JPH0698655A - 融合酵素産生植物 - Google Patents
融合酵素産生植物Info
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- JPH0698655A JPH0698655A JP5138392A JP13839293A JPH0698655A JP H0698655 A JPH0698655 A JP H0698655A JP 5138392 A JP5138392 A JP 5138392A JP 13839293 A JP13839293 A JP 13839293A JP H0698655 A JPH0698655 A JP H0698655A
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- JP
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- nadph
- reductase
- plasmid
- cytochrome
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- Enzymes And Modification Thereof (AREA)
- Breeding Of Plants And Reproduction By Means Of Culturing (AREA)
Abstract
(57)【要約】
【構成】 チトクロムＰ４５０に由来する一原子酸素添
加活性及びＮＡＤＰＨ−Ｐ４５０還元酵素に由来するＮ
ＡＤＰＨからの還元力供給活性を同一分子内に合わせ持
つ融合酸化酵素をコ−ドする遺伝子を含み、該融合酵素
を産生する能力を有する植物およびその利用、さらに該
融合酵素を植物細胞内で発現させるプラスミド 【効果】 本発明により、薬物・毒物、農薬を含めた
環境汚染物質等の各種の化合物に対するよりすぐれた解
毒代謝能力（酸化的浄化能力）を植物に付与することが
可能となる。さらに本発明植物を前記の化合物に接触さ
せることにより、該化合物を解毒代謝させて環境を浄化
したり、または本発明植物は該化合物に対する抵抗性を
獲得することができる。
加活性及びＮＡＤＰＨ−Ｐ４５０還元酵素に由来するＮ
ＡＤＰＨからの還元力供給活性を同一分子内に合わせ持
つ融合酸化酵素をコ−ドする遺伝子を含み、該融合酵素
を産生する能力を有する植物およびその利用、さらに該
融合酵素を植物細胞内で発現させるプラスミド 【効果】 本発明により、薬物・毒物、農薬を含めた
環境汚染物質等の各種の化合物に対するよりすぐれた解
毒代謝能力（酸化的浄化能力）を植物に付与することが
可能となる。さらに本発明植物を前記の化合物に接触さ
せることにより、該化合物を解毒代謝させて環境を浄化
したり、または本発明植物は該化合物に対する抵抗性を
獲得することができる。
Description
【０００１】
【産業上の利用分野】本発明は、融合酵素産生植物およ
びプラスミドに関する。
びプラスミドに関する。
【０００２】
【従来の技術】地球規模の環境汚染が問題となってお
り、バイオテクノロジーを用いた環境浄化は現代におけ
る最も重要な課題の１つになっている。たとえば、芳香
環炭化水素化合物等の脂溶性化合物には難分解性の物質
が多く、現在深刻な問題として取り上げられている。ま
た一部には、過剰の農薬の使用による環境汚染も問題に
なることもある。これらの問題を解決するために、現
在、環境浄化能を有する種々の微生物が作製され、その
利用が検討されている。
り、バイオテクノロジーを用いた環境浄化は現代におけ
る最も重要な課題の１つになっている。たとえば、芳香
環炭化水素化合物等の脂溶性化合物には難分解性の物質
が多く、現在深刻な問題として取り上げられている。ま
た一部には、過剰の農薬の使用による環境汚染も問題に
なることもある。これらの問題を解決するために、現
在、環境浄化能を有する種々の微生物が作製され、その
利用が検討されている。
【０００３】ところで、Ｐ４５０は微生物から哺乳動物
に至るまで生物界に広く分布するヘム酵素であり、広範
囲の脂溶性化合物に対して一原子酸素を添加する反応を
触媒する。このため、体内に取り込まれた薬物・毒物、
農薬を含めた環境汚染物質等の各種の化合物を解毒代謝
する能力を備えている。Ｐ４５０の活性にはＮＡＤＰＨ
からの電子を供給するＮＡＤＰＨ−Ｐ４５０還元酵素の
存在が必要である。本発明者らは既に種々のＰ４５０分
子種とＮＡＤＰＨ−Ｐ４５０還元酵素との融合酵素（特
開６３−４４８８８、２−２３８７０、特願１−７１２
５０）を作製し、それらが非常に高い活性を有すること
を示した。そしてまた最近になって、植物においてもＰ
４５０の存在が明らかになってきた（Ｎｅｂｅｒｔ ｅ
ｔ ａｌ．，ＤＮＡ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ．１０，１−
１４（１９９１））。
に至るまで生物界に広く分布するヘム酵素であり、広範
囲の脂溶性化合物に対して一原子酸素を添加する反応を
触媒する。このため、体内に取り込まれた薬物・毒物、
農薬を含めた環境汚染物質等の各種の化合物を解毒代謝
する能力を備えている。Ｐ４５０の活性にはＮＡＤＰＨ
からの電子を供給するＮＡＤＰＨ−Ｐ４５０還元酵素の
存在が必要である。本発明者らは既に種々のＰ４５０分
子種とＮＡＤＰＨ−Ｐ４５０還元酵素との融合酵素（特
開６３−４４８８８、２−２３８７０、特願１−７１２
５０）を作製し、それらが非常に高い活性を有すること
を示した。そしてまた最近になって、植物においてもＰ
４５０の存在が明らかになってきた（Ｎｅｂｅｒｔ ｅ
ｔ ａｌ．，ＤＮＡ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ．１０，１−
１４（１９９１））。
【０００４】
【発明が解決しようとする課題】しかしながら、哺乳動
物と比較すると植物体におけるＰ４５０含量は低い。し
たがって、植物における薬物・毒物、農薬を含めた環境
汚染物質等の各種の化合物に対する解毒代謝能力は哺乳
動物よりもはるかに低いと考えられる。このために、地
球上にはきわめて多数の植物体が棲息するにもかかわら
ず、植物体を用いた環境浄化は行われていない。したが
って、薬物・毒物、農薬を含めた環境汚染物質等の各種
の化合物に対する解毒代謝能力の高い植物を作成するこ
とが望まれていた。
物と比較すると植物体におけるＰ４５０含量は低い。し
たがって、植物における薬物・毒物、農薬を含めた環境
汚染物質等の各種の化合物に対する解毒代謝能力は哺乳
動物よりもはるかに低いと考えられる。このために、地
球上にはきわめて多数の植物体が棲息するにもかかわら
ず、植物体を用いた環境浄化は行われていない。したが
って、薬物・毒物、農薬を含めた環境汚染物質等の各種
の化合物に対する解毒代謝能力の高い植物を作成するこ
とが望まれていた。
【０００５】
【課題を解決するための手段】本発明者らは上記の状況
を鑑み、鋭意検討を重ねた結果、Ｐ４５０とＮＡＤＰＨ
−Ｐ４５０還元酵素との融合酵素を植物に導入すること
により、薬物・毒物、農薬を含めた環境汚染物質等の各
種の化合物に対するよりすぐれた解毒代謝能力（酸化的
浄化能力）を植物に付与することに成功し、本発明を完
成した。すなわち、本発明はチトクロムＰ４５０（以下
Ｐ４５０と記する）に由来する一原子酸素添加活性及び
ＮＡＤＰＨ−Ｐ４５０還元酵素に由来するＮＡＤＰＨか
らの還元力供給活性を同一分子内に合わせ持つ融合酸化
酵素をコードする遺伝子を含み、該融合酵素を産生する
能力を有する植物（以下、本発明植物と記す。）および
その利用、さらに該融合酵素を植物細胞内で発現させる
プラスミド（以下、本発明プラスミドと記す。）を提供
するものである。
を鑑み、鋭意検討を重ねた結果、Ｐ４５０とＮＡＤＰＨ
−Ｐ４５０還元酵素との融合酵素を植物に導入すること
により、薬物・毒物、農薬を含めた環境汚染物質等の各
種の化合物に対するよりすぐれた解毒代謝能力（酸化的
浄化能力）を植物に付与することに成功し、本発明を完
成した。すなわち、本発明はチトクロムＰ４５０（以下
Ｐ４５０と記する）に由来する一原子酸素添加活性及び
ＮＡＤＰＨ−Ｐ４５０還元酵素に由来するＮＡＤＰＨか
らの還元力供給活性を同一分子内に合わせ持つ融合酸化
酵素をコードする遺伝子を含み、該融合酵素を産生する
能力を有する植物（以下、本発明植物と記す。）および
その利用、さらに該融合酵素を植物細胞内で発現させる
プラスミド（以下、本発明プラスミドと記す。）を提供
するものである。
【０００６】本発明で用いるＰ４５０としては一原子酸
素添加活性を有する物であれば、特に限定されることは
なく、種々の分子種をあげることができる。現在までに
約１５０種類のＰ４５０分子種の構造が明らかにされて
おり、これらは１次構造の類似性から２７の遺伝子ファ
ミリーに分類されている。そのうち、１０個のファミリ
ーはすべての哺乳動物に存在し、I 、II, III, IV の遺
伝子ファミリーに属するＰ４５０分子種が主として薬物
・毒物、農薬を含めた環境汚染物質等の各種の化合物の
酸化に関与すると言われている。たとえば、Ｐ４５０
ｃ、Ｐ４５０ｄ、Ｐ４５０1A1、1A2,2A6,2B6,2C8,2C9,2C
18,2D6,2E1等をあげることができる。これら分子種はそ
れぞれ異なる化学構造の化合物を代謝するので、目的に
応じて最適の分子種を選ぶことができる。たとえば、ラ
ットの肝臓由来のＰ４５０ｃはベンツピレン等の芳香環
炭化水素化合物の環水酸化、７−エトキシクマリンのＯ
−脱エチル化等の活性を有する。
素添加活性を有する物であれば、特に限定されることは
なく、種々の分子種をあげることができる。現在までに
約１５０種類のＰ４５０分子種の構造が明らかにされて
おり、これらは１次構造の類似性から２７の遺伝子ファ
ミリーに分類されている。そのうち、１０個のファミリ
ーはすべての哺乳動物に存在し、I 、II, III, IV の遺
伝子ファミリーに属するＰ４５０分子種が主として薬物
・毒物、農薬を含めた環境汚染物質等の各種の化合物の
酸化に関与すると言われている。たとえば、Ｐ４５０
ｃ、Ｐ４５０ｄ、Ｐ４５０1A1、1A2,2A6,2B6,2C8,2C9,2C
18,2D6,2E1等をあげることができる。これら分子種はそ
れぞれ異なる化学構造の化合物を代謝するので、目的に
応じて最適の分子種を選ぶことができる。たとえば、ラ
ットの肝臓由来のＰ４５０ｃはベンツピレン等の芳香環
炭化水素化合物の環水酸化、７−エトキシクマリンのＯ
−脱エチル化等の活性を有する。
【０００７】本発明で用いる還元酵素としては、ＮＡＤ
ＰＨからの還元力供給活性を有するもの（ＮＡＤＰＨか
らの電子をＰ４５０へ伝達できるもの）であれば特に限
定されることはなく、たとえば酵母等の微生物由来のＮ
ＡＤＰＨ−Ｐ４５０還元酵素、ヒト、ラット、ウサギ、
ブタ等の哺乳動物由来のＮＡＤＰＨ−Ｐ４５０還元酵
素、植物由来のＮＡＤＰＨ−Ｐ４５０還元酵素等をあげ
ることができる。
ＰＨからの還元力供給活性を有するもの（ＮＡＤＰＨか
らの電子をＰ４５０へ伝達できるもの）であれば特に限
定されることはなく、たとえば酵母等の微生物由来のＮ
ＡＤＰＨ−Ｐ４５０還元酵素、ヒト、ラット、ウサギ、
ブタ等の哺乳動物由来のＮＡＤＰＨ−Ｐ４５０還元酵
素、植物由来のＮＡＤＰＨ−Ｐ４５０還元酵素等をあげ
ることができる。
【０００８】構造が明らかにされている上記のＰ４５０
及びＮＡＤＰＨ−Ｐ４５０還元酵素の遺伝子は、文献記
載の公知方法によって取得することができるし、また、
既報の塩基配列を基にして、ＰＣＲ法によってクローニ
ングすることも可能である。あるいは、化学合成によっ
ても目的とする遺伝子を作製することができる。
及びＮＡＤＰＨ−Ｐ４５０還元酵素の遺伝子は、文献記
載の公知方法によって取得することができるし、また、
既報の塩基配列を基にして、ＰＣＲ法によってクローニ
ングすることも可能である。あるいは、化学合成によっ
ても目的とする遺伝子を作製することができる。
【０００９】本発明で用いる融合酵素遺伝子は、たとえ
ば、ミクロソーム型Ｐ４５０の少なくともミクロソーム
膜結合領域、基質結合領域及びヘム結合領域を含む遺伝
子とＮＡＤＰＨ−Ｐ４５０還元酵素のフラビンモノヌク
レオチド、フラビンアデニンジヌクレオチドおよびＮＡ
ＤＰＨの各々の結合領域を含む遺伝子を接続することに
よって構築することができる。両遺伝子の接続にあたっ
ては、Ｐ４５０遺伝子を５’側に、還元酵素遺伝子を
３’側に配位し、途中に終止コドンが現れないように、
適当なリンカーを用いてフレームがずれないように接続
することによって得ることができる。
ば、ミクロソーム型Ｐ４５０の少なくともミクロソーム
膜結合領域、基質結合領域及びヘム結合領域を含む遺伝
子とＮＡＤＰＨ−Ｐ４５０還元酵素のフラビンモノヌク
レオチド、フラビンアデニンジヌクレオチドおよびＮＡ
ＤＰＨの各々の結合領域を含む遺伝子を接続することに
よって構築することができる。両遺伝子の接続にあたっ
ては、Ｐ４５０遺伝子を５’側に、還元酵素遺伝子を
３’側に配位し、途中に終止コドンが現れないように、
適当なリンカーを用いてフレームがずれないように接続
することによって得ることができる。
【００１０】得られたＰ４５０とＮＡＤＰＨ−Ｐ４５０
還元酵素との融合酵素をコードする遺伝子は、植物細胞
内で機能するプロモーター配列の下流に接続することに
より、植物細胞内で発現させるプラスミドを構築するこ
とができる。植物細胞内で機能するプロモーターとして
は、たとえば、カリフラワーモザイクウィルス３５Ｓプ
ロモーター、ノパリン合成酵素プロモーター等をあげる
ことができる。
還元酵素との融合酵素をコードする遺伝子は、植物細胞
内で機能するプロモーター配列の下流に接続することに
より、植物細胞内で発現させるプラスミドを構築するこ
とができる。植物細胞内で機能するプロモーターとして
は、たとえば、カリフラワーモザイクウィルス３５Ｓプ
ロモーター、ノパリン合成酵素プロモーター等をあげる
ことができる。
【００１１】こうして構築された植物細胞内で発現させ
るプラスミド（以下、発現プラスミドと記す。）は、た
とえば、下記のような通常の方法によって植物細胞内へ
導入することができる。なお、本発明で用いる植物（細
胞）としては、特に限定されることはなく、たとえばタ
バコ、トマト、ジャガイモ、ダイズ、イネ、小麦等の植
物をあげることができる。植物細胞内への遺伝子導入
は、たとえば、植物細胞をプロトプラスト化し、ポリエ
チレングリコール（以下ＰＥＧと記す。）の存在下でプ
ラスミドをプロトプラストに取り込ませるＰＥＧ法、電
気パルスを与えてプラスミドをプロトプラストに取り込
ませるエレクトロポーレーション法、微小針によりプラ
スミドをプロトプラストまたは植物細胞に注入するマイ
クロインジェクション法、あるいはリン酸カルシウム法
等の方法により、遺伝子を植物細胞内へ直接導入する方
法がある。他にはパーティクルガンを使用する方法もあ
げることができる。本発明プラスミドの植物細胞内への
導入量としては、たとえば、ＰＥＧ法では細胞当たり約
１０〜約１００ｐｇ、エレクトロポーレーション法で
は、約０．５〜約１ＫＶ／ｃｍの電気パルスを与えて細
胞当たり約１０〜約１００ｐｇ、マイクロインジェクシ
ョン法では、細胞当たり約１ｐｇ程度が好ましい。また
本発明で用いた方法、すなわち、アグロバクテリウムを
介して植物細胞内へ遺伝子を導入する方法もあげられ
る。なお、アグロバクテリウムを介した遺伝子の導入方
法は対象となる植物が双子葉植物に限られていたが、最
近では、単子葉植物へも導入可能になっており、幅広く
利用することができるのできわめて好ましい方法であ
る。また遺伝子導入に用いられた植物細胞は、リーフデ
ィスク、プロトプラスト細胞、培養細胞そのもの、ある
いは植物の茎、種子等を各種の遺伝子導入方法に応じて
適宜選択して用いる。
るプラスミド（以下、発現プラスミドと記す。）は、た
とえば、下記のような通常の方法によって植物細胞内へ
導入することができる。なお、本発明で用いる植物（細
胞）としては、特に限定されることはなく、たとえばタ
バコ、トマト、ジャガイモ、ダイズ、イネ、小麦等の植
物をあげることができる。植物細胞内への遺伝子導入
は、たとえば、植物細胞をプロトプラスト化し、ポリエ
チレングリコール（以下ＰＥＧと記す。）の存在下でプ
ラスミドをプロトプラストに取り込ませるＰＥＧ法、電
気パルスを与えてプラスミドをプロトプラストに取り込
ませるエレクトロポーレーション法、微小針によりプラ
スミドをプロトプラストまたは植物細胞に注入するマイ
クロインジェクション法、あるいはリン酸カルシウム法
等の方法により、遺伝子を植物細胞内へ直接導入する方
法がある。他にはパーティクルガンを使用する方法もあ
げることができる。本発明プラスミドの植物細胞内への
導入量としては、たとえば、ＰＥＧ法では細胞当たり約
１０〜約１００ｐｇ、エレクトロポーレーション法で
は、約０．５〜約１ＫＶ／ｃｍの電気パルスを与えて細
胞当たり約１０〜約１００ｐｇ、マイクロインジェクシ
ョン法では、細胞当たり約１ｐｇ程度が好ましい。また
本発明で用いた方法、すなわち、アグロバクテリウムを
介して植物細胞内へ遺伝子を導入する方法もあげられ
る。なお、アグロバクテリウムを介した遺伝子の導入方
法は対象となる植物が双子葉植物に限られていたが、最
近では、単子葉植物へも導入可能になっており、幅広く
利用することができるのできわめて好ましい方法であ
る。また遺伝子導入に用いられた植物細胞は、リーフデ
ィスク、プロトプラスト細胞、培養細胞そのもの、ある
いは植物の茎、種子等を各種の遺伝子導入方法に応じて
適宜選択して用いる。
【００１２】遺伝子の導入された植物細胞には、通常、
カナマイシンやハイグロマイシン等の薬剤耐性遺伝子等
を同時に導入した選択マーカーが存在しており、まずこ
のマーカーに基づき選抜を行ない、ついで、目的とする
遺伝子の発現量を解析することにより、さらなる選抜を
することができる。そして目的とする遺伝子が導入され
た植物細胞は、通常の公知な方法によって再分化させる
ことにより該遺伝子を有する植物体を作成することがで
きる。たとえば、１−ナフタリン酢酸および６−ベンジ
ルアデニン等の植物ホルモンを含むＭＳ、Ｗｈｉｔｅ、
Ｂ５，Ｎ６、ＮＮ寒天培地等の通常の植物培養に用いる
公知の寒天培地上に置床した植物細胞から茎葉を出現さ
せ、茎葉をホルモンフリ−のＭＳ、Ｗｈｉｔｅ、Ｂ５，
Ｎ６、ＮＮ寒天培地等の通常の植物培養に用いる公知の
寒天培地に移植し、発根させる。以降、一ヵ月ごとに培
養ポット内で茎頂培養を繰り返すことにより、植物体を
得ることが出来る。このようにして得られた植物体およ
び植物細胞は、薬物・毒物、農薬〔たとえば、殺虫剤・
殺菌剤・除草剤（例として、クロロトルロン（chloroto
luron)、ジウロン(diuron)、クロルスルフロン(chlorsu
lfron)、クロリムロン−エチル(chlorimuron-ethyl) 等
の尿素系除草剤等をあげることができる。）・植物生長
調整剤等〕を含めた環境汚染物質等の化合物に対するす
ぐれた解毒代謝能力を有する。その結果、該植物体およ
び植物細胞を前記の化合物に直接的あるいは間接的に接
触させることにより、環境を浄化させたり、または該化
合物に対する抵抗性を獲得することができる。
カナマイシンやハイグロマイシン等の薬剤耐性遺伝子等
を同時に導入した選択マーカーが存在しており、まずこ
のマーカーに基づき選抜を行ない、ついで、目的とする
遺伝子の発現量を解析することにより、さらなる選抜を
することができる。そして目的とする遺伝子が導入され
た植物細胞は、通常の公知な方法によって再分化させる
ことにより該遺伝子を有する植物体を作成することがで
きる。たとえば、１−ナフタリン酢酸および６−ベンジ
ルアデニン等の植物ホルモンを含むＭＳ、Ｗｈｉｔｅ、
Ｂ５，Ｎ６、ＮＮ寒天培地等の通常の植物培養に用いる
公知の寒天培地上に置床した植物細胞から茎葉を出現さ
せ、茎葉をホルモンフリ−のＭＳ、Ｗｈｉｔｅ、Ｂ５，
Ｎ６、ＮＮ寒天培地等の通常の植物培養に用いる公知の
寒天培地に移植し、発根させる。以降、一ヵ月ごとに培
養ポット内で茎頂培養を繰り返すことにより、植物体を
得ることが出来る。このようにして得られた植物体およ
び植物細胞は、薬物・毒物、農薬〔たとえば、殺虫剤・
殺菌剤・除草剤（例として、クロロトルロン（chloroto
luron)、ジウロン(diuron)、クロルスルフロン(chlorsu
lfron)、クロリムロン−エチル(chlorimuron-ethyl) 等
の尿素系除草剤等をあげることができる。）・植物生長
調整剤等〕を含めた環境汚染物質等の化合物に対するす
ぐれた解毒代謝能力を有する。その結果、該植物体およ
び植物細胞を前記の化合物に直接的あるいは間接的に接
触させることにより、環境を浄化させたり、または該化
合物に対する抵抗性を獲得することができる。
【００１３】
【実施例】以下、実施例に挙げて本発明を説明するが、
本実施例で用いた融合酵素遺伝子はラットＰ４５０ｃｃ
ＤＮＡ（特開昭６１−５２２８４）および酵母ＮＡＤＰ
Ｈ−Ｐ４５０還元酵素遺伝子（特開平２−４５１）を各
種の制限酵素を用いて処理する通常な方法により、必要
な遺伝子断片を調製し、以前本発明者らが構築した融合
酵素と同様の方法に準じて構築することもできる。
本実施例で用いた融合酵素遺伝子はラットＰ４５０ｃｃ
ＤＮＡ（特開昭６１−５２２８４）および酵母ＮＡＤＰ
Ｈ−Ｐ４５０還元酵素遺伝子（特開平２−４５１）を各
種の制限酵素を用いて処理する通常な方法により、必要
な遺伝子断片を調製し、以前本発明者らが構築した融合
酵素と同様の方法に準じて構築することもできる。
【００１４】実施例１ （発現プラスミドｐＧＦＣ２の
構築） （１）ｐＵＦＣＲ１の構築 ラット肝ミクロソームＰ４５０ｃのｃＤＮＡを含むｐＡ
ＭＰ１９（特開昭６３−４４８８８）をＨｉｎｄＩＩＩ
およびＸｈｏＩで同時消化して、Ｐ４５０ｃのコーディ
ング領域を含む約１．６ｋｂの断片を得た。一方、酵母
ＮＡＤＰＨ−Ｐ４５０還元酵素遺伝子を含むｐＢＹＲ７
１７（Ｈ）（特開平２−４５１）をＰｖｕＩＩで消化
し、これに化１
構築） （１）ｐＵＦＣＲ１の構築 ラット肝ミクロソームＰ４５０ｃのｃＤＮＡを含むｐＡ
ＭＰ１９（特開昭６３−４４８８８）をＨｉｎｄＩＩＩ
およびＸｈｏＩで同時消化して、Ｐ４５０ｃのコーディ
ング領域を含む約１．６ｋｂの断片を得た。一方、酵母
ＮＡＤＰＨ−Ｐ４５０還元酵素遺伝子を含むｐＢＹＲ７
１７（Ｈ）（特開平２−４５１）をＰｖｕＩＩで消化
し、これに化１
【００１５】
【化１】配列番号１
【００１６】のＸｈｏＩリンカー（図１−）を挿入
し、ＰｖｕＩＩ部位をＸｈｏＩ部位に変えた（ｐＢＹＲ
７１７（ＸＨ））。つぎに、これをＸｈｏＩとＨｉｎｄ
ＩＩＩで同時消化し、Ｐ４５０還元酵素のコーディング
領域を含む約２．１ｋｂの断片を得た。このようにして
調製した両断片をｐＵＣ１９のＨｉｎｄＩＩＩ部位に同
時に挿入することにより、プラスミドｐＵＦＣＲ１を得
た（図１）。
し、ＰｖｕＩＩ部位をＸｈｏＩ部位に変えた（ｐＢＹＲ
７１７（ＸＨ））。つぎに、これをＸｈｏＩとＨｉｎｄ
ＩＩＩで同時消化し、Ｐ４５０還元酵素のコーディング
領域を含む約２．１ｋｂの断片を得た。このようにして
調製した両断片をｐＵＣ１９のＨｉｎｄＩＩＩ部位に同
時に挿入することにより、プラスミドｐＵＦＣＲ１を得
た（図１）。
【００１７】（２）ｐＢＩ２２１の改変 カリフラワーモザイクウィルス（ＣＭＶ）の３５Ｓプロ
モーターとノパリン合成酵素（Ｎｏｓ）のターミネータ
ーの間にβ−グルクロニダーゼ（ＧＵＳ）遺伝子を含む
ｐＢＩ２２１（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ社製）をＨｉｎｄＩＩ
ＩとＥｃｏＲＩで同時消化し、アルカリホスファターゼ
処理を施した後、化２及び化３
モーターとノパリン合成酵素（Ｎｏｓ）のターミネータ
ーの間にβ−グルクロニダーゼ（ＧＵＳ）遺伝子を含む
ｐＢＩ２２１（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ社製）をＨｉｎｄＩＩ
ＩとＥｃｏＲＩで同時消化し、アルカリホスファターゼ
処理を施した後、化２及び化３
【００１８】
【化２】配列番号２
【００１９】及び化３
【００２０】
【化３】配列番号３
【００２１】のＮｏｔＩリンカー（図２−）を挿入
することにより、それぞれの部位をＮｏｔＩ部位に変え
た。これをＸｂａＩとＳａｃＩで切断し、ＧＵＳのコー
ディング領域（ＸｂａＩ−ＳａｃＩ小断片）を除去し
た。この断片を化４
することにより、それぞれの部位をＮｏｔＩ部位に変え
た。これをＸｂａＩとＳａｃＩで切断し、ＧＵＳのコー
ディング領域（ＸｂａＩ−ＳａｃＩ小断片）を除去し
た。この断片を化４
【００２２】
【化４】配列番号４
【００２３】の合成リンカー（図２−、両末端にそれ
ぞれＸｂａＩ、ＳａｃＩ部位を有し、中央にＨｉｎｄＩ
ＩＩ部位を含む）を挿入することにより、ＣＭＶ３５Ｓ
プロモーターとＮｏｓターミネーターの間にＨｉｎｄＩ
ＩＩ部位を作製した。つぎに、上記（１）で作製したｐ
ＵＦＣＲ１をＨｉｎｄＩＩＩで消化し、Ｐ４５０と還元
酵素の融合酵素をコードする約３．７ｋｂのＨｉｎｄＩ
ＩＩ断片を調製し、ＣＭＶ３５ＳプロモーターとＮｏｓ
ターミネーターの間のＨｉｎｄＩＩＩ部位に挿入した。
こうして得られたプラスミドのうち、ＣＭＶ３５Ｓプロ
モーターとＮｏｓターミネーターの間に融合酵素遺伝子
が順方向に挿入されたプラスミドをｐＢＦＣＲ１とした
（図２）。
ぞれＸｂａＩ、ＳａｃＩ部位を有し、中央にＨｉｎｄＩ
ＩＩ部位を含む）を挿入することにより、ＣＭＶ３５Ｓ
プロモーターとＮｏｓターミネーターの間にＨｉｎｄＩ
ＩＩ部位を作製した。つぎに、上記（１）で作製したｐ
ＵＦＣＲ１をＨｉｎｄＩＩＩで消化し、Ｐ４５０と還元
酵素の融合酵素をコードする約３．７ｋｂのＨｉｎｄＩ
ＩＩ断片を調製し、ＣＭＶ３５ＳプロモーターとＮｏｓ
ターミネーターの間のＨｉｎｄＩＩＩ部位に挿入した。
こうして得られたプラスミドのうち、ＣＭＶ３５Ｓプロ
モーターとＮｏｓターミネーターの間に融合酵素遺伝子
が順方向に挿入されたプラスミドをｐＢＦＣＲ１とした
（図２）。
【００２４】（３）ｐＧＦＣ２の構築 アグロバクテリウム チュメファシエンス（Ａｇｒｏｂ
ａｃｔｅｒｉｕｍ ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓ）のＴ−Ｄ
ＮＡのトランスファーに必要なＴ領域（ＲＢ、ＬＢ）を
含み、カナマイシン耐性を賦与するアミノグリコシドホ
スホトランスフェラーゼ（ＮＰＴＩＩ）とＧＵＳの発現
ユニットを有するｐＢＩ１２１（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ社
製）の外来遺伝子クローニングサイトであるＨｉｎｄＩ
ＩＩ部位を、同様にして、化５
ａｃｔｅｒｉｕｍ ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓ）のＴ−Ｄ
ＮＡのトランスファーに必要なＴ領域（ＲＢ、ＬＢ）を
含み、カナマイシン耐性を賦与するアミノグリコシドホ
スホトランスフェラーゼ（ＮＰＴＩＩ）とＧＵＳの発現
ユニットを有するｐＢＩ１２１（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ社
製）の外来遺伝子クローニングサイトであるＨｉｎｄＩ
ＩＩ部位を、同様にして、化５
【００２５】
【化５】配列番号２
【００２６】の合成リンカー（図２−）を挿入するこ
とにより、ＮｏｔＩ部位に変えた（ｐＢＩ１２１Ｎ）。
つぎに、このｐＢＩ１２１ＮのＮｏｔＩ部位に、上記
（２）で得たｐＢＦＣＲ１から調製したＮｏｔＩ断片を
正方向にライゲーションして組み込み、ｐＧＦＣ２とし
た（図２）。
とにより、ＮｏｔＩ部位に変えた（ｐＢＩ１２１Ｎ）。
つぎに、このｐＢＩ１２１ＮのＮｏｔＩ部位に、上記
（２）で得たｐＢＦＣＲ１から調製したＮｏｔＩ断片を
正方向にライゲーションして組み込み、ｐＧＦＣ２とし
た（図２）。
【００２７】実施例２ （アグロバクテリウムへのトラ
ンスフォーメーション） 実施例１で作製したｐＧＦＣ２を、ヘルパープラスミド
ｐＲＫ２０１３とともに、アグロバクテリウム チュメ
ファシエンスＬＢＡ４４０４株に導入した。ｐＧＦＣ２
を保持するアグロバクテリウムは２５μｇ／ｍｌのカナ
マイシン、１００μｇ／ｍｌのリファマイシン、３００
μｇ／ｍｌのストレプトマイシンを含むＬＢ寒天培地上
で選抜した。このようにして選抜したアグロバクテリウ
ム（薬剤に耐性を示す）について、そこから抽出したプ
ラスミドを電気泳動することにより、プラスミドの存在
を確認した。
ンスフォーメーション） 実施例１で作製したｐＧＦＣ２を、ヘルパープラスミド
ｐＲＫ２０１３とともに、アグロバクテリウム チュメ
ファシエンスＬＢＡ４４０４株に導入した。ｐＧＦＣ２
を保持するアグロバクテリウムは２５μｇ／ｍｌのカナ
マイシン、１００μｇ／ｍｌのリファマイシン、３００
μｇ／ｍｌのストレプトマイシンを含むＬＢ寒天培地上
で選抜した。このようにして選抜したアグロバクテリウ
ム（薬剤に耐性を示す）について、そこから抽出したプ
ラスミドを電気泳動することにより、プラスミドの存在
を確認した。
【００２８】実施例３ （植物への感染） アグロバクテリウムの植物への感染には、無菌発芽させ
たタバコ（Ｎ．ｔａｂａｃｕｍ ＣＶ．Ｘａｎｔｈｉ）
の葉および茎を用いた。約１０ｍｍ四方の葉片、および
５〜１０ｍｍ長の茎をアグロバクテリウム菌液に約５分
間浸したのち、１ーナフタリン酢酸０．１ｍｇ／ｌおよ
び６ーベンジルアデニン１．０ｍｇ／ｌを含むＭＳ寒天
培地（ＭＳ−ＮＢ培地）上におき、約３０００ルクスの
光を照射しながら培養した。感染させた組織は２〜３日
後にセフォタキシム１００μｇ／ｍｌを含むＭＳ−ＮＢ
寒天培地に移し、９〜１０日間培養を継続した。つい
で、カナマイシン１００μｇ／ｍｌとセフォタキシム１
００μｇ／ｍｌを含むＭＳ−ＮＢ寒天培地に移し、約１
ヶ月後に出現したカナマイシン耐性の茎葉をカナマイシ
ン２００μｇ／ｍｌを含むホルモンフリーＭＳ寒天培地
に移した。以後、４０日〜５０日毎に茎頂培養により継
代培養した。
たタバコ（Ｎ．ｔａｂａｃｕｍ ＣＶ．Ｘａｎｔｈｉ）
の葉および茎を用いた。約１０ｍｍ四方の葉片、および
５〜１０ｍｍ長の茎をアグロバクテリウム菌液に約５分
間浸したのち、１ーナフタリン酢酸０．１ｍｇ／ｌおよ
び６ーベンジルアデニン１．０ｍｇ／ｌを含むＭＳ寒天
培地（ＭＳ−ＮＢ培地）上におき、約３０００ルクスの
光を照射しながら培養した。感染させた組織は２〜３日
後にセフォタキシム１００μｇ／ｍｌを含むＭＳ−ＮＢ
寒天培地に移し、９〜１０日間培養を継続した。つい
で、カナマイシン１００μｇ／ｍｌとセフォタキシム１
００μｇ／ｍｌを含むＭＳ−ＮＢ寒天培地に移し、約１
ヶ月後に出現したカナマイシン耐性の茎葉をカナマイシ
ン２００μｇ／ｍｌを含むホルモンフリーＭＳ寒天培地
に移した。以後、４０日〜５０日毎に茎頂培養により継
代培養した。
【００２９】実施例４ （植物ＤＮＡの抽出とＰＣＲ法
による目的遺伝子の確認） タバコの葉からのＤＮＡの抽出は、Ｓ．Ｏ．Ｒｏｇｅｒ
ｓ ｅｔ ａｌ．（Ｐｌａｎｔ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．
５、 ６９ （１９８５））の方法により行った。融合
酵素のＰ４５０ｃをコードする領域および酵母還元酵素
をコードする領域中のＤＮＡ配列をそれぞれプライマー
としてＰＣＲを行った。その結果、ｐＧＦＣ２を導入し
た組換え体植物から調製したＤＮＡをテンプレートにし
た場合、それぞれの領域に対応するＤＮＡ断片が増幅さ
れた。したがって、組換え体植物染色体ＤＮＡ中に融合
酵素遺伝子が組み込まれたことがわかった。
による目的遺伝子の確認） タバコの葉からのＤＮＡの抽出は、Ｓ．Ｏ．Ｒｏｇｅｒ
ｓ ｅｔ ａｌ．（Ｐｌａｎｔ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．
５、 ６９ （１９８５））の方法により行った。融合
酵素のＰ４５０ｃをコードする領域および酵母還元酵素
をコードする領域中のＤＮＡ配列をそれぞれプライマー
としてＰＣＲを行った。その結果、ｐＧＦＣ２を導入し
た組換え体植物から調製したＤＮＡをテンプレートにし
た場合、それぞれの領域に対応するＤＮＡ断片が増幅さ
れた。したがって、組換え体植物染色体ＤＮＡ中に融合
酵素遺伝子が組み込まれたことがわかった。
【００３０】実施例５ （ミクロソームの調製） タバコ植物体全体からのミクロソーム蛋白質の抽出は、
Ｄ．Ｗｅｒｃｋ−Ｒｅｉｃｈｈａｒｔ ｅｔ ａｌ．
（Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｊ． ２７０、ｐ７２９−７３５
（１９９０））の方法に準じて行った。植物材料の破砕
にはポリトロンホモジナイザーを用い、４℃で１５ｍＭ
２−メルカプトエタノール、１ｍＭ ＥＤＴＡ、２５
０ｍＭ スクロース、４０ｍＭ アスコルビン酸ナトリ
ウム、１ｍＭ ＰＭＳＦを含む１００ｍＭ リン酸ナト
リウムバッファー（ｐＨ７．４）中で破砕した。材料は
あらかじめ細かく切り刻み、ポリトロンホモジナイザー
で１０秒×５回で破砕し、チーズクロスで濾過した後、
８００×ｇ １０分および４，５００×ｇ ３０分遠心
分離した。得られた上清をさらに２００，０００×ｇ、
３０分遠心分離して得た沈澱を、３０％（ｖ／ｖ）グリ
セロール、１．５ｍＭ２−メルカプトエタノールを含む
１００ｍＭ リン酸ナトリウムバッファー（ｐＨ７．
４）にポッターホモジナイザーを用いて再懸濁し、ミク
ロソーム画分とした。
Ｄ．Ｗｅｒｃｋ−Ｒｅｉｃｈｈａｒｔ ｅｔ ａｌ．
（Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｊ． ２７０、ｐ７２９−７３５
（１９９０））の方法に準じて行った。植物材料の破砕
にはポリトロンホモジナイザーを用い、４℃で１５ｍＭ
２−メルカプトエタノール、１ｍＭ ＥＤＴＡ、２５
０ｍＭ スクロース、４０ｍＭ アスコルビン酸ナトリ
ウム、１ｍＭ ＰＭＳＦを含む１００ｍＭ リン酸ナト
リウムバッファー（ｐＨ７．４）中で破砕した。材料は
あらかじめ細かく切り刻み、ポリトロンホモジナイザー
で１０秒×５回で破砕し、チーズクロスで濾過した後、
８００×ｇ １０分および４，５００×ｇ ３０分遠心
分離した。得られた上清をさらに２００，０００×ｇ、
３０分遠心分離して得た沈澱を、３０％（ｖ／ｖ）グリ
セロール、１．５ｍＭ２−メルカプトエタノールを含む
１００ｍＭ リン酸ナトリウムバッファー（ｐＨ７．
４）にポッターホモジナイザーを用いて再懸濁し、ミク
ロソーム画分とした。
【００３１】実施例６ （ウェスタンブロットによる発
現蛋白質の分析） 実施例５に従って、組換え体タバコから調製したミクロ
ソーム画分を、４％ＳＤＳを含む緩衝液を用いて可溶化
した後、ＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動に供
した。次に、ゲル中の蛋白質を電気泳動的にニトロセル
ロースフィルターに移した。以後の操作は３７℃で行な
った。ニトロセルロースフィルターを０．０５％ Ｔｗ
ｅｅｎ２０および３％ ゼラチンを含むＴＢＳ緩衝液
（５０ｍＭ トリス塩酸バッファー（ｐＨ ７．５）、
２００ｍＭ ＮａＣｌ）中で４０分間インキュベートし
た後、０．０５％ Ｔｗｅｅｎ２０および１％ ゼラチ
ンを含むＴＢＳ緩衝液に浸し、抗−ラットＰ４５０ｃ抗
体あるいは抗−酵母ＮＡＤＰＨ−Ｐ４５０還元酵素抗体
を添加し、２時間インキュベートした。フィルターを
０．０５％ Ｔｗｅｅｎ２０を含むＴＢＳ緩衝液で３０
分間ずつ合計４回洗浄した後、０．０５％ Ｔｗｅｅｎ
２０および３％ ゼラチンを含むＴＢＳ緩衝液中で２０
分間インキュベートした。さらに、フィルターを０．０
５％ Ｔｗｅｅｎ２０および１％ ゼラチンを含むＴＢ
Ｓ緩衝液に浸し、1 2 5 Ｉ−Ｐｒｏｔｅｉｎ Ａを添加
した後、１時間インキュベートした。上記同様の洗浄操
作を４回繰り返し、フィルターを風乾した後、イメージ
ングプレート（富士フィルム）に露光した。３６時間
後、バイオイメージアナライザー（富士フィルム）によ
り分析した。その結果、抗−Ｐ４５０ｃ抗体、抗−酵母
ＮＡＤＰＨ−Ｐ４５０還元酵素抗体のいずれとも反応す
るバンドが分子量約１３万ダルトンの位置に検出され、
組換え体タバコのミクロソーム画分に目的とする融合酵
素の産生が認められた。
現蛋白質の分析） 実施例５に従って、組換え体タバコから調製したミクロ
ソーム画分を、４％ＳＤＳを含む緩衝液を用いて可溶化
した後、ＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動に供
した。次に、ゲル中の蛋白質を電気泳動的にニトロセル
ロースフィルターに移した。以後の操作は３７℃で行な
った。ニトロセルロースフィルターを０．０５％ Ｔｗ
ｅｅｎ２０および３％ ゼラチンを含むＴＢＳ緩衝液
（５０ｍＭ トリス塩酸バッファー（ｐＨ ７．５）、
２００ｍＭ ＮａＣｌ）中で４０分間インキュベートし
た後、０．０５％ Ｔｗｅｅｎ２０および１％ ゼラチ
ンを含むＴＢＳ緩衝液に浸し、抗−ラットＰ４５０ｃ抗
体あるいは抗−酵母ＮＡＤＰＨ−Ｐ４５０還元酵素抗体
を添加し、２時間インキュベートした。フィルターを
０．０５％ Ｔｗｅｅｎ２０を含むＴＢＳ緩衝液で３０
分間ずつ合計４回洗浄した後、０．０５％ Ｔｗｅｅｎ
２０および３％ ゼラチンを含むＴＢＳ緩衝液中で２０
分間インキュベートした。さらに、フィルターを０．０
５％ Ｔｗｅｅｎ２０および１％ ゼラチンを含むＴＢ
Ｓ緩衝液に浸し、1 2 5 Ｉ−Ｐｒｏｔｅｉｎ Ａを添加
した後、１時間インキュベートした。上記同様の洗浄操
作を４回繰り返し、フィルターを風乾した後、イメージ
ングプレート（富士フィルム）に露光した。３６時間
後、バイオイメージアナライザー（富士フィルム）によ
り分析した。その結果、抗−Ｐ４５０ｃ抗体、抗−酵母
ＮＡＤＰＨ−Ｐ４５０還元酵素抗体のいずれとも反応す
るバンドが分子量約１３万ダルトンの位置に検出され、
組換え体タバコのミクロソーム画分に目的とする融合酵
素の産生が認められた。
【００３２】実施例７ （形質転換酵母による農薬の代
謝） 酵母サッカロマイセス セレビシエ ＡＨ２２／ｐＡＡ
Ｈ５株（ベクターのみを含むコントロール株）およびラ
ットＰ４５０ｃ／酵母ＮＡＤＰＨ−Ｐ４５０還元融合酵
素を発現させるプラスミドを保有する形質転換株ＡＨ２
２／ｐＡＦＣＲ１はＳＤ合成培地中で培養した。両酵母
培養液に、除草剤クロロトルロンあるいはジウロンを終
濃度１mMになるように添加した。除草剤添加２４時間後
に培養液１ｍｌを分取し、３０％トリクロロ酢酸を３
１．２μｌ添加した後、遠心分離した。上清を等量の酢
酸エチルで２回抽出し、酢酸エチル層を３０℃で濃縮乾
固した後、その残渣をメタノールに溶解して液体クロマ
トグラフィー（ＨＰＬＣ）で分析した。カラムはコスモ
シール５Ｃ１８−ＡＲを用い、移動層にはアセトニトリ
ル：０．１％酢酸ナトリウム（ｐＨ４．０）（２０：８
０）を用いた。その結果、クロロトルロンはＡＨ２２／
ｐＡＡＨ５株においてほとんど代謝されなかったが、Ａ
Ｈ２２／ｐＡＦＣ１株では７７％にまで減少し、主要な
代謝物１種類が確認された。また、同様にジウロンはＡ
Ｈ２２／ｐＡＡＨ５株ではほとんど代謝されなかった
が、ＡＨ２２／ｐＡＡＨ５株ではほとんど代謝されなか
ったが、ＡＨ２２／ｐＡＦＣＲ１株では７４％にまで減
少し、主要な代謝物１種類が確認された。
謝） 酵母サッカロマイセス セレビシエ ＡＨ２２／ｐＡＡ
Ｈ５株（ベクターのみを含むコントロール株）およびラ
ットＰ４５０ｃ／酵母ＮＡＤＰＨ−Ｐ４５０還元融合酵
素を発現させるプラスミドを保有する形質転換株ＡＨ２
２／ｐＡＦＣＲ１はＳＤ合成培地中で培養した。両酵母
培養液に、除草剤クロロトルロンあるいはジウロンを終
濃度１mMになるように添加した。除草剤添加２４時間後
に培養液１ｍｌを分取し、３０％トリクロロ酢酸を３
１．２μｌ添加した後、遠心分離した。上清を等量の酢
酸エチルで２回抽出し、酢酸エチル層を３０℃で濃縮乾
固した後、その残渣をメタノールに溶解して液体クロマ
トグラフィー（ＨＰＬＣ）で分析した。カラムはコスモ
シール５Ｃ１８−ＡＲを用い、移動層にはアセトニトリ
ル：０．１％酢酸ナトリウム（ｐＨ４．０）（２０：８
０）を用いた。その結果、クロロトルロンはＡＨ２２／
ｐＡＡＨ５株においてほとんど代謝されなかったが、Ａ
Ｈ２２／ｐＡＦＣ１株では７７％にまで減少し、主要な
代謝物１種類が確認された。また、同様にジウロンはＡ
Ｈ２２／ｐＡＡＨ５株ではほとんど代謝されなかった
が、ＡＨ２２／ｐＡＡＨ５株ではほとんど代謝されなか
ったが、ＡＨ２２／ｐＡＦＣＲ１株では７４％にまで減
少し、主要な代謝物１種類が確認された。
【００３３】実施例８ （形質転換植物による環境汚染
物質の代謝） 実施例７において用いた除草剤クロロトルロンあるいは
ジウロンのかわりに環境汚染物質であるベンツピレンあ
るいは７−エトキシクマリンを用いて実施例７に準じた
同様な試験を行なう。その結果として、ベンツピレンあ
るいは７−エトキシクマリンはＡＨ２２／ｐＡＡＨ５株
においてほとんど代謝されないが、ＡＨ２２／ｐＡＦＣ
Ｒ１株では減少する。
物質の代謝） 実施例７において用いた除草剤クロロトルロンあるいは
ジウロンのかわりに環境汚染物質であるベンツピレンあ
るいは７−エトキシクマリンを用いて実施例７に準じた
同様な試験を行なう。その結果として、ベンツピレンあ
るいは７−エトキシクマリンはＡＨ２２／ｐＡＡＨ５株
においてほとんど代謝されないが、ＡＨ２２／ｐＡＦＣ
Ｒ１株では減少する。
【００３４】実施例９ （形質転換植物の育成に対する
農薬の影響） 除草剤クロロトルロンあるいはジウロンを終濃度１０
０、１０μＭになるように添加したＭＳ寒天培地場で、
無菌培養した非形質転換タバコおよびＰ４５０ｃ／ＮＡ
ＤＰＨ−Ｐ４５０還元酵素の融合酵素をコードする遺伝
子を導入した形質転換タバコの苗を培養し、３０日後に
その生長度を比較した。その結果、いずれの除草剤を添
加した培地においては非形質転換タバコは生育が阻害さ
れたが、形質転換タバコは阻害されなかった。３０日後
に植物体の新鮮重を比較したところ、非形質転換タバコ
は１．０ｇ未満であったのに対し、形質転換タバコは約
１０ｇであり、両者の生育に顕著な違いが見られた。
農薬の影響） 除草剤クロロトルロンあるいはジウロンを終濃度１０
０、１０μＭになるように添加したＭＳ寒天培地場で、
無菌培養した非形質転換タバコおよびＰ４５０ｃ／ＮＡ
ＤＰＨ−Ｐ４５０還元酵素の融合酵素をコードする遺伝
子を導入した形質転換タバコの苗を培養し、３０日後に
その生長度を比較した。その結果、いずれの除草剤を添
加した培地においては非形質転換タバコは生育が阻害さ
れたが、形質転換タバコは阻害されなかった。３０日後
に植物体の新鮮重を比較したところ、非形質転換タバコ
は１．０ｇ未満であったのに対し、形質転換タバコは約
１０ｇであり、両者の生育に顕著な違いが見られた。
【００３５】
【発明の効果】本発明により、薬物・毒物、農薬を含め
た環境汚染物質等の各種の化合物に対するよりすぐれた
解毒代謝能力（酸化的浄化能力）を植物に付与すること
が可能となる。さらに本発明植物を前記の化合物に接触
させることにより、該化合物を解毒代謝させて環境を浄
化したり、または本発明植物は該化合物に対する抵抗性
を獲得することができる。
た環境汚染物質等の各種の化合物に対するよりすぐれた
解毒代謝能力（酸化的浄化能力）を植物に付与すること
が可能となる。さらに本発明植物を前記の化合物に接触
させることにより、該化合物を解毒代謝させて環境を浄
化したり、または本発明植物は該化合物に対する抵抗性
を獲得することができる。
配列番号：１ 配列の長さ：１２ 配列の型：核酸 鎖の数：二本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸、合成ＤＮＡ 配列 CAGCTCGAGCTG GTCGAGCTCGAC 配列番号：２ 配列の長さ：１６ 配列の型：核酸 鎖の数：二本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸、合成ＤＮＡ 配列番号：３ 配列の長さ：１６ 配列の型：核酸 鎖の数：二本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸、合成ＤＮＡ 配列番号：４ 配列の長さ：１５ 配列の型：核酸 鎖の数：二本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸、合成ＤＮＡ
【図１】プラスミドｐＵＦＣＲ１の構築方法を示す図で
ある。
ある。
Ｈ： 制限酵素ＨｉｎｄＩＩＩの切断部位 Ｘ： 制限酵素ＸｈｏＩの切断部位 網掛けを施した箱： ラットＰ４５０ｃのコーディング
領域 縦線を施した箱： 母還元酵素のコーディング領域を示
す。
領域 縦線を施した箱： 母還元酵素のコーディング領域を示
す。
【図２】プラスミドｐＧＦＣ２の構築方法を示す。
Ｈ： 制限酵素ＨｉｎｄＩＩＩによる切断部位 Ｘ： 制限酵素ＸｂａＩによる切断部位 Ｓ： 制限酵素ＳａｃＩによる切断部位 Ｅ： 制限酵素ＥｃｏＲＩによる切断部位 Ｎ： 制限酵素ＮｏｔＩによる切断部位 黒塗りの箱： 合成リンカー ＲＢ、ＬＢ： Ｔ−ＤＮＡのトランスファーに必要なボ
ーダー領域 Ｎｏｓ−ｐ： ノパリン合成酵素プロモーター Ｎｏｓ−ｔ： ノパリン合成酵素ターミネーター ３５Ｓ−ｐ： カリフラワーモザイクウィルス３５Ｓプ
ロモーター ＮＰＴＩＩ： アミノグリコシドホスホトランスフェラ
ーゼ ＧＵＳ： β−グルクロニダーゼ Ｐ４５０ｃ／Ｆｐｔ： ラットＰ４５０ｃと酵母還元酵
素の融合酵素をコードする領域
ーダー領域 Ｎｏｓ−ｐ： ノパリン合成酵素プロモーター Ｎｏｓ−ｔ： ノパリン合成酵素ターミネーター ３５Ｓ−ｐ： カリフラワーモザイクウィルス３５Ｓプ
ロモーター ＮＰＴＩＩ： アミノグリコシドホスホトランスフェラ
ーゼ ＧＵＳ： β−グルクロニダーゼ Ｐ４５０ｃ／Ｆｐｔ： ラットＰ４５０ｃと酵母還元酵
素の融合酵素をコードする領域
【図３】合成リンカーの塩基配列を示す。(1) は配列番
号１、(2) は配列番号２、(3)は配列番号３、(4) は配
列番号４として配列表に記載される。
号１、(2) は配列番号２、(3)は配列番号３、(4) は配
列番号４として配列表に記載される。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.5 識別記号 庁内整理番号 ＦＩ 技術表示箇所 Ｃ１２Ｎ 15/62 (Ｃ１２Ｎ 9/02 Ｃ１２Ｒ 1:91） (72)発明者 大川 秀郎 兵庫県芦屋市朝日ケ丘町14−３−403
Claims (8)
- 【請求項１】チトクロムＰ４５０に由来する一原子酸素
添加活性及びＮＡＤＰＨ−Ｐ４５０還元酵素に由来する
ＮＡＤＰＨからの還元力供給活性を同一分子内に合わせ
持つ融合酸化酵素をコードする遺伝子を含み、該融合酵
素を産生する能力を有する植物 - 【請求項２】チトクロムＰ４５０が哺乳動物チトクロム
Ｐ４５０ｃであり、ＮＡＤＰＨ−Ｐ４５０還元酵素が酵
母ＮＡＤＰＨ−Ｐ４５０還元酵素であることを特徴とす
る請求項１記載の植物 - 【請求項３】チトクロムＰ４５０に由来する一原子酸素
添加活性及びＮＡＤＰＨ−Ｐ４５０還元酵素に由来する
ＮＡＤＰＨからの還元力供給活性を同一分子内に合わせ
持つ融合酸化酵素をコードする遺伝子を含み、該融合酵
素を植物細胞内で発現させることを特徴とするプラスミ
ド - 【請求項４】チトクロムＰ４５０が哺乳動物チトクロム
Ｐ４５０ｃであり、ＮＡＤＰＨ−Ｐ４５０還元酵素が酵
母ＮＡＤＰＨ−Ｐ４５０還元酵素であることを特徴とす
る請求項３記載のプラスミド - 【請求項５】カリフラワーモザイクウィルス３５Ｓプロ
モーターを含むことを特徴とする請求項３記載のプラス
ミド - 【請求項６】ｐＧＦＣ２と命名した特許請求の範囲第３
項記載のプラスミド - 【請求項７】請求項３記載のプラスミドを植物細胞内に
導入することを特徴とする請求項１記載の植物の作成方
法。 - 【請求項８】請求項１記載の植物を環境汚染物質に接触
させることにより、該環境汚染物質を解毒代謝させるこ
とを特徴とする環境浄化方法。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP5138392A JPH0698655A (ja) | 1992-08-05 | 1993-06-10 | 融合酵素産生植物 |
Applications Claiming Priority (3)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP4-209226 | 1992-08-05 | ||
| JP20922692 | 1992-08-05 | ||
| JP5138392A JPH0698655A (ja) | 1992-08-05 | 1993-06-10 | 融合酵素産生植物 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH0698655A true JPH0698655A (ja) | 1994-04-12 |
Family
ID=26471432
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP5138392A Pending JPH0698655A (ja) | 1992-08-05 | 1993-06-10 | 融合酵素産生植物 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JPH0698655A (ja) |
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| EP0707070A1 (en) | 1994-07-18 | 1996-04-17 | Sumitomo Chemical Company, Limited | Method for enhancing disease and pest resistance of plants |
-
1993
- 1993-06-10 JP JP5138392A patent/JPH0698655A/ja active Pending
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| EP0707070A1 (en) | 1994-07-18 | 1996-04-17 | Sumitomo Chemical Company, Limited | Method for enhancing disease and pest resistance of plants |
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