JPH0595798A - ピルビン酸の定量方法及び該方法を利用する生体成分の定量方法 - Google Patents
ピルビン酸の定量方法及び該方法を利用する生体成分の定量方法Info
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- JPH0595798A JPH0595798A JP25671291A JP25671291A JPH0595798A JP H0595798 A JPH0595798 A JP H0595798A JP 25671291 A JP25671291 A JP 25671291A JP 25671291 A JP25671291 A JP 25671291A JP H0595798 A JPH0595798 A JP H0595798A
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Abstract
(57)【要約】
【構成】 検体にＮＡＤ、ピルビン酸デヒドロゲナーゼ
被合体及び補酵素Ａを反応させ、生成するＮＡＤＨ量を
測定することを特徴とするピルビン酸又は生体成分の定
量方法。 【効果】 生体中に存在し、又は生体反応過程で生成す
るピルビン酸又は他の生体成分を簡便かつ精度よく定量
できる。
被合体及び補酵素Ａを反応させ、生成するＮＡＤＨ量を
測定することを特徴とするピルビン酸又は生体成分の定
量方法。 【効果】 生体中に存在し、又は生体反応過程で生成す
るピルビン酸又は他の生体成分を簡便かつ精度よく定量
できる。
Description
【０００１】
【産業上の利用分野】本発明はピルビン酸の定量方法及
び該方法を利用する生体成分の定量方法に関する。
び該方法を利用する生体成分の定量方法に関する。
【０００２】
【従来の技術】臨床化学の分野では、生体成分を酸化酵
素の存在下で酸化し、過酸化水素を生成させ、さらに、
生じた過酸化水素をペルオキシダーゼと発色剤によりキ
ノン型色素にして比色定量する方法と脱水素酵素による
酸化型ニコチンアミドアデニンジヌクレオチド（以下Ｎ
ＡＤという）と還元型ニコチンアミドアデニンジヌクレ
オチド（以下ＮＡＤＨという）間の酸化還元反応を利用
してＮＡＤＨの波長３４０nmにおける吸光度の増加又は
減少を測定することにより生体成分を定量する方法が通
常用いられている。
素の存在下で酸化し、過酸化水素を生成させ、さらに、
生じた過酸化水素をペルオキシダーゼと発色剤によりキ
ノン型色素にして比色定量する方法と脱水素酵素による
酸化型ニコチンアミドアデニンジヌクレオチド（以下Ｎ
ＡＤという）と還元型ニコチンアミドアデニンジヌクレ
オチド（以下ＮＡＤＨという）間の酸化還元反応を利用
してＮＡＤＨの波長３４０nmにおける吸光度の増加又は
減少を測定することにより生体成分を定量する方法が通
常用いられている。
【０００３】生体中に存在する、又は生体反応の過程で
生成するピルビン酸を測定する場合、ピルビン酸酸化酵
素を用いて過酸化水素を生成させ、さらに、生じた過酸
化水素をペルオキシダーゼと発色剤によりキノン型色素
にして比色定量する方法が知られている。また、生体中
に存在する、又は生体反応の過程で生成するピルビン酸
に乳酸脱水素酵素とＮＡＤＨを反応させ、ＮＡＤＨの減
少を波長３４０nmで測定する方法も知られている。
生成するピルビン酸を測定する場合、ピルビン酸酸化酵
素を用いて過酸化水素を生成させ、さらに、生じた過酸
化水素をペルオキシダーゼと発色剤によりキノン型色素
にして比色定量する方法が知られている。また、生体中
に存在する、又は生体反応の過程で生成するピルビン酸
に乳酸脱水素酵素とＮＡＤＨを反応させ、ＮＡＤＨの減
少を波長３４０nmで測定する方法も知られている。
【０００４】
【発明が解決しようとする課題】しかしながら、ピルビ
ン酸酸化酵素によって生成する過酸化水素を測定する方
法は、生体成分中の還元性物質、例えば、アスコルビン
酸、ビリルビン等によって負誤差を受けること、また、
ピルビン酸の濃度が高い場合には、反応試液中の溶存酸
素が不足して測定ができないといった問題がある。
ン酸酸化酵素によって生成する過酸化水素を測定する方
法は、生体成分中の還元性物質、例えば、アスコルビン
酸、ビリルビン等によって負誤差を受けること、また、
ピルビン酸の濃度が高い場合には、反応試液中の溶存酸
素が不足して測定ができないといった問題がある。
【０００５】一方、乳酸脱水素酵素を用いてＮＡＤＨの
減少を波長３４０nmで測定する方法は、ＮＡＤＨの濃度
に依存して測定範囲が広がるが、ＮＡＤＨ濃度を上げる
と初期吸光度も上昇し、分光光度計の性能上、吸光度の
測定が不可能になるという問題点を有している。
減少を波長３４０nmで測定する方法は、ＮＡＤＨの濃度
に依存して測定範囲が広がるが、ＮＡＤＨ濃度を上げる
と初期吸光度も上昇し、分光光度計の性能上、吸光度の
測定が不可能になるという問題点を有している。
【０００６】
【課題を解決するための手段】本発明者らは、かかる実
情に鑑み、生体中に存在する、又は生体反応過程で生成
するピルビン酸の定量に関し鋭意検討した結果、検体に
ＮＡＤ、ピルビン酸デヒドロゲナーゼ複合体及び補酵素
Ａを反応させ、生成するＮＡＤＨを測定すれば、前記課
題を解決できることを見出し、本発明を完成するに至っ
た。
情に鑑み、生体中に存在する、又は生体反応過程で生成
するピルビン酸の定量に関し鋭意検討した結果、検体に
ＮＡＤ、ピルビン酸デヒドロゲナーゼ複合体及び補酵素
Ａを反応させ、生成するＮＡＤＨを測定すれば、前記課
題を解決できることを見出し、本発明を完成するに至っ
た。
【０００７】すなわち、本発明は検体に酸化型ニコチン
アミドアデニンジヌクレオチド、ピルビン酸デヒドロゲ
ナーゼ複合体及び補酵素Ａを反応させ、生成する還元型
ニコチンアミドアデニンジヌクレオチド量を測定するこ
とを特徴とするピルビン酸の定量方法を提供するもので
ある。
アミドアデニンジヌクレオチド、ピルビン酸デヒドロゲ
ナーゼ複合体及び補酵素Ａを反応させ、生成する還元型
ニコチンアミドアデニンジヌクレオチド量を測定するこ
とを特徴とするピルビン酸の定量方法を提供するもので
ある。
【０００８】本発明は、さらに、検体に被検成分よりピ
ルビン酸を生成させるための試薬、酸化型ニコチンアミ
ドジヌクレオチド、ピルビン酸デヒドロゲナーゼ複合体
及び補酵素Ａ（以下ＣｏＡという）を反応させ、生成す
る還元型ニコチンアミドジヌクレオチド量を測定するこ
とを特徴とするピルビン酸を反応生成物とする生体成分
の定量方法を提供するものである。
ルビン酸を生成させるための試薬、酸化型ニコチンアミ
ドジヌクレオチド、ピルビン酸デヒドロゲナーゼ複合体
及び補酵素Ａ（以下ＣｏＡという）を反応させ、生成す
る還元型ニコチンアミドジヌクレオチド量を測定するこ
とを特徴とするピルビン酸を反応生成物とする生体成分
の定量方法を提供するものである。
【０００９】本発明のピルビン酸の定量方法は、次の反
応式で表わされる。
応式で表わされる。
【００１０】
【化１】
【００１１】上記反応においては、ピルビン酸の濃度に
依存してＮＡＤＨが生成される。そして、ＮＡＤＨは波
長３４０nmに吸収を有するので、該波長における吸光度
を測定することにより目的とするピルビン酸を定量する
ことができる。本発明において検体としては、血液、血
漿、尿等の生体液、ピルビン酸溶液等が挙げられる。本
発明の定量方法を実施するには、例えば検体にＮＡＤ
０．１〜１０mM、ピルビン酸デヒドロゲナーゼ複合体
０．０５〜２０Ｕ／ml、及びＣｏＡ０．１〜５mMを含有
する緩衝液を加え、３７℃付近で２〜２０分間反応さ
せ、波長３４０nmの吸光度を測定すればよい。なお、こ
の緩衝液中には、ピルビン酸デヒドロゲナーゼ複合体の
活性化及び安定化の目的で、カルシウムイオンを０．０
１〜２０mM、またはマグネシウムイオンを０．０１〜２
０mM、チアミンピロリン酸０．１〜１０mM添加すること
ができる。カルシウムイオンとしては塩化カルシウム、
酢酸カルシウム等が利用でき、マグネシウムイオンとし
ては塩化マグネシウム、硫酸マグネシウム、酢酸マグネ
シウム等が利用できる。
依存してＮＡＤＨが生成される。そして、ＮＡＤＨは波
長３４０nmに吸収を有するので、該波長における吸光度
を測定することにより目的とするピルビン酸を定量する
ことができる。本発明において検体としては、血液、血
漿、尿等の生体液、ピルビン酸溶液等が挙げられる。本
発明の定量方法を実施するには、例えば検体にＮＡＤ
０．１〜１０mM、ピルビン酸デヒドロゲナーゼ複合体
０．０５〜２０Ｕ／ml、及びＣｏＡ０．１〜５mMを含有
する緩衝液を加え、３７℃付近で２〜２０分間反応さ
せ、波長３４０nmの吸光度を測定すればよい。なお、こ
の緩衝液中には、ピルビン酸デヒドロゲナーゼ複合体の
活性化及び安定化の目的で、カルシウムイオンを０．０
１〜２０mM、またはマグネシウムイオンを０．０１〜２
０mM、チアミンピロリン酸０．１〜１０mM添加すること
ができる。カルシウムイオンとしては塩化カルシウム、
酢酸カルシウム等が利用でき、マグネシウムイオンとし
ては塩化マグネシウム、硫酸マグネシウム、酢酸マグネ
シウム等が利用できる。
【００１２】ところでピルビン酸は、生体内物質代謝経
路における中間体として重要であり、生体内ではピルビ
ン酸を生成する数多くの代謝経路が存在する。従って、
ピルビン酸を反応生成物とする生体成分を測定しようと
する場合、当該被検生体成分よりピルビン酸を生成させ
るための既知の試薬と上記反応とを組み合わせれば、目
的とする生体成分を定量することができる。例えば、ピ
ルビン酸キナーゼとアデノシンニリン酸（以下、ＡＤＰ
と称する）とを組合せることによって、ホスホエノール
ピルビン酸（以下、ＰＥＰと称する）の測定が可能であ
る。
路における中間体として重要であり、生体内ではピルビ
ン酸を生成する数多くの代謝経路が存在する。従って、
ピルビン酸を反応生成物とする生体成分を測定しようと
する場合、当該被検生体成分よりピルビン酸を生成させ
るための既知の試薬と上記反応とを組み合わせれば、目
的とする生体成分を定量することができる。例えば、ピ
ルビン酸キナーゼとアデノシンニリン酸（以下、ＡＤＰ
と称する）とを組合せることによって、ホスホエノール
ピルビン酸（以下、ＰＥＰと称する）の測定が可能であ
る。
【００１３】
【化２】
【００１４】さらに、上記反応にさきだちクレアチンキ
ナーゼを使用することにより、クレアチンの測定も可能
である。反応過程を以下に表わす。
ナーゼを使用することにより、クレアチンの測定も可能
である。反応過程を以下に表わす。
【００１５】
【化３】
【００１６】さらに、上記のクレアチンキナーゼの代わ
りに、ウレアアミドリアーゼを用いることにより、尿素
の測定が可能となる。この反応過程を以下に表わす。
りに、ウレアアミドリアーゼを用いることにより、尿素
の測定が可能となる。この反応過程を以下に表わす。
【００１７】
【化４】
【００１８】以上の如く、生体中又は生体内反応の過程
で生成するピルビル酸を、同時に生成するＮＡＤＨの３
４０nmにおける吸光度を測定することにより、定量する
ことができる。さらに生体成分であるＰＥＰ、尿素、ク
レアチン、クレアチニン、グルコース、中性脂肪等を上
記定量法を利用することにより定量することができる。
で生成するピルビル酸を、同時に生成するＮＡＤＨの３
４０nmにおける吸光度を測定することにより、定量する
ことができる。さらに生体成分であるＰＥＰ、尿素、ク
レアチン、クレアチニン、グルコース、中性脂肪等を上
記定量法を利用することにより定量することができる。
【００１９】
【発明の効果】本発明によれば、生体中又は生体内反応
過程で生成するピルビル酸を簡便迅速、かつ精確に定量
することができる。しかも、上記定量方法を利用するこ
とにより他の生体成分を定量することも可能である。
過程で生成するピルビル酸を簡便迅速、かつ精確に定量
することができる。しかも、上記定量方法を利用するこ
とにより他の生体成分を定量することも可能である。
【００２０】
【実施例】以下に実施例により本発明を具体的に説明す
るが、本発明はこれらに限定されるものではない。
るが、本発明はこれらに限定されるものではない。
【００２１】実施例１ ピルビン酸の定量 反応試薬 ５０mM リン酸緩衝液 pH６．５ ０．２mM チアミンピロリン酸 １mM ＮＡＤ １mM 塩化カルシウム ０．２mM ＣｏＡ ０．５Ｕ／ml ピルビン酸デヒドロゲナーゼ複合体 １〜１０mMのピルビン酸水溶液５μｌに上記反応試薬３
００μｌを加え、３７℃で１０分間反応させた後、波長
３４０nmの吸光度を測定した。図１に、この結果得られ
たピルビン酸濃度と吸光度との関係を表わすグラフを示
す。
００μｌを加え、３７℃で１０分間反応させた後、波長
３４０nmの吸光度を測定した。図１に、この結果得られ
たピルビン酸濃度と吸光度との関係を表わすグラフを示
す。
【００２２】実施例２ ＰＥＰの定量 反応試薬１ ５０mM Ｎ，Ｎ−ビス（２−ヒドロキシエチル）−２−アミノエ タンスルホン酸（以下、ＢＥＳという）緩衝液 pH７． １ ０．２mM チアミンピロリン酸 １mM ＮＡＤ １mM 塩化カルシウム ０．２mM ＣｏＡ ０．５Ｕ／ml ピルビン酸デヒドロゲナーゼ複合体 反応試薬２ ５０mM ＢＥＳ緩衝液 pH７．１ ３mM ＡＤＰ １６mM 塩化マグネシウム ６Ｕ／ml ピルビン酸キナーゼ ２〜１０mMのＰＥＰ水溶液５μｌに反応試薬１を３００
μｌ、反応試薬２を１００μｌ加え、３７℃で５分間反
応させた後、波長３４０nmの吸光度を測定した。図２
に、この結果得られたＰＥＰ濃度と吸光度との関係を表
わすグラフを示す。
μｌ、反応試薬２を１００μｌ加え、３７℃で５分間反
応させた後、波長３４０nmの吸光度を測定した。図２
に、この結果得られたＰＥＰ濃度と吸光度との関係を表
わすグラフを示す。
【００２３】実施例３ クレアチンの定量 反応試薬１ ５０mM ＢＥＳ緩衝液 pH７．４ ０．３mM チアミンピロリン酸 １．５mM ＮＡＤ １０mM 酢酸マグネシウム １．５mM ＣｏＡ ０．７５Ｕ／ml ピルビン酸デヒドロゲナーゼ複合体 反応試薬２ ５０mM ＢＥＳ緩衝液 pH７．１ ４．５mM ＡＴＰ ４．５mM ＰＥＰ １０mM 酢酸マグネシウム ３Ｕ／ml ピルビン酸キナーゼ ２０Ｕ／ml クレアチンキナーゼ １０〜１５mMのクレアチン水溶液５μｌに反応試薬１を
２００μｌ、反応試薬２を２００μｌ加え、３７℃で５
分間反応させた後、波長３４０nmの吸光度を測定した。
図３に、この結果得られたクレアチン濃度と吸光度との
関係を表わすグラフを示す。
２００μｌ、反応試薬２を２００μｌ加え、３７℃で５
分間反応させた後、波長３４０nmの吸光度を測定した。
図３に、この結果得られたクレアチン濃度と吸光度との
関係を表わすグラフを示す。
【００２４】実施例４ 尿素の定量 反応試薬１ ５０mM ＢＥＳ緩衝液 pH７．１ ２．７mM チアミンピロリン酸 １．５mM ＮＡＤ １０mM 塩化マグネシウム １．５mM ＣｏＡ ２mM ＰＥＰ ２mM ＡＴＰ ６Ｕ／ml ピルビン酸キナーゼ ０．７５Ｕ／ml ピルビン酸デヒドロゲナーゼ複合体 反応試薬２ ５０mM ＢＥＳ緩衝液 pH７．１ ２０mM 炭酸水素カリウム ０．４Ｕ／ml ウレアアミドリアーゼ 尿素窒素量として１０〜５０mg／dlの尿素水溶液２μｌ
に反応試薬１を２００μｌ、反応試薬２を２００μｌ加
え、３７℃で５分間反応させた後、波長３４０nmの吸光
度を測定した。図４に、この結果得られた尿素窒素量と
吸光度との関係を表わすグラフを示す。
に反応試薬１を２００μｌ、反応試薬２を２００μｌ加
え、３７℃で５分間反応させた後、波長３４０nmの吸光
度を測定した。図４に、この結果得られた尿素窒素量と
吸光度との関係を表わすグラフを示す。
【００２５】実施例１〜４において、各被験物量とＮＡ
ＤＨの波長３４０nmにおける吸光度との間に直線関係の
存在することが明らかとなった。従って、前記グラフを
検量線として未知の濃度の被験物の定量が可能となる。
ＤＨの波長３４０nmにおける吸光度との間に直線関係の
存在することが明らかとなった。従って、前記グラフを
検量線として未知の濃度の被験物の定量が可能となる。
【図１】実施例１で得られたピルビン酸の検量線を表わ
すグラフである。
すグラフである。
【図２】実施例２で得られたＰＥＰの検量線を表わすグ
ラフである。
ラフである。
【図３】実施例３で得られたクレアチンの検量線を表わ
すグラフである。
すグラフである。
【図４】実施例４で得られた尿素の検量線を表わすグラ
フである。
フである。
Claims (2)
- 【請求項１】 検体に酸化型ニコチンアミドアデニンジ
ヌクレオチド、ピルビン酸デヒドロゲナーゼ複合体及び
補酵素Ａを反応させ、生成する還元型ニコチンアミドア
デニンジヌクレオチド量を測定することを特徴とするピ
ルビン酸の定量方法。 - 【請求項２】 検体に被検成分よりピルビン酸を生成さ
せるための試薬、酸化型ニコチンアミドジヌクレオチ
ド、ピルビン酸デヒドロゲナーゼ複合体及び補酵素Ａを
反応させ、生成する還元型ニコチンアミドジヌクレオチ
ド量を測定することを特徴とするピルビン酸を反応生成
物とする生体成分の定量方法。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP3256712A JPH07108239B2 (ja) | 1991-10-03 | 1991-10-03 | ピルビン酸の定量方法及び該方法を利用する生体成分の定量方法 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP3256712A JPH07108239B2 (ja) | 1991-10-03 | 1991-10-03 | ピルビン酸の定量方法及び該方法を利用する生体成分の定量方法 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH0595798A true JPH0595798A (ja) | 1993-04-20 |
| JPH07108239B2 JPH07108239B2 (ja) | 1995-11-22 |
Family
ID=17296419
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP3256712A Expired - Fee Related JPH07108239B2 (ja) | 1991-10-03 | 1991-10-03 | ピルビン酸の定量方法及び該方法を利用する生体成分の定量方法 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JPH07108239B2 (ja) |
Cited By (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US5447847A (en) * | 1993-09-02 | 1995-09-05 | Nissui Pharmaceutical Co., Ltd. | Quantitative determination of pyruvic acid and quantitative analysis for component of living body making use of such determination |
| WO2008047802A1 (fr) | 2006-10-18 | 2008-04-24 | National University Corporation Nagoya University | D-sérine déshydratase et son utilisation |
-
1991
- 1991-10-03 JP JP3256712A patent/JPH07108239B2/ja not_active Expired - Fee Related
Non-Patent Citations (1)
| Title |
|---|
| METHODS IN ENZYMOLOGY=1966 * |
Cited By (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US5447847A (en) * | 1993-09-02 | 1995-09-05 | Nissui Pharmaceutical Co., Ltd. | Quantitative determination of pyruvic acid and quantitative analysis for component of living body making use of such determination |
| WO2008047802A1 (fr) | 2006-10-18 | 2008-04-24 | National University Corporation Nagoya University | D-sérine déshydratase et son utilisation |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| JPH07108239B2 (ja) | 1995-11-22 |
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