JPH07102154B2 - １，５−アンヒドログルシトールの定量法 - Google Patents
１，５−アンヒドログルシトールの定量法Info
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- JPH07102154B2 JPH07102154B2 JP5022613A JP2261393A JPH07102154B2 JP H07102154 B2 JPH07102154 B2 JP H07102154B2 JP 5022613 A JP5022613 A JP 5022613A JP 2261393 A JP2261393 A JP 2261393A JP H07102154 B2 JPH07102154 B2 JP H07102154B2
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- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
- C12Q1/26—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving oxidoreductase
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- Y10S—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
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Description
【０００１】
【産業上の利用分野】本発明は、糖尿病の診断マーカー
である１，５−アンヒドログルシトール（以下１，５−
ＡＧと称する）の簡便で迅速で自動分析装置への適用も
可能な酵素的測定方法に関するものである。
である１，５−アンヒドログルシトール（以下１，５−
ＡＧと称する）の簡便で迅速で自動分析装置への適用も
可能な酵素的測定方法に関するものである。
【０００２】
【従来の技術】１，５−ＡＧはヒト髄液および血液中に
存在し、ある種の疾患、特に糖尿病において著しい濃度
低下が報告されている化合物であり（赤沼安夫、戸辺一
之：日本内科学会誌、８０ １１９８〜１２０４ １９
９１）、糖尿病の診断マーカーとして重要と目されるも
のである。
存在し、ある種の疾患、特に糖尿病において著しい濃度
低下が報告されている化合物であり（赤沼安夫、戸辺一
之：日本内科学会誌、８０ １１９８〜１２０４ １９
９１）、糖尿病の診断マーカーとして重要と目されるも
のである。
【０００３】これまでの１，５−ＡＧの測定方法として
は、ガスクロマトグラフィーによる方法（糖尿病２５
巻、１１１５〜１１１８、１９８２年、吉岡。以下、Ｇ
Ｃ法と称する。）と、ピラノースオキシターゼ（以下、
ＰＲＯＤと称する）またはＬ−ソルボースオキシターゼ
を用いる方法（特開昭６３−１８５３７９号公報。以
下、このような測定法を酵素法と称する）が知られてい
る。
は、ガスクロマトグラフィーによる方法（糖尿病２５
巻、１１１５〜１１１８、１９８２年、吉岡。以下、Ｇ
Ｃ法と称する。）と、ピラノースオキシターゼ（以下、
ＰＲＯＤと称する）またはＬ−ソルボースオキシターゼ
を用いる方法（特開昭６３−１８５３７９号公報。以
下、このような測定法を酵素法と称する）が知られてい
る。
【０００４】１，５−ＡＧ測定の対象となる検体は主と
して糖尿病患者の血清または血漿である。その糖尿病患
者の血中においてグルコース濃度は健常者に比べて高
く、その値は、健常者が６０〜１００mg／dl程度である
のに対し、糖尿病患者においては１００〜１０００mg／
dlの範囲で広く分布している。一方、血中の１，５−Ａ
Ｇ濃度は、健常者が１．６４〜２．６８mg／dlであるの
に対し、糖尿病患者においては０．１８〜０．２１mg／
dlという著しく低い数値を示す。（日本臨床４７巻 １
９８９年増刊号広範囲血液・尿化学検査免疫学的検査
上巻 ４３９〜４４２ 川合）。このため、糖尿病患者
血中の１，５−ＡＧの濃度はグルコースの約４７０分の
１以下になる。加えて、グルコースと１，５−ＡＧは構
造が近似しているため、現在の技術水準では共存下の選
択的測定は不可能であり、グルコースを選択的に除去す
るか、あるいは適切に修飾する検体前処理が不可欠であ
る。
して糖尿病患者の血清または血漿である。その糖尿病患
者の血中においてグルコース濃度は健常者に比べて高
く、その値は、健常者が６０〜１００mg／dl程度である
のに対し、糖尿病患者においては１００〜１０００mg／
dlの範囲で広く分布している。一方、血中の１，５−Ａ
Ｇ濃度は、健常者が１．６４〜２．６８mg／dlであるの
に対し、糖尿病患者においては０．１８〜０．２１mg／
dlという著しく低い数値を示す。（日本臨床４７巻 １
９８９年増刊号広範囲血液・尿化学検査免疫学的検査
上巻 ４３９〜４４２ 川合）。このため、糖尿病患者
血中の１，５−ＡＧの濃度はグルコースの約４７０分の
１以下になる。加えて、グルコースと１，５−ＡＧは構
造が近似しているため、現在の技術水準では共存下の選
択的測定は不可能であり、グルコースを選択的に除去す
るか、あるいは適切に修飾する検体前処理が不可欠であ
る。
【０００５】その前処理において、ＧＣ法は、グルコー
ス除去のほかに１，５−ＡＧのラベル化が必要であり、
これは手技が繁雑な上、分析に長時間を要する。このた
めＧＣ法による多数の検体の測定は困難であり、臨床的
な定量法として適用するには問題がある。
ス除去のほかに１，５−ＡＧのラベル化が必要であり、
これは手技が繁雑な上、分析に長時間を要する。このた
めＧＣ法による多数の検体の測定は困難であり、臨床的
な定量法として適用するには問題がある。
【０００６】酵素法による測定では、前処理としてグル
コース除去をイオン交換カラムを用いて行うか、リン酸
化によるグルコース修飾を行う。これらの操作の欠点と
されるところは、イオン交換カラムによる除去では分離
操作の著しい繁雑さである。一方リン酸化によるグルコ
ース修飾では最適pHの相違を初めとして、リン酸化の反
応至適条件と１，５−ＡＧの定量反応の至適条件が従来
異なるため、リン酸化反応と１，５−ＡＧの測定をそれ
ぞれ異なった反応条件で行わなければならない。加えて
リン酸化に用いるアデノシン−５′−三リン酸（以下Ａ
ＴＰと称する）はＰＲＯＤに対して阻害作用を有するの
で、リン酸化反応を促進するためにＡＴＰを測定系に加
えることには濃度的に限界があり、速やかにリン酸化反
応を終了させることは困難であった。いずれにせよ迅速
な定量が不可能であって、特に各種の臨床検査に広く用
いられている自動分析装置への適用はなされるに至って
いない。
コース除去をイオン交換カラムを用いて行うか、リン酸
化によるグルコース修飾を行う。これらの操作の欠点と
されるところは、イオン交換カラムによる除去では分離
操作の著しい繁雑さである。一方リン酸化によるグルコ
ース修飾では最適pHの相違を初めとして、リン酸化の反
応至適条件と１，５−ＡＧの定量反応の至適条件が従来
異なるため、リン酸化反応と１，５−ＡＧの測定をそれ
ぞれ異なった反応条件で行わなければならない。加えて
リン酸化に用いるアデノシン−５′−三リン酸（以下Ａ
ＴＰと称する）はＰＲＯＤに対して阻害作用を有するの
で、リン酸化反応を促進するためにＡＴＰを測定系に加
えることには濃度的に限界があり、速やかにリン酸化反
応を終了させることは困難であった。いずれにせよ迅速
な定量が不可能であって、特に各種の臨床検査に広く用
いられている自動分析装置への適用はなされるに至って
いない。
【０００７】
【発明が解決しようとする課題】以上に示すこれまでの
１，５−ＡＧ測定方法の欠点を解決し、検体中の１，５
−ＡＧを濾過、遠心分離、吸着などの分離操作を必要と
せずに簡便かつ迅速に測定できる方法、さらに自動分析
装置を用いて測定できる方法を提供する事が本発明の目
的である。
１，５−ＡＧ測定方法の欠点を解決し、検体中の１，５
−ＡＧを濾過、遠心分離、吸着などの分離操作を必要と
せずに簡便かつ迅速に測定できる方法、さらに自動分析
装置を用いて測定できる方法を提供する事が本発明の目
的である。
【０００８】
【課題を解決するための手段】上記課題を解決するため
本発明者は鋭意検討を重ねた結果、ＡＴＰのＰＲＯＤに
対する阻害作用がpHによって変動し、pHが7.2 〜8.5 の
範囲内でＰＲＯＤがＡＴＰによりほとんど阻害されず且
つ１，５−ＡＧに対して良好な反応性を示すことを見出
した。従ってpHが7.2 〜8.5 の範囲内で１，５−ＡＧに
対してＰＲＯＤを作用させる方法を採用することによ
り、検体中の１，５−ＡＧ以外の糖類のリン酸化による
除去をヘキソキナーゼとＡＴＰにより行うに際して該リ
ン酸化を過剰量のＡＴＰを用いて実施することができ且
つリン酸化反応に続いてそのまま１，５−ＡＧとＰＲＯ
Ｄの反応を行うことが可能となり、自動分析装置を用い
た１，５−ＡＧの測定の実現に成功し本発明を完成させ
た。
本発明者は鋭意検討を重ねた結果、ＡＴＰのＰＲＯＤに
対する阻害作用がpHによって変動し、pHが7.2 〜8.5 の
範囲内でＰＲＯＤがＡＴＰによりほとんど阻害されず且
つ１，５−ＡＧに対して良好な反応性を示すことを見出
した。従ってpHが7.2 〜8.5 の範囲内で１，５−ＡＧに
対してＰＲＯＤを作用させる方法を採用することによ
り、検体中の１，５−ＡＧ以外の糖類のリン酸化による
除去をヘキソキナーゼとＡＴＰにより行うに際して該リ
ン酸化を過剰量のＡＴＰを用いて実施することができ且
つリン酸化反応に続いてそのまま１，５−ＡＧとＰＲＯ
Ｄの反応を行うことが可能となり、自動分析装置を用い
た１，５−ＡＧの測定の実現に成功し本発明を完成させ
た。
【０００９】従って、本発明は、検体中の１，５−ＡＧ
をＰＲＯＤを用いて定量する方法において、pHが7.2 〜
8.5 の範囲内で１，５−ＡＧに対してＰＲＯＤを作用さ
せることにより、１，５−ＡＧを定量する方法を第１の
要旨とし、検体中に存在する、１，５−ＡＧ以外の糖類
を、ヘキソキナーゼと過剰量のＡＴＰによりリン酸化す
ることにより、検体中の１，５−ＡＧが残留するように
該糖類を選択的に除去し、次いでそのまま得られる試料
中の１，５−ＡＧにpHが7.2 〜8.5 の範囲内でＰＲＯＤ
を作用させて１，５−ＡＧを定量する方法を第２の要旨
とするものである。
をＰＲＯＤを用いて定量する方法において、pHが7.2 〜
8.5 の範囲内で１，５−ＡＧに対してＰＲＯＤを作用さ
せることにより、１，５−ＡＧを定量する方法を第１の
要旨とし、検体中に存在する、１，５−ＡＧ以外の糖類
を、ヘキソキナーゼと過剰量のＡＴＰによりリン酸化す
ることにより、検体中の１，５−ＡＧが残留するように
該糖類を選択的に除去し、次いでそのまま得られる試料
中の１，５−ＡＧにpHが7.2 〜8.5 の範囲内でＰＲＯＤ
を作用させて１，５−ＡＧを定量する方法を第２の要旨
とするものである。
【００１０】以下本発明を詳細に説明する。本発明にお
ける検体とは、１，５−ＡＧの濃度を測定したいもので
あれば特に制限はなく、例えばすでに触れた通り血清ま
たは血漿などがあげられる。本発明で用いるＰＲＯＤと
しては、ＩＵＰＡＣ−ＩＵＢの命名法委員会でＥＣ１．
１．３．１０に分類し得るものであれば特に制限はな
く、ＰＲＯＤ生産能力を有する菌株由来のさまざまなＰ
ＲＯＤを用いることができる。例えば特開昭６１−２３
９８８６号公報に記載されているポリポラス・オブツサ
ス（Ｐｏｌｙｐｏｒｕｓ ｏｂｔｕｓｕｓ）ＡＴＣＣ２
６７３３に代表されるポリポラス（Ｐｏｌｙｐｏｒｕ
ｓ）属に属する微生物の菌株由来のＰＲＯＤ、特開昭５
８−４３７８５号公報に記載されているコリオラス・ベ
ルシカラ（Ｃｏｒｉｏｌｕｓ ｖｅｒｓｉｃｏｌｏｒ）
ＩＦＯ４９３７に代表されるコリオラス（Ｃｏｒｉｏｌ
ｕｓ ）属に属する微生物の菌株由来のＰＲＯＤ、特開
昭６２−７９７８０号公報に記載されているピクノポラ
ス・コクシネウス（Ｐｙｃｎｏｐｏｒｕｓ ｃｏｃｃｉ
ｎｅｕｓ）ＩＦＯ４９２３に代表されるピクノポラス
（Ｐｙｃｎｏｐｏｒｕｓ）属に属する微生物の菌株由来
のＰＲＯＤ、特開平２−４２９８０号公報に記載されて
いるバシジオマイセタウス・フンギ（Ｂａｓｉｄｉｏｍ
ｙｃｅｔｏｕｓ ｆｕｎｇｉ）Ｎｏ．５２（微工研菌寄
第１０１０６号）由来のＰＲＯＤ、特開昭５８−４３７
８５号公報に記載されているダエダレオプシス・スチラ
シナ（Ｄａｅｄａｌｅｏｐｓｉｓ ｓｔｙｒａｃｉｎ
ａ）ＩＦＯ４９１０に代表されるダエダレオプシス（Ｄ
ａｓｅｄａｌｅｏｐｓｉｓ）属に属する微生物の菌株由
来のＰＲＯＤ、プロイロタス・オストレアタス（Ｐｌｅ
ｕｒｏｔｕｓｏｓｔｒｅａｔｕｓ）Ｚ−６４（ＮＲＲＬ
１２５０７）に代表されるプロイロタス（Ｐｌｅｕｒｏ
ｔｕｓ）属に属する微生物の菌株由来のＰＲＯＤ、グロ
エオフィルム・セピアリウム（Ｇｌｏｅｏｐｈｙｌｌｕ
ｍ ｓｅｐｉａｒｉｕｍ）Ｚ−４１（ＮＲＲＬ１２５０
６）に代表されるグロエオフィルム（Ｇｌｏｅｏｐｈｙ
ｌｌｕｍ）属に属する微生物の菌株由来のＰＲＯＤ、ま
たは特開昭６１−１７７９８６号公報に記載されている
イルペックス・ラクテウス（Ｉｒｐｅｘ ｌａｃｔｅｕ
ｓ）ＡＴＣＣ２０１２３に代表されるイルペックス（Ｉ
ｒｐｅｘ）属に属する微生物の菌株由来のＰＲＯＤ、オ
ーリキュラリア・ポリトリカ（Ａｕｒｉｃｕｌａｒｉａ
ｐｏｌｙｔｒｉｃｈａ）Ｚ−２２９（微工研菌寄第７
１１９号）に代表されるオーリキュラリア（Ａｕｒｉｃ
ｕｌａｒｉａ）属に属する微生物の菌株由来のＰＲＯ
Ｄ、コプリナス・ミカセウス（Ｃｏｐｒｉｎｕｓ ｍｉ
ｃａｃｅｕｓ）ＡＴＣＣ２０１２２に代表されるコプリ
ナス（Ｃｏｐｒｉｎｕｓ）属に属する微生物の菌株由来
のＰＲＯＤ、またはトラメテス・シンナバリナス（Ｔｒ
ａｍｅｔｅｓ ｃｉｎｎａｂａｒｉｎｕｓ）ＩＦＯ６１
３９に代表されるトラメテス（Ｔｒａｍｅｔｅｓ）属に
属する微生物の菌株由来のＰＲＯＤなどが挙げられる。
ける検体とは、１，５−ＡＧの濃度を測定したいもので
あれば特に制限はなく、例えばすでに触れた通り血清ま
たは血漿などがあげられる。本発明で用いるＰＲＯＤと
しては、ＩＵＰＡＣ−ＩＵＢの命名法委員会でＥＣ１．
１．３．１０に分類し得るものであれば特に制限はな
く、ＰＲＯＤ生産能力を有する菌株由来のさまざまなＰ
ＲＯＤを用いることができる。例えば特開昭６１−２３
９８８６号公報に記載されているポリポラス・オブツサ
ス（Ｐｏｌｙｐｏｒｕｓ ｏｂｔｕｓｕｓ）ＡＴＣＣ２
６７３３に代表されるポリポラス（Ｐｏｌｙｐｏｒｕ
ｓ）属に属する微生物の菌株由来のＰＲＯＤ、特開昭５
８−４３７８５号公報に記載されているコリオラス・ベ
ルシカラ（Ｃｏｒｉｏｌｕｓ ｖｅｒｓｉｃｏｌｏｒ）
ＩＦＯ４９３７に代表されるコリオラス（Ｃｏｒｉｏｌ
ｕｓ ）属に属する微生物の菌株由来のＰＲＯＤ、特開
昭６２−７９７８０号公報に記載されているピクノポラ
ス・コクシネウス（Ｐｙｃｎｏｐｏｒｕｓ ｃｏｃｃｉ
ｎｅｕｓ）ＩＦＯ４９２３に代表されるピクノポラス
（Ｐｙｃｎｏｐｏｒｕｓ）属に属する微生物の菌株由来
のＰＲＯＤ、特開平２−４２９８０号公報に記載されて
いるバシジオマイセタウス・フンギ（Ｂａｓｉｄｉｏｍ
ｙｃｅｔｏｕｓ ｆｕｎｇｉ）Ｎｏ．５２（微工研菌寄
第１０１０６号）由来のＰＲＯＤ、特開昭５８−４３７
８５号公報に記載されているダエダレオプシス・スチラ
シナ（Ｄａｅｄａｌｅｏｐｓｉｓ ｓｔｙｒａｃｉｎ
ａ）ＩＦＯ４９１０に代表されるダエダレオプシス（Ｄ
ａｓｅｄａｌｅｏｐｓｉｓ）属に属する微生物の菌株由
来のＰＲＯＤ、プロイロタス・オストレアタス（Ｐｌｅ
ｕｒｏｔｕｓｏｓｔｒｅａｔｕｓ）Ｚ−６４（ＮＲＲＬ
１２５０７）に代表されるプロイロタス（Ｐｌｅｕｒｏ
ｔｕｓ）属に属する微生物の菌株由来のＰＲＯＤ、グロ
エオフィルム・セピアリウム（Ｇｌｏｅｏｐｈｙｌｌｕ
ｍ ｓｅｐｉａｒｉｕｍ）Ｚ−４１（ＮＲＲＬ１２５０
６）に代表されるグロエオフィルム（Ｇｌｏｅｏｐｈｙ
ｌｌｕｍ）属に属する微生物の菌株由来のＰＲＯＤ、ま
たは特開昭６１−１７７９８６号公報に記載されている
イルペックス・ラクテウス（Ｉｒｐｅｘ ｌａｃｔｅｕ
ｓ）ＡＴＣＣ２０１２３に代表されるイルペックス（Ｉ
ｒｐｅｘ）属に属する微生物の菌株由来のＰＲＯＤ、オ
ーリキュラリア・ポリトリカ（Ａｕｒｉｃｕｌａｒｉａ
ｐｏｌｙｔｒｉｃｈａ）Ｚ−２２９（微工研菌寄第７
１１９号）に代表されるオーリキュラリア（Ａｕｒｉｃ
ｕｌａｒｉａ）属に属する微生物の菌株由来のＰＲＯ
Ｄ、コプリナス・ミカセウス（Ｃｏｐｒｉｎｕｓ ｍｉ
ｃａｃｅｕｓ）ＡＴＣＣ２０１２２に代表されるコプリ
ナス（Ｃｏｐｒｉｎｕｓ）属に属する微生物の菌株由来
のＰＲＯＤ、またはトラメテス・シンナバリナス（Ｔｒ
ａｍｅｔｅｓ ｃｉｎｎａｂａｒｉｎｕｓ）ＩＦＯ６１
３９に代表されるトラメテス（Ｔｒａｍｅｔｅｓ）属に
属する微生物の菌株由来のＰＲＯＤなどが挙げられる。
【００１１】これらのなかでも、ポリポラス・オブッサ
ス（Ｐｏｌｙｐｏｒｕｓ ｏｂｔｕｓｕｓ）ＡＴＣＣ２
６７３３などのポリポラス属に属する微生物由来のＰＲ
ＯＤ、バシジオマイセタウス・フンギ（Ｂａｓｉｄｉｏ
ｍｙｃｅｔｏｕｓ ｆｕｎｇｉ）Ｎｏ．５２由来のＰＲ
ＯＤなどが好ましく、特にポリポラス属に属する微生物
由来のＰＲＯＤが好ましい。本発明では、pHが7.2 〜8.
5 の範囲内において１，５−ＡＧに対してＰＲＯＤを作
用させる。pH範囲は特に7.5 〜8.0 が好ましい。このよ
うなpH範囲内で１，５−ＡＧとＰＲＯＤとの反応を行う
方法を採用することにより、ＰＲＯＤがＡＴＰによって
ほとんど阻害されず且つ１，５−ＡＧに対して良好な反
応性を示す。従って、本発明によれば、検体中に存在す
る、１，５−ＡＧ以外の糖類を、ヘキソキナーゼと過剰
量のＡＴＰを用いてリン酸化することによって、検体中
の１，５−ＡＧが残留するように該糖類を極めて短時間
で選択的に除去する方法を採用することが可能になり、
そして、そのまま得られる試料中の１，５−ＡＧにＰＲ
ＯＤを作用させて検体中の１，５−ＡＧを定量すること
ができる。
ス（Ｐｏｌｙｐｏｒｕｓ ｏｂｔｕｓｕｓ）ＡＴＣＣ２
６７３３などのポリポラス属に属する微生物由来のＰＲ
ＯＤ、バシジオマイセタウス・フンギ（Ｂａｓｉｄｉｏ
ｍｙｃｅｔｏｕｓ ｆｕｎｇｉ）Ｎｏ．５２由来のＰＲ
ＯＤなどが好ましく、特にポリポラス属に属する微生物
由来のＰＲＯＤが好ましい。本発明では、pHが7.2 〜8.
5 の範囲内において１，５−ＡＧに対してＰＲＯＤを作
用させる。pH範囲は特に7.5 〜8.0 が好ましい。このよ
うなpH範囲内で１，５−ＡＧとＰＲＯＤとの反応を行う
方法を採用することにより、ＰＲＯＤがＡＴＰによって
ほとんど阻害されず且つ１，５−ＡＧに対して良好な反
応性を示す。従って、本発明によれば、検体中に存在す
る、１，５−ＡＧ以外の糖類を、ヘキソキナーゼと過剰
量のＡＴＰを用いてリン酸化することによって、検体中
の１，５−ＡＧが残留するように該糖類を極めて短時間
で選択的に除去する方法を採用することが可能になり、
そして、そのまま得られる試料中の１，５−ＡＧにＰＲ
ＯＤを作用させて検体中の１，５−ＡＧを定量すること
ができる。
【００１２】検体中に存在する１，５−ＡＧ以外の糖類
とは主にグルコースを指すが、ヘキソキナーゼによって
リン酸化される他の糖類も対象とされる。グルコースを
グルコース−６−リン酸に変換するのをはじめとして、
検体中に存在する１，５−ＡＧ以外の糖類をリン酸化す
る際に用いるヘキソキナーゼは、酵母山来のＡ型または
Ｂ型のヘキソキナーゼ、あるいは動物由来のタイプＩ〜
ＩＶのヘキソキナーゼのいずれも用いることができ、特
に、国際生化学連合の分類に従い、ＥＣ ２．７．１．
１と分類されるものを用いるのが好ましい。この変換反
応では該酵素と合わせてＡＴＰ及ひマグネシウムイオン
が用いられる。マグネシウムイオンの供給源は、マグネ
シウムの脂肪酸塩などの有機酸塩、ハロゲン化塩、硫酸
塩、硝酸塩、リン酸塩などの無機酸塩を用いることがで
き、その中でも好ましいのは、酢酸塩、塩酸塩などであ
る。上記リン酸化反応において用いることのできる過剰
量のＡＴＰとは通常、検体中の想定されるグルコース量
に対し、モル比でＡＴＰが２．５倍以上、好ましくは
２．５〜２５００倍、より好ましくは１０〜１０００倍
の量である。実際の測定系を組む際にはＡＴＰの量は、
少なくとも５ｍＭ以上に調製すれば十分である。リン酸
化反応において実際に用いられるヘキソキナーゼ、ＡＴ
Ｐ及びマグネシウムイオンの好適な量は、例えば、ヘキ
ソキナーゼは５〜１００Ｕ／ｍｌ、ＡＴＰは５〜５００
ｍＭ、マグネシウムイオンは５〜５０ｍＭである。リン
酸化反応の際のｐＨは、１，５−ＡＧとＰＲＯＤとの反
応の際のｐＨ範囲と同様に７．２〜８．５が好ましく、
特に７．５〜８．０が好ましい。
とは主にグルコースを指すが、ヘキソキナーゼによって
リン酸化される他の糖類も対象とされる。グルコースを
グルコース−６−リン酸に変換するのをはじめとして、
検体中に存在する１，５−ＡＧ以外の糖類をリン酸化す
る際に用いるヘキソキナーゼは、酵母山来のＡ型または
Ｂ型のヘキソキナーゼ、あるいは動物由来のタイプＩ〜
ＩＶのヘキソキナーゼのいずれも用いることができ、特
に、国際生化学連合の分類に従い、ＥＣ ２．７．１．
１と分類されるものを用いるのが好ましい。この変換反
応では該酵素と合わせてＡＴＰ及ひマグネシウムイオン
が用いられる。マグネシウムイオンの供給源は、マグネ
シウムの脂肪酸塩などの有機酸塩、ハロゲン化塩、硫酸
塩、硝酸塩、リン酸塩などの無機酸塩を用いることがで
き、その中でも好ましいのは、酢酸塩、塩酸塩などであ
る。上記リン酸化反応において用いることのできる過剰
量のＡＴＰとは通常、検体中の想定されるグルコース量
に対し、モル比でＡＴＰが２．５倍以上、好ましくは
２．５〜２５００倍、より好ましくは１０〜１０００倍
の量である。実際の測定系を組む際にはＡＴＰの量は、
少なくとも５ｍＭ以上に調製すれば十分である。リン酸
化反応において実際に用いられるヘキソキナーゼ、ＡＴ
Ｐ及びマグネシウムイオンの好適な量は、例えば、ヘキ
ソキナーゼは５〜１００Ｕ／ｍｌ、ＡＴＰは５〜５００
ｍＭ、マグネシウムイオンは５〜５０ｍＭである。リン
酸化反応の際のｐＨは、１，５−ＡＧとＰＲＯＤとの反
応の際のｐＨ範囲と同様に７．２〜８．５が好ましく、
特に７．５〜８．０が好ましい。
【００１３】過剰量のＡＴＰを用いたリン酸化反応を行
い、次いでそのままＡＴＰを除去することなく、pHが7.
2 〜8.5 の範囲内で試料中の１，５−ＡＧとＰＲＯＤと
の酵素反応を実施することができる。この酵素反応はpH
が7.2 〜8.5 の範囲内で行うことにより、試料中に残存
するＡＴＰによりＰＲＯＤが阻害作用を受けず且つ１，
５−ＡＧに対してＰＲＯＤが良好な反応性を示す。従っ
て本発明では、リン酸化反応及び酵素反応を短時間で連
続して実施することができる。糖類が選択的に除去され
た検体中に残留する１，５−ＡＧにＰＲＯＤを作用させ
ることにより、過酸化水素が発生する。その過酸化水素
の測定は、例えばパーオキシダーゼを用いて行うことが
できる。すなわち国際生化学連合の分類によってＥＣ
１．１１．１．７と分類される酵素を用いて、２，２′
−アジノビス（３−エチルベンゾチアゾリン−６−スル
ホン酸）、ｏ−フェニレンジアミン、５−アミノサリチ
ル酸、３，３′，５，５′−テトラメチルベンジジン並
びに４−アミノアンチピリン及びＮ−エチル−Ｎ−（２
−ヒドロキシスルホプロピル）−ｍ−トルイジンの組み
合わせなどの公知のパーオキシダーゼ用基質に作用さ
せ、基質から生成する色素を吸光度測定する。過酸化水
素を測定するのに用いるパーオキシダーゼは、ホースラ
ディッシュパーオキシダーゼが好ましい。吸光度測定に
用いる色素を生成する基質は、４−アミノアンチピリン
及びＮ−エチル−Ｎ−（２−ヒドロキシスルホプロピ
ル）−ｍ−トルイジンの組み合わせが好ましい。４−ア
ミノアンチピリン及びＮ−エチル−Ｎ−（２−ヒドロキ
シスルホプロピル）−ｍ−トルイジンを用いる際の吸光
度測定域の波長は、５００ｎｍ〜８００ｎｍであり、こ
の範囲で２波長以上の波長を用いて測定することもでき
る。
い、次いでそのままＡＴＰを除去することなく、pHが7.
2 〜8.5 の範囲内で試料中の１，５−ＡＧとＰＲＯＤと
の酵素反応を実施することができる。この酵素反応はpH
が7.2 〜8.5 の範囲内で行うことにより、試料中に残存
するＡＴＰによりＰＲＯＤが阻害作用を受けず且つ１，
５−ＡＧに対してＰＲＯＤが良好な反応性を示す。従っ
て本発明では、リン酸化反応及び酵素反応を短時間で連
続して実施することができる。糖類が選択的に除去され
た検体中に残留する１，５−ＡＧにＰＲＯＤを作用させ
ることにより、過酸化水素が発生する。その過酸化水素
の測定は、例えばパーオキシダーゼを用いて行うことが
できる。すなわち国際生化学連合の分類によってＥＣ
１．１１．１．７と分類される酵素を用いて、２，２′
−アジノビス（３−エチルベンゾチアゾリン−６−スル
ホン酸）、ｏ−フェニレンジアミン、５−アミノサリチ
ル酸、３，３′，５，５′−テトラメチルベンジジン並
びに４−アミノアンチピリン及びＮ−エチル−Ｎ−（２
−ヒドロキシスルホプロピル）−ｍ−トルイジンの組み
合わせなどの公知のパーオキシダーゼ用基質に作用さ
せ、基質から生成する色素を吸光度測定する。過酸化水
素を測定するのに用いるパーオキシダーゼは、ホースラ
ディッシュパーオキシダーゼが好ましい。吸光度測定に
用いる色素を生成する基質は、４−アミノアンチピリン
及びＮ−エチル−Ｎ−（２−ヒドロキシスルホプロピ
ル）−ｍ−トルイジンの組み合わせが好ましい。４−ア
ミノアンチピリン及びＮ−エチル−Ｎ−（２−ヒドロキ
シスルホプロピル）−ｍ−トルイジンを用いる際の吸光
度測定域の波長は、５００ｎｍ〜８００ｎｍであり、こ
の範囲で２波長以上の波長を用いて測定することもでき
る。
【００１４】上記反応において用いられるＰＲＯＤ、パ
ーオキシダーゼ、４−アミノアンチピリン及びＮ−エチ
ル−Ｎ−（２−ヒドロキシスルホプロピル）−ｍ−トル
イジンの好適な量は、例えば、ＰＲＯＤは５〜５００Ｕ
／ｍｌ、パーオキシダーゼは２〜２０Ｕ／ｍｌ、４−ア
ミノアンチピリンは０．１〜１０ｍＭ、Ｎ−エチル−Ｎ
−（２−ヒドロキシスルホプロピル）−ｍ−トルイジン
は０．１〜１０ｍＭである。検体中の１，５−ＡＧを測
定する反応全体において、反応温度は５〜４０℃、好ま
しくは２５〜４０℃であり、反応時間は２〜６０分、好
ましくは２〜３０分である。反応液の調製の際は、反応
全体をpH7.2 〜8.5 、好ましくは7.5 〜8.0で進行させ
るため、試薬を構成する反応液のうち、緩衝液であるも
のについては、該反応液のpHを7.2 〜8.5 、好ましくは
7.5 〜8.0 の範囲で安定させるため、バッファーとして
リン酸バッファー、トリス塩酸バッファー、ＰＩＰＥＳ
バッファー、ＨＥＰＥＳバッファーなどを用いる。ＨＥ
ＰＥＳバッファーであれば５０〜５００ｍＭの濃度が好
ましい。またイオン強度調節のためハロゲン化アルカリ
金属塩、好ましくは塩化ナトリウムなどを用いる事がで
きる。本発明方法で１，５−ＡＧを測定するときは、上
記した各成分を１つの溶液に加えて用いてもよく、各成
分を適宜な組み合わせとなるように分割して用いても良
い。それらは溶液状でも凍結乾燥させても良いが、長期
の保存を意図する場合は凍結乾燥することが好ましい。
また、測定反応を阻害しない濃度範囲内ならば界面活性
剤の添加も可能であり、測定系を凍結乾燥する場合に
は、安定化剤を適当量加えても良い。本発明では、リン
酸化反応、酵素反応それに続く過酸化水素の発生量を測
定するための発色反応を、自動分析装置を用いて実施で
きる。本発明において自動分析装置として用いることの
できるものは、具体的に機種を挙げて例示すれば、日立
７０５０型、日立７０５型、日立７３６型、日立７１５
０型などであるが、例示の機種に限定されず、これらに
類するものであればいずれでもよい。
ーオキシダーゼ、４−アミノアンチピリン及びＮ−エチ
ル−Ｎ−（２−ヒドロキシスルホプロピル）−ｍ−トル
イジンの好適な量は、例えば、ＰＲＯＤは５〜５００Ｕ
／ｍｌ、パーオキシダーゼは２〜２０Ｕ／ｍｌ、４−ア
ミノアンチピリンは０．１〜１０ｍＭ、Ｎ−エチル−Ｎ
−（２−ヒドロキシスルホプロピル）−ｍ−トルイジン
は０．１〜１０ｍＭである。検体中の１，５−ＡＧを測
定する反応全体において、反応温度は５〜４０℃、好ま
しくは２５〜４０℃であり、反応時間は２〜６０分、好
ましくは２〜３０分である。反応液の調製の際は、反応
全体をpH7.2 〜8.5 、好ましくは7.5 〜8.0で進行させ
るため、試薬を構成する反応液のうち、緩衝液であるも
のについては、該反応液のpHを7.2 〜8.5 、好ましくは
7.5 〜8.0 の範囲で安定させるため、バッファーとして
リン酸バッファー、トリス塩酸バッファー、ＰＩＰＥＳ
バッファー、ＨＥＰＥＳバッファーなどを用いる。ＨＥ
ＰＥＳバッファーであれば５０〜５００ｍＭの濃度が好
ましい。またイオン強度調節のためハロゲン化アルカリ
金属塩、好ましくは塩化ナトリウムなどを用いる事がで
きる。本発明方法で１，５−ＡＧを測定するときは、上
記した各成分を１つの溶液に加えて用いてもよく、各成
分を適宜な組み合わせとなるように分割して用いても良
い。それらは溶液状でも凍結乾燥させても良いが、長期
の保存を意図する場合は凍結乾燥することが好ましい。
また、測定反応を阻害しない濃度範囲内ならば界面活性
剤の添加も可能であり、測定系を凍結乾燥する場合に
は、安定化剤を適当量加えても良い。本発明では、リン
酸化反応、酵素反応それに続く過酸化水素の発生量を測
定するための発色反応を、自動分析装置を用いて実施で
きる。本発明において自動分析装置として用いることの
できるものは、具体的に機種を挙げて例示すれば、日立
７０５０型、日立７０５型、日立７３６型、日立７１５
０型などであるが、例示の機種に限定されず、これらに
類するものであればいずれでもよい。
【００１５】
【実施例】以下、本発明を実施例により更に詳細に説明
する。勿論、本発明はこれらの実施例によって限定され
るものではない。 実施例１ ＰＲＯＤの１，５−ＡＧに対する至適pH ポリポラス・オブッサスＡＴＣＣ２６７３３由来のＰＲ
ＯＤの１，５−ＡＧに対する至適pHを測定し、その結果
を図１に示した。測定の際の反応条件は下記の通りであ
る。１０００Ｕ／１のＰＲＯＤ溶液１０μｌに対し以下
の組成の第１試薬２８０μｌ、第２試薬７０μｌを反応
させ日立７１５０型自動分析装置により主波長５６４n
m、副波長７００nmとし該分析装置の機能で３０〜４０
測光ポイント間において吸光度変化率を追跡した。この
時に得られた最大吸光度変化率（pH7.0 のとき）を１０
０％として相対活性として示した。図１に示されるよう
に、ＰＲＯＤはＭＥＳ，ＰＩＰＥＳ，ＨＥＰＥＳなどの
グッド緩衝液中において１，５−ＡＧに対しpH6.5 〜7.
5 において最大の活性を示す。
する。勿論、本発明はこれらの実施例によって限定され
るものではない。 実施例１ ＰＲＯＤの１，５−ＡＧに対する至適pH ポリポラス・オブッサスＡＴＣＣ２６７３３由来のＰＲ
ＯＤの１，５−ＡＧに対する至適pHを測定し、その結果
を図１に示した。測定の際の反応条件は下記の通りであ
る。１０００Ｕ／１のＰＲＯＤ溶液１０μｌに対し以下
の組成の第１試薬２８０μｌ、第２試薬７０μｌを反応
させ日立７１５０型自動分析装置により主波長５６４n
m、副波長７００nmとし該分析装置の機能で３０〜４０
測光ポイント間において吸光度変化率を追跡した。この
時に得られた最大吸光度変化率（pH7.0 のとき）を１０
０％として相対活性として示した。図１に示されるよう
に、ＰＲＯＤはＭＥＳ，ＰＩＰＥＳ，ＨＥＰＥＳなどの
グッド緩衝液中において１，５−ＡＧに対しpH6.5 〜7.
5 において最大の活性を示す。
【００１６】第１試薬 pH5.5 〜6.5 の範囲の第１試薬 ＭＥＳ ２００ ｍＭ 塩化ナトリウム １５０ ｍＭ 酢酸マグネシウム １０ ｍＭ Ｎ−エチル−Ｎ−（２−ヒドロキシスルホプロピル）− ｍ−トルイジン １ｍＭ パ−オキシターゼ ５ ＫＵ／１ ヘキソキナーゼ ２０ ＫＵ／１ pH6.5 〜7.5 の範囲の第１試薬 ＰＩＰＥＳ ２００ ｍＭ 塩化ナトリウム １５０ ｍＭ 酢酸マグネシウム １０ ｍＭ Ｎ−エチル−Ｎ−（２−ヒドロキシスルホプロピル）− ｍ−トルイジン １ｍＭ パ−オキシターゼ ５ ＫＵ／１ ヘキソキナーゼ ２０ ＫＵ／１ pH7.5 〜8.5 の範囲の第１試薬 ＨＥＰＥＳ ２００ ｍＭ 塩化ナトリウム １５０ ｍＭ 酢酸マグネシウム １０ ｍＭ Ｎ−エチル−Ｎ−（２−ヒドロキシスルホプロピル）− ｍ−トルイジン １ｍＭ パ−オキシターゼ ５ ＫＵ／１ ヘキソキナーゼ ２０ ＫＵ／１
【００１７】第２試薬 ４−アミノアンチピリン ４ ｍＭ 塩化ナトリウム １５０ ｍＭ １，５−ＡＧ １００ ｍＭ 緩衝種 無し
【００１８】実施例２ ＡＴＰのＰＲＯＤに対する阻害
程度のpHにおける変化 ポリポラス・オブッサスＡＴＣＣ２６７３３由来のＰＲ
ＯＤの１，５−ＡＧに対する反応がＡＴＰにより阻害さ
れる程度をグッド緩衝液中pH5.5 〜8.5 の範囲で検討し
た。１０００Ｕ／ｌのＰＲＯＤ溶液１０μｌに対し以下
の組成の第１試薬２８０μｌ、第２試薬７０μｌを反応
させ日立７１５０型自動分析装置により主波長５６４n
m、副波長７００nmとし該分析装置の機能で３０〜４０
測光ポイント間において吸光度変化率を追跡した。ＡＴ
Ｐによる阻害程度は各pHの緩衝液中に１００mMのＡＴＰ
を新たに加えた条件においてＡＴＰが存在しない各場合
のＰＲＯＤ活性を１００％として同一pH内でＡＴＰが存
在した場合のＰＲＯＤ活性を相対活性として図２に示し
た。図２に示されるように、グッド緩衝液中においてＰ
ＲＯＤはpH７以下においてＡＴＰにより強く阻害される
がpH7.5 以上ではその阻害程度は著しく緩和される。図
１及び図２の結果から、グッド緩衝液中においてpH7.5
〜8.0 の範囲においてＰＲＯＤはＡＴＰによりほとんど
阻害されず、１，５−ＡＧに対して良好な反応性を示す
ことが明らかである。
程度のpHにおける変化 ポリポラス・オブッサスＡＴＣＣ２６７３３由来のＰＲ
ＯＤの１，５−ＡＧに対する反応がＡＴＰにより阻害さ
れる程度をグッド緩衝液中pH5.5 〜8.5 の範囲で検討し
た。１０００Ｕ／ｌのＰＲＯＤ溶液１０μｌに対し以下
の組成の第１試薬２８０μｌ、第２試薬７０μｌを反応
させ日立７１５０型自動分析装置により主波長５６４n
m、副波長７００nmとし該分析装置の機能で３０〜４０
測光ポイント間において吸光度変化率を追跡した。ＡＴ
Ｐによる阻害程度は各pHの緩衝液中に１００mMのＡＴＰ
を新たに加えた条件においてＡＴＰが存在しない各場合
のＰＲＯＤ活性を１００％として同一pH内でＡＴＰが存
在した場合のＰＲＯＤ活性を相対活性として図２に示し
た。図２に示されるように、グッド緩衝液中においてＰ
ＲＯＤはpH７以下においてＡＴＰにより強く阻害される
がpH7.5 以上ではその阻害程度は著しく緩和される。図
１及び図２の結果から、グッド緩衝液中においてpH7.5
〜8.0 の範囲においてＰＲＯＤはＡＴＰによりほとんど
阻害されず、１，５−ＡＧに対して良好な反応性を示す
ことが明らかである。
【００１９】第１試薬 pH5.5 〜6.5 の範囲の第１試薬 ＭＥＳ ２００ ｍＭ 塩化ナトリウム １５０ ｍＭ 酢酸マグネシウム １０ ｍＭ Ｎ−エチル−Ｎ−（２−ヒドロキシスルホプロピル）− ｍ−トルイジン １ ｍＭ パ−オキシターゼ ５ ＫＵ／１ ヘキソキナーゼ ２０ ＫＵ／１ ＡＴＰ ０ ｍＭまたは １００ ｍＭ pH6.5 〜7.5 の範囲の第１試薬 ＰＩＰＥＳ ２００ ｍＭ 塩化ナトリウム １５０ ｍＭ 酢酸マグネシウム １０ ｍＭ Ｎ−エチル−Ｎ−（２−ヒドロキシスルホプロピル）− ｍ−トルイジン １ ｍＭ パ−オキシターゼ ５ ＫＵ／１ ヘキソキナーゼ ２０ ＫＵ／１ ＡＴＰ ０ ｍＭまたは １００ ｍＭ pH7.5 〜8.5 の範囲の第１試薬 ＨＥＰＥＳ ２００ ｍＭ 塩化ナトリウム １５０ ｍＭ 酢酸マグネシウム １０ ｍＭ Ｎ−エチル−Ｎ−（２−ヒドロキシスルホプロピル）− ｍ−トルイジン １ ｍＭ パ−オキシターゼ ５ ＫＵ／１ ヘキソキナーゼ ２０ ＫＵ／１ ＡＴＰ ０ ｍＭまたは １００ ｍＭ
【００２０】第２試薬 ４−アミノアンチピリン ４ ｍＭ 塩化ナトリウム １５０ ｍＭ １，５−ＡＧ １００ ｍＭ 緩衝液 無し
【００２１】実施例３ 本発明における測定反応タイム
コース 生理食塩水、５mg／dlの１，５−ＡＧ水溶液およびヒト
血清を検体として、以下の組成の第１試薬、第２試薬と
反応させた場合の反応タイムコースを図３に示した。反
応条件は検体容量７μｌ、第１試薬容量２８０μｌ、第
２試薬容量７０μｌとし主波長５４６nm、副波長７００
nmで日立７１５０型自動分析装置を用いて２ポイントア
ッセイにて行なった。測定反応は５分でほぼ完了してい
る。
コース 生理食塩水、５mg／dlの１，５−ＡＧ水溶液およびヒト
血清を検体として、以下の組成の第１試薬、第２試薬と
反応させた場合の反応タイムコースを図３に示した。反
応条件は検体容量７μｌ、第１試薬容量２８０μｌ、第
２試薬容量７０μｌとし主波長５４６nm、副波長７００
nmで日立７１５０型自動分析装置を用いて２ポイントア
ッセイにて行なった。測定反応は５分でほぼ完了してい
る。
【００２２】第１試薬 ＨＥＰＥＳ ２００ ｍＭ 塩化ナトリウム １５０ ｍＭ 酢酸マグネシウム １０ ｍＭ Ｎ−エチル−Ｎ−（２−ヒドロキシスルホプロピル）− ｍ−トルイジン １ ｍＭ パ−オキシターゼ ５ ＫＵ／１ ヘキソキナーゼ ２０ ＫＵ／１ ＡＴＰ １００ ｍＭ pH7.5
【００２３】第２試薬 ＨＥＰＥＳ ２００ ｍＭ 塩化ナトリウム １５０ ｍＭ ４−アミノアンチピリン ４ ｍＭ ＰＲＯＤ ６２．５ ＫＵ／１ pH7.5
【００２４】実施例４ １，５−ＡＧ検量線及び検体中
のグルコース消去性 0.5mg ／dl刻みで調製された０〜５mg／dlの１，５−Ａ
Ｇ水溶液を実施例３の測定条件において反応させ、それ
ぞれの吸光度を測定した。結果を図４に示した。他方、
１５０mg／dl刻みで調製された０〜１５００mg／dlのグ
ルコース水溶液を同様に反応させた場合の吸光度を測定
した。結果は図４に示した。図４から判るように、１，
５−ＡＧを反応させた場合は５mg／dlまで原点を通る良
好な直線性を示した。グルコースを反応させた場合は１
５００mg／dlまでほぼ試薬ブランクと同一の吸光度が得
られた。したがって本測定条件は、充分なグルコース消
去性を有し、良好な１，５−ＡＧ定量が行えるものと判
断できる。
のグルコース消去性 0.5mg ／dl刻みで調製された０〜５mg／dlの１，５−Ａ
Ｇ水溶液を実施例３の測定条件において反応させ、それ
ぞれの吸光度を測定した。結果を図４に示した。他方、
１５０mg／dl刻みで調製された０〜１５００mg／dlのグ
ルコース水溶液を同様に反応させた場合の吸光度を測定
した。結果は図４に示した。図４から判るように、１，
５−ＡＧを反応させた場合は５mg／dlまで原点を通る良
好な直線性を示した。グルコースを反応させた場合は１
５００mg／dlまでほぼ試薬ブランクと同一の吸光度が得
られた。したがって本測定条件は、充分なグルコース消
去性を有し、良好な１，５−ＡＧ定量が行えるものと判
断できる。
【００２５】実施例５ 添加回収試験 １，５−ＡＧの含有量が既知の糖尿病の患者血清を用
い、それらに１，５−ＡＧを添加して調製した検体を、
実施例３の測定条件と同じ条件で反応させ、実施例３で
得られた検量線を用いて１，５−ＡＧを測定した。加え
た１，５−ＡＧの回収率により本測定条件における測定
値の正確性を検討した。結果を表１に示す。実際に得ら
れた定量値（実測値）を患者血清の１，５−ＡＧ含有量
と後からの１，５−ＡＧ添加量の和である値（理論値）
で割り算して得た値を回収率とした。表１から判るよう
に、平均回収率はほぼ１００％であり、本測定条件にお
ける測定値の正確性が示される。
い、それらに１，５−ＡＧを添加して調製した検体を、
実施例３の測定条件と同じ条件で反応させ、実施例３で
得られた検量線を用いて１，５−ＡＧを測定した。加え
た１，５−ＡＧの回収率により本測定条件における測定
値の正確性を検討した。結果を表１に示す。実際に得ら
れた定量値（実測値）を患者血清の１，５−ＡＧ含有量
と後からの１，５−ＡＧ添加量の和である値（理論値）
で割り算して得た値を回収率とした。表１から判るよう
に、平均回収率はほぼ１００％であり、本測定条件にお
ける測定値の正確性が示される。
【００２６】
【表１】
【００２７】実施例６ 従来の測量法との相関性 これまで信頼性の高い１，５−ＡＧの定量法とされてき
たグルコース除去をイオン交換カラムを用いて行う方式
の酵素法（以下カラム酵素法と言う）と本発明の酵素法
の測定値の相関性を調べた。カラム酵素法は、日本化薬
株式会社ラナＡＧ（登録商標）を用いて、ヒト血清５７
検体を使用説明書の記載の通りの操作で測定を行った。
本発明の酵素法については実施例４で作成した検量線を
利用し、カラム酵素法で用いたのと同じヒト血清を検体
にし実施例３と同様の操作で測定を行った。結果は図５
に示した通りである。相関係数は０．９６であり、両測
定法間には高い相関性が認められた。
たグルコース除去をイオン交換カラムを用いて行う方式
の酵素法（以下カラム酵素法と言う）と本発明の酵素法
の測定値の相関性を調べた。カラム酵素法は、日本化薬
株式会社ラナＡＧ（登録商標）を用いて、ヒト血清５７
検体を使用説明書の記載の通りの操作で測定を行った。
本発明の酵素法については実施例４で作成した検量線を
利用し、カラム酵素法で用いたのと同じヒト血清を検体
にし実施例３と同様の操作で測定を行った。結果は図５
に示した通りである。相関係数は０．９６であり、両測
定法間には高い相関性が認められた。
【００２８】
【発明の効果】以上の実施例にも示された通り、本発明
の１，５−ＡＧの測定方法は自動分析装置への適用に即
したものである。すなわち、本発明の方法により、従来
不可能であった１，５−ＡＧの測定の自動化が可能とな
り、その他多くの臨床検査項目と同様に多数の検体を迅
速、正確、かつ多量に処理することができるようになっ
た。
の１，５−ＡＧの測定方法は自動分析装置への適用に即
したものである。すなわち、本発明の方法により、従来
不可能であった１，５−ＡＧの測定の自動化が可能とな
り、その他多くの臨床検査項目と同様に多数の検体を迅
速、正確、かつ多量に処理することができるようになっ
た。
【図１】グッド緩衝液中におけるＰＲＯＤの１，５−Ａ
Ｇに対する至適pHを示す図である。
Ｇに対する至適pHを示す図である。
【図２】ＡＴＰのＰＲＯＤに対する阻害程度のpHにおけ
る変化を示す図である。
る変化を示す図である。
【図３】本発明における測定反応タイムコースを示す図
である。
である。
【図４】１，５−ＡＧの検量線を示す図である。合せて
反応系のグルコース消去能力を示す図である。
反応系のグルコース消去能力を示す図である。
【図５】本発明の方法とカラム酵素法との相関性を示す
図である。
図である。
Claims (7)
- 【請求項１】 検体中の１，５−アンヒドログルシトー
ルをピラノースオキシダーゼを用いて定量する方法にお
いて、 検体中に存在する、１，５−アンヒドログルシトール以
外の糖類を、ヘキソキナーゼと過剰量のアデノシン−
５′−三リン酸によりリン酸化することにより、検体中
の１，５−アンヒドログルシトールが残留するように該
糖類を選択的に除去し、 次いでそのまま得られる試料中の１，５−アンヒドログ
ルシトールを、ｐＨが７．２〜８．５の範囲内で１，５
−アンヒドログルシトールに対してピラノースオキシダ
ーゼを作用させで定量する、 １，５−アンヒドログルシトールの定量法。 - 【請求項２】 ｐＨが７．５〜８．０の範囲内で１，５
−アンヒドログルシトールに対してピラノースを作用さ
せる請求項１の１，５−アンヒドログルシトールの定量
法。 - 【請求項３】 糖類の選択的除去をｐＨ７．２〜８．５
の範囲内で行う請求項１または２の１，５−アンヒドロ
グルシトールの定量法。 - 【請求項４】 糖類の選択的除去をｐＨ７．５〜８．０
の範囲内で行う請求項１から３のいずれかの１，５−ア
ンヒドログルシトールの定量法。 - 【請求項５】 ピラノースオキシダーゼがポリポラス属
に属する微生物由来のピラノースオキシダーゼである請
求項１から４のいずれかの１，５−アンヒドログルシト
ールの定量法。 - 【請求項６】 ピラノースオキシダーゼがポリポラス・
オブッサス由来のピラノースオキシダーゼである請求項
１から５のいずれかの１，５−アンヒドログルシトール
の定量法。 - 【請求項７】 検体中の１，５−アンヒドログルシトー
ルに対してピラノースオキシダーゼを作用させ、生成す
る過酸化水素の量から１，５−アンヒドログルシトール
を定量する請求項１から６のいずれかの１，５−アンヒ
ドログルシトールの定量法。
Applications Claiming Priority (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP4471492 | 1992-03-02 | ||
| JP4-44714 | 1992-03-02 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH05304996A JPH05304996A (ja) | 1993-11-19 |
| JPH07102154B2 true JPH07102154B2 (ja) | 1995-11-08 |
Family
ID=12699092
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP5022613A Expired - Lifetime JPH07102154B2 (ja) | 1992-03-02 | 1993-02-10 | １，５−アンヒドログルシトールの定量法 |
Country Status (3)
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