JPH07107971A

JPH07107971A - アルカリに安定なサイクロデキストリングルカノトランスフェラーゼ及びその製造法

Info

Publication number: JPH07107971A
Application number: JP27778893A
Authority: JP
Inventors: Yoshiyuki Takasaki; 義幸高崎
Original assignee: Amano Pharmaceutical Co Ltd
Current assignee: Amano Enzyme Inc
Priority date: 1993-10-08
Filing date: 1993-10-08
Publication date: 1995-04-25
Anticipated expiration: 2019-07-21
Also published as: JP3544383B2

Abstract

(57)【要約】【目的】本発明は、サイクロデキストリングルカノト
ランスフェラーゼ、その製造法に関する。【構成】サイクロデキストリングルカノトランスフェ
ラーゼ生産能を有するバチルス属に属する菌を培養し、
培養物中に耐アルカリ性CGTaseを産生せしめる。本酵素
は洗浄剤などの用途に使用される。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【産業上の利用分野】本発明は、サイクロデキストリン
グルカノトランスフェラーゼ（EC 2.4.1.19、以下CGT
aseという）、その製造法に関する。更に詳しくは、CGT
ase生産能を有するバチルス属に属する菌を培養し、培
養物中に耐アルカリ性CGTaseを産生せしめ、これを採取
するCGTaseの製造法に関する。

【０００２】

【従来の技術】サイクロデキストリンはグルコースが
６、７又は８個などからなる環状オリゴ糖の総称であ
り、バチルス・マセランス（Bacillus macerans）、バ
チルス・メガテリウム（Bacillus megaterium）、バチ
ルス・ステアロサーモフィラス（Bacillus stearotherm
ophilus）等のバチルス属細菌、クレブシエラ・ニュー
モニア（Klebsiella pneumoniae）等の細菌などの生産
するCGTaseにより澱粉から生産される。又、ある種の好
アルカリ性菌、例えば、好アルカリ性バチルス No.38-2
は、pH5.5とpH8.5に最適pHをもつCGTaseを生産し、澱粉
からβ−サイクロデキストリンを生産する。これらの微
生物の生産するCGTaseについては、例えば、発酵と工業
36(3) 176-183 (1978), 醸造 80(7) 434-440 (1985),
（株）学会出版センター発行「好アルカリ性微生物」 1
01-110 (1982)等に詳しくまとめられている。

【０００３】上記の各種CGTaseを澱粉に作用させて生成
したサイクロデキストリンは各種の有機化合物を包蔵
し、不安定物質の安定化、芳香の保持、悪臭物質の消
臭、苦みの除去、乳化促進、起泡性改善等の作用が知ら
れ、医薬、食品分野に使用されている。例えば、サイク
ロデキストリンを洗浄剤に配合し、その起泡性を改善し
たり（特開昭63−68520、特開平２-34693、特開平3−17
2397）、香料の持続効果を図ったり（特開平１−18539
9）する方法が知られている。

【０００４】

【課題が解決しようとする課題】本発明の目的は、より
耐アルカリ性で、かつ効率的にサイクロデキストリンを
生成するCGTaseを生産する微生物を、広く自然界に求め
てスクリーニングして見いだすことであり、当該菌株か
ら得られる耐アルカリ性のCGTaseは洗浄剤などの用途に
新たな道を開くものである。

【０００５】

【課題を解決するための手段】本発明者は広く自然界に
耐アルカリ性のCGTase生産菌を求めた結果、土壌より分
離したバチルス・エスピーＹＴ−１株の生産するCGTase
が、最適pHは６付近にあるが、pH５−12の広いpH域で安
定で、pH４〜12の広いpH域でサイクロデキストリンを合
成する性質を有し、特に、pH５〜10においても、至適pH
の活性の90％以上の活性を有する耐アルカリ性の性質を
有し、更にpH９以上ではα−サイクロデキストリンの生
成は抑制され、β−サイクロデキストリンとγ−サイク
ロデキストリンを主成分として生産することを認めた。

【０００６】このように、本酵素が、pH９以上のアルカ
リ性下で、澱粉質から生産するサイクロデキストリン
は、空洞の大きいβ−サイクロデキストリンとγ−サイ
クロデキストリンが主成分となるため、このCGTaseを洗
剤とともに使用すれば、食器等の澱粉質等の汚れの分解
除去の他に、生成したサイクロデキストリンの消臭など
のマスキング効果も顕著に発揮され、又、起泡性の改善
と汚れの乳化促進などによる洗滌効果向上等、洗剤成分
として極めて有用であることを認めた。本発明はこの知
見に基づいてなされたものである。

【０００７】本発明において例示菌として使用されるバ
チルス・エスピーＹＴ−１株は、以上の目的のために、
自然界から分離した多数の微生物の中から選び出された
ものである。バチルス・エスピーＹＴ−１の菌学的性質
は下記の通りである。なお本菌は工業技術院生命工学工
業技術研究所に、FERM P-13877として寄託されている。

【０００８】 (1) 形態：桿菌（幅0.8〜1.0μm、長さ3.0〜4.0μm） (2) 胞子：卵形で菌体を膨張させる。径0.9〜1.2μm、
菌端または中央に形成する。 (3) グラム染色：陰性 (4) 運動性：＋ (5) オキシダーゼ：＋ (6) カタラーゼ反応：＋ (7) インドール：− (8) ＶＰ：− (9) ＶＰ培地におけるpH：7.8 (10) リトマスミルク反応：− (11) メチレンブルー還元：− (12) チロシン分解：− (13) 食塩（5,7,10％）生育：− (14) 尿素の分解：− (15) クエン酸塩利用（christensen）：− (16) ＯＦ反応：− (17) 酸素に対する態度：好気性 (18) ブドウ糖の分解：− (19) エスクリンの分解：＋ (20) 硝酸塩還元：± (21) マッコンキー生育：− (22) 澱粉の分解：＋ (23) ゼラチン：＋ (24) ツイン80：− (25) DNase：＋ (26) フェニルアラニン：− (27) エッグヨーク：− (28) カゼイン：＋（但し18日） (29) 生育温度（℃）：10〜41（最適32〜36） (30) 生育pH：7.2〜11.5（最適8.0〜9.0） (31) 食塩生育（％）：０〜１ (32) 栄養要求：ビオチン ± ナイアシン − サイアミン − 葉酸 − トリプトファン − (33) 糖から酸の産生（フェノールレッド半流動培地−2
1日）：マンニット＋サッカロース − キシロース − ソルビット − サリシン＋アラビノース − グリセリン − ダルシット − グルコース − マルトース − マンノース − ラクトース −

【０００９】以上の菌学的性質について、 Bergey's Mannual of Determinative Bacteriolog
y、vol. 2（1986）, Williams & Wilkins U.S.A、 N. R. Smith, R. E. Gordon, F. E. Clark（1952）
Aerobic Sporeforming Bacteria. Agr. Monogragh、 R. E. Gordon, W. C. Haynes, C. H. Pang.（197
3）The Genus Bacillus. Agr. Handbook No.427 United
states department of Agriculture. WashingtonD. C. 等を参照して同定した。本菌は２％食塩に生育せず、そ
の他の性状においても極めてBacillus brevisに類似す
るが、澱粉を分解し、チロシンを分解しないことから当
該菌と同定できなかった。もちろん糖の資化性等からBa
cillus alcalophilus, Bacillus firmus, Bacillus len
tus, Bacillus circulans等に相当しないことより、本
菌をバチルス・エスピーＹＴ−１と命名した。

【００１０】本菌の生産するCGTaseの酵素的性質の概要
を以下に示す。 (a) 作用及び基質特異性：澱粉を分解してα−、β−及
びγ−サイクロデキストリン合成する。これらサイクロ
デキストリンの生成比は、pH７〜８において、通常、20
〜30：60〜70：10〜15の割合で生成するが、pH９以上に
おいては、α−サイクロデキストリンの生成が抑制さ
れ、β−サイクロデキストリンとγ−サイクロデキスト
リンを主成分として生産し、その生成比は、通常、０〜
３：80〜85：10〜20である。

【００１１】(b) 作用pH及び最適pH：作用pHが４〜12で
あり、１％可溶性澱粉、10mM酢酸緩衝液又はリン酸緩衝
液の下で、40℃で30分測定した場合の最適pHは６〜７で
あり、かつpH５〜10において、最高活性の90％以上の活
性を示す（図１に示す。）。

【００１２】(c) 作用温度及び最適温度：作用温度の上
限が80℃であり、かつ１％可溶性澱粉、10ｍＭリン酸緩
衝液（pH10）下で10分間反応させたときの最適温度は65
℃にある（図２に示す。）。

【００１３】(d) pH安定性：10mM酢酸緩衝液又はリン酸
緩衝液の下、25℃で３時間処理したとき、pH５〜10にお
いて安定である（図３に示す。）。

【００１４】(e) 熱安定性：10mMリン酸緩衝液（pH10）
の下で10分間加熱する場合、50℃まで安定であるが、60
℃で80％失活する。５mMのカルジウムイオンの存在下で
は60℃で10分間加熱しても90％以上残存する（図４に示
す。）。

【００１５】(f) 分子量：アクリルアミド電気泳動法に
より求めた分子量が43,000である。

【００１６】(g) 安定化：Ca²⁺の存在下で熱安定化され
る。

【００１７】(h) 阻害剤：Hg²⁺、Ag⁺、Cu²⁺、Ni²⁺、Fe
²⁺等の存在下により活性が阻害される。

【００１８】(i) 精製法：培養上澄から、60％硫安沈
殿、DEAE−セファロースカラムクロマトグラフィーとセ
ファデックスゲル濾過クロマトグラフィーにより、電気
泳動的に均一まで精製することができる。

【００１９】(j) 活性測定法：２％可溶性澱粉を含む0.
1Ｍリン酸緩衝液（pH11.0）0.2mlに、適量の酵素液を加
え、全量を水で0.4mlとし、50℃で10分間反応させた。
反応後、ヨウ素−ヨウ化カリウム−HCl溶液［（I₂ 0.00
5g ; KI 0.05g ; 0.1Ｍ HCl 10ml）に水を加えて、全量
100mlとしたもの］を２ml加え、室温で15分間放置後、6
60nmで比色する。この条件で、１分間に青色の１％を減
少させる酵素量を１単位とする。

【００２０】これまで、サイクロデキストリンを生成す
る多くの微生物が発見されてきた。生成されるサイクロ
デキストリンの種類は、微生物の種類により異なり、例
えば、バチルス・マセランス（Bacillus macerams）の
酵素は比較的α−サイクロデキストリンを多く生産する
（α：β：γ＝13.3：2.3：１）。そして、ある種の細
菌、例えば、バチルス・メガテリウム（Bacillus megat
erium）は比較的β−サイクロデキストリンを多く生産
する（α：β：γ＝1.0：7.0：1.0）。又、好アルカリ
性細菌が生産する、例えば、バチルス No.38-2株のCGTa
seは、最適pHが5.5とpH8.5にあり、β−サイクロデキス
トリンを生産する〔発酵と工業 37(2) 150-161 (197
9)〕。

【００２１】然るに、本発明において例示菌として使用
するバチルス・エスピーＹＴ−１株の生産するCGTase
は、pH５〜10の広いpH域で安定であるが、最適pHが６〜
７にあり、pH６〜８で反応したとき、通常、α−サイク
ロデキストリンを20〜30％、β−サイクロデキストリン
を60〜70％、そして、γ−サイクロデキストリンを10〜
15％の割合で生成する。一方、pH９以上で反応したとき
は、α−サイクロデキストリンの生成が抑制され、空洞
の大きいβ−サイクロデキストリンとγ−サイクロデキ
ストリンが主成分として生産される。その割合は、α−
サイクロデキストリンが０〜３％、β-サイクロデキス
トリンが80〜85％そして、γ−サイクロデキストリンが
10〜20％である（表１を参照）。しかし、最高収量は、
ほぼ同じ50〜60％である。

【００２２】本菌を培養して本発明のCGTaseを生産する
には、窒素源として、大豆粕、コーン・スティープ・リ
カー、肉エキス、ペプトン、ミルクカゼイン、酵母エキ
スなどの有機窒素源が使用される。中でも、大豆タンパ
ク、大豆粕（脱脂大豆）、コーン・ルティーブ・リカー
などは良好な窒素源である。この他、必要に応じ、硫酸
アンモニウム、塩化アンモニウム、尿素、硝酸アンモニ
ウムなどの無機窒素源が使用される。炭素源としては、
通常、澱粉又は液化澱粉、可溶性澱粉、デキストリンな
どの澱粉派生物が使用される。

【００２３】以上の窒素源と炭素源の他に、リン酸塩、
マグネシウム塩、ナトリウム塩、カリウム塩などが補足
原料として使用される。特に、リン酸塩、マグネシウム
イオン、マンガンイオンなどの添加は効果があり、リン
酸塩として、例えば、K₂HPO₄は0.05〜0.3％、マグネシ
ウム塩として、例えば、MgSO₄・7H₂Oは0.01〜0.3％、カ
ルシウム塩として、例えば、CaCl₂は0.01〜0.1％程度添
加される。CGTaseは菌体外に生産されるので、培養後、
濾過又は遠心分離により、除菌し、酵素を回収する。

【００２４】CGTaseの高アルカリ性下の洗剤中での耐性
試験は、市販の洗剤、例えば、ライオン社製ママローヤ
ル（商品名：界面活性剤を30％含有）を使用し、界面活
性剤として例えば450ppmを含むpH10又はpH11の溶液中
で、40℃又は50℃で試験した。以下、実施例により本発
明の内容を更に具体的に説明するが、本発明の範囲は、
これら実施例に限定されるものでない。

【００２５】

【実施例】

実施例１コーン・スティープ・リカー２％（固形分として）、K
₂HPO₄ 0.2％、MgSO₄・7H₂O 0.2％、CaCl₂ １×10^-3Ｍか
らなる培地200mlを１リットル容三角フラスコに入れ、1
21℃で15分殺菌後、バチルス・エスピーＹＴ−１株（FE
RM P-13877）を接種し、30℃で225回転／分で３日間振
盪培養した。培養後、遠心分離して得た上澄液のCGTase
活性は、184単位／ml培地であった。

【００２６】培養上澄に、硫酸アンモニウムを60％飽和
になるように加え、生成した沈殿を回収後、透析して
後、25mMのトリス緩衝液（pH7.0）で緩衝化させたDEAE
−セファロース CL−68カラムに供給し、KCl濃度を０〜
１Ｍまでリニヤーに変えて溶出した。CGTase区分を回収
し、濃縮、透析後、次いで、セファデックスG−150カラ
ムでゲル濾過を行った。得られた精製酵素は2960単位／
A₂₈₀であり、電気泳動的に均一であった。

【００２７】実施例２実施例２と同様にし、培養して得られた上澄液200mlに
硫安を60％飽和になるよう加えて沈殿物を得、水で透析
した酵素液を用い、澱粉からのサイクロデキストリンの
生産試験を行った。

【００２８】ポテト澱粉100mg、0.4 Mグリシン−水酸化
ナトリウム緩衝液（pH７〜10）1.3ml、0.1M CaCl₂ 0.5m
l、CGTase 1.25単位、全量を水で10mlとし、50℃で反応
を行った。経時的に一定量を採り、高速液体クロマトグ
ラフィーにより各サイクロデキストリン量を測定した。
得られた結果を表１に示す。

【００２９】

【表１】

【００３０】尚、表中でCDはサイクロデキストリンを表
す。表１から明らかなように、本酵素は、試験したpH７
〜10の広いpH域でサイクロデキストリンを効率的に生成
し、特に、pH９以上の反応ではα−CDの生成が抑制さ
れ、β−サイクロデキストリンとγ−サイクロデキスト
リンが主体に生産された。

【００３１】実施例３本実施例においては、本発明のCGTaseの洗剤溶液中での
安定性について試験した。

【００３２】0.4M グリシン−水酸化ナトリウム緩衝液
1.0ml、実施例１及び２に従い調製したCGTase 0.3ml（3
81単位）、使用規格２倍濃度の液体洗剤〔ライオン
（株）製：商品名ママローヤル、界面活性剤（α−オレ
フィンスルホン酸ナトリウム、脂肪酸アルカノールアミ
ド、ポリオキシエチレンアルキルエーテルなど）30％含
有〕３mlを加え、水で全量6.0ml（界面活性剤濃度450pp
m）とし、pH5.0、7.0と10に調製し、35℃で放置した。
経時的に一定量を採取し、残存活性を測定した。得られ
た結果を図５に示す。

【００３３】図中で−○−はpH10の場合を示し、−□−
はpH５の場合を示し、そして−●−はpH７の場合を示し
ている。

【００３４】図から明らかなように、本酵素は、界面活
性剤に対して安定であり、接触140時間後も50％以上の
活性を保持した。そして、本酵素はpH５及びpH７よりも
pH10においてより安定であった。

【００３５】実施例４本実施例においては、食器に付着した澱粉質の汚れを想
定して、洗剤に含まれるCGTaseによる澱粉質汚れの除去
試験を行った。

【００３６】ガラス版に糊化もち米澱粉（約30mg）を塗
布し、乾燥したものを、種々の濃度のCGTaseを含む、実
施例４で使用した液体洗剤に入れ、pH10とpH11、及び40
℃と50℃で浸漬した。15分後、各上澄を採取し、pHを5.
0に調製して後、100倍に希釈した市販（ノボ社製造販
売）のバチルス属α−アミラーゼ（ターマミル６Ｌ）
とアスペルギルス・ニガーのグルコアミラーゼ各0.05ml
を加え、60℃で、15分反応した。そして、生成した還元
糖をソモギー・ネルソン法により定量した。得られた結
果を図６及び図７に示す。

【００３７】図６はpH10で処理した場合を示し、図７は
pH11で処理した場合を示している。横軸の酵素量は本発
明のCGTaseの存在量（×25単位）を示し、縦軸は澱粉が
分解されて可溶化された量の相対値（％）を示してい
る。図中で−●−は50℃の場合を、−○−は40℃の場合
を示している。いずれの場合も、洗剤に含まれるCGTase
により澱粉が分解可溶化（デキストリン化）された。

【００３８】

【発明の効果】本発明はバチルス属細菌が生産し、pH９
以上において、β−サイクロデキストリンとγ−サイク
ロデキストリンを生成するCGTaseに関する。該酵素はア
ルカリで安定であり洗浄剤成分として有効に利用され
る。

【図面の簡単な説明】

【図１】本発明のCGTaseの最適pHを示す。図中で−●−
酢酸緩衝液を使用した場合を示し、−○−はリン酸緩衝
液（KH₂PO₄−Na₂HPO₄又はNaOH−Na₂HPO₄）を使用した場
合を示す。

【図２】本発明のCGTaseの最適温度を示す。

【図３】本発明のCGTaseのpH安定性を示す。図中で−●
−は酢酸緩衝液、−○−はリン酸緩衝液を使用した場合
を示す。

【図４】本発明のCGTaseの温度安定性を示している。図
中で−○−はカルシウムイオンが存在しない場合を示
し、−●−は５mMのCaCl₂が存在する場合を示す。

【図５】本発明のCGTaseの洗剤中でのpH安定性を示す。
図中で−○−はpH10の場合を示し、−□−はpH５の場合
を示し、そして−●−はpH７の場合を示す。

【図６】洗剤に添加された本発明のCGTaseによる澱粉質
汚れのpH10で処理した場合の分解可溶化作用を示す。図
中で−●−は50℃の場合を示し、−○−は40℃の場合を
示す。

【図７】洗剤に添加された本発明のCGTaseによる澱粉質
汚れのpH11で処理した場合の分解可溶化作用を示す。図
中で−●−は50℃の場合を示し、−○−は40℃の場合を
示す。

Claims

【特許請求の範囲】

【請求項１】少なくとも以下の理化学的性質をもつサイ
クロデキストリングルカノトランスフェラーゼ。 a) 作用：澱粉を分解してα−、β−及びγ−サイクロ
デキストリンを合成する。 b) 至適pH：pH６付近（１％可溶性澱粉、10ｍＭ酢酸緩
衝液又はリン酸緩衝液、40℃，30分） c) 至適温度：65℃付近［１％可溶性澱粉、10ｍＭリン
酸緩衝液（pH10）、10分］ d) pH安定性：pH５〜10（10ｍＭ酢酸緩衝液又はリン酸
緩衝液、25℃，３時間） e) 分子量：約43,000（アクリルアミド電気泳動法） f) 阻害剤：Hg²⁺、Ag⁺、Cu²⁺、Ni²⁺、Fe²⁺により阻害さ
れる。
【請求項２】バチルス属に属し、少なくとも以下に記載
の酵素化学的性質を有するサイクロデキストリングル
カノトランスフェラーゼ生産能を有する微生物を培養
し、培養物中にサイクロデキストリングルカノトラン
スフェラーゼを産生せしめ、これを採取することを特徴
とするサイクロデキストリングルカノトランスフェラ
ーゼの製造法。 a) 作用：澱粉を分解してα−、β−及びγ−サイクロ
デキストリンを合成する。 b) 至適pH：pH６付近（１％可溶性澱粉、10ｍＭ酢酸緩
衝液又はリン酸緩衝液、40℃，30分） c) 作用pH：pH４〜12 c) 至適温度：65℃付近［１％可溶性澱粉、10ｍＭリン
酸緩衝液（pH10）、10分］ d) pH安定性：pH５〜10（10ｍＭ酢酸緩衝液又はリン酸
緩衝液、25℃，３時間） e) 分子量：約43,000（アクリルアミド電気泳動法） f) 阻害剤：Hg²⁺、Ag⁺、Cu²⁺、Ni²⁺、Fe²⁺により阻害さ
れる。
【請求項３】微生物がバチルス・エスピーＹＴ−１（FE
RM P-13877）である請求項２記載のサイクロデキストリ
ングルカノトランスフェラーゼの製造法。