpikser med meget stor porestørrelse, hvorved den faktisk går tabt deri.

Specifik fysisk interaktion og anionbinding synes at være uafhængige kilder for harpiksens bindingskapacitet. De produkter, der er identificeret i den før angivne tabel 1, blev 10 ekstraheret med A: 1% Triton® X-100 og C: 1 M natriumacetat, pH

6. Forsøgsomstændighed A har tendens til at fjerne udelukkende ikkeionisk bundet lipase, og forsøgsomstændighed C har tendens til udelukkende at fjerne ionisk bundet lipase. Resultaterne er opstillet i den følgende tabel.

15 Tabel 2

Udbytte Ladning Aktivitet Ekstraktion (% i lh, 25°C) Harpiks (%) (LU/mg) (BlU/g) Cyclus A C

Duolite® ES562 " ~ ΓΊ 0 ΊΙ svag base, 96 25 30 2. 0 8 20 phenol-form-aldehyd

Duolite® S761, 1. 39 0 phenolisk 76 20 20 2. 10 0

Duolite® S861, 1. 29 0 25 ikke-ionisk, 52 15 4 2. 7 0 polystyren_ I udpræget modsætning til de partielle ekstraktionsresultater, der er rapporteret i den før angivne tabel 2, blev lipase, der var adsorberet på Celite®, praktisk taget ekstraheret 30 100% med rent vand i løbet af få minutter.

Man kan opnå produkter med en akceptabel høj specifik aktivitet i et godt udbytte med makroporøse, adsorberende harpikser med en phenolformaldehyd-matrix ved fremgangsmåden ifølge opfindelsen. Et lipaseprodukt, der kan tjene som eksempel 35 på den bedste udførelsesform, og som foreligger på en sådan adsorberende harpiks, udviste en halveringstid på over 3000 timer (den Duolite® S761 harpiks, hvortil der allerede har været henvist i de før angivne tabeller).

DK 153762 B

9

Temperaturintervallet for gennemførelsen af omestringerne ved anvendelse af de ifølge opfindelsen fremstillede lipasepræparater er 25 - 85°C, fortrinsvis 50 - 80°C, især 55 -75°C. Der skal nu henvises til den medfølgende tegning, der er en 5 grafisk afbildning af vigtige egenskaber ved en i det følgende eksemplificeret foretrukket udførelsesform for kontinuerlig omestring med immobiliseret lipase i en pakket masse (søjle), hvorved

Figuren viser logaritmen til strømningshastigheden i 10 g/time mod tiden i timer ved et forsøg gennemført ved 60°C.

Den lipaseaktivitetsenhed (LU), som er angivet i de følgende eksempler, som yderligere illustrerer opfindelsen, blev bestemt som beskrevet i publikationen AF 95.1/2-GB af 83-01-03, rekvirerbar fra NOVO INDUSTRI A/S, Novo Alle, 2880 Bagsværd, 15 Danmark.

Eksempel 1

Dette eksempel illustrerer immobilisering af lipase ifølge opfindelsen og karakterisering af det immobiliserede enzym. 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11

Immobilisering 2 1 g Mucor miehei lipase med 124.000 LU/g blev opløst i 3 10 ml vand og blandet med 4,25 g Duolite® S761 harpiks (tørstof), 4 hvis pH tidligere var blev indstillet på 6,0 i vandig suspension 5 (85% af partiklerne 425 - 825 pm). pH blev derpå genindstillet på 6 6,0, og den flaske, hvori blandingen forelå, blev roteret i to 7 timer ved stuetemperatur, i hvilket tidsrum pH blev genindstillet 8 efter 1 times rotation.

9

Harpiksen blev filtreret, vasket to gange med 10 ml 10 vand og derpå tørret i vacuum natten over ved stuetemperatur.

11

Det kombinerede filtrat omfattende 31 ml og med pH 6,3 indeholdt 700 LU/ml, hvilket svarer til ca. 17,5% af den initiale, totale enzymmængde.

Udbyttet af immobiliseret lipase var 4,91 g (94,3% tørstof). Den beregnede ladning var 22.000 LU/g tørstof.

10

DK 15 3 7 6 2 B

Diskontinuerlig omestringsaktivitet

Denne analyse blev udført i overensstemmelse med den interne NOVO metode AF 206, som er beskrevet i det følgende. Aktiviteten var 20,3 Biu/g.

5 Fo-søg i søjle

Forsøjle 30 g Duolite® A561, 86% tørstof hydratiseret med 21 g vand, pakkes i en 2,5 x 25 cm søjle med petrolether.

Lipasesøjle 10 3,5 g af den før beskrevne, immobiliserede lipase pakkes i en 1,5 x 25 cm søjle med petrolether.

Substrat

Der anvendes olivenolie (Sigma® 0-1500)/decansyre (Merck) i et vægtforhold på 2,5 til 1, stabiliseret med 0,1% BHT. 15 Substratet omrøres i et reservoir ved 60°C og mættes med vand. Inkorporeringen af decansyre (D) i triolein (det hovedsagelige triglycerid i olivenolie) til DOO-triglycerid følges. Substratet pumpes nedad gennem søjlerne og fortrænger petroletheren.

Analyse 20 Strømningshastigheden indstilles for at opnå ca. 23% DOO i produktstrømmen, svarende til 65% konvertering af 000 + P til DOO + P. Der afvejes en 7 - 8 ml prøve, og strømmen beregnes i g/time.

For at analysere sammensætningen af triglycerider (TG) 25 opløses 7 dråber fra prøven i 4 ml heptan og indføres på en søjle med 12 g aktiveret A^O^ i heptan. Elueringen foretages med 15 ml ether, som fordampes, og remanensen genopløses i 1,5 ml heptan. Med den HPLC-analyse, som udføres som beskrevet i det følgende i AF 206, forekommer der toppe af DOO og DOD ved henholdsvis 5,6 og 30 3,9 minutter.

Vandindholdet i produktstrømmen kontrolleres ved Karl Fischer titrering.

DK 153762 B

11 Søjledrift

Man udtog prøver med intervaller på 2 og 3 dage. Strømningshastighed i g substrat/time blev omregnet til g TG/h g enzym (F) som mål for aktiviteten. Man beregnede også produktiviteten i 5 g TG/g enzym (P). Temperaturen var gennemsnitligt 60,3°C med en standardafvigelse på 0,4°C.

Vandindholdet i produktet faldt fra 0,36% til 0,28% efter 400 timer. Forsøj len blev derpå erstattet, og vandindholdet faldt fra 0,50 til 0,31% over de følgende 400 timer.

10 Man anvendte data med en konvertering på .23 ± 1% DOO

til en semilogaritmisk afbildning af strømning mod tid. På basis af denne afbildning bedømmes den initiale aktivitet til at være Finit = 1,94 g TG/h g enzymproduktkatalysator med en halveringstid på 3100 timer ved 60°C. Figuren er afbildningen svarende til 15 dette forsøgsstudium.

Produktiviteten under antagelse af en forsøgstid på 2 halveringstider skulle være 6,5 tons TG/kg enzymproduktkatalysator .

Eksempel 2 20 Dette eksempel illustrerer immobiliseringen af lipase ifølge opfindelsen på to phenoliske adsorberende harpikser af lignende art med eller uden høj ionstyrke under immobiliseringen:

Tabel 3 25 Makroporøs Partikel- Immobilisering phenolisk størrelse Uden salt Med 2M natriumacetat adsorberende 85% Udbytte Ladning Aktivitet Udbytte Ladning Aktivitet harpiks _(jm)_(%) (LU/rag) (BlU/g) (%) (LU/mg) (BlU/g)

Duolite® 30 S761 400 - 800 77 21 20 82 21 15

Duolite® ES762 200 - 400 63 17 6,0 95 25 17

Bestemmelse af den diskontinuerlige lipaseomestringsaktivitet (BIU) i henhold til NOVO metode AF 206

12 DK 153762 B

Princippet er inkorporering af fri palmitinsyre (P) i rent triolein (000), hvor den initiale hastighed beregnes for denne ligevægtsfraktion:

000 + P P00 + O 5 POO + P POP + P

PPP dannes ikke, hvis lipasen (som f.eks. Mucor miehei lipase) er 1,3-specifik.

Værdien P^nc beregnes ved en given reaktionstid som mængden af palmitinsyre i 1- og 3-stillingerne af triglycerid:

10 o. r, _ % POO + 2% POP

* inc 3

Der anvendes en ækvimolær blanding af P og 000, og P^nc vil følge en konverteringskurve fra 0 til ca. 21% ved ligevægt.

Denne kurve indpasses i en eksponentiel model, og den 15 initiale aktivitet beregnes som 1 μπιοί P inkorporeret i 000 per minut ved 40°C 1 BIU.

678 μιηοΐ 000 og 678 μπιοί P i 12 ml petrolether blandes med 250 mg immobiliseret lipase (tørstof), hydratiseret til 10% vand. Denne blanding rystes ved 40°C i 15 og/eller 30 minutter, 20 og den relative sammensætning af 000, P00 og POP måles ved hjælp af HPLC.

P. In (P. /(P. HP. )) M

BlU/cr = ιηο'β<3· · ln^eq.7 mc,eq. mc" t .w 25 er ligevægtsværdien for P. (molfraktion)/v»0,222 inc f · inc P. beregnes som beskrevet i molfraktion M er den molære mængde af 000 og P<^678 μπιοί t er tiden i minutter w er tørvægten af katalysator (0,250 g) 1

Beregning af konvertering, aktivitet, halveringstid og produktivitet ved søjleforsøg

DK 153762 B

13

A — A

Konverteringsgrad: v _ o X “ A - A eg o A er % inkorporeret fedtsyre i triglycerid (f.eks. decansyre eller palmitinsyre i triolein).

5 Søjle eller strømningsaktivitet F = Fq . exp (- ln 2 - t / tl/2) g TG/h g kat.

Fq: initial aktivitet; tl/2 = halveringstid

Enheder af g triglycerid/time g katalysator afledes af strømningen af substrat i g/time, når man kender mængden af 10 triglycerid i substratet og mængden af katalysator i søjlen.

t

Produktivitet P = (V dt o

Claims (8)

1. Fremgangsmåde til fremstilling af et immobiliseret lipasepræparat til omestring af fedtstoffer, kendetegnet ved, at man bringer kontakt mellem en vandig opløsning af mikrobiel 5 lipase og en partikelformet, makroporøs, adsorberende harpiks af phenol-formaldehyd-typen, hvorved mere end 90% af harpikspartiklerne ligger mellem 100 og 1000 μπι, ved et pH mellem 5 og 7 i et tidsrum, der er tilstrækkeligt til at fjerne mindst 75% af lipaseaktiviteten fra opløsningen, hvorefter det således 10 dannede immobiliserede lipasepræparat separeres fra den vandige fase omfattende lipaseopløsning efter kontaktprocessen, hvorefter det separerede, immobiliserede lipasepræparat tørres til et vandindhold på mellem ca. 2 og 40%, idet det resulterende præparat har en værdi af BlU/g på mindst 10 (tør basis), og 15 mindst 5000 LU/g (tør basis).

2. Fremgangsmåde ifølge krav 1, kendetegnet ved, at det immobiliserede lipasepræparat vaskes med vand efter separation fra lipaseopløsningen efter kontaktprocessen.

3. Fremgangsmåde ifølge krav 2, kendetegnet ved, at 20 lipasen er en thermostabil Mucor-lipase.

4. Fremgangsmåde ifølge krav 3, kendetegnet ved, at lipasen er Mucor miehei lipasen.

5. Fremgangsmåde ifølge krav 1, kendetegnet ved, at over 90% af partiklerne af den makroporøse adsorberende harpiks 25 har en partikelstørrelse mellem ca. 400 og ca. 800 μπι. DK 153762 B

6. Fremgangsmåde ifølge krav 1, kendetegnet ved, at den vandige opløsning af den mikrobielle lipase indeholder mellem 5000 og 20.000 LU/g tør, adsorberende harpiks.

7. Fremgangsmåde ifølge krav 1, kendetegnet ved, at 5 kontakttiden ligger mellem 0,5 og 4 timer.

8. Fremgangsmåde ifølge krav 1, kendetegnet ved, at tørringen gennemføres til et vandindhold mellem 5 og 20%.