JPH0698007B2

JPH0698007B2 - シュードモナス属細菌によるシクロプロパン脂肪酸の製造方法

Info

Publication number: JPH0698007B2
Application number: JP28551892A
Authority: JP
Inventors: 久彰八木; 俊弘横地; 泰神坂; 正和山岡; 東郎中原
Original assignee: 工業技術院長
Priority date: 1992-09-30
Filing date: 1992-09-30
Publication date: 1994-12-07
Anticipated expiration: 2009-12-07
Also published as: JPH06113868A

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【産業上の利用分野】本発明はシュードモナス属細菌を
用いて、プロピオン酸等を添加した培地において培養を
行い自然界に極めて稀なシクロプロパン脂肪酸を製造す
る方法に関するものである。

【０００２】

【従来の技術】シクロプロパン環を持つ脂肪酸が乳酸菌
の１種(Lactobacillus arabinosus)に見いだされ(Hofma
nnとLucas, J. Am. Chem. Soc., ７２巻、４３２８頁〜
４３２９頁、１９５０年）、乳酸菌よりラクトバシル酸
と名付けられた。これは下記の化合物（１）として示さ
れる。その後それが炭素数１９、シクロプロパン環の位
置が（ｎ−７）（メチル基炭素から数えて７つめの炭
素）である２−ヘキシル−１−シクロプロパン−１−デ
カン酸（ここでは１９：０ｃｐ（ｎ−７）と表わす。）
であることが確かめられた。さらにこの脂肪酸は乳酸菌
以外にも大腸菌等いくつかの細菌に含まれており、ラク
トバシル酸以外に、下記の化合物（２）、２−ヘキシル
−１−シクロプロパン−１−オクタン酸（１７：０ｃｐ
（ｎ−７））を含むものも見いだされた。

【０００３】

【化１】

【０００４】そしてこれら２つのシクロプロパン酸はそ
れぞれバクセン酸（１８：１（ｎ−７））及びパルミト
レイン酸（１６：１（ｎ−７））を前駆体として生成さ
れることも明らかにされた(Law, Acc. chem. Rec.,４
巻、１９９頁〜２０３頁、１９７１年）。すなわちこれ
らのモノエン酸とＳ−アデノシルメチオニンとの反応に
より、それぞれ炭素数の１つ多いシクロプロパン酸が生
合成される。特徴的なことは、この反応が（ｎ−７）の
炭素に特異的であることである。酵母等の真核微生物及
び藍藻にはシクロプロパン酸は見いだされていないが、
ある種の鞭毛虫類に炭素数１９のシクロプロパン脂肪酸
が見いだされた報告がある(MeyerとHolz,J.Biol. Che
m.,２４１巻、５０００頁〜５００７頁、１９６６
年）。一方、２重結合を１つ含むシクロプロペン環を持
つ脂肪酸が、アオギリ科植物(Sterculia faetide) の種
子油に見いだされ(Nunn, J. Chem. Soc., ３１３頁〜３
１８頁、１９５０年）、その名にちなみステルクリン酸
（２−オクチル−１−シクロプロペン−１−オクタン
酸）（ここでは１９：１ｃｐ（ｎ−９）で表わす）（下
記の化合物（３））と名付けられた。またアオイ科植物
(Malva sylvestris)から、炭素数１８のシクロプロペン
脂肪酸であるマルバリン酸（２−オクチル−１−シクロ
プロペン−１−ヘプタン酸）（１８：１ｃｐ（ｎ−
８））（下記の化合物（４））も見いだされた。シクロ
プロパン脂肪酸は上記の植物種子油に含まれるシクロプ
ロペン脂肪酸を還元したジヒドロステルクリン酸等に相
当する。大腸菌、ビブリオ、サルモネラ、シュードモナ
ス等各種の細菌培養により、シクロプロパン脂肪酸の生
産を実施することができるが、生成される酸は全て前記
の化合物（１）と（２）のみである。

【０００５】

【化２】

【０００６】これらの脂肪酸の生理活性については、こ
れらを含む油脂を摂取すると不飽和化酵素が阻害され、
ステアリン酸が増加し、オレイン酸が減少することが報
告されている(Reiser とRaju, Biochem. Biophys. Res.
Commun １７巻、８頁〜、１９６４年）。またラクトバ
シル酸を培地に加えると、乳酸菌は炭素数１８の不飽和
酸を作らないことも報告された(Hofmannら、J. Biol. C
hem., ２１３巻、３４９頁〜３５５頁、１９５７年）。
シクロプロパン脂肪酸は乳酸菌等の培養においてビオチ
ン類似の増殖促進作用が認められている(HofmannとPano
s, J. Biol. Chem.,２１０巻、６８７頁〜６９３頁、１
９５４年）。各種細菌の培養において、培養後期すなわ
ち対数増殖期後期より、前駆体のモノエン酸の減少とシ
クロプロパン酸の増加がみられ、後者は前者より細胞膜
の流動性を減少させることがわかっている(Jarrel ら、
Biechemistry, ２２巻、５６１１頁〜５６１９頁、１９
８３年）し、これは低温で培養するほど、又はモノエン
酸の減少とシクロプロパン酸の増加が認められることと
符合する。大腸菌やシュードモナス属細菌における、温
度以外の培養条件のシクロプロパン脂肪酸（前記化合物
（１）と（２））組成への影響も明らかにされており、
溶存酸素の減少、ｐＨの減少及び塩分濃度の増加が、こ
れらシクロプロパン脂肪酸組成の増加に寄与することが
報告されてきた。

【０００７】

【発明が解決しようとする課題】本発明の目的は、シュ
ードモナス属細菌を用いて特定のシクロプロパン脂肪酸
を効率よく製造する方法を提供することにある。

【０００８】

【課題を解決するための手段】本発明者らは上記目的を
達成するため種々検討を重ねた結果、シクロプロパン脂
肪酸産生細菌の中で前記化合物（１）及び（２）以外の
シクロプロパン脂肪酸を生産する可能性のある細菌及び
培養条件の探索において、１種のシュードモナス属細菌
(Pseudomonas sp. ATCC １２０８５）がエタノール等の
アルコール類を資化することを見いだした。さらに細菌
細胞を超音波破砕し、粗抽出液を用いて各種アルコール
のアルコールデヒドロゲナーゼ活性を測定した結果、プ
ロパノールが最も大きい活性を示した。そこで本発明者
らは、このシュードモナス属細菌を用いて、化合物
（１）、（２）以外のシクロプロパン脂肪酸を生産すべ
く鋭意研究を重ねた結果、プロパノール及プロピオン酸
を培地に添加することにより自然界には稀なシクロプロ
パン脂肪酸を製造しうることを見いだし、本発明を完成
するに至った。

【０００９】（１）すなわち本発明はシュードモナス属
細菌をプロパノール及び／又はプロピオン酸もしくはそ
の塩を含む培地において培養し２−ペンチル−１−シク
ロプロパン−１−デカン酸（１８：０ｃｐ（ｎ−６））
又は２−ヘプチル−１−シクロプロパン−１−オクタン
酸（１８：０ｃｐ（ｎ−８））を得ることを特徴とする
シクロプロパン脂肪酸の製造方法、（２）培地がプロピ
オン酸の塩を含むことを特徴とする（１）項記載のシク
ロプロパン脂肪酸の製造方法及び（３）プロピオン酸の
塩がプロピオン酸ナトリウムである（２）項記載のシク
ロプロパン脂肪酸の製造方法、を提供するものである。
本発明において培地の組成はプロパノール又はプロピオ
ン酸を含むこと以外は特に制限はないが、通常の海洋性
細菌用培地（ペプトン及び酵母エキス）のものを用いる
ことができる。ｐＨは通常５〜９、好ましくは６〜８と
する。培地中のプロパノール又はプロピオン酸の濃度は
０．５〜１．０％とするのが好ましい。接種するシュー
ドモナス属細菌の量は特に制限はないが、通常培養液の
１％容量である。培養温度は２２〜２８℃が好ましい。
本発明方法により得られた脂肪酸の分離は以下のように
できる。すなわち増殖終了後の培養液から遠心沈降法に
より集菌し、クロロホルム−メタノール（１：２）溶液
により脂質抽出を行う。抽出された脂質を加水分解し、
沸点を下げるためにメチルエステルとする。得られたメ
チルエステル混合物を減圧蒸留にかけることにより目的
化合物が精製される。減圧蒸留にかける前に低温結晶法
あるいは尿素付加法などの操作により不飽和酸と飽和酸
とを分別しておくとさらに効果的に精製される。得られ
た脂肪酸のメチルエステルは加水分解後酸性にすること
により目的の脂肪酸とすることができる。

【００１０】次に本発明の好ましい実施態様を説明す
る。上記シュードモナス属細菌を、基本培地（１リット
ルの人工海水中にペプトン３ｇ、酵母エキス１ｇ、ＨＥ
ＰＥＳ２００ｍＭｐＨ７．５）及びエタノール添加
培地（基本培地にエタノール１０ｇを加えたもの）で培
養すると最終菌体濃度は後者は前者の５倍を示した。そ
こで本菌のアルコールデヒドロゲナーゼ活性を測定し
た。培養菌体を超音波により破砕し、遠心分離により細
胞破砕物を取り除いた上清より一定濃度の蛋白質溶液に
調製したものを試料とした。反応液としてこのタンパク
質溶液とＮＡＤ⁺ の溶液とし、アルコールを加えること
により反応を開始させ、生成するＮＡＤＨを比色法によ
り測定した。その結果、最大の活性はプロパノールで示
され、その値を１００％とすればエタノールは８８％、
ブタノールは５７％、メタノールは０％であった。次に
基本培地にプロパノール１０ｇ／リットルを加えたもの
で本菌の培養を行った。その結果はプロパノールのデヒ
ドロゲナーゼ活性は高いものの、最終菌体濃度は基本培
地の２倍に留まり、エタノールのそれには及ばなかっ
た。一方菌体脂質中の脂肪酸組成を調べた結果、エタノ
ール添加培地及び基本培地においては、１６：０、１
６：１（ｎ−７）、１７：０ｃｐ（ｎ−７）、１８：１
（ｎ−７）、１９：０ｃｐ（ｎ−７）の５つの脂肪酸が
認められたのに対して、プロパノール添加培地において
は上記の酸以外にさらに１５：０、１７：０、１７：１
（ｎ−８）、１８：０ｃｐ（ｎ−８）、１８：０ｃｐ
（ｎ−６）の脂肪酸も認められた。このシュードモナス
属細菌の菌体脂質中の脂肪酸組成を示すガスクロマトグ
ラムを図１に示す。図１（ａ）は基本培地であり、図１
（ｂ）は基本培地に０．５％プロパノールを加えたもの
である。これは次式によりプロパノールを出発物質とす
る脂肪酸合成により、炭素数１５及び１７の奇数鎖脂肪
酸が合成され、２つのモノエン酸（１７：１（ｎ−６）
（化合物（５））と１７：１（ｎ−８））（化合物
（６））よりそれぞれ２つの炭素数１８のシクロプロパ
ン脂肪酸（１８：６ｃｐ（ｎ−６）（化合物（７））と
１８：０ｃｐ（ｎ−８））（化合物（８））が生成した
ことを示す。

【００１１】

【化３】

【００１２】これらの脂肪酸は水素添加を受けないこと
及びそのピコリニルエステルのマススペクトル（図２及
び３）よりシクロプロパン脂肪酸と決定された。すなわ
ち図２及び３に示すように、分子量３７２及び２７５と
２４７の強いピークより（ｎ−６）及び（ｎ−８）のシ
クロプロパン酸であることが判る(Harvey, Biomed. Mas
s Spectrom.,１１巻、１８７頁〜１９２頁、１９８４
年）。図２は脂肪酸１８：０ｃｐ（ｎ−６）、図３は脂
肪酸１８：０ｃｐ（ｎ−８）である。これらの内の１つ
（１８：０ｃｐ（ｎ−８）は植物に見られるマルバリン
酸の還元物（ジヒドロマルバリン酸）である。

【００１３】さらにプロパノールの代わりにプロピオン
酸塩を用いても同じシクロプロパン脂肪酸を生ずること
が判った。以下の実施例に示すように、０．５％プロパ
ノールを添加した培地において、全脂肪酸に対して１
８．８％の１８：０ｃｐ（ｎ−８）と５．７％の１８：
０ｃｐ（ｎ−６）という最大値が得られる。すなわちこ
れ以上のプロパノールを基本培地に加えても所要培養時
間が増加するだけでなく目的物の組成も減少する。プロ
ピオン酸ナトリウムの場合、所要培養時間がプロパノー
ルよりも延長すると共に、５００ｍＭプロピオン酸ナト
リウム（約５％）を添加した培地において全脂肪酸に対
して１４．５％の１８：０ｃｐ（ｎ−８）と６．７％の
１８：０ｃｐ（ｎ−６）という最大値を得た。すなわち
プロパノールの方がプロピオン酸ナトリウムより１／１
０という低い濃度で目的物を同様に生成するものの、一
方プロピオン酸ナトリウムを用いると１８：０ｃｐ（ｎ
−６）の生成比率がプロパノールよりも高い。本発明に
おいてプロピオン酸ナトリウムを用いる方が、２−ペン
チル−１−シクロプロパン−１−デカン酸の２−ヘブチ
ル−１−シクロプロパン−１−オクタン酸に対する生成
比率の上昇が見られる。

【００１４】

【実施例】次に、本発明を実施例に基づいてさらに詳細
に説明する。実施例１基本培地（１リットルの人工海水中にペプトン３ｇ、酵
母エキス１ｇ、ＨＥＰＥＳ２００ｍＭ、ｐＨ７．５）に
０．５％プロパノール（５ｇ／リットル）を加え、Pseu
domonas sp.(ATCC 12085) を植菌し、フラスコによる振
とう培養（２５℃）を７７時間行った。その結果、１
８：０ｃｐ（ｎ−８）と１８：０ｃｐ（ｎ−６）が生成
され、それらの全脂肪酸に対する比率はそれぞれ１８．
８％、及び５．７％であった。実施例２基本培地に１．０％プロパノールを加え、Pseudomonas
sp. を実施例１と同様に７７時間培養した結果、１８：
０ｃｐ（ｎ−８）と１８：０ｃｐ（ｎ−６）が生成さ
れ、それらの全脂肪酸に対する比率はそれぞれ９．０
％、及び５．７％であった。

【００１５】実施例３基本培地に０．２％プロパノールを加え、Pseudomonas
sp. を実施例１と同様に５４時間培養した結果、１８：
０ｃｐ（ｎ−８）と１８：０ｃｐ（ｎ−６）が生成さ
れ、それらの全脂肪酸に対する比率はそれぞれ６．６
％、及び３．６％であった。実施例４基本培地に２．０％プロパノールを加え、Pseudomonas
sp. を実施例１と同様に１７５時間培養した結果、１
８：０ｃｐ（ｎ−８）と１８：０ｃｐ（ｎ−６）が生成
され、それらの全脂肪酸に対する比率はそれぞれ４．６
％、及び２．５％であった。

【００１６】実施例５基本培地に５００ｍＭプロピオン酸ナトリウムを加え、
Pseudomonas sp. を実施例１と同様に２３２時間培養し
た結果、１８：０ｃｐ（ｎ−８）と１８：０ｃｐ（ｎ−
６）が生成され、それらの全脂肪酸に対する比率はそれ
ぞれ１４．５％、及び６．７％であった。実施例６基本培地に３００ｍＭプロピオン酸ナトリウムを加え、
Pseudomonas sp. を実施例１と同様に２３２時間培養し
た結果、１８：０ｃｐ（ｎ−８）と１８：０ｃｐ（ｎ−
６）が生成され、それらの全脂肪酸に対する比率はそれ
ぞれ１１．３％、及び６．６％であった。実施例７基本培地に１００ｍＭプロピオン酸ナトリウムを加え、
Pseudomonas sp. を実施例１と同様に２３２時間培養し
た結果、１８：０ｃｐ（ｎ−８）と１８：０ｃｐ（ｎ−
６）が生成され、それらの全脂肪酸に対する比率はそれ
ぞれ８．１％、及び６．７％であった。

【００１７】実施例８基本培地に１０ｍＭプロピオン酸ナトリウムを加え、Ps
eudomonas sp. を実施例１と同様に１１９時間培養した
結果、１８：０ｃｐ（ｎ−８）と１８：０ｃｐ（ｎ−
６）が生成され、それらの全脂肪酸に対する比率はそれ
ぞれ７．７％、及び４．７％であった。実施例９基本培地に２ｍＭプロピオン酸ナトリウムを加え、Pseu
domonas sp. を実施例１と同様に４７時間培養した結
果、１８：０ｃｐ（ｎ−８）と１８：０ｃｐ（ｎ−６）
が生成され、それらの全脂肪酸に対してそれぞれ２．２
％、及び２．１％であった。

【００１８】

【発明の効果】本発明によれば、シュードモナス属細菌
の培養において、培地にプロピオン酸塩またはプロパノ
ールを加えることにより自然界に稀なシクロプロパン脂
肪酸を効率よく生産できる。本発明方法により得られる
２−ペンチル−１−シクロプロパン−１−デカン酸及び
２−ヘプチル−１−シクロプロパン−１−オクタン酸は
不飽和酵素阻害剤及び細菌増殖促進剤として有用であ
る。

【図面の簡単な説明】

【図１】シュードモナス属細菌の菌体脂質中の脂肪酸組
成を示すガスクロマトグラムである。

【図２】シュードモナス属細菌により生成される脂肪酸
（１８：０ｃｐ（ｎ−６））のピコリニルエステルのマ
ススペクトルである。

【図３】シュードモナス属細菌により生成される脂肪酸
（１８：０ｃｐ（ｎ−８））のピコリニルエステルのマ
ススペクトルである。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (72)発明者山岡正和茨城県つくば市東１丁目１番地工業技術院化学技術研究所内 (72)発明者中原東郎茨城県つくば市東１丁目１番地工業技術院化学技術研究所内

Claims

【特許請求の範囲】

【請求項１】シュードモナス属細菌をプロパノール及
び／又はプロピオン酸もしくはその塩を含む培地におい
て培養し２−ペンチル−１−シクロプロパン−１−デカ
ン酸又は２−ヘプチル−１−シクロプロパン−１−オク
タン酸を得ることを特徴とするシクロプロパン脂肪酸の
製造方法。
【請求項２】培地がプロピオン酸の塩を含むものであ
ることを特徴とする請求項１記載のシクロプロパン脂肪
酸の製造方法。
【請求項３】プロピオン酸の塩がプロピオン酸ナトリ
ウムである請求項１記載のシクロプロパン脂肪酸の製造
方法。