JPH07109300A - ヒトｉｉ型ホスホリパーゼａ２と結合する抗体 - Google Patents
ヒトｉｉ型ホスホリパーゼａ２と結合する抗体Info
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- JPH07109300A JPH07109300A JP5255646A JP25564693A JPH07109300A JP H07109300 A JPH07109300 A JP H07109300A JP 5255646 A JP5255646 A JP 5255646A JP 25564693 A JP25564693 A JP 25564693A JP H07109300 A JPH07109300 A JP H07109300A
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- Japan
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- pla2
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Abstract
(57)【要約】
【目的】 ヒトII型ホスホリパーゼＡ２と硫酸化多糖と
の結合を促進する因子を見出す。かかる因子は抗凝固作
用、抗炎症作用等の効果が期待できる。 【構成】 ヒトII型ホスホリパーゼＡ２に結合する抗体
であって、ヒトII型ホスホリパーゼＡ２と硫酸化多糖と
の結合を促進する活性を有するモノクローナル抗体。ま
たかかる活性を有するモノクローナル抗体を産生するハ
イブリドーマ細胞等の動物細胞。
の結合を促進する因子を見出す。かかる因子は抗凝固作
用、抗炎症作用等の効果が期待できる。 【構成】 ヒトII型ホスホリパーゼＡ２に結合する抗体
であって、ヒトII型ホスホリパーゼＡ２と硫酸化多糖と
の結合を促進する活性を有するモノクローナル抗体。ま
たかかる活性を有するモノクローナル抗体を産生するハ
イブリドーマ細胞等の動物細胞。
Description
【０００１】
【産業上の利用分野】本発明はヒトII型ホスホリパーゼ
Ａ２と結合するモノクローナル抗体に関する。さらに詳
しくは、ヒトII型ホスホリパーゼＡ２とヘパリン等の硫
酸化多糖との結合を促進する活性を有するモノクローナ
ル抗体に関する。
Ａ２と結合するモノクローナル抗体に関する。さらに詳
しくは、ヒトII型ホスホリパーゼＡ２とヘパリン等の硫
酸化多糖との結合を促進する活性を有するモノクローナ
ル抗体に関する。
【０００２】
【従来の技術】近年、ヒト炎症性疾患や炎症動物モデル
の炎症局所からホスホリパーゼＡ２が精製され、その性
状が明らかになった（工藤一郎、井上圭三、生化学、６
４，３３３０―３３４４，１９９２年）。ヒトII型ホス
ホリパーゼＡ２（以下、「II型ＰＬＡ２」という。）
は、それまでに膵臓より単離されていたホスホリパーゼ
Ａ２とほぼ同じ１４ＫＤａの分子量であるが、一次配列
はそれと異なるものである。また、膵臓由来ホスホリパ
ーゼＡ２と異なり、硫酸化多糖に高い親和性を有してい
る。この性質は生理的にも重要であり、炎症性サイトカ
イン（ＩＬ―１、ＴＮＦなど）で発現誘導されたII型Ｐ
ＬＡ２は細胞表面のヘパラン硫酸に結合した形で存在し
ていることが示されている（Murakami, M. et al.: J.
Biol. Chem.,２６８：８３９〜８４４，１９９３）。し
かし、これまでのところ、かかる結合を促進する物質は
知られていない。
の炎症局所からホスホリパーゼＡ２が精製され、その性
状が明らかになった（工藤一郎、井上圭三、生化学、６
４，３３３０―３３４４，１９９２年）。ヒトII型ホス
ホリパーゼＡ２（以下、「II型ＰＬＡ２」という。）
は、それまでに膵臓より単離されていたホスホリパーゼ
Ａ２とほぼ同じ１４ＫＤａの分子量であるが、一次配列
はそれと異なるものである。また、膵臓由来ホスホリパ
ーゼＡ２と異なり、硫酸化多糖に高い親和性を有してい
る。この性質は生理的にも重要であり、炎症性サイトカ
イン（ＩＬ―１、ＴＮＦなど）で発現誘導されたII型Ｐ
ＬＡ２は細胞表面のヘパラン硫酸に結合した形で存在し
ていることが示されている（Murakami, M. et al.: J.
Biol. Chem.,２６８：８３９〜８４４，１９９３）。し
かし、これまでのところ、かかる結合を促進する物質は
知られていない。
【０００３】逆にこの結合を阻害する物質として、II型
ＰＬＡ２のヘパリン結合ドメインを認識する抗体が知ら
れている（Murakami, M. et al., Methods in Enzymolo
gy,１９７，２２３〜２３３，１９９１）。
ＰＬＡ２のヘパリン結合ドメインを認識する抗体が知ら
れている（Murakami, M. et al., Methods in Enzymolo
gy,１９７，２２３〜２３３，１９９１）。
【０００４】一方、II型ＰＬＡ２は血管内皮細胞に作用
して、ＰＧＩ2 の産生を誘導し抗凝固作用および血流循
環改善作用を発揮していると考えられる（Murakami, M.
etal.: J. Biol. Chem.,２６８：８３９〜８４４，１
９９３）。また、ｉｎ ｖｉｔｒｏ血液凝固系に作用し
て、抗凝固作用を示すことも報告されている（G. Cirin
o, C. Cicala, L. Sorrentino, J.L. Browning, Thromb
osis Research,７０，３３７〜３４２，１９９３）。さ
らに、II型ＰＬＡ２が好中球の産生する菌体膜透過性亢
進因子の共存下でグラム陰性菌の膜を破壊することが報
告されている（Elsbach, P., Weiss, J., Biochem. Bio
phys. Acta, ９４７，２９〜５２，１９８８）。これら
の反応にもヘパリン結合部位が関与しているものと考え
られる。
して、ＰＧＩ2 の産生を誘導し抗凝固作用および血流循
環改善作用を発揮していると考えられる（Murakami, M.
etal.: J. Biol. Chem.,２６８：８３９〜８４４，１
９９３）。また、ｉｎ ｖｉｔｒｏ血液凝固系に作用し
て、抗凝固作用を示すことも報告されている（G. Cirin
o, C. Cicala, L. Sorrentino, J.L. Browning, Thromb
osis Research,７０，３３７〜３４２，１９９３）。さ
らに、II型ＰＬＡ２が好中球の産生する菌体膜透過性亢
進因子の共存下でグラム陰性菌の膜を破壊することが報
告されている（Elsbach, P., Weiss, J., Biochem. Bio
phys. Acta, ９４７，２９〜５２，１９８８）。これら
の反応にもヘパリン結合部位が関与しているものと考え
られる。
【０００５】
【発明が解決しようとする課題】本発明の課題は、上記
したII型ＰＬＡ２とヘパリン等の硫酸化多糖との結合を
促進する活性を有する物質を見出すことである。そうし
た物質は、II型ＰＬＡ２のもつ抗凝固作用、血流循環改
善作用、抗菌作用等の生理作用を促進させることが期待
できる。そして凝固線溶異常、虚血、喘息、関節炎、敗
血症および皮膚の炎症性の疾患のための新しい治療薬、
診断薬となり得るものである。
したII型ＰＬＡ２とヘパリン等の硫酸化多糖との結合を
促進する活性を有する物質を見出すことである。そうし
た物質は、II型ＰＬＡ２のもつ抗凝固作用、血流循環改
善作用、抗菌作用等の生理作用を促進させることが期待
できる。そして凝固線溶異常、虚血、喘息、関節炎、敗
血症および皮膚の炎症性の疾患のための新しい治療薬、
診断薬となり得るものである。
【０００６】
【課題を解決するための手段】本発明者らはII型ＰＬＡ
２に結合するモノクローナル抗体５４種を取得し、その
うち１０種類にII型ＰＬＡ２と硫酸化多糖との結合を促
進する活性があることを見出し、本発明を完成した。
２に結合するモノクローナル抗体５４種を取得し、その
うち１０種類にII型ＰＬＡ２と硫酸化多糖との結合を促
進する活性があることを見出し、本発明を完成した。
【０００７】すなわち本発明は、ヒトII型ホスホリパー
ゼＡ２と結合する抗体であって、ヒトII型ホスホリパー
ゼＡ２と硫酸化多糖との結合を促進する活性を有するモ
ノクローナル抗体である。本発明には、かかるモノクロ
ーナル抗体を産生するハイブリドーマ細胞等の動物細胞
も含まれる。
ゼＡ２と結合する抗体であって、ヒトII型ホスホリパー
ゼＡ２と硫酸化多糖との結合を促進する活性を有するモ
ノクローナル抗体である。本発明には、かかるモノクロ
ーナル抗体を産生するハイブリドーマ細胞等の動物細胞
も含まれる。
【０００８】一般にモノクローナル抗体は、抗原分子の
特定の部位を認識し、そこに結合する性質を有してい
る。ここで、そうした抗原分子中の部位が、抗原分子と
他の分子との結合にあずかる部位である場合には、当該
他の分子とモノクローナル抗体とがそうした抗原分子中
の部位を求めて競合するため、抗原分子と他の分子との
結合は阻害されるであろう。また、モノクローナル抗体
の抗原認識部位が、他の分子との結合部位の近傍である
場合にも、モノクローナル抗体が結合すると、それによ
る立体障害により、他の分子との結合はやはり阻害され
ることとなろう。モノクローナル抗体の抗原認識部位
が、これらの部位以外のときは、他の分子との結合が阻
害されない場合もあろうが、いずれの場合でもモノクロ
ーナル抗体の結合により他の分子との結合が促進される
場合があることは予期し難いことであった。
特定の部位を認識し、そこに結合する性質を有してい
る。ここで、そうした抗原分子中の部位が、抗原分子と
他の分子との結合にあずかる部位である場合には、当該
他の分子とモノクローナル抗体とがそうした抗原分子中
の部位を求めて競合するため、抗原分子と他の分子との
結合は阻害されるであろう。また、モノクローナル抗体
の抗原認識部位が、他の分子との結合部位の近傍である
場合にも、モノクローナル抗体が結合すると、それによ
る立体障害により、他の分子との結合はやはり阻害され
ることとなろう。モノクローナル抗体の抗原認識部位
が、これらの部位以外のときは、他の分子との結合が阻
害されない場合もあろうが、いずれの場合でもモノクロ
ーナル抗体の結合により他の分子との結合が促進される
場合があることは予期し難いことであった。
【０００９】実際、本発明者も、II型ＰＬＡ２に対する
モノクローナル抗体について調べた結果、II型ＰＬＡ２
と硫酸化多糖との結合に影響を与えない抗体およびこの
結合を阻害する抗体を多数見出している。しかしなが
ら、本発明者は、これらの抗体以外にこの結合を促進す
る活性を有する抗体を今回新たに見出したものである。
モノクローナル抗体について調べた結果、II型ＰＬＡ２
と硫酸化多糖との結合に影響を与えない抗体およびこの
結合を阻害する抗体を多数見出している。しかしなが
ら、本発明者は、これらの抗体以外にこの結合を促進す
る活性を有する抗体を今回新たに見出したものである。
【００１０】本発明のモノクローナル抗体は例えば以下
に述べる方法で調製することができる。すなわち、基本
的には、GalfreおよびMilstein, Methods in Enzymolog
y,第７３巻，Academic Press, New York (1981); James
W.Goding, Monoclonal Antibodies: Principles and P
ractice, Academic Press, Orlando, Florida (1986);
Current Protocols in Molecular Biology, F.M. Ausub
el等共編、Wiley Interscience, New York (1987) 等に
記載されている方法である。
に述べる方法で調製することができる。すなわち、基本
的には、GalfreおよびMilstein, Methods in Enzymolog
y,第７３巻，Academic Press, New York (1981); James
W.Goding, Monoclonal Antibodies: Principles and P
ractice, Academic Press, Orlando, Florida (1986);
Current Protocols in Molecular Biology, F.M. Ausub
el等共編、Wiley Interscience, New York (1987) 等に
記載されている方法である。
【００１１】モノクローナル抗体を調製するためには、
抗原タンパク質を精製した方がよい。この精製タンパク
質は抗体力価検定のためにも用いられる。本発明のモノ
クローナル抗体の調製に際して用いたII型ＰＬＡ２の精
製法は、実施例において詳述する。
抗原タンパク質を精製した方がよい。この精製タンパク
質は抗体力価検定のためにも用いられる。本発明のモノ
クローナル抗体の調製に際して用いたII型ＰＬＡ２の精
製法は、実施例において詳述する。
【００１２】次に、精製II型ＰＬＡ２をアジュバントと
ともに動物に腹腔内注射または皮下注射することを繰り
返し、動物に免疫応答を起こさせる。用いる動物として
は哺乳類が好ましく、ラットおよびマウスがより好まし
い。最も好ましくはｂａｌｂ／ｃマウスである。
ともに動物に腹腔内注射または皮下注射することを繰り
返し、動物に免疫応答を起こさせる。用いる動物として
は哺乳類が好ましく、ラットおよびマウスがより好まし
い。最も好ましくはｂａｌｂ／ｃマウスである。
【００１３】続いて、その免疫した動物からＢリンパ球
を取り出し、上記文献記載の方法で、無限増殖能を持つ
動物細胞と細胞融合を行う。この融合の相手として好ま
しい細胞株はマウスの骨髄腫細胞であり、Ｐ３―Ｘ６３
―Ａｇ８―Ｕ１ミエローマ細胞（ＡＴＣＣ ＣＲＬ１５
９７）が特に好ましい。
を取り出し、上記文献記載の方法で、無限増殖能を持つ
動物細胞と細胞融合を行う。この融合の相手として好ま
しい細胞株はマウスの骨髄腫細胞であり、Ｐ３―Ｘ６３
―Ａｇ８―Ｕ１ミエローマ細胞（ＡＴＣＣ ＣＲＬ１５
９７）が特に好ましい。
【００１４】細胞融合後は、常法に従い適当な選択培地
で培養を続け、生残した細胞の中からII型ＰＬＡ２に結
合する抗体を産生している細胞株をＥＬＩＳＡ法等によ
り選別する。さらに得られたモノクローナル抗体産生細
胞について数回のクローニングを行い、単クローン性お
よび抗体産生能の安定性のある株を選別することが望ま
しい。クローニング法としては、限界希釈法、軟アガロ
ース法、およびセルソーターを用いた選別法等を用いる
ことができる。
で培養を続け、生残した細胞の中からII型ＰＬＡ２に結
合する抗体を産生している細胞株をＥＬＩＳＡ法等によ
り選別する。さらに得られたモノクローナル抗体産生細
胞について数回のクローニングを行い、単クローン性お
よび抗体産生能の安定性のある株を選別することが望ま
しい。クローニング法としては、限界希釈法、軟アガロ
ース法、およびセルソーターを用いた選別法等を用いる
ことができる。
【００１５】こうして得られたII型ＰＬＡ２に対するモ
ノクローナル抗体のうちから、II型ＰＬＡ２と硫酸化多
糖との結合を促進する活性を有するものを、例えば以下
の方法で選別する。すなわち、ヘパリンを結合したＥＬ
ＩＳＡ用９６ウェルプレートに、ビオチン化したII型Ｐ
ＬＡ２を加え、続いてアルカリフォスファターゼ結合ス
トレプトアビジンを反応させることでヘパリンとII型Ｐ
ＬＡ２との結合を検出する系に、評価すべきモノクロー
ナル抗体を適宜希釈して加え、その結合の阻害または促
進活性を調べる。こうしてII型ＰＬＡ２に結合するモノ
クローナル抗体の中から、II型ＰＬＡ２とヘパリンとの
結合を促進する活性を有するものを選別することができ
る。
ノクローナル抗体のうちから、II型ＰＬＡ２と硫酸化多
糖との結合を促進する活性を有するものを、例えば以下
の方法で選別する。すなわち、ヘパリンを結合したＥＬ
ＩＳＡ用９６ウェルプレートに、ビオチン化したII型Ｐ
ＬＡ２を加え、続いてアルカリフォスファターゼ結合ス
トレプトアビジンを反応させることでヘパリンとII型Ｐ
ＬＡ２との結合を検出する系に、評価すべきモノクロー
ナル抗体を適宜希釈して加え、その結合の阻害または促
進活性を調べる。こうしてII型ＰＬＡ２に結合するモノ
クローナル抗体の中から、II型ＰＬＡ２とヘパリンとの
結合を促進する活性を有するものを選別することができ
る。
【００１６】ヒトの治療に本発明のモノクローナル抗体
を用いる場合には、ヒト型のモノクローナル抗体を用い
ることが望ましい。ヒト型のモノクローナル抗体には、
ヒトのモノクローナル抗体のほか、いわゆるキメラ抗体
すなわち可変領域のみマウス等の動物由来のアミノ酸配
列からなり、定常領域にはヒトのアミノ酸配列を用いた
ものも含まれる。この他、いわゆるＣＤＲグラフティン
グ技術によるモノクローナル抗体すなわち相補性決定領
域のみ動物由来のアミノ酸配列からなり、それ以外の配
列は全てヒト由来のものであるものも、ここでいうヒト
型のモノクローナル抗体に含まれる。
を用いる場合には、ヒト型のモノクローナル抗体を用い
ることが望ましい。ヒト型のモノクローナル抗体には、
ヒトのモノクローナル抗体のほか、いわゆるキメラ抗体
すなわち可変領域のみマウス等の動物由来のアミノ酸配
列からなり、定常領域にはヒトのアミノ酸配列を用いた
ものも含まれる。この他、いわゆるＣＤＲグラフティン
グ技術によるモノクローナル抗体すなわち相補性決定領
域のみ動物由来のアミノ酸配列からなり、それ以外の配
列は全てヒト由来のものであるものも、ここでいうヒト
型のモノクローナル抗体に含まれる。
【００１７】これらのキメラ抗体あるいはＣＤＲグラフ
ティング技術によるモノクローナル抗体は、現在の遺伝
子組換え技術によれば、本発明のモノクローナル抗体を
産生するマウスのハイブリドーマから、それに対応する
遺伝子を取り出してヒト抗体遺伝子と組み換え、動物細
胞に導入して発現させることによっても容易に作製する
ことができる。例えばInt. J. Cancer, ４４，４２４〜
４３３（１９８９），Pro Natl Acad Sci USA,８７，８
０９５〜８０９９（１９９０）に記載のごとくである。
また、アミノ酸配列を変えずに、モノクローナル抗体の
産生効率向上を目的として、ハイブリドーマから取り出
した本発明の抗体に対応する遺伝子を他の動物細胞にお
いて発現させることも可能である。本発明のモノクロー
ナル抗体には、これらの遺伝子組換え技術によって得ら
れるモノクローナル抗体およびそれを産生する動物細胞
も含まれる。
ティング技術によるモノクローナル抗体は、現在の遺伝
子組換え技術によれば、本発明のモノクローナル抗体を
産生するマウスのハイブリドーマから、それに対応する
遺伝子を取り出してヒト抗体遺伝子と組み換え、動物細
胞に導入して発現させることによっても容易に作製する
ことができる。例えばInt. J. Cancer, ４４，４２４〜
４３３（１９８９），Pro Natl Acad Sci USA,８７，８
０９５〜８０９９（１９９０）に記載のごとくである。
また、アミノ酸配列を変えずに、モノクローナル抗体の
産生効率向上を目的として、ハイブリドーマから取り出
した本発明の抗体に対応する遺伝子を他の動物細胞にお
いて発現させることも可能である。本発明のモノクロー
ナル抗体には、これらの遺伝子組換え技術によって得ら
れるモノクローナル抗体およびそれを産生する動物細胞
も含まれる。
【００１８】ヒト型モノクローナル抗体の作製方法に
は、上記のほかに、ヒトのＢリンパ球をヒトまたはマウ
スのミエローマあるいはヘテロミエローマと細胞融合す
る方法もある。ヒトのミエローマと細胞融合する方法と
しては、例えばJ. Immunol Methods, ６１，１７〜３２
（１９８３）に、マウスのミエローマと細胞融合する方
法としては、例えばProc Natl Acad Sci USA, ７７，６
８４１〜６８４５（１９８０）に、ヘテロミエローマと
細胞融合する方法としては、例えばProc Natl Acad Sci
USA, ８１，３２１４（１９８４）等に記載されてい
る。これらの方法を実施するにあたっては、ヒトのＢリ
ンパ球を細胞融合する前にｉｎ ｖｉｔｒｏで刺激して
おく方がよい。その方法としては、例えばBiochem Biop
hys Rec Commun, １３５，４９５（１９８６）に記載の
方法によればよい。
は、上記のほかに、ヒトのＢリンパ球をヒトまたはマウ
スのミエローマあるいはヘテロミエローマと細胞融合す
る方法もある。ヒトのミエローマと細胞融合する方法と
しては、例えばJ. Immunol Methods, ６１，１７〜３２
（１９８３）に、マウスのミエローマと細胞融合する方
法としては、例えばProc Natl Acad Sci USA, ７７，６
８４１〜６８４５（１９８０）に、ヘテロミエローマと
細胞融合する方法としては、例えばProc Natl Acad Sci
USA, ８１，３２１４（１９８４）等に記載されてい
る。これらの方法を実施するにあたっては、ヒトのＢリ
ンパ球を細胞融合する前にｉｎ ｖｉｔｒｏで刺激して
おく方がよい。その方法としては、例えばBiochem Biop
hys Rec Commun, １３５，４９５（１９８６）に記載の
方法によればよい。
【００１９】このほか、ヒトモノクローナル抗体を作製
する方法としては、ＥＢウイルスによるヒトＢリンパ球
のトランスフォーメーションが挙げられる。
する方法としては、ＥＢウイルスによるヒトＢリンパ球
のトランスフォーメーションが挙げられる。
【００２０】すなわち、本発明のモノクローナル抗体
は、II型ＰＬＡ２と硫酸化多糖との結合促進活性を有す
るという、これまでにない活性を有することに特徴があ
るのであって、いずれの種のものであるか、いかなる方
法で作製されたか等は問わない。当業者であれば、かか
る活性を有するモノクローナル抗体が存在することがわ
かれば、種を変えることや、作製方法を変えることに何
ら困難はないであろう。
は、II型ＰＬＡ２と硫酸化多糖との結合促進活性を有す
るという、これまでにない活性を有することに特徴があ
るのであって、いずれの種のものであるか、いかなる方
法で作製されたか等は問わない。当業者であれば、かか
る活性を有するモノクローナル抗体が存在することがわ
かれば、種を変えることや、作製方法を変えることに何
ら困難はないであろう。
【００２１】本発明のモノクローナル抗体はII型ＰＬＡ
２を測定することに用いることもできる。すなわち、Ｅ
ＬＩＳＡ法あるいはＲＩＡ法として知られる免疫化学的
測定手段により、II型ＰＬＡ２濃度を測定することがで
きる。例えば固相側にヘパリンを固定したプレートを用
いることでII型ＰＬＡ２を高感度に測定することが可能
となる。
２を測定することに用いることもできる。すなわち、Ｅ
ＬＩＳＡ法あるいはＲＩＡ法として知られる免疫化学的
測定手段により、II型ＰＬＡ２濃度を測定することがで
きる。例えば固相側にヘパリンを固定したプレートを用
いることでII型ＰＬＡ２を高感度に測定することが可能
となる。
【００２２】また、本発明のモノクローナル抗体を用い
て、硫酸化多糖と結合を形成しているII型ＰＬＡ２を測
定することもできる。この硫酸化多糖との複合体は炎症
等の病態進行のメルクマールとなり得るものである。か
かる硫酸化多糖としてはヘパリン類が挙げられる。II型
ＰＬＡ２はヘパリン存在下で酵素活性が上昇するのに対
し、Ｉ型のものは逆に低下することが知られていること
から、II型ＰＬＡ２の血中濃度そのもののほかに、硫酸
化多糖との複合体の血中濃度を測定する意義が存するの
である。
て、硫酸化多糖と結合を形成しているII型ＰＬＡ２を測
定することもできる。この硫酸化多糖との複合体は炎症
等の病態進行のメルクマールとなり得るものである。か
かる硫酸化多糖としてはヘパリン類が挙げられる。II型
ＰＬＡ２はヘパリン存在下で酵素活性が上昇するのに対
し、Ｉ型のものは逆に低下することが知られていること
から、II型ＰＬＡ２の血中濃度そのもののほかに、硫酸
化多糖との複合体の血中濃度を測定する意義が存するの
である。
【００２３】
【発明の効果】本発明のモノクローナル抗体によれば、
それを治療薬として用いることによりII型ＰＬＡ２のも
つ抗凝固活性、血流循環改善作用、抗菌作用等の生理作
用を促進することが期待できる。
それを治療薬として用いることによりII型ＰＬＡ２のも
つ抗凝固活性、血流循環改善作用、抗菌作用等の生理作
用を促進することが期待できる。
【００２４】また、本発明のモノクローナル抗体を用い
た診断薬、診断キットによれば、例えば血中のII型ＰＬ
Ａ２濃度や、II型ＰＬＡ２と硫酸化多糖との複合体の濃
度を測定することができる。
た診断薬、診断キットによれば、例えば血中のII型ＰＬ
Ａ２濃度や、II型ＰＬＡ２と硫酸化多糖との複合体の濃
度を測定することができる。
【００２５】
【実施例】以下、実施例により本発明をさらに詳細に説
明するが、本発明はこれにより何ら限定されるものでは
ない。
明するが、本発明はこれにより何ら限定されるものでは
ない。
【００２６】
【実施例１】 II型ＰＬＡ２の調製 II型ＰＬＡ２のｃＤＮＡはJ.J. Seilhamerらの報告（J.
Biol. Chem., ２６４，５３３５（１９８９））に記載
の方法によって調製した。すなわち、ヒト胎盤由来ＲＮ
Ａ（クローンテック社より購入）から、逆転写酵素ＲＡ
Ｖ―２（宝酒造）を添付プロトコールに従って用いるこ
とにより、ｃＤＮＡライブラリーを作製した。
Biol. Chem., ２６４，５３３５（１９８９））に記載
の方法によって調製した。すなわち、ヒト胎盤由来ＲＮ
Ａ（クローンテック社より購入）から、逆転写酵素ＲＡ
Ｖ―２（宝酒造）を添付プロトコールに従って用いるこ
とにより、ｃＤＮＡライブラリーを作製した。
【００２７】次に、（５′）ＡＡＣＴＣＴＡＧＡＣＣＡ
ＴＧＡＡＧＡＣＣＣＴＣＣ（３′）および（５′）ＡＧ
ＡＡＧＡＴＣＴＣＣＴＧＣＣＴＧＧＣＣＴＣＴＡ
（３′）なる配列の一本鎖合成ＤＮＡプライマーを用い
たＰＣＲ法によりII型ＰＬＡ２ｃＤＮＡを増幅した。反
応はパーキンエルマー社のＴａｑポリメラーゼを添付プ
ロトコールに従って用いることにより行った。約５６０
ｂｐのII型ＰＬＡ２ｃＤＮＡ断片は、アガロースゲル電
気泳動により精製した。
ＴＧＡＡＧＡＣＣＣＴＣＣ（３′）および（５′）ＡＧ
ＡＡＧＡＴＣＴＣＣＴＧＣＣＴＧＧＣＣＴＣＴＡ
（３′）なる配列の一本鎖合成ＤＮＡプライマーを用い
たＰＣＲ法によりII型ＰＬＡ２ｃＤＮＡを増幅した。反
応はパーキンエルマー社のＴａｑポリメラーゼを添付プ
ロトコールに従って用いることにより行った。約５６０
ｂｐのII型ＰＬＡ２ｃＤＮＡ断片は、アガロースゲル電
気泳動により精製した。
【００２８】続いて、II型ＰＬＡ２ｃＤＮＡを、合成Ｄ
ＮＡリンカーを介してバキュロウイルス組換えベクター
ｐＡＣ ＹＭ１（Matsuura, Y. et al, T. Gen. Viro
l., ６８，１２３３〜１２５０（１９８７）；国立予防
衛生研究所、松浦善治博士より分与された）のＢａｍＨ
Ｉサイトに組み込んだ。
ＮＡリンカーを介してバキュロウイルス組換えベクター
ｐＡＣ ＹＭ１（Matsuura, Y. et al, T. Gen. Viro
l., ６８，１２３３〜１２５０（１９８７）；国立予防
衛生研究所、松浦善治博士より分与された）のＢａｍＨ
Ｉサイトに組み込んだ。
【００２９】これを、夜蛾科のバキュロウイルス（Ａｃ
ＮＰＶ）ＤＮＡと共に昆虫細胞Ｓｆ―９にトランスフェ
クションすることにより、組換えウイルスを得た。Ｓｆ
―９細胞はインビトロジェン社より購入したものであ
り、トランスフェクションおよび組換えウイルスの純化
の操作手順については添付のプロトコールに従った。
ＮＰＶ）ＤＮＡと共に昆虫細胞Ｓｆ―９にトランスフェ
クションすることにより、組換えウイルスを得た。Ｓｆ
―９細胞はインビトロジェン社より購入したものであ
り、トランスフェクションおよび組換えウイルスの純化
の操作手順については添付のプロトコールに従った。
【００３０】次にＳｆ―９細胞を２０ｍｌ／フラスコ
（ファルコン社製）のスケールで静置培養し、ＭＯＩ＝
１で上記組換えウイルスを感染させ、２５℃で４日間培
養した後、その培養上清を回収した。
（ファルコン社製）のスケールで静置培養し、ＭＯＩ＝
１で上記組換えウイルスを感染させ、２５℃で４日間培
養した後、その培養上清を回収した。
【００３１】この培養上清から、ヘパリンセファロース
カラム（ファルマシアＣＬ―６Ｂ）を用いることにより
II型ＰＬＡ２を精製した。すなわち、φ１．５×５ｃｍ
のカラムを用い、１．１リットルの培養上清を通した
後、１０ｍｌの５０ｍＭ Ｔｒｉｓ・ＨＣｌ緩衝液（ｐ
Ｈ７．４）、５０ｍｌの０．３Ｍ ＮａＣｌ／５０ｍＭ
Ｔｒｉｓ・ＨＣｌ（ｐＨ７．４）緩衝液、５０ｍｌの
０．６Ｍ ＮａＣｌ／５０ｍＭ Ｔｒｉｓ・ＨＣｌ（ｐ
Ｈ７．４）緩衝液を順に通したところ、０．６ＭのＮａ
Ｃｌの画分にII型ＰＬＡ２が溶出した。
カラム（ファルマシアＣＬ―６Ｂ）を用いることにより
II型ＰＬＡ２を精製した。すなわち、φ１．５×５ｃｍ
のカラムを用い、１．１リットルの培養上清を通した
後、１０ｍｌの５０ｍＭ Ｔｒｉｓ・ＨＣｌ緩衝液（ｐ
Ｈ７．４）、５０ｍｌの０．３Ｍ ＮａＣｌ／５０ｍＭ
Ｔｒｉｓ・ＨＣｌ（ｐＨ７．４）緩衝液、５０ｍｌの
０．６Ｍ ＮａＣｌ／５０ｍＭ Ｔｒｉｓ・ＨＣｌ（ｐ
Ｈ７．４）緩衝液を順に通したところ、０．６ＭのＮａ
Ｃｌの画分にII型ＰＬＡ２が溶出した。
【００３２】次にこの溶出液を、ウォーターズ６００Ｅ
ＨＰＬＣシステムに組み合わせた逆相カラム（Ｖｙｄ
ａｃTMＣ―４カラム、φ２．２×２５ｃｍ）にかけてさ
らに精製した。用いた緩衝液は０．１％ＴＦＡ／Ｈ2 Ｏ
で、アセトニトリルの０％→５０％のリニアーグラジエ
ント（６０分）をかけた。ここで述べた精製法および次
に述べる抗体作製法はMethods in Enzymology,１９７，
２２３〜２３３を参考とした。かくして、II型ＰＬＡ２
は精製され、次に述べる免疫に用いた。なお、精製II型
ＰＬＡ２はＨＰＬＣで単一ピークであり、Ｌａｅｍｌｉ
の系のＰＡＧＥで単一バンドであった。
ＨＰＬＣシステムに組み合わせた逆相カラム（Ｖｙｄ
ａｃTMＣ―４カラム、φ２．２×２５ｃｍ）にかけてさ
らに精製した。用いた緩衝液は０．１％ＴＦＡ／Ｈ2 Ｏ
で、アセトニトリルの０％→５０％のリニアーグラジエ
ント（６０分）をかけた。ここで述べた精製法および次
に述べる抗体作製法はMethods in Enzymology,１９７，
２２３〜２３３を参考とした。かくして、II型ＰＬＡ２
は精製され、次に述べる免疫に用いた。なお、精製II型
ＰＬＡ２はＨＰＬＣで単一ピークであり、Ｌａｅｍｌｉ
の系のＰＡＧＥで単一バンドであった。
【００３３】
【実施例２】 II型ＰＬＡ２と反応するモノクローナル抗体の作製 実施例１で調製したII型ＰＬＡ２ １０μｇをフロイン
ドのコンプリートアジュバント（ＢＡＣＴＯ社製、１：
１）とともに、２週間毎にＢａｌｂ／ｃマウス（６週
齢、オス）にｉ．ｐ．投与した。これを４回行なった
後、５回目は細胞融合の３日前に上記混合物５０μｌを
ｉ．ｖ．投与した。
ドのコンプリートアジュバント（ＢＡＣＴＯ社製、１：
１）とともに、２週間毎にＢａｌｂ／ｃマウス（６週
齢、オス）にｉ．ｐ．投与した。これを４回行なった
後、５回目は細胞融合の３日前に上記混合物５０μｌを
ｉ．ｖ．投与した。
【００３４】細胞融合の直前にマウスを殺し、脾細胞を
ＰＢＳ中でホモジナイズし、残渣をナイロンメッシュで
濾過後、ＰＢＳで遠心洗浄を１回行なった。この脾細胞
２×１０7 個をマウスミエローマ（Ｐ３―Ｘ６３―Ａｇ
８―Ｕ１）４×１０7 と常法（Kohler, Milstein; Natu
re, ２５６，４９５〜４９７（１９７５））に従って細
胞融合した。
ＰＢＳ中でホモジナイズし、残渣をナイロンメッシュで
濾過後、ＰＢＳで遠心洗浄を１回行なった。この脾細胞
２×１０7 個をマウスミエローマ（Ｐ３―Ｘ６３―Ａｇ
８―Ｕ１）４×１０7 と常法（Kohler, Milstein; Natu
re, ２５６，４９５〜４９７（１９７５））に従って細
胞融合した。
【００３５】すなわち、両細胞を混合後遠沈し、Ｃｅｌ
ｌ Ｐａｃｋにしてから１ｍｌの５０％ポリエチレング
リコール（和光純薬、２０００）ＨＡＴ培地（ＧＩＴ培
地、和光純薬）を２分間かけて滴下し、さらに５分間か
けて１０ｍｌのＨＡＴ培地でポリエチレングリコールを
希釈した後、最終的に同培地で１００ｍｌにしてから２
００μｌ／ウェルで９６ウェルプレート５枚に分注し
た。５％ＣＯ2 、３７℃で一週間培養後、半量（１００
μｌ／ウェル）を除去し、ＨＴ培地（ＧＩＴ培地、和光
純薬）を加えた（１００μｌ／ウェル）。二週間後に以
下に述べるII型ＰＬＡ２をコートしたプレートによるス
クリーニングを行なった。
ｌ Ｐａｃｋにしてから１ｍｌの５０％ポリエチレング
リコール（和光純薬、２０００）ＨＡＴ培地（ＧＩＴ培
地、和光純薬）を２分間かけて滴下し、さらに５分間か
けて１０ｍｌのＨＡＴ培地でポリエチレングリコールを
希釈した後、最終的に同培地で１００ｍｌにしてから２
００μｌ／ウェルで９６ウェルプレート５枚に分注し
た。５％ＣＯ2 、３７℃で一週間培養後、半量（１００
μｌ／ウェル）を除去し、ＨＴ培地（ＧＩＴ培地、和光
純薬）を加えた（１００μｌ／ウェル）。二週間後に以
下に述べるII型ＰＬＡ２をコートしたプレートによるス
クリーニングを行なった。
【００３６】すなわち、II型ＰＬＡ２の５０ｍＭ Ｎａ
ＣＯ3 緩衝液（ｐＨ９．５）溶液（１μｇ／ｍｌ）を９
６ウェルプレート（Ｆａｌｃｏｎ社、ＰＶＣ製）に各ウ
ェル当り５０μｌづつ分注し、３７℃で１時間放置し
た。洗浄後、３％ＢＳＡ／ＰＢＳを各ウェル当り２００
μｌ加えて３７℃で１時間ブロッキングした。再度洗浄
後、各ウェル当り５０μｌの培養上清を加え、室温で１
時間放置し、０．０５％Ｔｗｅｅｎ／ＰＢＳで３回洗浄
した。
ＣＯ3 緩衝液（ｐＨ９．５）溶液（１μｇ／ｍｌ）を９
６ウェルプレート（Ｆａｌｃｏｎ社、ＰＶＣ製）に各ウ
ェル当り５０μｌづつ分注し、３７℃で１時間放置し
た。洗浄後、３％ＢＳＡ／ＰＢＳを各ウェル当り２００
μｌ加えて３７℃で１時間ブロッキングした。再度洗浄
後、各ウェル当り５０μｌの培養上清を加え、室温で１
時間放置し、０．０５％Ｔｗｅｅｎ／ＰＢＳで３回洗浄
した。
【００３７】次に、３％ＢＳＡおよび０．２％スキムミ
ルクを含むＰＢＳで２０００倍に希釈したやぎ抗マウス
ＩｇＧ―アルカリホスファターゼコンジュゲート（Ｔａ
ｇｏ社）をウェル当り５０μｌ加え、室温で１時間放置
した。再度洗浄し、０．２５ｍＭの塩化マグネシウムを
含む１Ｍジエタノールアミン緩衝液（ｐＨ９．８）に溶
解したｐ―ニトロフェニルホスフェート二ナトリウム塩
（和光純薬）の１ｍｇ／ｍｌ溶液をウェル当り１００μ
ｌ加え、室温で３０分間反応させた。この４０５ｎｍに
おける吸光度を、９６ウェルプレート用のＥＬＩＳＡリ
ーダー測定器（Molecular Davice社Ｖｍａｘ）を用いて
調べ、II型ＰＬＡ２と結合するモノクローナル抗体を分
泌するハイブリドーマを選択した。
ルクを含むＰＢＳで２０００倍に希釈したやぎ抗マウス
ＩｇＧ―アルカリホスファターゼコンジュゲート（Ｔａ
ｇｏ社）をウェル当り５０μｌ加え、室温で１時間放置
した。再度洗浄し、０．２５ｍＭの塩化マグネシウムを
含む１Ｍジエタノールアミン緩衝液（ｐＨ９．８）に溶
解したｐ―ニトロフェニルホスフェート二ナトリウム塩
（和光純薬）の１ｍｇ／ｍｌ溶液をウェル当り１００μ
ｌ加え、室温で３０分間反応させた。この４０５ｎｍに
おける吸光度を、９６ウェルプレート用のＥＬＩＳＡリ
ーダー測定器（Molecular Davice社Ｖｍａｘ）を用いて
調べ、II型ＰＬＡ２と結合するモノクローナル抗体を分
泌するハイブリドーマを選択した。
【００３８】このように選択したハイブリドーマについ
て、限界希釈法によるクローニングを２回行ない、株化
した。具体的にはマウス腹腔浸出細胞をＨＴ培地中１０
6 個／ｍｌの割合に調製したものを各ウェルに分注し、
これにウェル当り０．５個の割合でＨＴ培地に懸濁した
ハイブリドーマ細胞を播き込んだ。５％ＣＯ2 のＣＯ 2
インキュベーター内で、３７℃で２週間培養し、その培
養上清について上記ＥＬＩＳＡ法でスクリーニングし、
単一コロニーをピックアップすることで株化を行なっ
た。
て、限界希釈法によるクローニングを２回行ない、株化
した。具体的にはマウス腹腔浸出細胞をＨＴ培地中１０
6 個／ｍｌの割合に調製したものを各ウェルに分注し、
これにウェル当り０．５個の割合でＨＴ培地に懸濁した
ハイブリドーマ細胞を播き込んだ。５％ＣＯ2 のＣＯ 2
インキュベーター内で、３７℃で２週間培養し、その培
養上清について上記ＥＬＩＳＡ法でスクリーニングし、
単一コロニーをピックアップすることで株化を行なっ
た。
【００３９】
【実施例３】 II型ＰＬＡ２とヘパリンとの結合を促進するモノクロー
ナル抗体の取得II型ＰＬＡ２のビオチン化 実施例１により得られたII型ＰＬＡ２ １ｍｇを１ｍｌ
のＰＢＳに溶解し、ＰＩＥＲＣＥ社製ＮＨＳ―Ｌｃ Ｂ
ｉｏｔｉｎを１０倍当量加え、３７℃で１時間反応さ
せ、２ｍｌのヘパリンセファロースＣＬ６Ｂカラムに吸
着させた。これを１０ｍｌの０．３Ｍ ＮａＣｌ／５０
ｍＭ Ｔｒｉｓ・ＨＣｌ（ｐＨ７．４）で洗浄し、さら
に１０ｍｌの０．６Ｍ ＮａＣｌ／５０ｍＭ Ｔｒｉｓ
・ＨＣｌ（ｐＨ７．４）で溶出し、これを以下の実験に
使用した。
ナル抗体の取得II型ＰＬＡ２のビオチン化 実施例１により得られたII型ＰＬＡ２ １ｍｇを１ｍｌ
のＰＢＳに溶解し、ＰＩＥＲＣＥ社製ＮＨＳ―Ｌｃ Ｂ
ｉｏｔｉｎを１０倍当量加え、３７℃で１時間反応さ
せ、２ｍｌのヘパリンセファロースＣＬ６Ｂカラムに吸
着させた。これを１０ｍｌの０．３Ｍ ＮａＣｌ／５０
ｍＭ Ｔｒｉｓ・ＨＣｌ（ｐＨ７．４）で洗浄し、さら
に１０ｍｌの０．６Ｍ ＮａＣｌ／５０ｍＭ Ｔｒｉｓ
・ＨＣｌ（ｐＨ７．４）で溶出し、これを以下の実験に
使用した。
【００４０】ヘパリン結合プレートの作製 ＥＬＩＳＡ用９６ウェルプレート（Ｆａｌｃｏｎ社、Ｐ
ＶＣ製）の各ウェルに、２０μｇ／ｍｌのポリ―Ｌ―リ
ジンを含むＰＢＳを５０μｌ加えて室温で１時間放置し
た。次に各ウェルをＰＢＳにて２回洗浄し、ヘパリンの
ＰＢＳ溶液（２０μｇ／ｍｌ）を５０μｌづつ加え、さ
らに室温で１時間反応させた。続いて各ウェルをＰＢＳ
で２回洗浄し、ＢＳＡのＰＢＳ溶液（３ｍｇ／ｍｌ）を
ウェル当り２００μｌ加えて３７℃で１時間反応させる
ことによりヘパリン結合プレートを作製した。なお、プ
レートの保存は４℃で行なった。
ＶＣ製）の各ウェルに、２０μｇ／ｍｌのポリ―Ｌ―リ
ジンを含むＰＢＳを５０μｌ加えて室温で１時間放置し
た。次に各ウェルをＰＢＳにて２回洗浄し、ヘパリンの
ＰＢＳ溶液（２０μｇ／ｍｌ）を５０μｌづつ加え、さ
らに室温で１時間反応させた。続いて各ウェルをＰＢＳ
で２回洗浄し、ＢＳＡのＰＢＳ溶液（３ｍｇ／ｍｌ）を
ウェル当り２００μｌ加えて３７℃で１時間反応させる
ことによりヘパリン結合プレートを作製した。なお、プ
レートの保存は４℃で行なった。
【００４１】II型ＰＬＡ２とヘパリンとの結合を促進す
る活性を有するモノクローナル抗体の取得 実施例２で得たハイブリドーマ細胞を１０％ＦＣＳ／Ｒ
ＰＭＩ １６４０培地を用い、３００ｍｌフラスコで培
養した。培養上清は対数終期に回収した。この培養上清
５０μｌに０．１μｇ／ｍｌのビオチン化II型ＰＬＡ２
を含む３％ＢＳＡ／ＰＢＳ溶液５０μｌを加え、室温で
１時間放置後、ヘパリン結合９６ウェルプレートにのせ
た。１時間反応後、０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０を含むＰ
ＢＳで各ウェルを洗浄し、続いて３％ＢＳＡおよび０．
２％スキムミルクを含むＰＢＳで２０００倍に希釈した
アルカリフォスファターゼ結合ストレプトアビジン（Ｔ
ａｇｏ社製）をウェル当り１００μｌ加え、室温で１時
間反応させた。次に、実施例２で述べたＥＬＩＳＡ法と
同様にして、アルカリフォスファターゼの酵素活性を測
定することによりII型ＰＬＡ２とヘパリンとの結合を促
進する活性を調べた。これによりII型ＰＬＡ２とヘパリ
ンとの結合を促進する活性を有するモノクローナル抗体
を産生するハイブリドーマ細胞株を選別した。表１に示
すごとく、II型ＰＬＡ２とヘパリンの結合に何ら影響を
与えないもの、阻害するもの、そして本発明の促進させ
るものの三種が見出された。
る活性を有するモノクローナル抗体の取得 実施例２で得たハイブリドーマ細胞を１０％ＦＣＳ／Ｒ
ＰＭＩ １６４０培地を用い、３００ｍｌフラスコで培
養した。培養上清は対数終期に回収した。この培養上清
５０μｌに０．１μｇ／ｍｌのビオチン化II型ＰＬＡ２
を含む３％ＢＳＡ／ＰＢＳ溶液５０μｌを加え、室温で
１時間放置後、ヘパリン結合９６ウェルプレートにのせ
た。１時間反応後、０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０を含むＰ
ＢＳで各ウェルを洗浄し、続いて３％ＢＳＡおよび０．
２％スキムミルクを含むＰＢＳで２０００倍に希釈した
アルカリフォスファターゼ結合ストレプトアビジン（Ｔ
ａｇｏ社製）をウェル当り１００μｌ加え、室温で１時
間反応させた。次に、実施例２で述べたＥＬＩＳＡ法と
同様にして、アルカリフォスファターゼの酵素活性を測
定することによりII型ＰＬＡ２とヘパリンとの結合を促
進する活性を調べた。これによりII型ＰＬＡ２とヘパリ
ンとの結合を促進する活性を有するモノクローナル抗体
を産生するハイブリドーマ細胞株を選別した。表１に示
すごとく、II型ＰＬＡ２とヘパリンの結合に何ら影響を
与えないもの、阻害するもの、そして本発明の促進させ
るものの三種が見出された。
【００４２】
【表１】
【００４３】ここで、II型ＰＬＡ２とヘパリンとの結合
を促進する活性を有する４株について、その活性の濃度
依存性を図１に示す。
を促進する活性を有する４株について、その活性の濃度
依存性を図１に示す。
【００４４】グラフの横軸は、加えたハイブリドーマ培
養上清量を表し、縦軸はヘパリン結合プレートと反応し
たビオチン化II型ＰＬＡ２量を表す。
養上清量を表し、縦軸はヘパリン結合プレートと反応し
たビオチン化II型ＰＬＡ２量を表す。
【図１】II型ＰＬＡ２とヘパリンとの結合を促進する活
性
性
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.6 識別記号 庁内整理番号 ＦＩ 技術表示箇所 Ａ６１Ｋ 39/395 ＡＤＺ Ｃ１２Ｎ 5/10 Ｃ１２Ｐ 21/08 9161−4Ｂ Ｇ０１Ｎ 33/573 Ａ 33/577 Ｂ // Ｃ１２Ｎ 15/02 (Ｃ１２Ｐ 21/08 Ｃ１２Ｒ 1:91）
Claims (6)
- 【請求項１】 ヒトII型ホスホリパーゼＡ２と結合する
抗体であって、ヒトII型ホスホリパーゼＡ２と硫酸化多
糖との結合を促進する活性を有するモノクローナル抗
体。 - 【請求項２】 硫酸化多糖がヘパリンである請求項１に
記載のモノクローナル抗体。 - 【請求項３】 細胞株Ｋ３―１（生命工学工業技術研究
所受託番号ＦＥＲＭＰ―１３８４９号）が産生する請求
項１または２に記載のモノクローナル抗体。 - 【請求項４】 請求項１または２に記載のモノクローナ
ル抗体を産生する動物細胞。 - 【請求項５】 動物細胞がハイブリドーマ細胞またはハ
イブリドーマ細胞から誘導される細胞である請求項４に
記載の細胞。 - 【請求項６】 細胞株Ｋ３―１（生命工学工業技術研究
所受託番号ＦＥＲＭＰ―１３８４９号）。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP5255646A JPH07109300A (ja) | 1993-10-13 | 1993-10-13 | ヒトｉｉ型ホスホリパーゼａ２と結合する抗体 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP5255646A JPH07109300A (ja) | 1993-10-13 | 1993-10-13 | ヒトｉｉ型ホスホリパーゼａ２と結合する抗体 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH07109300A true JPH07109300A (ja) | 1995-04-25 |
Family
ID=17281646
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP5255646A Pending JPH07109300A (ja) | 1993-10-13 | 1993-10-13 | ヒトｉｉ型ホスホリパーゼａ２と結合する抗体 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JPH07109300A (ja) |
Cited By (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO1996020959A1 (en) * | 1994-12-29 | 1996-07-11 | Yamanouchi Pharmaceutical Co., Ltd. | Novel monoclonal antibody having inhibitory effect on type ii phospholipase a2 and protein containing a part of the same |
| EP0937463A1 (en) * | 1998-02-18 | 1999-08-25 | The Procter & Gamble Company | Skin care compositions |
-
1993
- 1993-10-13 JP JP5255646A patent/JPH07109300A/ja active Pending
Cited By (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO1996020959A1 (en) * | 1994-12-29 | 1996-07-11 | Yamanouchi Pharmaceutical Co., Ltd. | Novel monoclonal antibody having inhibitory effect on type ii phospholipase a2 and protein containing a part of the same |
| EP0937463A1 (en) * | 1998-02-18 | 1999-08-25 | The Procter & Gamble Company | Skin care compositions |
| WO1999042131A1 (en) * | 1998-02-18 | 1999-08-26 | The Procter & Gamble Company | Skin care compositions |
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