JPH07103239B2 - ジフェニルホスホリルアジドによるコラーゲンの架橋方法、該方法でえられた架橋コラーゲンおよびそのように架橋されたコラーゲンを基礎としたバイオマテリアル - Google Patents
ジフェニルホスホリルアジドによるコラーゲンの架橋方法、該方法でえられた架橋コラーゲンおよびそのように架橋されたコラーゲンを基礎としたバイオマテリアルInfo
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- JPH07103239B2 JPH07103239B2 JP2506624A JP50662490A JPH07103239B2 JP H07103239 B2 JPH07103239 B2 JP H07103239B2 JP 2506624 A JP2506624 A JP 2506624A JP 50662490 A JP50662490 A JP 50662490A JP H07103239 B2 JPH07103239 B2 JP H07103239B2
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Description
【発明の詳細な説明】 本発明は本質的に、ジフェニルホスホリルアジドによる
コラーゲンの架橋方法、そのようにしてえられた架橋コ
ラーゲンおよびそのように架橋されたコラーゲンを基礎
としたバイオマテリアルに関する。
コラーゲンの架橋方法、そのようにしてえられた架橋コ
ラーゲンおよびそのように架橋されたコラーゲンを基礎
としたバイオマテリアルに関する。
コラーゲンは生物におけるタンパク質の３分の１を構成
していることが知られている。コラーゲンは、その低い
抗原性、細胞発育（croissance cellulaire）に対する
影響および高い機械的性質のため、バイオマテリアルの
ための原料としてあきらかに有利である。しかしなが
ら、コラーゲンが移植されたばあい、それがとっている
形態（溶液、スポンジ、フィルムまたは天然の組織）に
よって、移植された部位によっておよび動物の種によっ
て、速くまたは遅く分解される。該コラーゲン分解は、
時に（治療包帯剤（pansements cicatrisants）望まし
く、時に（人工弁、人工血管など）不便である。
していることが知られている。コラーゲンは、その低い
抗原性、細胞発育（croissance cellulaire）に対する
影響および高い機械的性質のため、バイオマテリアルの
ための原料としてあきらかに有利である。しかしなが
ら、コラーゲンが移植されたばあい、それがとっている
形態（溶液、スポンジ、フィルムまたは天然の組織）に
よって、移植された部位によっておよび動物の種によっ
て、速くまたは遅く分解される。該コラーゲン分解は、
時に（治療包帯剤（pansements cicatrisants）望まし
く、時に（人工弁、人工血管など）不便である。
他方、コラーゲンの分解は、成長の、発育のおよび結合
組織の再生の一部である正常なプロセスである。それは
また、治癒のプロセスに不可欠の部分でもある。該コラ
ーゲン分解は一定数の酵素、とくにコラゲナーゼによっ
て引き起こされる。コラゲナーゼは中性pHでの天然コラ
ーゲンに対する最初の攻撃の原因である。それらは同時
に、３本のペプチド鎖を開裂させると言われている。そ
の開裂はGly-LeuまたはGLy-Ile残基の間で起こる。しか
しながら、そのような分解には、いくつかの酵素なかで
もストロメリシン（stromlysine）、ゼラチナーゼの
協力的な作用が必要であることが現在認められている。
組織の再生の一部である正常なプロセスである。それは
また、治癒のプロセスに不可欠の部分でもある。該コラ
ーゲン分解は一定数の酵素、とくにコラゲナーゼによっ
て引き起こされる。コラゲナーゼは中性pHでの天然コラ
ーゲンに対する最初の攻撃の原因である。それらは同時
に、３本のペプチド鎖を開裂させると言われている。そ
の開裂はGly-LeuまたはGLy-Ile残基の間で起こる。しか
しながら、そのような分解には、いくつかの酵素なかで
もストロメリシン（stromlysine）、ゼラチナーゼの
協力的な作用が必要であることが現在認められている。
コラーゲンがバイオマテリアルとして用いられるばあい
の大きな利点は、提案される用途によってコラーゲンの
生分解能（biodgradabilit）を調節することができ
るということである。該生分解能は、酵素阻害剤（α−
２−マクログロブリンまたはβ−１−アンチコラゲナー
ゼのような）の添加からなる方法、またはコラーゲン分
子間への化学的架橋結合の導入からなる方法の少なくと
も２つの方法において調節しうる。酵素分解に対する抵
抗性に関して、より有効であるので、この２番目の方法
は最も広く用いられる。架橋結合は、いかなる化学薬品
も組織中に入れないという利点を有するがどちらかとい
えば有効でないことがわかっている物理的方法によって
も、または有効であるが組織中に少量の架橋剤を残す化
学的方法によってもえることができる。そうして、グル
タルアルデヒド（GTAと略す）は最も広く用いられる架
橋剤であるが、あいにく溶液中では重合する性質を有す
る。そのようにして、コラーゲンを架橋する間にGTAポ
リマーの形成があり、時とともに、コラーゲンが選択さ
れた理由である生物学的性質の一部がそれによって失わ
れる一方、周囲の組織の中へGTAモノマー（この後者は1
0〜25ppmより上の濃度で細胞毒性である）が溶け出す。
の大きな利点は、提案される用途によってコラーゲンの
生分解能（biodgradabilit）を調節することができ
るということである。該生分解能は、酵素阻害剤（α−
２−マクログロブリンまたはβ−１−アンチコラゲナー
ゼのような）の添加からなる方法、またはコラーゲン分
子間への化学的架橋結合の導入からなる方法の少なくと
も２つの方法において調節しうる。酵素分解に対する抵
抗性に関して、より有効であるので、この２番目の方法
は最も広く用いられる。架橋結合は、いかなる化学薬品
も組織中に入れないという利点を有するがどちらかとい
えば有効でないことがわかっている物理的方法によって
も、または有効であるが組織中に少量の架橋剤を残す化
学的方法によってもえることができる。そうして、グル
タルアルデヒド（GTAと略す）は最も広く用いられる架
橋剤であるが、あいにく溶液中では重合する性質を有す
る。そのようにして、コラーゲンを架橋する間にGTAポ
リマーの形成があり、時とともに、コラーゲンが選択さ
れた理由である生物学的性質の一部がそれによって失わ
れる一方、周囲の組織の中へGTAモノマー（この後者は1
0〜25ppmより上の濃度で細胞毒性である）が溶け出す。
グルタルアルデヒドの使用を避けるために、本発明者ら
はすでにフランス国特許出願第8710317号明細書中に、
コラーゲンの側鎖のカルボキシル基に対するアジド基の
導入によるコラーゲンの架橋方法を提案した。この明細
書において、架橋は、コラーゲンカルボキシル基をエス
テル化すること、そのあとにエステルを連続的にヒドラ
ジンに変換すること、つぎにアシルアジドに変換するこ
とにより行なわれた。最後に、アシルアジドが塩基性溶
媒中でコラーゲンの側鎖のアミノ基と反応して、ペプチ
ド型結合をえた。該方法は、非常に革新的ではあるが、
コラーゲンの架橋に８日間かかるので、長時間かかると
いう欠点を有し、工業的規模で用いるのに実際的でな
い。
はすでにフランス国特許出願第8710317号明細書中に、
コラーゲンの側鎖のカルボキシル基に対するアジド基の
導入によるコラーゲンの架橋方法を提案した。この明細
書において、架橋は、コラーゲンカルボキシル基をエス
テル化すること、そのあとにエステルを連続的にヒドラ
ジンに変換すること、つぎにアシルアジドに変換するこ
とにより行なわれた。最後に、アシルアジドが塩基性溶
媒中でコラーゲンの側鎖のアミノ基と反応して、ペプチ
ド型結合をえた。該方法は、非常に革新的ではあるが、
コラーゲンの架橋に８日間かかるので、長時間かかると
いう欠点を有し、工業的規模で用いるのに実際的でな
い。
本発明者は、完成したマテリアル中に架橋剤を入れるこ
となしに架橋方法を単純化すること、および一方フラン
ス国特許出願第8710317号明細書中に記載の方法でえら
れたのと同程度の架橋コラーゲンをえることを目的に研
究を続けた。
となしに架橋方法を単純化すること、および一方フラン
ス国特許出願第8710317号明細書中に記載の方法でえら
れたのと同程度の架橋コラーゲンをえることを目的に研
究を続けた。
したがって、完成品中に架橋剤を入れないと同時に単純
化されたコラーゲンの架橋方法を提供することおよび先
行の、フランス国特許出願第8710317号明細書中に明白
に記載されている方法でえられるのと等しいコラーゲン
の架橋の程度に到達することに存する新たな技術的課題
を解決することが本発明の目的である。
化されたコラーゲンの架橋方法を提供することおよび先
行の、フランス国特許出願第8710317号明細書中に明白
に記載されている方法でえられるのと等しいコラーゲン
の架橋の程度に到達することに存する新たな技術的課題
を解決することが本発明の目的である。
本発明のまた別の目的は、架橋時間をかなり減ずること
に伴なう前述の新たな技術的課題を解決することであ
る。
に伴なう前述の新たな技術的課題を解決することであ
る。
本発明は、初めて、きわめて単純で再現可能な仕方で、
予期される用途に応じてコラーゲンの架橋の程度を随意
に調節するために、随意にパラメータを変化させうる方
法でおよび低いコストで、前記の新たな技術的課題を解
決した。
予期される用途に応じてコラーゲンの架橋の程度を随意
に調節するために、随意にパラメータを変化させうる方
法でおよび低いコストで、前記の新たな技術的課題を解
決した。
したがって、第一の局面において、本発明は、コラーゲ
ンをジフェニルホスホリルアジド（DPPA）と反応させる
ことを特徴とする、アシルアジド基によってアミド結合
を形成することを含むタイプの、コラーゲンの架橋方法
を提供する。
ンをジフェニルホスホリルアジド（DPPA）と反応させる
ことを特徴とする、アシルアジド基によってアミド結合
を形成することを含むタイプの、コラーゲンの架橋方法
を提供する。
本発明の方法の有利な具体例では、DPPAとの反応は非水
溶媒中で行なわれる。好ましくは、該非水溶媒はジメチ
ルホルムアミド（DMF）により構成される。
溶媒中で行なわれる。好ましくは、該非水溶媒はジメチ
ルホルムアミド（DMF）により構成される。
有利な、さまざまな具体例において、DPPA濃度は0.0125
容量％と1.50容量％の間、および好ましくはさらに0.25
と0.7％の間に含まれる。
容量％と1.50容量％の間、および好ましくはさらに0.25
と0.7％の間に含まれる。
本発明の方法の有利なさまざまな具体例では、DPPAとの
反応は、約０と10℃との間に含まれる、好ましくは約４
℃の、インキュベーション温度での、数時間と約１日間
の間の、好ましくは約１日間のインキュベーション期間
のインキュベーションによって行なわれる。
反応は、約０と10℃との間に含まれる、好ましくは約４
℃の、インキュベーション温度での、数時間と約１日間
の間の、好ましくは約１日間のインキュベーション期間
のインキュベーションによって行なわれる。
本発明の方法のとくに有利な特徴では、コラーゲンをDP
PAと反応させたのち、DPPAを除去するため少なくとも１
回のすすぎが行なわれ、そのつぎにアシルアジド基を含
むコラーゲンをホウ酸塩バッファー溶液中に入れる。
PAと反応させたのち、DPPAを除去するため少なくとも１
回のすすぎが行なわれ、そのつぎにアシルアジド基を含
むコラーゲンをホウ酸塩バッファー溶液中に入れる。
本発明の方法の有利な具体例では、アシルアジド基を含
むコラーゲンはホウ酸塩バッファー中で、有利には約０
と10℃の間に含まれる温度で、およびさらに好ましくは
約40℃で、数時間と約１日間の間の、および好ましくは
約１日間のインキュベーション時間でインキュベーショ
ンされる。
むコラーゲンはホウ酸塩バッファー中で、有利には約０
と10℃の間に含まれる温度で、およびさらに好ましくは
約40℃で、数時間と約１日間の間の、および好ましくは
約１日間のインキュベーション時間でインキュベーショ
ンされる。
有利な具体例では、該ホウ酸塩バッファーは8.9とおよ
そ等しいpHを有する。
そ等しいpHを有する。
本発明の方法のまた別の具体例では、原料として用いる
DPPAと反応させるコラーゲンは、ゲル、フィルムまたは
心膜（ｐricarde）もしくは移植血管（greffon vascu
laire）のような天然の組織の形態である。
DPPAと反応させるコラーゲンは、ゲル、フィルムまたは
心膜（ｐricarde）もしくは移植血管（greffon vascu
laire）のような天然の組織の形態である。
第２の局面では、本発明はジフェニルホスホリルアジド
によって架橋されたコラーゲンをも包含する。
によって架橋されたコラーゲンをも包含する。
本発明は、上述の架橋方法によってえられることを特徴
とする架橋コラーゲンも包含する。
とする架橋コラーゲンも包含する。
最後に、本発明はDPPAによって架橋されたことを特徴と
する、すべてのコラーゲンを基礎とするバイオマテリア
ルをも包含する。
する、すべてのコラーゲンを基礎とするバイオマテリア
ルをも包含する。
DPPAによるコラーゲンの架橋を起こす反応機構を正確に
知ることなしに、DPPAによるカルボキシル基でのアミド
結合形成について提案される反応機構を類推によって論
ずることによって、添付の図１に示す反応機構を提案す
ることは可能である。コラーゲンペプチド鎖のアスパラ
ギン酸もしくはグルタミン酸の側方のカルボキシル基に
より供給されるカルボキシルアニオン（ａ）がDPPA
（ｂ）のリン原子を攻撃することができ、本質的に五共
有結合リン化合物（ｃ）をえる。すると、内部求核置換
型の転位により、リン原子のアジド基の、カルボキシル
炭素原子への移動が起こる。
知ることなしに、DPPAによるカルボキシル基でのアミド
結合形成について提案される反応機構を類推によって論
ずることによって、添付の図１に示す反応機構を提案す
ることは可能である。コラーゲンペプチド鎖のアスパラ
ギン酸もしくはグルタミン酸の側方のカルボキシル基に
より供給されるカルボキシルアニオン（ａ）がDPPA
（ｂ）のリン原子を攻撃することができ、本質的に五共
有結合リン化合物（ｃ）をえる。すると、内部求核置換
型の転位により、リン原子のアジド基の、カルボキシル
炭素原子への移動が起こる。
最終的に、形成されたアシルアジド（ｄ）はコラーゲン
のペプチド鎖のリシンおよびヒドロリシンの側方のアミ
ノ基と反応し、アミド型結合をえる。
のペプチド鎖のリシンおよびヒドロリシンの側方のアミ
ノ基と反応し、アミド型結合をえる。
したがって、本発明は、全く予期されない方法でコラー
ゲン架橋方法を単純化することを可能にすることがわか
る。該方法はきわめて単純で、費用がかかわらず、かつ
比較的短い架橋期間を必要とするだけであり、このこと
は、いかなる当業者に対しても先行技術をこえる決定的
要素である、著しい技術的利点を説明するものである。
ゲン架橋方法を単純化することを可能にすることがわか
る。該方法はきわめて単純で、費用がかかわらず、かつ
比較的短い架橋期間を必要とするだけであり、このこと
は、いかなる当業者に対しても先行技術をこえる決定的
要素である、著しい技術的利点を説明するものである。
本発明の他の目的、特徴および利点は以下のいくつかの
具体例の実施例の詳細な記載から明らかになるであろ
う。この実施例は単に説明のために与えられるものであ
り、したがって本発明の範囲にいかなる限定をも行うも
のではない。
具体例の実施例の詳細な記載から明らかになるであろ
う。この実施例は単に説明のために与えられるものであ
り、したがって本発明の範囲にいかなる限定をも行うも
のではない。
図面において、 −図１は、ジフェニルホスホリルアジドとコラーゲンの
カルボキシル基との反応に存するコラーゲン架橋反応の
反応機構の１つの仮説を示す； −図２は、コラーゲン変性ピーク温度（TP）から測定さ
れる、RTPと呼ばれるコラーゲン架橋割合の、子牛の心
膜についてDPPA濃度の関数としての展開を示す；および −図３は、コラーゲンフィルムについてDPPA濃度の関数
としての架橋RTP割合の展開を示す。
カルボキシル基との反応に存するコラーゲン架橋反応の
反応機構の１つの仮説を示す； −図２は、コラーゲン変性ピーク温度（TP）から測定さ
れる、RTPと呼ばれるコラーゲン架橋割合の、子牛の心
膜についてDPPA濃度の関数としての展開を示す；および −図３は、コラーゲンフィルムについてDPPA濃度の関数
としての架橋RTP割合の展開を示す。
実施例１ DPPAでの子牛心膜の架橋 ａ）原料の調製 屠殺場から、屠殺後１時間未満の子牛の心膜を集める。
心膜から脂肪を除き、0.9％のNaCl溶液中で洗浄する。
つぎにこれをパンチで1cm2のペレットに切断する。
心膜から脂肪を除き、0.9％のNaCl溶液中で洗浄する。
つぎにこれをパンチで1cm2のペレットに切断する。
ｂ）心膜の架橋 この反応は以下のように要約することができる： 組織から水を除去するために前もって10mlの純DMF中で
５分間すすいだ４つの心膜のペレットを0.75％のDPPA
（濃度は容量／容量で表わす）含有DMF溶液10ml中で４
℃にて24時間インキュベートする。つぎに10mlのDMF溶
液中ですすぐことにより組織からDPPAを除去する。さら
に10mlのpH8.9のホウ酸塩バッファー溶液（四ホウ酸ナ
トリウム0.04M、ホウ酸0.04M）ですすぐことによりDMF
を除去する。最後に、pH8.9のホウ酸塩バッファー中一
晩の間その組織をインキュベートする。そうして、その
組織を、たとえば70°にてエタノール溶液中に、保存す
る。
５分間すすいだ４つの心膜のペレットを0.75％のDPPA
（濃度は容量／容量で表わす）含有DMF溶液10ml中で４
℃にて24時間インキュベートする。つぎに10mlのDMF溶
液中ですすぐことにより組織からDPPAを除去する。さら
に10mlのpH8.9のホウ酸塩バッファー溶液（四ホウ酸ナ
トリウム0.04M、ホウ酸0.04M）ですすぐことによりDMF
を除去する。最後に、pH8.9のホウ酸塩バッファー中一
晩の間その組織をインキュベートする。そうして、その
組織を、たとえば70°にてエタノール溶液中に、保存す
る。
実施例２ DPPAでのコラーゲンフィルムの架橋 ａ）原料の調製 石灰と硫化物との混合物で前もって洗浄しはがされた子
牛の皮膚からゲルを調製する。その皮膚を中和し、さら
に、その塩を２回の水洗によって除く。つぎにその皮膚
をひいて粉にし、pH7.8のリン酸塩バッファー（リン酸
二水素カリウム0.78g/lおよびリン酸一水素二ナトリウ
ム21.7g/l）で洗浄する。そのあとでイオン交換水で二
回連続洗浄することによりリン酸塩を除く。その粉にし
た原料を、コラーゲンに関して酢酸の量が５％になる10
％の酢酸溶液で酸性化する。つぎに粉にした原料を均一
なペーストがえられるまでこねる。そのペーストを0.7
％のコラーゲン濃度を有するゲルがえられるように希釈
する。さらに、そのゲルを小さなテフロン（Ｔflon）
型の中に入れ、蒸発させる。その後、えられたフィルム
をパンチで1cm2のペレットに切断する。
牛の皮膚からゲルを調製する。その皮膚を中和し、さら
に、その塩を２回の水洗によって除く。つぎにその皮膚
をひいて粉にし、pH7.8のリン酸塩バッファー（リン酸
二水素カリウム0.78g/lおよびリン酸一水素二ナトリウ
ム21.7g/l）で洗浄する。そのあとでイオン交換水で二
回連続洗浄することによりリン酸塩を除く。その粉にし
た原料を、コラーゲンに関して酢酸の量が５％になる10
％の酢酸溶液で酸性化する。つぎに粉にした原料を均一
なペーストがえられるまでこねる。そのペーストを0.7
％のコラーゲン濃度を有するゲルがえられるように希釈
する。さらに、そのゲルを小さなテフロン（Ｔflon）
型の中に入れ、蒸発させる。その後、えられたフィルム
をパンチで1cm2のペレットに切断する。
ｂ）フィルムの架橋 この反応は以下のように要約することができる： 表面積1cm2の４つのフィルムのペレットを、0.25％のDP
PA（濃度は容量／容量で表わす）を含む10mlのDMFの溶
液中で４°にて24時間インキュベーションする。つぎ
に、10mlのDMF溶液ですすぐことにより、フィルムからD
PPAを除去する。さらに、10mlのpH8.9のホウ酸塩バッフ
ァー溶液（四ホウ酸ナトリウム0.04M、ホウ酸0.04M）で
すすぐことによりDMFを除去する。最後に、そのフィル
ムをpH8.9のホウ酸塩バッファー中で一晩の間インキュ
ベートする。それらを濾紙の上にのせて水を切り、風乾
する。それらは、その後、たとえばガンマ線で滅菌され
うる。
PA（濃度は容量／容量で表わす）を含む10mlのDMFの溶
液中で４°にて24時間インキュベーションする。つぎ
に、10mlのDMF溶液ですすぐことにより、フィルムからD
PPAを除去する。さらに、10mlのpH8.9のホウ酸塩バッフ
ァー溶液（四ホウ酸ナトリウム0.04M、ホウ酸0.04M）で
すすぐことによりDMFを除去する。最後に、そのフィル
ムをpH8.9のホウ酸塩バッファー中で一晩の間インキュ
ベートする。それらを濾紙の上にのせて水を切り、風乾
する。それらは、その後、たとえばガンマ線で滅菌され
うる。
スポンジ、チューブ、コラーゲンストランドなどを同じ
方法で架橋しうる。
方法で架橋しうる。
実施例３ A.子牛心膜の架橋に対するDPPA濃度の影響 研究の最初は、心膜の架橋の程度に対するDPPA濃度の影
響を調べることである。この趣旨で、0.0125％と1.5％
（容量／容量）の間のさまざまな濃度のDPPA溶液中で心
膜をインキュベートする。
響を調べることである。この趣旨で、0.0125％と1.5％
（容量／容量）の間のさまざまな濃度のDPPA溶液中で心
膜をインキュベートする。
コラーゲンの架橋の程度を走査熱量分析（analyse calo
rimtrique balayage）により測定する。この技術
は、温度が線型に上昇する間、サンプルおよびリファレ
ンスを同一の温度に保つためにサンプルおよびリファレ
ンスに供給されるべきエネルギーの差を測定することに
ある。コラーゲンが変性されると、熱吸収ピークが記録
計に現われる。変性の始まりの温度（TD）、変性のピー
クの温度（TP）および変性の終わりの温度（TF）はこの
ようにして定義される。
rimtrique balayage）により測定する。この技術
は、温度が線型に上昇する間、サンプルおよびリファレ
ンスを同一の温度に保つためにサンプルおよびリファレ
ンスに供給されるべきエネルギーの差を測定することに
ある。コラーゲンが変性されると、熱吸収ピークが記録
計に現われる。変性の始まりの温度（TD）、変性のピー
クの温度（TP）および変性の終わりの温度（TF）はこの
ようにして定義される。
コラーゲン架橋割合Ｒを計算するために以下の式をたて
る： TM:DPPAでのコラーゲン架橋の際えることができる最大
変性の温度；実際、この場合では、0.75％DPPA濃度
（［DPPA］）でえられる温度と一致する。
る： TM:DPPAでのコラーゲン架橋の際えることができる最大
変性の温度；実際、この場合では、0.75％DPPA濃度
（［DPPA］）でえられる温度と一致する。
TI:無処理組織についてえられる変性の温度である。
TX:DPPA濃度Ｘでの組織についてえられる変性の温度で
ある。
ある。
ＲはTPすなわち変性ピーク温度から計算される架橋％で
あり、RTPと呼ばれる。Log（［DPPA］×1000）の関数と
してのRTPの展開を図２に示す。本発明者は、このよう
に0.0125％と0.50％の間ではLog（［DPPA］×1000）の
関数としてのRTPの展開は線型であることおよび0.5〜0.
75％では架橋は最大で、DPPA濃度にかかわらず一定であ
ることを確かめる。
あり、RTPと呼ばれる。Log（［DPPA］×1000）の関数と
してのRTPの展開を図２に示す。本発明者は、このよう
に0.0125％と0.50％の間ではLog（［DPPA］×1000）の
関数としてのRTPの展開は線型であることおよび0.5〜0.
75％では架橋は最大で、DPPA濃度にかかわらず一定であ
ることを確かめる。
0.75％もしくは0.5％DPPAでえられた変性の温度を特許
番号（le brevet no）8710317において提案された方法
でえられた変性の温度および0.6％GTA（生補整弁膜（bi
prothses valvulaires）の伝統的処理）の変性の温度
と比較すると、これらの値はそれほど異ならないことが
わかる（表Ｉ）。
番号（le brevet no）8710317において提案された方法
でえられた変性の温度および0.6％GTA（生補整弁膜（bi
prothses valvulaires）の伝統的処理）の変性の温度
と比較すると、これらの値はそれほど異ならないことが
わかる（表Ｉ）。
B.コラーゲンフィルムの架橋に対するDPPA濃度の影響 我々はコラーゲンフィルムの架橋の程度に対するDPPA濃
度の影響を研究した。この趣旨で、0.0125％と1.0％
（容量／容量）の間のさまざまの濃度のDPPAの溶液中で
フィルムをインキュベートする。
度の影響を研究した。この趣旨で、0.0125％と1.0％
（容量／容量）の間のさまざまの濃度のDPPAの溶液中で
フィルムをインキュベートする。
Log（［DPPA］×1000）の関数としてのRTPの展開（図
３）を子牛心膜と同様に正確に計算する。このようにし
て、本発明者は0.0125％と0.10％の間では、Log（［DPP
A］×1000）の関数としてのRTPの展開は線型であること
を確かめる。最大の架橋は0.25％〜0.5％のDPPA濃度で
えられる。
３）を子牛心膜と同様に正確に計算する。このようにし
て、本発明者は0.0125％と0.10％の間では、Log（［DPP
A］×1000）の関数としてのRTPの展開は線型であること
を確かめる。最大の架橋は0.25％〜0.5％のDPPA濃度で
えられる。
0.15％もしくは0.5％DPPAでえられた変性の温度を特許
番号8710317において提案された方法でえられた変性の
温度および0.6％GTA（生補整弁膜の伝統的処理）の変性
の温度と比較すると、これらの値はそれほど異ならない
ことがわかる（表Ｉ）。
番号8710317において提案された方法でえられた変性の
温度および0.6％GTA（生補整弁膜の伝統的処理）の変性
の温度と比較すると、これらの値はそれほど異ならない
ことがわかる（表Ｉ）。
C.心膜の架橋後のDPPAの定量 架橋後のDPPAに何が起きたのか確かめるために、DPPAの
定量をそのリンを含む基によって行なった。
定量をそのリンを含む基によって行なった。
初めに、いかなるすすぎもせずに、異なる濃度でDPPA処
理した材料のリンを測定する。処理された材料をオーブ
ンで110℃にて単純に乾燥する。リンの定量は過塩素酸
および硝酸溶液（容量／容量で３分の2/3分の１）によ
って鉱物化したのち、プラズマ放出分光測定（spectrom
trie d'mission plasma）により行なわれる。結果
は乾燥重量に関するリン％でえられる。結果を表IIに記
録する。
理した材料のリンを測定する。処理された材料をオーブ
ンで110℃にて単純に乾燥する。リンの定量は過塩素酸
および硝酸溶液（容量／容量で３分の2/3分の１）によ
って鉱物化したのち、プラズマ放出分光測定（spectrom
trie d'mission plasma）により行なわれる。結果
は乾燥重量に関するリン％でえられる。結果を表IIに記
録する。
二番目に、ホウ酸塩バッファー中のみですすがれたのち
またはDMF中つぎにホウ酸塩バッファー中ですすがれた
のち、0.5％および1.0％の濃度でDPPA処理した材料につ
いてリンを定量した。結果を表IIIに記録する。
またはDMF中つぎにホウ酸塩バッファー中ですすがれた
のち、0.5％および1.0％の濃度でDPPA処理した材料につ
いてリンを定量した。結果を表IIIに記録する。
0.5％の濃度DPPAでのときは、ホウ酸塩バッファーでの
３回すすぎだけのあとでさえ、残存リンは、いかなる架
橋剤も伴なわないDMF中インキュベートした心膜につい
て示される残存リンと等しいと思われる（それぞれ0.09
％と0.1％）。
３回すすぎだけのあとでさえ、残存リンは、いかなる架
橋剤も伴なわないDMF中インキュベートした心膜につい
て示される残存リンと等しいと思われる（それぞれ0.09
％と0.1％）。
したがって架橋後架橋剤は組織中に残っていないと思わ
れる。それゆえ、この新規な製法はまったく革新的であ
ると思われる。ちょうどフランス国特許出願第8710317
号明細書中提案された製法のような、架橋剤の永続的な
導入を伴なわないコラーゲンの架橋を可能にし、および
さらに、産業レベルでのその使用は明らかにより容易に
なされる。
れる。それゆえ、この新規な製法はまったく革新的であ
ると思われる。ちょうどフランス国特許出願第8710317
号明細書中提案された製法のような、架橋剤の永続的な
導入を伴なわないコラーゲンの架橋を可能にし、および
さらに、産業レベルでのその使用は明らかにより容易に
なされる。
本来、本発明は記載した手段のさまざまな組合せだけで
なく、それらに技術的に均等な手段よりなるすべての手
段を含むものである。
なく、それらに技術的に均等な手段よりなるすべての手
段を含むものである。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (56)参考文献 欧州特許公開70021（ＥＰ，Ａ)
Claims (12)
- 【請求項１】コラーゲンをジフェニルホスホリルアジド
（DPPA）と反応させることを特徴とする、アシルアジド
基を用いることによるアミド結合の形成よりなるタイプ
のコラーゲンの架橋方法。 - 【請求項２】DPPAとの反応を非水溶媒中で行なうことを
特徴とする請求項１記載の方法。 - 【請求項３】非水溶媒がジメチルホルムアミドである請
求項２記載の方法。 - 【請求項４】DPPA濃度が容量／容量における0.0125％と
１％の間、好ましくは0.25と0.70％の間に含まれる請求
項１から３記載の１つの方法。 - 【請求項５】約０と約10℃の間に含まれる温度で、好ま
しくは約４℃の温度でのインキュベーションにより反応
がえられ、インキュベーション期間が好ましくは数時間
と約１日間の間に含まれ、好ましくは約１日間であるこ
とを特徴とする請求項１から４記載の１つの方法。 - 【請求項６】DPPAでの反応後、DPPAを除去するために少
なくとも１回すすぎを行ない、つぎにアシルアジド基を
含むそのコラーゲンをホウ酸塩バッファーへ入れること
を特徴とする請求項１から５記載の１つの方法。 - 【請求項７】インキュベーションが約０と約10℃の間に
含まれる温度、好ましくは約４℃にて、ホウ酸塩バッフ
ァー中で行なわれることを特徴とする請求項６記載の方
法。 - 【請求項８】ホウ酸塩バッファーが約8.9と等しいpHを
有することを特徴とする請求項７記載の方法。 - 【請求項９】原料として用いられるコラーゲンがゲル、
フィルムまたはたとえば心膜もしくは移植血管のような
天然の組織の形態であることを特徴とする請求項１から
８記載の１つである方法。 - 【請求項１０】ジフェニルホスホリルアジドによって架
橋されたことを特徴とする架橋コラーゲン。 - 【請求項１１】請求項１から９のいずれか１つに記載の
ような方法によりえられることを特徴とする架橋コラー
ゲン。 - 【請求項１２】ジフェニルホスホリルアジドにより架橋
されたことを特徴とするコラーゲンを基礎とするバイオ
マテリアル。
Applications Claiming Priority (3)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| FR8904846A FR2645870B1 (fr) | 1989-04-12 | 1989-04-12 | Procede de reticulation du collagene par le diphenylphosphorylazide, collagene reticule ainsi obtenu et biomateriaux a base de collagene ainsi reticules |
| FR89/04846 | 1989-04-12 | ||
| PCT/FR1990/000253 WO1990012055A2 (fr) | 1989-04-12 | 1990-04-10 | Procede de reticulation du collagene par le diphenylphosphorylazide, collagene reticule ainsi obtenu et biomateriaux a base de collagene ainsi reticules |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH04504586A JPH04504586A (ja) | 1992-08-13 |
| JPH07103239B2 true JPH07103239B2 (ja) | 1995-11-08 |
Family
ID=9380649
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP2506624A Expired - Lifetime JPH07103239B2 (ja) | 1989-04-12 | 1990-04-10 | ジフェニルホスホリルアジドによるコラーゲンの架橋方法、該方法でえられた架橋コラーゲンおよびそのように架橋されたコラーゲンを基礎としたバイオマテリアル |
Country Status (17)
| Country | Link |
|---|---|
| US (1) | US5264551A (ja) |
| EP (1) | EP0466829B1 (ja) |
| JP (1) | JPH07103239B2 (ja) |
| KR (1) | KR0160309B1 (ja) |
| AT (1) | ATE140709T1 (ja) |
| AU (1) | AU5531690A (ja) |
| BR (1) | BR9007287A (ja) |
| CA (1) | CA2051426C (ja) |
| DE (1) | DE69027925T2 (ja) |
| ES (1) | ES2092507T3 (ja) |
| FI (1) | FI914798A7 (ja) |
| FR (1) | FR2645870B1 (ja) |
| HU (1) | HU208840B (ja) |
| MC (1) | MC2187A1 (ja) |
| NO (1) | NO177502C (ja) |
| RU (1) | RU2061000C1 (ja) |
| WO (1) | WO1990012055A2 (ja) |
Families Citing this family (18)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US5660692A (en) * | 1988-02-24 | 1997-08-26 | Cedars-Sinai Medical Center | Method of crosslinking amino acid-containing polymers using photoactivatable chemical crosslinkers |
| FR2675048B1 (fr) * | 1991-04-12 | 1995-06-23 | Coletica | Utilisation de collagene reticule par un agent de reticulation pour la fabrication de fils de collagene destines a constituer un implant pour le comblement de tissus mous et implant ainsi obtenu. |
| US5314874A (en) * | 1991-04-19 | 1994-05-24 | Koken Co., Ltd. | Intracorporeally injectable composition for implanting highly concentrated cross-linked atelocollagen |
| FR2679778B1 (fr) * | 1991-08-02 | 1995-07-07 | Coletica | Utilisation de collagene reticule par un agent de reticulation pour la fabrication d'une membrane suturable, biocompatible, a resorption lente, ainsi qu'une telle membrane. |
| GB9215002D0 (en) * | 1992-07-15 | 1992-08-26 | Univ Singapore | Method of fixing biological tissue |
| US5741319A (en) * | 1995-01-27 | 1998-04-21 | Medtronic, Inc. | Biocompatible medical lead |
| US20020015724A1 (en) * | 1998-08-10 | 2002-02-07 | Chunlin Yang | Collagen type i and type iii hemostatic compositions for use as a vascular sealant and wound dressing |
| US6375672B1 (en) | 1999-03-22 | 2002-04-23 | Board Of Trustees Of Michigan State University | Method for controlling the chemical and heat induced responses of collagenous materials |
| FR2801313A1 (fr) | 1999-05-19 | 2001-05-25 | Coletica | Produit collagenique contenant du collagene d'origine marine a faible odeur et de preference a proprietes mecaniques ameliorees, ainsi que son utilisation sous forme de compositions ou de produits cosmetiques ou pharmaceutiques |
| US6385491B1 (en) * | 1999-10-04 | 2002-05-07 | Medtronic, Inc. | Temporary medical electrical lead having biodegradable electrode mounting pad loaded with therapeutic drug |
| FR2809412A1 (fr) | 2000-05-26 | 2001-11-30 | Coletica | Utilisation de collagene d'origine aquatique pour la realisation de supports destines a l'ingenierie tissulaire, et supports et biomateriaux obtenus |
| DE10196235B4 (de) * | 2000-05-26 | 2007-12-27 | Engelhard Lyon S.A. | Verwendung von Fischkollagen zur Herstellung von Trägern für die Gewebebildung sowie diese Träger |
| US6974679B2 (en) * | 2000-05-26 | 2005-12-13 | Coletica | Support with collagen base for tissue engineering and manufacture of biomaterials |
| US6790454B1 (en) | 2000-05-26 | 2004-09-14 | Coletica | Processes for the preparation of novel collagen-based supports for tissue engineering, and biomaterials obtained |
| FR2809314B1 (fr) * | 2000-05-26 | 2005-11-18 | Coletica | Utilisation de collagene d'origine aquatique pour la realisation de supports destines a l'ingenierie tissulaire, et supports et biomateriaux obtenus |
| RU2189257C1 (ru) * | 2001-10-10 | 2002-09-20 | Хуснутдинов Анис Хатыпович | Биоматериал аллоплант для регенеративной хирургии |
| WO2005042043A2 (en) * | 2003-10-28 | 2005-05-12 | Medtronic, Inc. | Methods of preparing crosslinked materials and bioprosthetic devices |
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| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| EP0070021A1 (en) * | 1981-07-15 | 1983-01-19 | Merck & Co. Inc. | Process for the preparation of cyclic hexapeptide |
Family Cites Families (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JPS4881838A (ja) * | 1972-02-15 | 1973-11-01 | ||
| US4755593A (en) * | 1985-07-24 | 1988-07-05 | Lauren Mark D | Novel biomaterial of cross-linked peritoneal tissue |
| FR2617855B1 (fr) * | 1987-07-08 | 1992-02-21 | Bioetica Sa | Procede de reticulation du collagene par introduction de groupes azides ainsi que les tissus et biomateriaux obtenus par mise en oeuvre du procede |
-
1989
- 1989-04-12 FR FR8904846A patent/FR2645870B1/fr not_active Expired - Lifetime
-
1990
- 1990-04-10 AT AT90907101T patent/ATE140709T1/de not_active IP Right Cessation
- 1990-04-10 RU SU905010096A patent/RU2061000C1/ru active
- 1990-04-10 KR KR1019910701328A patent/KR0160309B1/ko not_active Expired - Lifetime
- 1990-04-10 EP EP90907101A patent/EP0466829B1/fr not_active Expired - Lifetime
- 1990-04-10 MC MC@@@@D patent/MC2187A1/xx unknown
- 1990-04-10 FI FI914798A patent/FI914798A7/fi not_active Application Discontinuation
- 1990-04-10 DE DE69027925T patent/DE69027925T2/de not_active Expired - Lifetime
- 1990-04-10 CA CA002051426A patent/CA2051426C/en not_active Expired - Lifetime
- 1990-04-10 HU HU903751A patent/HU208840B/hu not_active IP Right Cessation
- 1990-04-10 US US07/768,406 patent/US5264551A/en not_active Expired - Lifetime
- 1990-04-10 AU AU55316/90A patent/AU5531690A/en not_active Abandoned
- 1990-04-10 ES ES90907101T patent/ES2092507T3/es not_active Expired - Lifetime
- 1990-04-10 JP JP2506624A patent/JPH07103239B2/ja not_active Expired - Lifetime
- 1990-04-10 WO PCT/FR1990/000253 patent/WO1990012055A2/fr not_active Ceased
- 1990-04-10 BR BR909007287A patent/BR9007287A/pt not_active Application Discontinuation
-
1991
- 1991-10-11 NO NO914012A patent/NO177502C/no unknown
Patent Citations (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| EP0070021A1 (en) * | 1981-07-15 | 1983-01-19 | Merck & Co. Inc. | Process for the preparation of cyclic hexapeptide |
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