JPH07108239B2 - ピルビン酸の定量方法及び該方法を利用する生体成分の定量方法 - Google Patents
ピルビン酸の定量方法及び該方法を利用する生体成分の定量方法Info
- Publication number
- JPH07108239B2 JPH07108239B2 JP3256712A JP25671291A JPH07108239B2 JP H07108239 B2 JPH07108239 B2 JP H07108239B2 JP 3256712 A JP3256712 A JP 3256712A JP 25671291 A JP25671291 A JP 25671291A JP H07108239 B2 JPH07108239 B2 JP H07108239B2
- Authority
- JP
- Japan
- Prior art keywords
- pyruvic acid
- quantifying
- reaction
- produced
- absorbance
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Expired - Fee Related
Links
- LCTONWCANYUPML-UHFFFAOYSA-N Pyruvic acid Chemical compound CC(=O)C(O)=O LCTONWCANYUPML-UHFFFAOYSA-N 0.000 title claims description 46
- 229940107700 pyruvic acid Drugs 0.000 title claims description 23
- 238000000034 method Methods 0.000 title claims description 21
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 claims description 18
- 229930027945 nicotinamide-adenine dinucleotide Natural products 0.000 claims description 17
- BOPGDPNILDQYTO-NNYOXOHSSA-N nicotinamide-adenine dinucleotide Chemical compound C1=CCC(C(=O)N)=CN1[C@H]1[C@H](O)[C@H](O)[C@@H](COP(O)(=O)OP(O)(=O)OC[C@@H]2[C@H]([C@@H](O)[C@@H](O2)N2C3=NC=NC(N)=C3N=C2)O)O1 BOPGDPNILDQYTO-NNYOXOHSSA-N 0.000 claims description 14
- BAWFJGJZGIEFAR-NNYOXOHSSA-N NAD zwitterion Chemical compound NC(=O)C1=CC=C[N+]([C@H]2[C@@H]([C@H](O)[C@@H](COP([O-])(=O)OP(O)(=O)OC[C@@H]3[C@H]([C@@H](O)[C@@H](O3)N3C4=NC=NC(N)=C4N=C3)O)O2)O)=C1 BAWFJGJZGIEFAR-NNYOXOHSSA-N 0.000 claims description 11
- 102000012751 Pyruvate Dehydrogenase Complex Human genes 0.000 claims description 11
- 108010090051 Pyruvate Dehydrogenase Complex Proteins 0.000 claims description 11
- JLVVSXFLKOJNIY-UHFFFAOYSA-N Magnesium ion Chemical compound [Mg+2] JLVVSXFLKOJNIY-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 8
- 229910001424 calcium ion Inorganic materials 0.000 claims description 8
- 229910001425 magnesium ion Inorganic materials 0.000 claims description 8
- 239000000126 substance Substances 0.000 claims description 8
- YXVCLPJQTZXJLH-UHFFFAOYSA-N thiamine(1+) diphosphate chloride Chemical compound [Cl-].CC1=C(CCOP(O)(=O)OP(O)(O)=O)SC=[N+]1CC1=CN=C(C)N=C1N YXVCLPJQTZXJLH-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 8
- 229950006238 nadide Drugs 0.000 claims description 7
- 229960002363 thiamine pyrophosphate Drugs 0.000 claims description 7
- 235000008170 thiamine pyrophosphate Nutrition 0.000 claims description 7
- 239000011678 thiamine pyrophosphate Substances 0.000 claims description 7
- OYPRJOBELJOOCE-UHFFFAOYSA-N Calcium Chemical compound [Ca] OYPRJOBELJOOCE-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 5
- 239000011575 calcium Substances 0.000 claims description 5
- 239000007795 chemical reaction product Substances 0.000 claims description 3
- 239000002253 acid Substances 0.000 claims description 2
- 239000005515 coenzyme Substances 0.000 claims 2
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 27
- 238000002835 absorbance Methods 0.000 description 15
- XSQUKJJJFZCRTK-UHFFFAOYSA-N Urea Chemical compound NC(N)=O XSQUKJJJFZCRTK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 14
- CVSVTCORWBXHQV-UHFFFAOYSA-N creatine Chemical compound NC(=[NH2+])N(C)CC([O-])=O CVSVTCORWBXHQV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 12
- MHAJPDPJQMAIIY-UHFFFAOYSA-N Hydrogen peroxide Chemical compound OO MHAJPDPJQMAIIY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 10
- 239000004202 carbamide Substances 0.000 description 8
- DTBNBXWJWCWCIK-UHFFFAOYSA-N phosphoenolpyruvic acid Chemical compound OC(=O)C(=C)OP(O)(O)=O DTBNBXWJWCWCIK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 8
- 239000007992 BES buffer Substances 0.000 description 6
- TWRXJAOTZQYOKJ-UHFFFAOYSA-L Magnesium chloride Chemical compound [Mg+2].[Cl-].[Cl-] TWRXJAOTZQYOKJ-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 6
- 229960003624 creatine Drugs 0.000 description 6
- 239000006046 creatine Substances 0.000 description 6
- 238000011002 quantification Methods 0.000 description 6
- 238000011088 calibration curve Methods 0.000 description 5
- AZQWKYJCGOJGHM-UHFFFAOYSA-N 1,4-benzoquinone Chemical compound O=C1C=CC(=O)C=C1 AZQWKYJCGOJGHM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- XTWYTFMLZFPYCI-KQYNXXCUSA-N 5'-adenylphosphoric acid Chemical compound C1=NC=2C(N)=NC=NC=2N1[C@@H]1O[C@H](COP(O)(=O)OP(O)(O)=O)[C@@H](O)[C@H]1O XTWYTFMLZFPYCI-KQYNXXCUSA-N 0.000 description 3
- XTWYTFMLZFPYCI-UHFFFAOYSA-N Adenosine diphosphate Natural products C1=NC=2C(N)=NC=NC=2N1C1OC(COP(O)(=O)OP(O)(O)=O)C(O)C1O XTWYTFMLZFPYCI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- BHPQYMZQTOCNFJ-UHFFFAOYSA-N Calcium cation Chemical compound [Ca+2] BHPQYMZQTOCNFJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- UXVMQQNJUSDDNG-UHFFFAOYSA-L Calcium chloride Chemical compound [Cl-].[Cl-].[Ca+2] UXVMQQNJUSDDNG-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 3
- 102000004420 Creatine Kinase Human genes 0.000 description 3
- 108010042126 Creatine kinase Proteins 0.000 description 3
- 108020005115 Pyruvate Kinase Proteins 0.000 description 3
- 102000013009 Pyruvate Kinase Human genes 0.000 description 3
- 239000007864 aqueous solution Substances 0.000 description 3
- 239000007853 buffer solution Substances 0.000 description 3
- 239000001110 calcium chloride Substances 0.000 description 3
- 229910001628 calcium chloride Inorganic materials 0.000 description 3
- 238000001727 in vivo Methods 0.000 description 3
- UEGPKNKPLBYCNK-UHFFFAOYSA-L magnesium acetate Chemical compound [Mg+2].CC([O-])=O.CC([O-])=O UEGPKNKPLBYCNK-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 3
- 239000011654 magnesium acetate Substances 0.000 description 3
- 235000011285 magnesium acetate Nutrition 0.000 description 3
- 229940069446 magnesium acetate Drugs 0.000 description 3
- 229910001629 magnesium chloride Inorganic materials 0.000 description 3
- 235000011147 magnesium chloride Nutrition 0.000 description 3
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 3
- AJTVSSFTXWNIRG-UHFFFAOYSA-N 2-[bis(2-hydroxyethyl)amino]ethanesulfonic acid Chemical compound OCC[NH+](CCO)CCS([O-])(=O)=O AJTVSSFTXWNIRG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- CIWBSHSKHKDKBQ-JLAZNSOCSA-N Ascorbic acid Chemical compound OC[C@H](O)[C@H]1OC(=O)C(O)=C1O CIWBSHSKHKDKBQ-JLAZNSOCSA-N 0.000 description 2
- BPYKTIZUTYGOLE-IFADSCNNSA-N Bilirubin Chemical compound N1C(=O)C(C)=C(C=C)\C1=C\C1=C(C)C(CCC(O)=O)=C(CC2=C(C(C)=C(\C=C/3C(=C(C=C)C(=O)N\3)C)N2)CCC(O)=O)N1 BPYKTIZUTYGOLE-IFADSCNNSA-N 0.000 description 2
- 101100459438 Caenorhabditis elegans nac-1 gene Proteins 0.000 description 2
- RGJOEKWQDUBAIZ-IBOSZNHHSA-N CoASH Chemical compound O[C@@H]1[C@H](OP(O)(O)=O)[C@@H](COP(O)(=O)OP(O)(=O)OCC(C)(C)[C@@H](O)C(=O)NCCC(=O)NCCS)O[C@H]1N1C2=NC=NC(N)=C2N=C1 RGJOEKWQDUBAIZ-IBOSZNHHSA-N 0.000 description 2
- 102000003855 L-lactate dehydrogenase Human genes 0.000 description 2
- 108700023483 L-lactate dehydrogenases Proteins 0.000 description 2
- 102000004317 Lyases Human genes 0.000 description 2
- 108090000856 Lyases Proteins 0.000 description 2
- CSNNHWWHGAXBCP-UHFFFAOYSA-L Magnesium sulfate Chemical compound [Mg+2].[O-][S+2]([O-])([O-])[O-] CSNNHWWHGAXBCP-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 2
- 102000003992 Peroxidases Human genes 0.000 description 2
- 108010042687 Pyruvate Oxidase Proteins 0.000 description 2
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 2
- 239000003795 chemical substances by application Substances 0.000 description 2
- RGJOEKWQDUBAIZ-UHFFFAOYSA-N coenzime A Natural products OC1C(OP(O)(O)=O)C(COP(O)(=O)OP(O)(=O)OCC(C)(C)C(O)C(=O)NCCC(=O)NCCS)OC1N1C2=NC=NC(N)=C2N=C1 RGJOEKWQDUBAIZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 239000005516 coenzyme A Substances 0.000 description 2
- 229940093530 coenzyme a Drugs 0.000 description 2
- DDRJAANPRJIHGJ-UHFFFAOYSA-N creatinine Chemical compound CN1CC(=O)NC1=N DDRJAANPRJIHGJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- KDTSHFARGAKYJN-UHFFFAOYSA-N dephosphocoenzyme A Natural products OC1C(O)C(COP(O)(=O)OP(O)(=O)OCC(C)(C)C(O)C(=O)NCCC(=O)NCCS)OC1N1C2=NC=NC(N)=C2N=C1 KDTSHFARGAKYJN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 238000005259 measurement Methods 0.000 description 2
- 230000037353 metabolic pathway Effects 0.000 description 2
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 2
- 108040007629 peroxidase activity proteins Proteins 0.000 description 2
- 101150029019 ATP6 gene Proteins 0.000 description 1
- 101100189913 Caenorhabditis elegans pept-1 gene Proteins 0.000 description 1
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 1
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 1
- WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N Glucose Natural products OC[C@H]1OC(O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N 0.000 description 1
- 102000004316 Oxidoreductases Human genes 0.000 description 1
- 108090000854 Oxidoreductases Proteins 0.000 description 1
- LCTONWCANYUPML-UHFFFAOYSA-M Pyruvate Chemical compound CC(=O)C([O-])=O LCTONWCANYUPML-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 101710204616 Pyruvate kinase 2 Proteins 0.000 description 1
- JZRWCGZRTZMZEH-UHFFFAOYSA-N Thiamine Natural products CC1=C(CCO)SC=[N+]1CC1=CN=C(C)N=C1N JZRWCGZRTZMZEH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- PNNCWTXUWKENPE-UHFFFAOYSA-N [N].NC(N)=O Chemical compound [N].NC(N)=O PNNCWTXUWKENPE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000010521 absorption reaction Methods 0.000 description 1
- 230000004913 activation Effects 0.000 description 1
- 235000010323 ascorbic acid Nutrition 0.000 description 1
- 229960005070 ascorbic acid Drugs 0.000 description 1
- 239000011668 ascorbic acid Substances 0.000 description 1
- QVGXLLKOCUKJST-UHFFFAOYSA-N atomic oxygen Chemical compound [O] QVGXLLKOCUKJST-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- WQZGKKKJIJFFOK-VFUOTHLCSA-N beta-D-glucose Chemical compound OC[C@H]1O[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-VFUOTHLCSA-N 0.000 description 1
- 239000013060 biological fluid Substances 0.000 description 1
- 239000008280 blood Substances 0.000 description 1
- 210000004369 blood Anatomy 0.000 description 1
- 229960005069 calcium Drugs 0.000 description 1
- VSGNNIFQASZAOI-UHFFFAOYSA-L calcium acetate Chemical compound [Ca+2].CC([O-])=O.CC([O-])=O VSGNNIFQASZAOI-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 1
- 239000001639 calcium acetate Substances 0.000 description 1
- 235000011092 calcium acetate Nutrition 0.000 description 1
- 229960005147 calcium acetate Drugs 0.000 description 1
- 239000003638 chemical reducing agent Substances 0.000 description 1
- 229940109239 creatinine Drugs 0.000 description 1
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 1
- 239000008103 glucose Substances 0.000 description 1
- 229960001031 glucose Drugs 0.000 description 1
- 229910052943 magnesium sulfate Inorganic materials 0.000 description 1
- 235000019341 magnesium sulphate Nutrition 0.000 description 1
- 230000007935 neutral effect Effects 0.000 description 1
- 239000001301 oxygen Substances 0.000 description 1
- 229910052760 oxygen Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000008363 phosphate buffer Substances 0.000 description 1
- 229930029653 phosphoenolpyruvate Natural products 0.000 description 1
- 235000015497 potassium bicarbonate Nutrition 0.000 description 1
- 229910000028 potassium bicarbonate Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000011736 potassium bicarbonate Substances 0.000 description 1
- TYJJADVDDVDEDZ-UHFFFAOYSA-M potassium hydrogencarbonate Chemical compound [K+].OC([O-])=O TYJJADVDDVDEDZ-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 229940086066 potassium hydrogencarbonate Drugs 0.000 description 1
- 229940076788 pyruvate Drugs 0.000 description 1
- 238000006479 redox reaction Methods 0.000 description 1
- 230000006641 stabilisation Effects 0.000 description 1
- 238000011105 stabilization Methods 0.000 description 1
- 239000013589 supplement Substances 0.000 description 1
- 229960003495 thiamine Drugs 0.000 description 1
- 235000019157 thiamine Nutrition 0.000 description 1
- 239000011721 thiamine Substances 0.000 description 1
- KYMBYSLLVAOCFI-UHFFFAOYSA-N thiamine Chemical compound CC1=C(CCO)SCN1CC1=CN=C(C)N=C1N KYMBYSLLVAOCFI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229940045136 urea Drugs 0.000 description 1
- 210000002700 urine Anatomy 0.000 description 1
Landscapes
- Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
Description
【０００１】
【産業上の利用分野】本発明はピルビン酸の定量方法及
び該方法を利用する生体成分の定量方法に関する。
び該方法を利用する生体成分の定量方法に関する。
【０００２】
【従来の技術】臨床化学の分野では、生体成分を酸化酵
素の存在下で酸化し、過酸化水素を生成させ、さらに、
生じた過酸化水素をペルオキシダーゼと発色剤によりキ
ノン型色素にして比色定量する方法と脱水素酵素による
酸化型ニコチンアミドアデニンジヌクレオチド（以下Ｎ
ＡＤという）と還元型ニコチンアミドアデニンジヌクレ
オチド（以下ＮＡＤＨという）間の酸化還元反応を利用
してＮＡＤＨの波長３４０nmにおける吸光度の増加又は
減少を測定することにより生体成分を定量する方法が通
常用いられている。
素の存在下で酸化し、過酸化水素を生成させ、さらに、
生じた過酸化水素をペルオキシダーゼと発色剤によりキ
ノン型色素にして比色定量する方法と脱水素酵素による
酸化型ニコチンアミドアデニンジヌクレオチド（以下Ｎ
ＡＤという）と還元型ニコチンアミドアデニンジヌクレ
オチド（以下ＮＡＤＨという）間の酸化還元反応を利用
してＮＡＤＨの波長３４０nmにおける吸光度の増加又は
減少を測定することにより生体成分を定量する方法が通
常用いられている。
【０００３】生体中に存在する、又は生体反応の過程で
生成するピルビン酸を測定する場合、ピルビン酸酸化酵
素を用いて過酸化水素を生成させ、さらに、生じた過酸
化水素をペルオキシダーゼと発色剤によりキノン型色素
にして比色定量する方法が知られている。また、生体中
に存在する、又は生体反応の過程で生成するピルビン酸
に乳酸脱水素酵素とＮＡＤＨを反応させ、ＮＡＤＨの減
少を波長３４０nmで測定する方法も知られている。
生成するピルビン酸を測定する場合、ピルビン酸酸化酵
素を用いて過酸化水素を生成させ、さらに、生じた過酸
化水素をペルオキシダーゼと発色剤によりキノン型色素
にして比色定量する方法が知られている。また、生体中
に存在する、又は生体反応の過程で生成するピルビン酸
に乳酸脱水素酵素とＮＡＤＨを反応させ、ＮＡＤＨの減
少を波長３４０nmで測定する方法も知られている。
【０００４】
【発明が解決しようとする課題】しかしながら、ピルビ
ン酸酸化酵素によって生成する過酸化水素を測定する方
法は、生体成分中の還元性物質、例えば、アスコルビン
酸、ビリルビン等によって負誤差を受けること、また、
ピルビン酸の濃度が高い場合には、反応試液中の溶存酸
素が不足して測定ができないといった問題がある。
ン酸酸化酵素によって生成する過酸化水素を測定する方
法は、生体成分中の還元性物質、例えば、アスコルビン
酸、ビリルビン等によって負誤差を受けること、また、
ピルビン酸の濃度が高い場合には、反応試液中の溶存酸
素が不足して測定ができないといった問題がある。
【０００５】一方、乳酸脱水素酵素を用いてＮＡＤＨの
減少を波長３４０nmで測定する方法は、ＮＡＤＨの濃度
に依存して測定範囲が広がるが、ＮＡＤＨ濃度を上げる
と初期吸光度も上昇し、分光光度計の性能上、吸光度の
測定が不可能になるという問題点を有している。
減少を波長３４０nmで測定する方法は、ＮＡＤＨの濃度
に依存して測定範囲が広がるが、ＮＡＤＨ濃度を上げる
と初期吸光度も上昇し、分光光度計の性能上、吸光度の
測定が不可能になるという問題点を有している。
【０００６】
【課題を解決するための手段】本発明者らは、かかる実
情に鑑み、生体中に存在する、又は生体反応過程で生成
するピルビン酸の定量に関し鋭意検討した結果、検体に
特定量のＮＡＤ、ピルビン酸デヒドロゲナーゼ複合体、
補酵素Ａ、チアミンピロリン酸及びカルシウム又はマグ
ネシウムイオンを反応させ、生成するＮＡＤＨを測定す
れば、前記課題を解決できることを見出し、本発明を完
成するに至った。
情に鑑み、生体中に存在する、又は生体反応過程で生成
するピルビン酸の定量に関し鋭意検討した結果、検体に
特定量のＮＡＤ、ピルビン酸デヒドロゲナーゼ複合体、
補酵素Ａ、チアミンピロリン酸及びカルシウム又はマグ
ネシウムイオンを反応させ、生成するＮＡＤＨを測定す
れば、前記課題を解決できることを見出し、本発明を完
成するに至った。
【０００７】すなわち、本発明は検体と酸化型ニコチン
アミドアデニンジヌクレオチド０．１〜１０ｍＭ、ピル
ビン酸デヒドロゲナーゼ複合体０．０５〜２０Ｕ／ｍ
ｌ、補酵素Ａ０．１〜５ｍＭ、チアミンピリロン酸０．
１〜１０ｍＭ及びカルシウム又はマグネシウムイオン
０．０１〜２０ｍＭを含有する緩衝液とを反応させ、生
成する還元型ニコチンアミドアデニンジヌクレオチド量
を測定することを特徴とするピルビン酸の定量方法を提
供するものである。
アミドアデニンジヌクレオチド０．１〜１０ｍＭ、ピル
ビン酸デヒドロゲナーゼ複合体０．０５〜２０Ｕ／ｍ
ｌ、補酵素Ａ０．１〜５ｍＭ、チアミンピリロン酸０．
１〜１０ｍＭ及びカルシウム又はマグネシウムイオン
０．０１〜２０ｍＭを含有する緩衝液とを反応させ、生
成する還元型ニコチンアミドアデニンジヌクレオチド量
を測定することを特徴とするピルビン酸の定量方法を提
供するものである。
【０００８】本発明は、さらに、検体と被検成分よりピ
ルビン酸を生成させるための試薬、酸化型ニコチンアミ
ドジヌクレオチド０．１〜１０ｍＭ、ピルビン酸デヒド
ロゲナーゼ複合体０．０５〜２０Ｕ／ｍｌ、補酵素Ａ
（以下ＣｏＡという）０．１〜５ｍＭ、チアミンピロリ
ン酸０．１〜１０ｍＭ及びカルシウム又はマグネシウム
イオン０．０１〜２０ｍＭを含有する緩衝液とを反応さ
せ、生成する還元型ニコチンアミドジヌクレオチド量を
測定することを特徴とするピルビン酸を反応生成物とす
る生体成分の定量方法を提供するものである。
ルビン酸を生成させるための試薬、酸化型ニコチンアミ
ドジヌクレオチド０．１〜１０ｍＭ、ピルビン酸デヒド
ロゲナーゼ複合体０．０５〜２０Ｕ／ｍｌ、補酵素Ａ
（以下ＣｏＡという）０．１〜５ｍＭ、チアミンピロリ
ン酸０．１〜１０ｍＭ及びカルシウム又はマグネシウム
イオン０．０１〜２０ｍＭを含有する緩衝液とを反応さ
せ、生成する還元型ニコチンアミドジヌクレオチド量を
測定することを特徴とするピルビン酸を反応生成物とす
る生体成分の定量方法を提供するものである。
【０００９】本発明のピルビン酸の定量方法は、次の反
応式で表わされる。
応式で表わされる。
【００１０】
【化１】
【００１１】上記反応においては、ピルビン酸の濃度に
依存してＮＡＤＨが生成される。そして、ＮＡＤＨは波
長３４０ｎｍに吸収を有するので、該波長における吸光
度を測定することにより目的とするピルビン酸を定量す
ることができる。本発明において検体としては、血液、
血漿、尿等の生体液、ピルビン酸溶液等が挙げられる。
本発明の定量方法を実施するには、検体にＮＡＤ０．１
〜１０ｍＭ、ピルビン酸デヒドロゲナーゼ複合体０．０
５〜２０Ｕ／ｍｌ、及びＣｏＡ０．１〜５ｍＭを含有す
る緩衝液を加え、例えば３７℃付近で２〜２０分間反応
させ、波長３４０ｎｍの吸光度を測定すればよい。な
お、この緩衝液中には、ピルビン酸デヒドロゲナーゼ複
合体の活性化及び安定化の目的で、カルシウムイオンを
０．０１〜２０ｍＭ、またはマグネシウムイオンを０．
０１〜２０ｍＭ及びチアミンピロリン酸０．１〜１０ｍ
Ｍ添加することが必要である。カルシウムイオンまたは
マグネシウムイオンは、併用して使用してもよく、この
場合は、合計量０．０１〜４０ｍＭ添加することが必要
である。カルシウムイオンとしては塩化カルシウム、酢
酸カルシウム等が利用でき、マグネシウムイオンとして
は塩化マグネシウム、硫酸マグネシウム、酢酸マグネシ
ウム等が利用できる。
依存してＮＡＤＨが生成される。そして、ＮＡＤＨは波
長３４０ｎｍに吸収を有するので、該波長における吸光
度を測定することにより目的とするピルビン酸を定量す
ることができる。本発明において検体としては、血液、
血漿、尿等の生体液、ピルビン酸溶液等が挙げられる。
本発明の定量方法を実施するには、検体にＮＡＤ０．１
〜１０ｍＭ、ピルビン酸デヒドロゲナーゼ複合体０．０
５〜２０Ｕ／ｍｌ、及びＣｏＡ０．１〜５ｍＭを含有す
る緩衝液を加え、例えば３７℃付近で２〜２０分間反応
させ、波長３４０ｎｍの吸光度を測定すればよい。な
お、この緩衝液中には、ピルビン酸デヒドロゲナーゼ複
合体の活性化及び安定化の目的で、カルシウムイオンを
０．０１〜２０ｍＭ、またはマグネシウムイオンを０．
０１〜２０ｍＭ及びチアミンピロリン酸０．１〜１０ｍ
Ｍ添加することが必要である。カルシウムイオンまたは
マグネシウムイオンは、併用して使用してもよく、この
場合は、合計量０．０１〜４０ｍＭ添加することが必要
である。カルシウムイオンとしては塩化カルシウム、酢
酸カルシウム等が利用でき、マグネシウムイオンとして
は塩化マグネシウム、硫酸マグネシウム、酢酸マグネシ
ウム等が利用できる。
【００１２】ところでピルビン酸は、生体内物質代謝経
路における中間体として重要であり、生体内ではピルビ
ン酸を生成する数多くの代謝経路が存在する。従って、
ピルビン酸を反応生成物とする生体成分を測定しようと
する場合、当該被検生体成分よりピルビン酸を生成させ
るための既知の試薬と上記反応とを組み合わせれば、目
的とする生体成分を定量することができる。例えば、ピ
ルビン酸キナーゼとアデノシンニリン酸（以下、ＡＤＰ
と称する）とを組合せることによって、ホスホエノール
ピルビン酸（以下、ＰＥＰと称する）の測定が可能であ
る。
路における中間体として重要であり、生体内ではピルビ
ン酸を生成する数多くの代謝経路が存在する。従って、
ピルビン酸を反応生成物とする生体成分を測定しようと
する場合、当該被検生体成分よりピルビン酸を生成させ
るための既知の試薬と上記反応とを組み合わせれば、目
的とする生体成分を定量することができる。例えば、ピ
ルビン酸キナーゼとアデノシンニリン酸（以下、ＡＤＰ
と称する）とを組合せることによって、ホスホエノール
ピルビン酸（以下、ＰＥＰと称する）の測定が可能であ
る。
【００１３】
【化２】
【００１４】さらに、上記反応にさきだちクレアチンキ
ナーゼを使用することにより、クレアチンの測定も可能
である。反応過程を以下に表わす。
ナーゼを使用することにより、クレアチンの測定も可能
である。反応過程を以下に表わす。
【００１５】
【化３】
【００１６】さらに、上記のクレアチンキナーゼの代わ
りに、ウレアアミドリアーゼを用いることにより、尿素
の測定が可能となる。この反応過程を以下に表わす。
りに、ウレアアミドリアーゼを用いることにより、尿素
の測定が可能となる。この反応過程を以下に表わす。
【００１７】
【化４】
【００１８】以上の如く、生体中又は生体内反応の過程
で生成するピルビル酸を、同時に生成するＮＡＤＨの３
４０nmにおける吸光度を測定することにより、定量する
ことができる。さらに生体成分であるＰＥＰ、尿素、ク
レアチン、クレアチニン、グルコース、中性脂肪等を上
記定量法を利用することにより定量することができる。
で生成するピルビル酸を、同時に生成するＮＡＤＨの３
４０nmにおける吸光度を測定することにより、定量する
ことができる。さらに生体成分であるＰＥＰ、尿素、ク
レアチン、クレアチニン、グルコース、中性脂肪等を上
記定量法を利用することにより定量することができる。
【００１９】
【発明の効果】本発明によれば、生体中又は生体内反応
過程で生成するピルビル酸を簡便迅速、かつ精確に定量
することができる。しかも、上記定量方法を利用するこ
とにより他の生体成分を定量することも可能である。
過程で生成するピルビル酸を簡便迅速、かつ精確に定量
することができる。しかも、上記定量方法を利用するこ
とにより他の生体成分を定量することも可能である。
【００２０】
【実施例】以下に実施例により本発明を具体的に説明す
るが、本発明はこれらに限定されるものではない。
るが、本発明はこれらに限定されるものではない。
【００２１】実施例１ ピルビン酸の定量 反応試薬 ５０mM リン酸緩衝液 pH６．５ ０．２mM チアミンピロリン酸 １mM ＮＡＤ １mM 塩化カルシウム ０．２mM ＣｏＡ ０．５Ｕ／ml ピルビン酸デヒドロゲナーゼ複合体 １〜１０mMのピルビン酸水溶液５μｌに上記反応試薬３
００μｌを加え、３７℃で１０分間反応させた後、波長
３４０nmの吸光度を測定した。図１に、この結果得られ
たピルビン酸濃度と吸光度との関係を表わすグラフを示
す。
００μｌを加え、３７℃で１０分間反応させた後、波長
３４０nmの吸光度を測定した。図１に、この結果得られ
たピルビン酸濃度と吸光度との関係を表わすグラフを示
す。
【００２２】実施例２ ＰＥＰの定量 反応試薬１ ５０mM Ｎ，Ｎ−ビス（２−ヒドロキシエチル）−２−アミノエ タンスルホン酸（以下、ＢＥＳという）緩衝液 pH７． １ ０．２mM チアミンピロリン酸 １mM ＮＡＤ １mM 塩化カルシウム ０．２mM ＣｏＡ ０．５Ｕ／ml ピルビン酸デヒドロゲナーゼ複合体 反応試薬２ ５０mM ＢＥＳ緩衝液 pH７．１ ３mM ＡＤＰ １６mM 塩化マグネシウム ６Ｕ／ml ピルビン酸キナーゼ ２〜１０mMのＰＥＰ水溶液５μｌに反応試薬１を３００
μｌ、反応試薬２を１００μｌ加え、３７℃で５分間反
応させた後、波長３４０nmの吸光度を測定した。図２
に、この結果得られたＰＥＰ濃度と吸光度との関係を表
わすグラフを示す。
μｌ、反応試薬２を１００μｌ加え、３７℃で５分間反
応させた後、波長３４０nmの吸光度を測定した。図２
に、この結果得られたＰＥＰ濃度と吸光度との関係を表
わすグラフを示す。
【００２３】実施例３ クレアチンの定量 反応試薬１ ５０mM ＢＥＳ緩衝液 pH７．４ ０．３mM チアミンピロリン酸 １．５mM ＮＡＤ １０mM 酢酸マグネシウム １．５mM ＣｏＡ ０．７５Ｕ／ml ピルビン酸デヒドロゲナーゼ複合体 反応試薬２ ５０mM ＢＥＳ緩衝液 pH７．１ ４．５mM ＡＴＰ ４．５mM ＰＥＰ １０mM 酢酸マグネシウム ３Ｕ／ml ピルビン酸キナーゼ ２０Ｕ／ml クレアチンキナーゼ １０〜１５mMのクレアチン水溶液５μｌに反応試薬１を
２００μｌ、反応試薬２を２００μｌ加え、３７℃で５
分間反応させた後、波長３４０nmの吸光度を測定した。
図３に、この結果得られたクレアチン濃度と吸光度との
関係を表わすグラフを示す。
２００μｌ、反応試薬２を２００μｌ加え、３７℃で５
分間反応させた後、波長３４０nmの吸光度を測定した。
図３に、この結果得られたクレアチン濃度と吸光度との
関係を表わすグラフを示す。
【００２４】実施例４ 尿素の定量 反応試薬１ ５０mM ＢＥＳ緩衝液 pH７．１ ２．７mM チアミンピロリン酸 １．５mM ＮＡＤ １０mM 塩化マグネシウム １．５mM ＣｏＡ ２mM ＰＥＰ ２mM ＡＴＰ ６Ｕ／ml ピルビン酸キナーゼ ０．７５Ｕ／ml ピルビン酸デヒドロゲナーゼ複合体 反応試薬２ ５０mM ＢＥＳ緩衝液 pH７．１ ２０mM 炭酸水素カリウム ０．４Ｕ／ml ウレアアミドリアーゼ 尿素窒素量として１０〜５０mg／dlの尿素水溶液２μｌ
に反応試薬１を２００μｌ、反応試薬２を２００μｌ加
え、３７℃で５分間反応させた後、波長３４０nmの吸光
度を測定した。図４に、この結果得られた尿素窒素量と
吸光度との関係を表わすグラフを示す。
に反応試薬１を２００μｌ、反応試薬２を２００μｌ加
え、３７℃で５分間反応させた後、波長３４０nmの吸光
度を測定した。図４に、この結果得られた尿素窒素量と
吸光度との関係を表わすグラフを示す。
【００２５】実施例１〜４において、各被験物量とＮＡ
ＤＨの波長３４０nmにおける吸光度との間に直線関係の
存在することが明らかとなった。従って、前記グラフを
検量線として未知の濃度の被験物の定量が可能となる。
ＤＨの波長３４０nmにおける吸光度との間に直線関係の
存在することが明らかとなった。従って、前記グラフを
検量線として未知の濃度の被験物の定量が可能となる。
【図１】実施例１で得られたピルビン酸の検量線を表わ
すグラフである。
すグラフである。
【図２】実施例２で得られたＰＥＰの検量線を表わすグ
ラフである。
ラフである。
【図３】実施例３で得られたクレアチンの検量線を表わ
すグラフである。
すグラフである。
【図４】実施例４で得られた尿素の検量線を表わすグラ
フである。
フである。
Claims (2)
- 【請求項１】 検体と酸化型ニコチンアミドアデニンジ
ヌクレオチド０．１〜１０ｍＭ、ピルビン酸デヒドロゲ
ナーゼ複合体０．０５〜２０Ｕ／ｍｌ、補酵素Ａ０．１
〜５ｍＭ、チアミンピリロン酸０．１〜１０ｍＭ及びカ
ルシウム又はマグネシウムイオン０．０１〜２０ｍＭを
含有する緩衝液とを反応させ、生成する還元型ニコチン
アミドアデニンジヌクレオチド量を測定することを特徴
とするピルビン酸の定量方法。 - 【請求項２】 検体と被検成分よりピルビン酸を生成さ
せるための試薬、酸化型ニコチンアミドジヌクレオチド
０．１〜１０ｍＭ、ピルビン酸デヒドロゲナーゼ複合体
０．０５〜２０Ｕ／ｍｌ、補酵素Ａ０．１〜５ｍＭ、チ
アミンピロリン酸０．１〜１０ｍＭ及びカルシウム又は
マグネシウムイオン０．０１〜２０ｍＭを含有する緩衝
液とを反応させ、生成する還元型ニコチンアミドジヌク
レオチド量を測定することを特徴とするピルビン酸を反
応生成物とする生体成分の定量方法。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP3256712A JPH07108239B2 (ja) | 1991-10-03 | 1991-10-03 | ピルビン酸の定量方法及び該方法を利用する生体成分の定量方法 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP3256712A JPH07108239B2 (ja) | 1991-10-03 | 1991-10-03 | ピルビン酸の定量方法及び該方法を利用する生体成分の定量方法 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH0595798A JPH0595798A (ja) | 1993-04-20 |
| JPH07108239B2 true JPH07108239B2 (ja) | 1995-11-22 |
Family
ID=17296419
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP3256712A Expired - Fee Related JPH07108239B2 (ja) | 1991-10-03 | 1991-10-03 | ピルビン酸の定量方法及び該方法を利用する生体成分の定量方法 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JPH07108239B2 (ja) |
Families Citing this family (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US5447847A (en) * | 1993-09-02 | 1995-09-05 | Nissui Pharmaceutical Co., Ltd. | Quantitative determination of pyruvic acid and quantitative analysis for component of living body making use of such determination |
| JP5218949B2 (ja) | 2006-10-18 | 2013-06-26 | 国立大学法人名古屋大学 | Ｄ−セリンデヒドラターゼ及びその利用 |
-
1991
- 1991-10-03 JP JP3256712A patent/JPH07108239B2/ja not_active Expired - Fee Related
Non-Patent Citations (1)
| Title |
|---|
| 丸尾文治、田宮信雄監修「酵素ハンドブック」朝倉書店（１９８２−１２−１）Ｐ．８９ |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| JPH0595798A (ja) | 1993-04-20 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| Matsubara et al. | Spectrophotometric determination of hydrogen peroxide with titanium 2-((5-bromopyridyl) azo)-5-(N-propyl-N-sulfopropylamino) phenol reagent and its application to the determination of serum glucose using glucose oxidase | |
| JPH0147152B2 (ja) | ||
| US4120755A (en) | Kinetic method for determination of glucose concentrations with glucose dehydrogenase | |
| CN107505273A (zh) | 血清总胆汁酸含量测定试剂盒及其使用方法 | |
| EP0140589B1 (en) | Enzymatic determination of d-3-hydroxybutyric acid or acetoacetic acid, and reagents therefor | |
| EP0100217A2 (en) | Process for quantitative determination of substrate treated with oxidase | |
| US5447847A (en) | Quantitative determination of pyruvic acid and quantitative analysis for component of living body making use of such determination | |
| US4695539A (en) | Process for quantitative determination of substrate treated with oxidase | |
| JPH07108239B2 (ja) | ピルビン酸の定量方法及び該方法を利用する生体成分の定量方法 | |
| JP2767049B2 (ja) | 被分析物の存在を測定する分析方法及び試験組成物 | |
| JP5843072B2 (ja) | 特定物質の測定方法および特定物質測定用キット | |
| US5888828A (en) | Kit for measuring urea nitrogen | |
| JP4182859B2 (ja) | クレアチンキナーゼ測定用液状試薬キットおよびその安定化方法 | |
| JP5633669B2 (ja) | Ａｄｐの測定方法およびａｄｐ測定用キット | |
| JPH05219991A (ja) | 酵素反応利用定量分析方法 | |
| JP2761768B2 (ja) | Ｎａｄｈの定量法及びそれを用いた胆汁酸の定量法 | |
| JP3034988B2 (ja) | イソクエン酸またはα−ケトグルタル酸の高感度定量法および定量用組成物 | |
| JP7234923B2 (ja) | 測定対象物質を補酵素として測定する物質測定方法 | |
| CN118006725A (zh) | 一种肌酐检测试剂盒及方法 | |
| JPH04346796A (ja) | 乳酸またはピルビン酸の高感度定量法および定量用組成物 | |
| JP3034979B2 (ja) | グリセロール、ジヒドロキシアセトンまたはｄ−グリセロアルデヒドの高感度定量法および高感度定量用組成物 | |
| JPH06269299A (ja) | 物質の測定法 | |
| JPH0698035B2 (ja) | 体液中のカルシウム測定方法 | |
| JPH06311897A (ja) | カリウムイオン測定用組成物 | |
| JP2001149092A (ja) | ホモシステインの測定方法 |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| A01 | Written decision to grant a patent or to grant a registration (utility model) |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A01 Effective date: 19970708 |
|
| R250 | Receipt of annual fees |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250 |
|
| R250 | Receipt of annual fees |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250 |
|
| R250 | Receipt of annual fees |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250 |
|
| R250 | Receipt of annual fees |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250 |
|
| LAPS | Cancellation because of no payment of annual fees |