JPH07109421B2 - カチオン界面活性剤含有洗浄液ならびにクラミジアおよび淋菌の測定におけるその使用 - Google Patents

Description

【発明の詳細な説明】 〔産業上の利用分野〕 本発明は、生物学的被験体中のクラミジア生菌体または
淋菌生菌体の測定方法で有用な洗浄液に関する。具体的
には、この発明はカチオン界面活性剤を含んでなる洗浄
液に関する。

〔従来の技術〕

最近では、イムノアッセイが感染性疾患の存在を検出す
るのに使用されてきた。このアッセイが有用であるため
には、高度の信頼性を保ちながら特殊な生菌体を検出し
なければならない。これには殆どの場合に、生菌体に関
する特定抗原の単離およびその抗原と対応する抗体との
反応が必要である。商業的に成功するための試金石とし
ては、加えて、相当安価であり使用が簡便で、かつ迅速
であることも必要である。

イムノアッセイによって検出することができるかかる生
菌体の１つは、クラミジアーレス（Chlamydiales）目、
クラミジアセエ（Chlamydiaceae）属の２つの菌種の１
つであるクラミジア・トラコマチス（Chlamydia tracho
matis）（本明細書では、「C.トラコマチス」という）
である。トラコーマ、包入体性結膜炎、性病性リンパ肉
芽腫、非淋菌性尿道炎および直腸肛門炎を包含する多数
のヒトの眼および性器の疾病の原因となるこの種に属す
る15以上の菌株が存在する。C.トラコマチスに由来する
感染症は、普通の人々の間で蔓延し、そのため非淋菌性
尿道炎だけをとっても各年毎に数百万人存在すると信じ
られる。

淋菌は、ナイセリア（Neisseria）属、特にN.ゴノロエ
エ（N.gonorrhoeae）に属する細菌により惹起される性
器接触で一般に伝播される疾病である。この疾病は年に
数千の人間を疾病にかからせ、たとえ抗生物質がその蔓
延の抑制に役立っているとはいえ、いまだ世界の多くの
地域の流行期にある人々の間に存続している。この生菌
体の検出および処置の重要性は、十分に認識されてい
る。N.メニンギチジス（N.meningitidis）およびN.ラク
タミカ（N.lactamica）もまた医療および診断上無視で
きない対象の種である。

これらの疾病の広く蔓延する性質のため、これらの原因
となる生菌体の検出について迅速、簡便かつ信頼できる
試験を入手することに相当な興味が存在する。これらの
生菌体から検出可能な抗原を抽出する有用な方法を見い
出すべくかなりの研究が行われてきた。例えば、米国特
許第4,427,782号および同4,663,291号明細書ならびにヨ
ーロッパ特許公開第174,106号および同193,431号公報を
参照のこと。

固体支持体を使用して実施するC.トラコマチスおよびN.
ゴノロエエについてのアッセイは、それぞれ米国特許第
4,497,899号および同4,497,900号明細書に記載されてい
る。記載されているアッセイは、生菌体から抗原を抽出
し、それを裸の固体支持体上に塗布することによって行
われている。次に、塗布された抗原が、１つは適当に標
識されている１種または２種の抗体いずれかにより検出
されている。このアッセイの主要な態様は、付着の目的
で全くどのような材料によっても処理または塗布されて
いない固体支持体が使用されていることが明らかであ
る。抗原の付着は、支持体上への抗原の吸着を起こすの
に十分長い時間その塗布支持体をインキュベーションす
ることにより達成されていることが明らかである（米国
特許第4,497,899号明細書、カラム２、51〜55行）。米
国特許第4,497,899号明細書に記載されるアッセイ全体
は、完結までに少なくとも３時間かかる。N.ゴノロエエ
について、ほんのわずか早められた同様なアッセイは、
米国特許第4,497,900号明細書（カラム、４および５を
参照のこと）に記載されている。

このような既知のアッセイを実施するに際して、結合抗
原および結合免疫複合体は水または緩衝液により洗浄さ
れている。Caldwellら〔J.Clin.Microbiol.18（３）,53
9〜545ページ、1983〕は、洗浄工程を非イオン界面活性
剤、Tween^TM20を含有するリン酸緩衝溶液（PBS）を使用
して行うC.トラコマチスに対するイムノアッセイを記載
する。N.ゴノロエエに対する同様なアッセイは、米国特
許第4,241,045号明細書に記載されている。

〔発明が解決しようとする課題〕

クラミジア生菌体または淋菌生菌体に関するアッセイで
既知の洗浄方法を使用することは、そのバックグランド
が高すぎるかもしくは感度が低くすぎ、そして抗体が高
原に対するよりもむしろ固体支持体に結合することが見
い出されることから受け入れることができない。

〔課題を解決するための手段〕

前記課題は、本発明によると、１種以上のカチオン界面
活性剤を少なくとも0.1重量％含んでなる、クラミジア
および淋菌の測定に使用するための洗浄液によって解決
される。

本発明は、また、クラミジア生菌体および淋菌生菌体の
いずれか一方の生菌体を測定するための方法であって、 A.前記クラミジアまたは淋菌生菌体を含むことが予測さ
れる被験体から抽出された前記クラミジアまたは淋菌の
抗原を、その抗原に対する抗体と接触させることにより
抗原と抗体の免疫複合体を形成する工程、 B.複合体形成の前、それと同時またはその後に、前記抗
原もしくは抗体のいずれか一方または両者を固体支持体
上で不溶化することにより、前記固体支持体に結合した
免疫複合体を形成する工程、 C.1種以上のカチオン界面活性剤少なくとも0.1重量％を
含んでいる洗浄液で前記複合体を洗浄することにより、
前記結合した免疫複合体から複合体化していない物質を
分離する工程、ならびに D.被験体中の前記クラミジアまたは淋菌生菌体の量を示
すものとして前記結合した複合体の存在を測定する工
程、 を含んでなるクラミジアまたは淋菌生菌体の測定方法も
提供する。

〔具体的な記述〕

本発明は、適当な医療および診断法を使用して患者から
得られた生物学的被験体中のC.トラコマチス（C.tracho
matis）（または他のクラミジア種）の存在、あるいは
N.ゴノロエエ（N.gonorrhoeae）（または他の淋菌種）
の存在を測定する方法である。このような被験体として
は、例えば、患者の頚管、尿道、咽頭または肛門から得
られる綿棒被験体、および滑液または病巣由来の流体の
ような体液が挙げられる。こうして得られる生物学的被
験体は、測定されるべきクラミジア抗原もしくは淋菌抗
原（またはそれらの混合物）を有するクラミジア生菌体
または淋菌生菌体を含むことが予測される。

このアッセイは、クラミジア細胞全体または淋菌細胞全
体の抗原部位の検出を行うことができるが、アッセイ感
度を高めるにはそれらの生菌体から抗原を抽出すること
が一般に望ましい。標準的な手段、例えば溶媒希釈また
は高pH溶菌溶液、酵素処理および超音波または遠心のよ
うな物理的攪拌を使用することで、生菌体を溶解し、そ
して含まれる抗原を遊離させることができる。加熱法も
当該技術分野で溶菌法として公表されている。ドデシル
硫酸ナトリウムおよびデオキシコール酸ナトリウムのよ
うなアニオン洗浄剤または塩の使用は、米国特許第4,49
7,899号、同4,497,900号および同4,663,291号明細書に
記載されている。

好ましい態様では、本発明を使用してクラミジアリポポ
リサッカライド（糖脂質群）抗原（例えば、ヨーロッパ
特許公開第193431号公報に記載）を検出することができ
る。その公報には、また、抽出法も記載されている。も
う一つの態様では、検出される抗原が会合する外層幕蛋
白全体の60％を占めるその生菌体のクラミジア主要外層
膜蛋白であってもよい。ある例では、これらのクラミジ
ア抗原混合物が本発明を使用して検出されうる。さらに
もう一つの態様では、本発明を使用して１種以上の淋菌
抗原（IAもしくはIB蛋白）または別個の淋菌株に由来す
る抗原混合物が検出される。

好ましい抽出組成物は、アルコールアミンまたはその塩
を含んでなり、かつ高pH（少なくとも８）を有する。こ
の好ましい組成物のより詳細は、例との関連で後述す
る。

さらに、蛋白質、全血または粘液を分解するため抽出工
程でプロテアーゼを使用することが好ましい場合もあ
る。

必須ではないが、生菌体から抗原の抽出がされた後、次
の操作を行う前に被験体を予備濾過して細胞残屑、微小
粒子または他の不要物を除去することが望ましい。予備
濾過は、ある型のフィルターを有する適当な容器で行う
ことができる。

抽出は、抗原の抽出用として特別に設計された装置を含
むいずれかの適当な容器で行うことができる。利用可能
な装置は、米国特許第4,746,614号明細書を含む従来技
術で知られている。

抽出された抗原は１種以上の適当な抗体とそれを免疫的
に反応させるイムノアッセイを使用して検出される。得
られた免疫複合体は、適当は放射線、比色、蛍光または
酵素標識試薬を使用して検出される。ある場合には、試
薬は抗原に対する標識抗体であり、またある場合には、
抗原と反応する未標識抗体に向けられる標識抗−抗体で
ある。このようなイムノアッセイは、一般に、塗布され
ているかまたは塗布されていないある型の固定支持体上
での検出可能な免疫複合体の形成、それに続く適当な検
出法を含む。別のアッセイは、免疫複合体の少なくとも
１種の反応体（例えば、抗体）が複合体形成中に一緒に
凝集するようなある型の標識または未標識粒子に付着さ
れた場合に免疫複合体の凝集を伴う。

有用なアッセイの例としては、コンペティティブイムノ
アッセイまたはエンザイム・リンクト・イムノアブソー
ベント・（通常「ELISA」と称される）が挙げられる。
これらのアッセイは米国特許第4,427,782号明細書およ
びSchmeerらにより、J.Clin.Microbiol.,15（５）,830
〜834ページ（1982）に概述されている。使用されるク
ラミジア抗体または淋菌抗体は生菌体から抽出されてい
るいずれかの抗原または数種の抗原に向けることができ
る。一の態様では、抗体がC.トラコマチスのリポポリサ
ッカライドのような単一抗原に向けられる。もう一つの
態様は、各種抗体混合物が数種の淋菌株から抽出される
ような数種の抗原に向けられる。

好ましくは、抽出された抗原はそれが結合しうるオリマ
ー固体支持体と接触される。利用可能な支持体材料とし
ては、ガラス、セルロース系またはポリマービーズ、フ
ィルム、チューブ、ゲル、プレートおよび当該技術分野
で既知のものが挙げられる。好ましくは、支持体材料は
より詳細について後述するような微孔質膜である。この
膜は、「裸」、すなわち何等かの物質によっても処理さ
れていないかまたは塗布されていないものであることが
できる。しかしながら、それはアッセイ性能を高めうる
物質（例えば、界面活性剤）で好ましくは処理または塗
布される。

ある態様では、固体支持体は負数の正荷電基をその表面
に有する。これらの正荷電基は、支持体表面にポジティ
ブな電荷、すなわち広いpH範囲を通じてポジティブなゼ
ータ（zeta）電位を生じさせる。ゼータ電位は、支持体
とそれに接触する流体との間の電位差として知られてい
る。支持体上に所定のゼータ電位を生じさせるすべての
正荷電化学残基が本発明の実施上利用可能である。

例えば、この支持体は、抽出抗原とイオン的に結合し得
る適当なカチオン基を表面上に有するいずれかの天然ま
たは合成ポリマーから構築することができる。利用可能
なポリマーとしては、必要な荷電基を有するポリエステ
ル、ポリアミド、ポリカーボネート、ポリエチレンイミ
ン、セルロース系材料およびエチレン系不飽和ビニルモ
ノマーから製造される付加ポリマーならびに当該技術分
野で既知の他のポリマーが挙げられる。一般に、カチオ
ン基としては、第四級アンモニウム塩、第四級ホスホニ
ウム塩、第四級スルホニウム塩、第四級ピリジニウム
塩、第四級ピリミジニウム塩または第四級イミダゾリウ
ム塩が挙げられ、第四級アンモニウム塩が好ましいもの
である。さらなる詳細は、引用により本明細書の内容と
なる、前述の出願を調査することにより得ることができ
る。

ある種の利用可能なポリマー固体支持体は、Posidyne^TM
またはBiodyne^TM−Ｂ膜のような既知の微孔質膜であ
る。これらの支持体は、細孔に第四級アンモニウム基を
有するポリエステルが塗布されたナイロン膜からなる。
他の膜、例えば界面活性剤が塗布されたものも、また本
発明の実施上利用可能である。

抗原が免疫反応前に固体支持体に結合される前述の態様
と対比して、本発明のアッセイは、抗原が固体支持体に
付着すると同時かまたはその前後で免疫複合体を形成す
ることによっても実施することができる。換言すれば、
溶液中で複合体が形成された後、固体支持体との接触に
よりそれにバインディングすることができる。

本明細書で開示される支持体は、アッセイを実施するた
めの他の備品（ボトル、試験管、綿棒、ビーカーまたは
カップ）と組み合わせて使用することができる。また、
好ましくは、支持体はアッセイを実施しそしてすべての
流体に適合しうる使い捨て試験装置中に固定された微孔
質膜を有する。利用可能な試験装置の構成は、米国特許
第3,825,410号、同3,888,629号、同3,970,429号および
同4,446,232号明細書を含む従来技術で知られている。
特に有用な装置は、特開昭63−223563号公報（昭和63年
９月19日公開）および特願昭63−234692号明細書（昭和
63年９月18日出願）に記載されている。

前記荷電支持体と抗原の接触により、ほとんど瞬間的に
抗原は支持体に結合される。場合により、すべての未結
合抗原は、本発明の洗浄液で洗浄することによって支持
体から除去してもよい。

前記接触の10分以内、好ましくは１〜５分以内に結合抗
原は、クラミジア抗体または淋菌抗体と接触されること
により支持体上で免疫複合体を形成する。流体と未結合
物質は、同時に素早く除去することができる。アッセイ
が使い捨て装置を使用して実施される場合、その支持体
は、被験体中の流体および複合体化していない物質を通
過させ、膜に抗原が結合するような微孔質膜であっても
よい。

このアッセイで使用されるクラミジア抗体または淋菌抗
体は、１種以上のクラミジア株または淋菌株（目的の生
菌体が何んであるかに応じて）と特異的免疫反応生を有
する。それは、ポリクロナルまたはモノクロナルである
ことができる。ポリクロナルの場合には、それは市販さ
れているか、または検出される生菌体株に共通する抗原
を使用する既知の方法で各種動物で産生される。単一抗
体またはその混合物も使用することができる。例えば、
クラミジアリポポリサッカイドまたは主要外層膜蛋白抗
原のいずれかに対する抗体、あるいは両抗原に対する抗
体をこのアッセイで使用することができる。好ましく
は、抗体は市販または標準的なハイブリドーマ法を使用
して調製されるモノクロナルである。

一の態様では、抗原に対する抗体は検出のために標識さ
れる。利用可能な標識は、当該技術分野で既知であり、
これらには適当な方法および装置を使用して直接検出で
きる化学的または生物学的化合物、ならびに検出可能な
種を提供するさらなる化学的または特異的なバインディ
ング反応を介して検出することができる化合物が含まれ
る。標識が酵素、例えば、グルコースオキシダーゼ、ウ
レアーゼ、ペルオキシダーゼおよびアルカリホスファタ
ーゼなどである場合には、基質および色素生成試薬もま
た必要である。

特に好ましい態様では、標識がペルオキシダーゼであ
り、アッセイのある時点で過酸化水素および適当な色素
生成試薬を添加し、検出可能な色素を提供する。例え
ば、有用な色素生成試薬には、トリアリールイミダゾー
ルロイコ染料またはペルオキシダーゼおよび過酸化水素
の存在下で反応して色素を提供する他の化合物（すなわ
ち、ペルオキシダーゼの触媒作用により反応して色素を
提供する化合物）のようなロイコ染料が含まれる。

好ましい態様では、クラミジア抗体または、淋菌抗体は
標識されておらず、そして形成され支持体に結合されて
いる抗体−抗原複合体の検出は、それぞれ前記未標識
（標識されていない）抗体に特異性を有し、かつ適当に
標識されている第二の抗体（以下に記載する）を使用し
て行われる。

結合抗原が一度クラミジア抗体または淋菌抗体と接触し
てしまうと、支持体上で結合免疫複合体が形成される。
この複合体の形成を促進するには、一般に、15〜30℃の
温度で10分未満前記抗体と抗原がインキュベーションさ
れる。好ましくは、インキュベーションは18〜25℃（す
なわち、室温）で１〜５分間行われる。この温和なイン
キュベーション条件は、米国特許第4,497,899号明細書
で裸の支持体に対するクラミジア抗原の吸着のための要
件として記載される37℃30分と際立った対照を示す。

前記インキュベーション後であって抗体−抗原の接触10
分以内に、結合複合体は、一般にpH7〜12、好ましくはp
H9〜11を有するこの発明の洗浄液で１度以上洗浄され
る。洗浄液のpHは、特定の塩基または緩衝剤の緩衝能に
応じて緩衝剤を使用して得ることができる。すなわち、
溶液のpHは塩基で高めそして緩衝剤で持続するか、また
は特定の強緩衝剤を使用してpHの上昇と持続の両者を達
成することができる。

洗浄液中に存在させうる緩衝剤、当業者に自明なもので
ある。例としては、水酸化アルカリ金属、アルカリ土類
金属およびアンモニウム（例えば、水酸化ナトリウム、
水酸化カリウムおよび水酸化アンモニウム）、リン酸塩
（例えば、リン酸三ナトリウムおよびリン酸三カリウ
ム）、ホウ酸塩、３−シクロヘキシルアミノ−１−プロ
パンスルホン酸、３−（Ｎ−シクロヘキシルアミノ）エ
タンスルホン酸、３−シクロヘキシルアミノ−３−ヒド
ロキシ−１−プロパンスルホン酸および当該技術分野で
既知の他のものが挙げられる。緩衝剤と塩基の量は、適
切なpHおよび緩衝能を提供するように選ばれる。場合に
より緩衝剤と塩基の混合物を使用してもよい。

洗浄液はまた、１種以上のカチオン界面活性剤を含む。
特に有用な界面活性剤は、第四級アンモニウム塩、第四
級ホスホニウム塩、第四級ピリジニウム塩および第四級
イミダゾリウム塩または分子中に他のカチオン基を有す
るカチオン界面活性剤である。一般に、支持体上の結合
抗原または免疫複合体に悪影響を及ぼさない限りすべて
のカチオン界面活性剤を本発明で使用することができ
る。これらの要件に合致する多くのカチオン界面活性剤
が当該技術分野で知られている。McCutcheon's Emulsif
iers and Detergents,1986版（McCutcheon Division,Pu
blishing Co.,Glen Rock,N,J.1986）の標準的な供給源
に相談すると有用なカチオン界面活性剤のいくつかを見
い出すことができる。

代表的な界面活性剤としては、ポリプロポキシ第四級ア
ンモニウムクロライド、アセテートおよびホスフェート
（Emcol^TMとして市販されている）、脂肪酸アミノアル
キルメチルアミン（Schercodines,商品名）、エトキシ
ル化脂肪族アミン（Pegameens,商品名）、長鎖アルキル
ジエタノールメチル第四級アンモニウムクロライド（Ｍ
−Quat^TM）、イミダゾリンの脂肪酸誘導体（Monazoline
s,商品名）、ポリオキシエチレン脂肪族アミン（Mazeen
^TM）ならびに長鎖アルキルヒドロキシエチルイミダゾリ
ン（Alkazines,商品名）が挙げられる。最も有用な界面
活性剤は、ポリプロポキシ−ｔ−アミンの第四級アンモ
ニウム塩（例えばEmcol^TMCC−９、CC−55およびCC−5
7）である。溶液中のカチオン界面活性剤量は、一般に
少なくとも0.1重量％である。好ましくは、0.5〜３重量
％の量で存在する。この量は、最高の結果を得るために
はそれぞれの界面活性剤について調整することができ
る。特に有用な洗浄液は、例との関連で後述する。

前述の態様で、クラミジア抗体または淋菌抗体が標識さ
れている場合には、洗浄後のアッセイ手順は、直接的な
その標識の検出か、または適当な試薬添加後の間接的な
検出となる。検出は、結合複合体の洗浄後の、比較的速
やかに、すなわち、一般的に10分以内、好ましくは１〜
５分以内に行われる。場合により標識の検出は、試薬が
許容するならばインキュベーションにより促進してもよ
い。次に、標準的な装置および方法を使用して標識が検
出される。

好ましい態様では、クラミジア抗体または淋菌抗体は標
識されておらず、そして結合複合体の洗浄後にそれが、
標識されていない抗体に向けられた抗体と接触される。
この第二の抗体（すなわち、抗−抗体）は、前述した標
識のいずれかにより適当に標識される。この抗体は、市
販または既知の方法を使用して調製されるモノクロナル
またはポリクロナルであることができる。クラミジアの
アッセイでは、抗−抗体はリポポリサッカライド抗体ま
たは主要外層膜蛋白抗体のいずれかと反応性を有するポ
リクロナル抗体が好ましい。

この接触後、支持体に結合されている得られた抗原−抗
体−抗体複合体は、15〜30℃の温度で10分未満、好まし
くは18〜25℃で１〜５分間インキュベーションされる。

次に、本発明の洗浄液またはいずれか他の適当な洗浄液
（例えば、水または緩衝液）を使用してさらに洗浄を行
って複合体化していない物質を除去し、次いで適当な酵
素基質または他の必要な試薬を添加して検出可能な種を
提供する。その後、この抗原−抗体−標識抗体複合体
は、標準的な放射線、比色、蛍光または他の検出法を使
用して支持体上で検出される。

クラミジア生菌体または淋菌生菌体の測定に好ましい方
法は以下の工程を含んでなる： A.クラミジア生菌体または淋菌生菌体を含むことが予測
される被験体から、それぞれ抽出されたクラミジア抗原
または淋菌抗原を、ポリマー固体支持体と接触させるこ
とによりその固体支持体上に抗原を結合する工程、 B.前記接触の10分以内に、前記結合抗原を未標識クラミ
ジア抗体または淋菌抗体と接触させることにより支持体
上に結合した免疫複合体を形成する工程、 C.前記抗体−抗原の接触の10分以内に、この発明の洗浄
液で前記複合体を洗浄することにより、前記結合免疫複
合体から複合体化していない物質を分離する工程、 D.前記結合複合体を、その未標識抗体に対する標識抗体
と接触させることにより支持体上に標識抗体−抗体−抗
原複合体を形成する工程、 E.工程Ｄにおける接触の10分以内に、この発明の洗浄液
で前記標識複合体を洗浄することによりその結合標識複
合体から複合体化していない物質を分離する工程、およ
び F.被験体中のクラミジア生菌体または淋菌生菌体の量の
測定として支持体上の標識複合体の存在を測定する工
程。

前記の好ましい方法では、必要により、この発明の洗浄
液を使用して結合抗原から未結合抗原を分離することも
可能である。

〔実施例〕

以下の例で本発明を具体的に説明するが、本発明の範囲
を限定するものではない。

なお、本明細書で「TM」が付される名称は商品名または
商標であることを意味する。

クラミジアリポポリサッライド抗原に対するマウスモノ
クロナル抗体は、標準的ハイブリドーマ法およびマウス
細胞系を使用して調製し、アジド0.01重量％を含有する
リン酸緩衝溶液（PBS）（pH7.4）中に貯蔵した。このア
ッセイで使用される抗体組成物は、カゼイン（0.5重量
％）およびLonzaine^TMC両性界面活性剤（0.01重量％）
含有PBSに前記抗体溶液試料（19μ）を添加（1:800希
釈）して調製し、次いで0.22μｍのフィルターで濾過し
て使用液を得た。

使用される標識ポリクロナル抗体は、ワサビペルオキシ
ダーゼに接合させたヤギ抗マウスIgG抗体であった。こ
の接合体を、カゼイン0.5重量％とLonzaine^TMC0.01重量
％含有PBSで1:2000まで希釈し、次いで0.22μｍのフィ
ルターで濾過して使用液を得た。

抗原抽出溶液は、次の成分から調製した： アジ化ナトリウム（25ml中25mg）、塩化ナトリウム（1.
5モル濃度溶液2.5mlを25mlに希釈した）、ジチオスレイ
トール還元剤（（25ml中29mg）、エタノールアミン（10
％溶液6.25mlを25mlに希釈した）、エチレンジアミン四
酢酸（25ml中0.23g）および水酸化ナトリウム（0.1モル
濃度、pHを12.5に調節）。この溶液15mlに、メタノール
中10重量％のEmcol^TMCC−36カチオン界面活性剤（ポリ
プロポキシ−ｔ−アミンの塩化四級アンモニウム塩）溶
液375μを添加した。

例1:2種の抗体を使用するクラミジア・トラコマチス（C
hlamydia trachomatis）リポポリサッカライド抗原の測
定 この例は、２種の抗体、一つはリポポリサッカライドC.
トラコマチス抗原に向けられたものであり、第二は標識
され、かつそのクラミジア抗体に向けられた抗体を使用
する本発明の実施例を示す。

アッセイは、使い捨て装置により行った。それは表面上
に四級アンモニウム基を有する微孔質膜（Pall Biodyne
^TM−Ｂ膜として市販されている、Pall Corp.製）を含め
た。使用前にこの膜は、Zonyl^TMFSNで処理した。

クラミジアリポポリサッカライド抗原は、前述の抽出組
成物を使用して約５分間約20℃で基本小体（elementary
body）蛋白から抽出した。次に、シトレート（0.7モル
濃度溶液100μ）を添加して約pH7〜８に低下させ、次
いで市販のプロテアーゼ（例えば、Sigma Chemicalから
入手したプロテアーゼP0 652のPBS溶液2mg/mlの400μ
）を添加した。約20℃でさらに５分間抽出を続けた
後、過酸化水素と水酸化ナトリウム（pH10以上）を加え
て内因性カタラーゼ、ペルオキシダーゼおよびミエロペ
ルオキシダーゼを除去した。

次に、５μｍのフィルターで処理被験体を濾過して不要
物を除去した。濾過した抽出物（120μ）を、使い捨
て試験装置の試験ウェルに添加した。被験体流体を膜に
接触させながら流出させた。２または３秒以内で膜を通
してすべての流体を排出し、前述のモノクロナル抗体溶
液を試験ウェルに添加し排液させた。

膜に結合した免疫複合体を、PBS（pH7.2）中Emcol^TMCC
−９カチオン界面活性剤（0.75重量％）を含有するこの
発明の洗浄液で２度洗浄した。

２度目の洗浄直後に、前述のペルオキシダーゼ標識ポリ
クロナル抗体溶液（120μ）を試験ウェルに添加し、
次いで直ちに流体を排出した。約５分間約20℃でインキ
ュベーションして、膜にイオン的に結合した抗原−抗体
−標識抗体複合体を形成させた。

前述の洗浄液（160μ）で２度洗浄した後、試験ウェ
ルに色素生成組成物（120μ）を添加した。この組成
物は、過酸化水素（10ミリモル濃度）、２−（４−ヒド
ロキシ−３−メトキシフェニル）−4,5−ビス（４−メ
トキシフェニル）イミダゾールロイコ染料（0.005重量
％）、ポリ（ビニルピロリドン）（１重量％）、４′−
ヒドロキシアセトアニリド（５ミリモル濃度）およびジ
エチレントリアミン五酢酸（10ミリモル濃度）を含む。

室温で約５分後に、試験ウェル中で被験体から得られた
クラミジア抗原の存在を示す赤色色素が観察された。抗
原抽出後の全アッセイは、30分未満で実施された。

例2:1種の抗体を使用するC.トラコマチスリポポリサッ
カライド抗原の測定 この例は、アッセイにおいてただ１種の抗体を使用した
こと以外は例１と同様である。この抗体は、C.トラコマ
チスのリポポリサッカライド抗原に対するペルオキシダ
ーゼ標識マウスモノクロナル抗体であった。この標識抗
体は、標準的なハイブリドーマ法を使用して得た。

PBS中ポリオキシエチレン−９−ラウリルエーテル（0.0
5重量％、80μ）、Zonyl^TMFSN（１重量％、80μ）
およびエチレンジアミン四酢酸（20ミリモル濃度、80μ
）の混合物を使用して基本小体蛋白質から抗原を抽出
した。このPBS容量は、抗原5750pg含有試料について緩
衝化対照溶液（抗原を含まない）560μ〜510μに変
化させた。抽出は45℃で10分間行い、10秒間攪拌し次い
で室温に放冷した。

使い捨て試験装置中のPosidyne^TM膜は、ポリオキシエチ
レン−９−ラウリルエーテル（0.005重量％、100μ
）、Zonyl^TMFSN（0.1重量％）およびエチレンジアミ
ン四酢酸（２ミリモル濃度）で予め湿潤させた後、37℃
で15分間乾燥させた。

いろいろな濃度の抗原（288,585,1150,2875および5750p
g）を有する抽出抗原溶液および対照溶液を、別個に使
い捨て装置に添加し、直後に流体を排出させた。

0.05モル濃度のPBS（pH7.2）中の市販の脱脂粉乳（１重
量％）、ウシ胎仔血清（１重量％）で1:450に希釈した
ペルオキシダーゼ標識抗体接合体の溶液（200μ）を
加え、次いで負圧で膜の上面に流体を維持しながら室温
で５分間試験装置内で反応混合物をインキュベーション
した。その後、膜を通して流体を排出させた。

PBS中Emcol^TMCC−９カチオン界面活性剤（0.75重量％）
含有のこの発明の洗浄液（500μ）を、試験装置に加
え、次いで排液した。

負圧で膜の上面に流体を維持しながら前述のロイコ染料
溶液（50μ）を試験装置に加えた。２もしくは３秒
後、流体を排出し次いで色素を生成させた。

色素濃度を視覚的に読みとった後段階付けしたところ、
試験された抗原量の増加につれて着色段階の上昇がみら
れた。対照ウェルでは全く色素が観察されなかった。

例３および例4:比較例 この例は、本発明に従う洗浄組成物と従来技術の洗浄組
成物とを比較する。

材 料 本発明の洗浄組成物は、以下の材料から調製した:3−
（シクロヘキシルアミノ）−２−ヒドロキシ−１−プロ
パンスルホン酸（1.186g）を蒸留水（100ml）に溶解
し、次いで0.05N水酸化ナトリウムを添加してpH10.0に
高めた。Emcol^TMCC−９カチオン界面活性剤（0.75g）を
この溶液に加えた。

試験試料は、PBS（0.1mg/ml）中ウシ血清アルブミン
（0.1mg/ml）とクラミジア基本小体（前述のようにして
得た）を含有する溶液を使用した。最終の基本小体濃度
は約1000pgであった。

対照試料は、PBS中にウシ血清アルブミン（0.1mg/ml）
を含ませた。すなわち、クラミジア抗原は全く存在しな
い。

米国特許第4,746,614号明細書（前記）に記載されるよ
うな抽出装置を、トリス（ヒドロキシメチル）アミノエ
タン緩衝剤（1.65モル濃度溶液20μ、pH11.1）とチメ
ロサール防腐剤（0.01重量％）の乾燥塗布物を含ませて
作製した。

塩化ナトリウム（50ミリモル濃度）、塩化カルシウム
（５ミリモル濃度）、1,2−プロパンジオール（10％w/
v）および防腐剤（0.01重量％）を含有する２−（Ｎ−
モルホリノ）エタンスルホン酸緩衝液（10ミリモル濃
度、pH6.0）にAmideck^TMプロテアーゼ（Eastman Kadak
Co.,BioProduct Division）（4mg/ml、170単位/mg）を
溶解させた。

抽出組成物は、以下の成分を含む：塩酸エタノールアミ
ン（0.47モル濃度）、塩化ナトリウム（0.27モル濃
度）、防腐剤（30ミリモル濃度）、エチレンジアミン四
酢酸（50ミリモル濃度）、Emcol^TMCC−36カチオン界面
活性剤（0.45容量％）および水酸化ナトリウム（0.66
N）（pH13.4に調節）。

過酸化水素洗浄液は、過酸化水素（12容量％）、ジエチ
レントリアミン五酢酸（10マイクロモル濃度）および防
腐剤（0.01重量％）を含ませた。

アッセイで使用した洗浄組成物は以下のとおりである。

対照A:3−シクロヘキシルアミノ−２−ヒドロキシ−１
−プロパンスルホン酸緩衝液（0.05モル濃度、pH10.
0）、 対照B:リン酸緩衝溶液（PBS）（pH7.2）、 対照C:PBSおよびTween20非イオン界面活性剤（Tweenは
商品名、0.75重量％）、 例3:PBSおよびEmcol^TMCC−９カチオン界面活性剤（0.75
重量％）、ならびに 例4:2−シクロヘキシルアミノ−２−ヒドロキシ−１−
プロパンスルホン酸緩衝液（0.05モル濃度、pH10.0）お
よびEmcol^TMCC−９カチオン界面活性剤（0.75重量
％）。

対照試薬組成物は、PBS（pH7.2）中クレアチンキナーゼ
MBに対する抗体（５μg/ml）、カゼイン（0.5重量
％）、Lonzaine^TMC両性界面活性剤（0.01重量％）およ
び防腐剤（0.01重量％）を含めた。

クラミジアリポポリサッカライド抗原に対するモノクロ
ナル抗体（４μg/ml）は、前記対照組成物について記載
したカゼイン、両性界面活性剤および防腐剤と一緒に供
給した。

ワサビペルオキシダーゼに接合したヤギポリクロナル抗
マウスIgG抗体は、PBS（pH7.2）中カゼイン（0.5重量
％）、Lonzaine^TMC両性界面活性剤（0.1重量％）、４′
−ヒドロキシアセトアニリド（10ミリモル濃度）および
防腐剤（0.01重量％）組成物中に供給した（1:700希
釈）。

ロイコ染料組成物は、２−（４−ヒドロキシ−３−メト
キシフェニル）−4,5−ビス（４−メトキシフエニル）
イミダゾールロイコ染料（0.008重量％）、リン酸ナト
リウム緩衝液（pH6.8、10ミリモル濃度）、ジエチレン
トリアミン五酢酸（10マイクロモル濃度）、４′−ヒド
ロキシアセトアニリド（２ミリモル濃度）および過酸化
水素（10ミリモル濃度）を含む。

アッセイ 抽出装置にプロテアーゼ溶液（280μ）を加え、次い
でジチオスレイトール（0.188モル濃度）とポリ（アク
リルアミド）（6.35重量％）含有溶液（50μ）、さら
に試験試料（12.5μ）を加えた。別個の抽出および試
験装置を使用して対照試料（12.5μ）との並列比較を
行った。抽出装置中で得られた溶液を混合してそして３
分間室温でインキュベーションした。

次に、前述の抽出溶液（280μ）を抽出装置に加え、
混合そして３分間室温でインキュベーションした。次
に、過酸化水素溶液（280μ）を加え、さらに３分間
室温でインキュベーションした。

この抽出装置中の溶液の一部（160μ）を、本明細書
に記載するような使い捨て試験装置の３個のウェルにそ
れぞれ加えた。第１のウェルは対照ウェルとし、残りの
２つのウェルは試験ウェルとした。

各ウェル中の膜を通して流体を排出し、次いで各ウェル
を前記洗浄組成物で各２度ずつ洗浄し、流体は排出させ
た。

排液することなく、前記対照試薬組成物（80μ）を、
各対照ウェルに加え、クラミジア抗原組成物（80μ）
を各試験ウェルに加えた。室温でのインキュベーション
を２分間行った。

流体を排出させ、各ウェルを再び２度洗浄した。次に、
抗−抗体組成物（80μ）を各ウェルに添加し、引き続
き５分間室温でインキュベーションした。

さらなる洗浄工程の後、ロイコ染料組成物（80μ）を
各ウェルに添加した。室温でのインキュベーションを５
分間行い、次いでアジ化ナトリウム溶液（0.01重量％、
120μ）を添加することにより反応を停止させた。膜
上の色素濃度を測定し、透過濃度（D_T）に換算した。結
果を以下の表に示す。それらから、本発明の洗浄組成物
は、好ましい低いバッググランドと改良された感度を与
えることがわかる。例４は、より高いpHの洗浄組成物が
使用されているので、最も低いバックグランドと最も高
い感度を提供する。

〔発明の効果〕 この発明のアッセイは、使用に関して迅速であり、信頼
性を有しかつ簡便である。例えば、アッセイは室温で30
分未満で行うことができる。抽出クラミジア抗原（例え
ば、C.トラコマチス）、特にそのリポポリサッカライド
抗原の測定について高い信頼性を有する。このアッセイ
を使用して、また、淋菌抗原（例えば、N.ゴノロエエ）
を迅速かつ高感度で検出することができる。

アッセイは高感度であり、低いバックグランドを示し、
そして阻害する可能性のある負荷電解質の影響は少な
い。さらに、アッセイにおける固体支持体への抗体の好
ましくない結合は、極小化される。これらの利点は、カ
チオン界面活性剤を含む洗浄液を使用する本発明によっ
て達成される。この洗浄液は、アッセイにおいて少なく
とも１度は使用され、すなわち、通常は、支持体に結合
する抗体−抗原免疫複合体の形成後に使用される。

Claims (2)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】１種以上のカチオン界面活性剤少なくとも
   0.1重量％を含んでなる、クラミジアおよび淋菌の測定
   に使用するための洗浄液。
2. 【請求項２】クラミジア生菌体および淋菌生菌体のいず
   れか一方の生菌体を測定するための方法であって、 A.前記生菌体を含むことが予測される被験体から抽出さ
   れた前記クラミジアまたは淋菌の抗原を、その抗原に対
   する抗体と接触させることにより抗原と抗体の免疫複合
   体を形成する工程、 B.複合体形成の前、それと同時またはその後に、前記抗
   原もしくは抗体のいずれか一方または両者を固体支持体
   上で不溶化することにより、前記固体支持体に結合した
   免疫複合体を形成する工程、 C.1種以上のカチオン界面活性剤少なくとも0.1重量％を
   含んでいる洗浄液で前記複合体を洗浄することにより、
   前記結合した免疫複合体から複合体化していない物質を
   分離する工程、ならびに D.被験体中の前記生菌体の量を示すものとして前記結合
   した複合体の存在を測定する工程、 を含んでなる、クラミジアまたは淋菌生菌体の測定方
   法。