JPH07113040B2

JPH07113040B2 - 融合タンパク質、その生産方法及びその用途

Info

Publication number: JPH07113040B2
Application number: JP61176558A
Authority: JP
Inventors: パウル、ハーベルマン; ジークフリート、シュテンゲリン; フリードリッヒ、ベンゲンマイヤー
Original assignee: ヘキスト、アクチエンゲゼルシヤフト
Priority date: 1985-07-27
Filing date: 1986-07-26
Publication date: 1995-12-06
Anticipated expiration: 2010-12-06
Also published as: ATE50596T1; KR870001312A; NO863000L; DE3669175D1; HU197356B; CA1336329C; PT83065A; EP0211299A3; GR861957B; AU595221B2; HUT43629A; DE3526995A1; DK355486A; NO863000D0; DK172618B1; IL79522A; IE861977L; IL79522A0; NO175640C; FI863041A0

Description

【発明の詳細な説明】分子量約15000ドルトン以下の比較的小さな真核生物タ
ンパク質を遺伝子工学的手法によって産生する場合に、
細菌によって達成される収率は少ないことが多い。これ
は、形成されるタンパク質が宿主に固有のプロテアーゼ
によって急速に分解されるためであると推測される。こ
のような理由から、このタイプのタンパク質は、宿主に
固有のタンパク質部分を特に有する融合タンパク質とし
て産生させてから切断することが有利である。

大腸菌trpオペロン由来Ｄ−タンパク質のほんの約70個
のアミノ酸からなるセグメントは、特にアミノ酸23〜93
番目の配列領域において、融合タンパク質の形成に特に
適していることが見出されたのであるが〔c. Yanofsky
et al.,Nucleic Acids Reserch,9（1981）6647〕。こ
のセグメントは以下において“Ｄ′−ペプチド”とも称
されている。このペプチドのカルボキシル末端と所望の
真核生物タンパク質のアミノ酸配列との間には、所望の
タンパク質を化学的に又は酵素的に切断させ得る１以上
の遺伝的にコード可能なアミノ酸からなる配列が存在し
ている。本発明の好ましい態様において、アミノ末端に
は、Lys−Alaからなる短鎖アミノ酸配列が続き、場合に
より、１〜10個、特に１〜３個、の他の遺伝的にコード
可能なアミノ酸配列、このまくは２個のアミノ酸配列、
特にLys−Glyが続いている。

このように、本発明は下記一般式の融合タンパク質に関
する。

Met−X_n−Ｄ′−Ｙ−Ｚ上記式中、ｎは、０又は１であり、Ｘは、１〜12個の遺伝的にコード可能なアミノ酸の配
列、好ましくはLys−Ala、であり、Ｄ′は、大腸菌trpオペロン中のＤ−ペプチドのアミノ
酸23〜93番目の配列領域における約70個のアミノ酸の配
列であり、Ｙは、下記アミノ酸配列Ｚを切断させ得る１以上の遺伝
的にコード可能なアミノ酸の配列を表わし、Ｚは、遺伝的にコード可能なアミノ酸の配列である。

本発明の他の側面及び好ましい態様は以下に記載され、
特許請求の範囲に規定されている。

勿論、融合タンパク質の（宿主に固有の）不要部分はで
きるだけ小さいことが有利であるが、その理由は細胞が
ほとんど“バラスト（ballast）”を産生せず、そのた
め所望のタンパク質を収率が高くなるからである。しか
も、不要部分が切断された場合に、副生物がほとんど生
じなくなり、作業性を簡易化するからである。これに対
立するファクターは、不要部分の（仮説）“保護機能”
が一定サイズ以上のときにのみ期待されるということで
ある。しかしながら、意外なことに、本発明において選
択されたＤ−タンパク質由来セグメントは、それがわず
か約70個のアミノ酸であるにもかかわらず、この課題を
克服することが明らかにされたのである。

多くの場合、特にＸがLys−Alaを表す、即ちＮ末端にこ
の配列を有する好ましい態様において、形成される融合
タンパク質は、不溶性である。後者は可溶性タンパク質
から容易に分離することができ、これにより作業性が一
層簡単になり、収率が増大する。不溶性融合タンパク質
が形成されたことは予想外であったが、その理由は、一
方において細菌由来部分がわずか約70個のアミノ酸であ
って非常に小さく、しかも他方においてそれが宿主細胞
内の溶液中に存在するタンパク質成分であったからであ
る。

“Ｄ′−ペプチドのアミノ酸23〜93番目の配列領域にお
ける約70個のアミノ酸”とは、それに関し自体公知の方
法で変更を加えることが可能であるもの、即ち、本発明
の融合タンパク質の性質を著しく変化させずに個々のア
ミノ酸を削除、置換又は交換させることが可能であるも
の、を意味する。本発明は同様にこの種の変更にも関す
る。

望ましい真核生物タンパク質は、好ましくはヒルジンの
ような生物活性タンパク質又はヒトプロインシュリンの
ようなタイプのタンパク質前駆体である。

融合タンパク質は適切な系での発現によって得られ、特
に好ましい態様においては、宿主細胞の破壊後、該タン
パク質がその難溶性を故に濃縮されている沈殿物から単
離される。したがって、それを細胞の可溶成分から分離
することが容易になる。

適切な宿主細胞は発現系が公知のすべてのものであり、
即ち、哺乳類細胞及び微生物、好ましくは細菌、特に大
腸菌であって、したがってこの場合における融合タンパ
ク質の細胞由来部分は宿主大腸菌に固有のタンパク質と
なる。

本発明の融合タンパク質についてコードするDNA配列
は、選択された発現系において満足すべき発現を確実化
させるベクター中に公知の方法で組込まれる。

細菌性宿主の場合は、ファージλ、hsp、ompのLac、Ta
c、P_L又はP_Rからなる群よりプロモーター及びオペレー
ターを選択するか、あるいは例えば西ドイツ特許公開第
3,430,683号公報（欧州特許出願第0,173,149号明細書）
に記載されているような合成プロモーターを選択するこ
とが好都合である。

特に適切なベクターは、大腸菌trpオペロンの次記要
素：即ち、Ｌ−ペプチドのプロモーター、オペレーター
及びリボソーム結合部位、を有するものである。このＬ
−ペプチドの最初の３個のアミノ酸がコード領域に続
き、次いで短鎖アミソ酸配列及びtrpオペロン中のＤ−
タンパク質のアミノ酸23〜93番目に続いていることが特
に有利である。

所望のポリペプチドの切断を可能ならしめる中間配列Ｙ
は、この所望のペプチドの構造いかんにかかっている。
例えば、この構造がメチオニンを有していない場合は、
ＹはMetを表わすことができ、したがって臭化シアンに
よる科学的切断が行なわれる。連結構造物ＹのＣ末端に
システインが存在するか、又はＹがCysを表わす場合
は、システイン特異性の酵素的切断又は化学的切断が、
例えば特異的Ｓ−シアニル化後に行なうことができる。
連結構成物Ｙのカルボキシル末端にトリプトファンが存
在するか、又はＹがTrpを表わす場合は、Ｎ−ブロモス
クシンイミドによる化学的切断を行なうことができる。
ＹがAsp−Proを表わす場合は、タンパク質分解的切断が
自体公知の方法によって行うことができる〔D.Piszkiew
icz et al.,Biochemical and Biophysical Research Co
mmunications,40（1970）117−1178〕。Asp−Pro結合
は、既に明らかであるように、Ｙが（Asp）_ｍ−Pro又は
Glu−（Asp）_ｍ−Pro（ｍは１、２又は３を表わす）で
ある場合に、より一層酸反応性となることができる。こ
のような場合に得られる切断産物は、Ｎ末端のProで始
まり、Ｃ末端のAspを終了する。

酵素的切断の例も同様に公知であり、改善された特異性
をもつ修正酵素を用いることも可能である〔例えば、C.
S.Craik at al.,Science 228（1985）291−297〕。所望
の真核生物ペプチドがヒトプロインシュリンである場合
は、配列Ｙとして、トリプシンによる切断が可能なアミ
ノ酸（Arg、Lys）がプロインシュリンのＮ末端アミノ酸
（Phe）に結合しているペプチド配列、例えばAla−Ser
−Met−Thr−Argを選択することができるが、それはア
ルギニンの特異的切断がプロテアーゼたるトリプシンに
よって行い得るからである。所望のタンパク質がアミノ
配列Ile−Glu−Gly−Argを有しない場合は、ファクター
Xaによって切断させることもできる（欧州特許出願第0,
161,937号明細書）。

配列Ｙのデザインにおいては、合成環境を考慮にいれ、
しかも制限酵素の適切な切断部位を挿入しておくことも
できる。アミノ酸配列Ｙに相当するDNA配列としては、
このようにリンカー又はアダプターの機能をも兼ねさせ
ることができる。

本発明の融合タンパク質は、大腸菌trpオペロンのコン
トロール下で発現させることが有利である。trpオペロ
ンのプロモーター及びオペレーターを有するDNAセグメ
ントは、現在市販されている。trpオペロンのコントロ
ール下でのタンパク質発現については、例えば欧州特許
出願第0,036,776号明細書のように、数多く掲載されて
きている。trpオペロンの誘導は、培地中において、Ｌ
−トリプトファンの非存在下で、及び／又はインドリル
−３−アクリル酸の存在下で行なうことができる。

trpオペレーターによるコントロール下、Ｌ−ペプチド
をコードするDNA領域の転写が最初に行なわれる。14個
のアミノ酸からなるこのＬ−ペプチドは、10位及び11位
にそれぞれＬ−トリプトファンを有している。Ｌ−ペプ
チドのタンパク質合成速度は、下流構造遺伝子が同様に
翻訳されるのか否か、又はタンパク質合成が終了したの
か否かにかかっている。Ｌ−トリプトファンが欠失して
いる場合、Ｌ−トリプトファンについてのtRNAが低濃度
になるため、Ｌ−ペプチドの合成速度が遅くなり、次の
タンパク質が合成される。反対に、Ｌ−トリプトファン
が高濃度である場合は、対応するmRNAセグメントが急速
に読込まれてタンパク質生合成が終了するが、その理由
は、mRNAがターミネーター様構造をしていると考えられ
るからである。〔C.Yanofskyら、同上〕。

mRNA翻訳頻度は、開始コドン近傍におけるヌクレオチド
の性質によって一般に左右される。このようにtrpオペ
ロンが介入する融合タンパク質の発現においては、融合
タンパク質の構造遺伝子の開始部分にＬ−ペプチドの最
初の数個のアミノ酸に関するヌクレオチドを挿入するこ
とが好ましいようである。trp系を利用する本発明の好
ましい態様においては、Ｌ−ペプチドの最初の３個のア
ミノ酸（以下、Ｌ′−ペプチドと称される）に関するヌ
クレオチドが、融合タンパク質のＮ末端アミノ酸につい
てのコドンとして選択された。

したがって、本発明は融合タンパク質の発現のためのベ
クター、好ましくはプラスミド、にも関し、ベクターの
DNAは５′末端から（適切な順序でかつ段階的に）次の
構造、即ち、プロモーター、オペレーター、リボソーム
結合部位及び融合タンパク質に関する構造遺伝子、を有
しており、後者は所望のタンパク質配列の上流にアミノ
酸配列Ｉ（後記）を有する。構造遺伝子の上流に、即ち
構造遺伝子の最初のトリプレットとして、開始コドン
（ATG）と、場合により更に他のアミノ酸についてのコ
ドンとが位置しており、更なるコドンは開始コドンと
Ｄ′−配列との間、即ち、Ｄ′−配列と所望のタンパク
質についての遺伝子との間に配置されている。構造遺伝
子の上流のDNA配列の選択は、所望のタンパク質のアミ
ノ酸組織にかかっているが、これは、融合タンパク質か
らの所望のタンパク質の切断を可能ならしめるためであ
る。

mRNAレベルでの塩基の対合を阻止するために、ATG開始
コドンの下流における最初の数個のアミノ酸の個々のト
リプレットを修正することが本発明での融合タンパク質
の発現において有利であることは立証可能である。この
タイプの修正とは、正に、当業者が周知のように、Ｄ′
−タンパク質における個々のアミノ酸の修正、削除又は
付加であり、本発明は同様にそれらにも関する。

比較的小さなプラスミドはいくつかの利点をもたらすこ
とから、本発明の好ましい態様では、pBR322由来プラス
ミドからテトラサイクリン耐性に関する構造遺伝子のDN
Aセグメントを取除く。即ち、29位のHind III制限部位
から2066位のPvu II制限部位までのセグメントを削除す
ることが有利である。（非本質的部分に位置する）trp
オペロンの（読取り方向の）開始部分におけるPvu II制
限部位を利用することによって、本発明のプラスミドか
らやや大きなDNAセグメントを取除くことは特に有利で
ある。このようにして得られるフラグメントを二つのPv
u II制限部位で直接結合させることは可能である。約2k
bp短縮されて得られたプラスミドは発現を増大させ、こ
れによって宿主細胞内における複製数の増大に寄与する
ことができる。

本発明は下記の諸例において詳細に説明されている。

例１ａ）大腸菌染色体DNAをHinf IIで切断し、trpオペロ
ンからプロモーター、オペレーター、Ｌ−ペプチドの構
造遺伝子、アテニュエーター及びtrp−Ｅ構造遺伝子の
最初の６個のアミノ酸についてのコドンからなる492bp
対フラグメントを単離する。このフラグメントをクレノ
ウポリメラーゼによってデオキシヌクレオチド三リン酸
で埋填し、その両末端でHind III認識部位含有オリゴヌ
クレオチドに結合し、次いでHind IIIで切断する。この
ようにして得られたHind IIIフラグメントをpBR322のHi
nd III制限部位に結合させる。これによって、プラスミ
ドptrpE2−１が得られる〔J.C.Edmann et al.,Nature 2
91（1981）503−506〕。これを説明するどおりにプラス
ミドptrpL1に変換する。

合成オリゴヌクレオチド（N1）及び（N2）：５′ CGA CAA TGA AAG CAA AGG ３′ （N1）５′ CCT TTG CTT TCA TTG T 3′ （N2）を用い、二重鎖オリゴヌクレオチド（N3）：５′ CGA CAA TGA AAG CAA AGG ３′ ３′ T GTT ACT TTC GTT TCC ５′ ハイブリット形成させることによって、Ｌ−ペプチドの
最初の３個のアミノ酸についてのDNA配列を組込み、プ
ラスミドptrpL1（第１図）Cla I部位に他のDNA挿入のた
めの制限部位（Stu I）を形成させる（第１図）プラス
ミドptrpL1を製造者の指示に従って酵素Cla Iと反応さ
せ、混合物をフェノールで抽出し、DNAをエタノールで
沈殿させる。開環したプラスミドを大腸菌由来アルカリ
ホスファターゼと反応させ、５′末端でホスフェート基
を除去する。合成ヌクレオチドを５′末端でホスホリル
化し、T4DNAリガーゼを用いて、ホスファターゼで処理
された開環プラスミドに挿入する。リガーゼとの反応
後、大腸菌294へ形質転換、アンピシリン（Amp）耐性形
質転換株の選別及び、Stu I制限部位の形成を行なう。

得られたクローンの約80％は期待どおりの制限部位を有
していた。第１図に示されたヌクレオチド配列は、配列
分析によって決定された。Ｌ−ペプチドのリボソーム結
合部位の下流にＬ−ペプチドの最初の３個のアミノ酸
（Ｌ′−ペプチド）についてのヌクレオチドトリプレッ
トを有し、続いて他のDNAを順次挿入することによりＬ
−ペプチドの最初の３個のアミノ酸を含む融合タンパク
質の形成を可能ならしめるStu I部位を有するプラスミ
ドpH120/14が得られる。

ｂ）上記で使用されたオリゴヌクレオチド（N1）の例は、このオリゴヌクレオチドの化学的合成に
ついて説明するために、如何で用いられている。

M.J.Gait et al.,Nucleic Acids Research 8（1980）10
81−1096の方法は、３′末端でヌクレオチド、即ちこの
場合はグアノシンを、３′−ヒドロキシル基を介してグ
ラスビーズ支持体〔ピアス社（Pierce）市販のCPG（コ
ントロールされた多孔質ガラス）LCAA（長鎖アルキルア
ミン）〕に共有結合させるために利用される。この方法
では、N,N′−ジシクロヘキシルカルボジイミド及び４
−ジメチルアミノピリジンの存在下、改変支持体にＮ−
２−イソブチリル−３′−Ｏ−スクシニル−５′−ジメ
トキシトリチルエーテルとして反応せしめられるグアノ
シンを必要とし、スクシニル基の遊離カルボキシル基に
よって支持体上の長鎖アミンのアミノ基がアシル化され
る。

合成の次の段階において、塩基成分は５′−Ｏ−ジメト
キシトリチルヌクレオシド−３′−亜リン酸モノメチル
エステルのジアルキルアミド又はクロリドとして使用さ
れるが、この場合において、アデニンはN6−ベンゾイル
化合物の形、シトシンはN4−ベンゾイル化合物の形、グ
アニンはN2−イソブチル化合物の形、アミノ基のないチ
ミンは保護基なしの形である。

結合グアノシン１μモル含有支持体40mgを下式試薬で逐
次処理する。

ａ）塩化メチレンｂ）塩化メチレン中の10％トリクロロ酢酸ｃ）メタノールｄ）テトラヒドロフタンｅ）アセトニトリルｆ）無水アセトニトリル中の適切なヌクレオシドホス
ファイト15μモル及びテトラゾール70μモル（５分間）ｇ） 40％ルチジン及び10％ジメチルアミノピリジン含
有テトラヒドロフラン中の20％無水酢酸（２分間）ｈ）テトラヒドロフランｉ） 20％水及び40％ルチジン含有テトラヒドロフランｊ）容積比5:4:1のコリジン／水／テトラヒドロフラ
ン中の３％ヨウ素ｋ）テトラヒドロフラン及びｌ）メタノール本分において“ホスファイト”という語は、デオキシリ
ボース−３′−亜リン酸のモノメチルエステルと定義さ
れるが、３番目の原子価は、塩基又は三級アミノ基、例
えばジイソプロピルアミノ基で飽和されている。各合成
段階における収率は、それぞれ脱トリチル化反応語、分
光光度計による波長496nmでのジメトキシトリチル陽イ
オンの吸光度測定によって調べることができる。

オリゴヌクレオチドの合成が終了したら、オリゴマー上
のメチルホスフェート保護基をｐ−チオクレゾール及び
トリエチルアミンの使用によって切断する。

オリゴヌクレオチドを、次いでアンモニアで３時間処理
することにより固体支持体から分離させる。濃アンモニ
アで２〜３日間オリゴマーを処理して、塩基上のアミノ
保護基を定量的に切断させる。このようにして得られた
粗生成物を高速液体クロマトグラフィー（HPLC）又はポ
リアクリルアミドゲル電気泳動によって精製する。

他のオリゴヌクレオチド類も全く同様にして合成され
る。

ｃ）プラスミドptrpE5−１〔R.A.Hallewell et al.,G
ene 9（1980）27−47〕を製造者の指示どおりに制限酵
素Hind III及びSal Iと反応させて、約620塩基対のDNA
フラグメントを切断する。合成オリゴヌクレオチド（N
4）及び（N5）：５′ AGC TTC CAT GAC GCG Ｔ３′ （N4）５′ ACG CGT CAT GGA ３′ （N5）をホスホリル化し、37℃で一緒にインキュベートし、DN
Aリガーゼの使用によってプロインシュリンについての
ブランド末端DNAに挿入する〔W.Wetecam et al.,Gene 1
9（1982）179−183〕。Hind III及びSal Iと反応させた
後、伸長されたプロインシュリンDNAを、T4DNAリガーゼ
酵素を用いて開環プラスミドに組込んで共有結合させ、
これによってプラスミドpH106/4（第２図）を得る。

プラスミドpH106/4を最初に再度Sal Iと反応させ、重複
末端をクレノウポリメラーゼで埋填してブラント末端と
し、生成物を次いでMst I酵素と一緒にインキュベート
する。プロインシュリンについてすべてコードする部分
を含む約500塩基対のDNAフラグメント及び大腸菌trpオ
ペロン由来Ｄ−タンパク質の約210塩基対のセグメント
を単離する。DNAフラグメントをブラント末端化し、プ
ラスミドpH120/14のStu I部位に挿入し、かくしてプラ
スミドpH154/25（第３図）を得る。これはtrpオペロン
のコントロール下における融合タンパク質の発現に適し
ており、そのタンパク質においては、アミノ酸配列Ala
−Ser−Met−Thr−ArgがＬ′−及びＤ′−ペプチドの後
に位置し、その後にプロインシュリンのアミノ酸配列が
連結している。

例２プラスミドpH154/25（第３図）を制限酵素BamH I及びXm
a IIIと反応させる。突出末端をクレノウポリメラーゼ
で埋填し、T4DNAリガーゼにて結合させる。これによっ
てプラスミドpH254（第４図）が得られ、これはtrpプロ
モーターのコントロール下におけるＬ−,D′−プロイン
シュリンアミノ酸配列含有融合タンパク質の発現に適し
ている。プラスミドはpH154/25よりもやや小さく、有利
であるかもしれない。

例３制限酵素Mlu I及びSal Iと一緒にプラスミドpH254（例
２。第４図）をインキュベートして、280塩基対のDNAセ
グメントに切断し、これを除去する。残りのプラスミド
をクレノウポリメラーゼによってブラント末端型に変換
し、DNAリガーゼによって再度環化させる。これにより
プラスミドpH255（第４図）が得られるが、これは制限
部位Mlu I、Sal I及びEcoR Iの一つに構造遺伝子を挿入
するのに適している。Ｌ′,D′−タンパク質含有融合タ
ンパク質の形成は、誘導条件下で行われる。当然のこと
ながら、適切なリンカーによって、更にプラスミドpH25
5に制限部位を挿入することも可能である。

例４プラスミドpH154/25（第３図）を酵素Mlu I及びEcoR I
と一緒にインキュベートし、切断されたDNAフラグメン
ト（約300塩基対）を除去する。残りのプラスミドをク
レノウポリメラーゼにより埋填する。閉環をDNAリガー
ゼの作用によって行なう。得られるプラスミドpH256
（第５図）は、EcoR I部位の構造遺伝子を挿入するため
に使用することができる。

例５制限酵素BamH I及びNru Iを用いたプラスミドpH256（例
４。第５図）からの600塩基対プラスミドの削除によ
り、プラスミドpH257（第５図）が得られる。このため
には、pH256を最初にBamH Iと一緒にインキュベート
し、ブラント末端をクレノウポリメラーゼにより形成さ
せる。Nru Iとのインキュベート及び600塩基対フラグメ
ントの除去の後、DNAリガーゼと一緒にインキュベート
すると、pH257が形成される。

例６ Iacリプレッサー〔P.J.Farabaugh,Nature274（1978）76
5−769〕をプラスミドpKK177−３〔Amann et al.,Gene
25（1983）167〕に挿入すると、プラスミドpJF118が得
られる。これをEcoR I及びSal Iと反応させ、残留プラ
スミドを単離する。

大きさが約495塩基対のフラグメントを、Sal Iの作用と
Mst Iとのインキュベートとによって、プラスミドpH106
/4（第２図）から得る。

合成されたオリゴヌクレオチド（N6）及び（N7）：５′ ACG AAT TCA TGA AAG CAA AGG ３′ （N
6）５′ CCT TTG CTT TCA TGA ATT CGT ３′ （N
7）をホスホリル化し、DNAリガーゼによってブラント末端D
NAフラグメントに付加させる。

EcoR I及びSal Iとの反応により、開環プラスミドpJF18
8と結合させるための重複末端を形成する。

このようにして得られたハイブリッドプラスミドによる
大腸菌294への形質転換後、適切なクローンを制限フラ
グメントの大きさに基づいて選別する。このプラスミド
はpJ120（第６図）と称される。

融合タンパク質の発現は、下記のように振盪フラスコ内
で行なう。

アンピシリン50μg/ml含有LB培地〔J.H.Miller.Experim
ents in Molecular Genetics,Cold Spring Harbor Labo
ratory,1972〕中におけるプラスミドpJ120含有大腸菌29
4形質転換株の一夜培養物を約1:100の比率の新鮮培養物
を調製するために使用し、増殖は吸光度測定によって追
跡する。吸光度が0.5の場合は、イソプロピルβ−Ｄ−
ガラクトピラノシド（LPTG）をその濃度が1mMとなるよ
うな量で培養物中に加え、細菌を150〜180分間後遠心分
離により除去する。細胞を緩衝液混合物（7M尿素、0.1
％SDS、0.1Mリン酸ナトリウム、pH7.0）中で５分間沸騰
させ、試料をSDSゲル電気泳動プレートに供する。電気
泳動後、プラスミドpJ120含有細菌は、予想される融合
タンパク質の大きさに相当し、しかもイソシュリンに対
する抗体と反応するタンパク質バンドを与える。融合タ
ンパク質を単離した後、予想されるプロインシュリン誘
導体を臭化シアンで切断させて得ることができる。細菌
破壊〔French Press「ダイノミル」（Dyno−mill）〕と
遠心分離との後、Ｌ′,D′−プロインシュリン融合タン
パク質は沈殿物中に存在しているため、著しい量の他の
タンパク質を上澄と一緒に除去することができる。

誘導開始条件を培養物を振盪する際に課す。大規模発酵
の場合は、それに応じて吸光度を修正し、てきとにIPTG
濃度を若干変更することが有利である。

例７ 50μg/mlアンピシリン含有LB培地中における一夜培養物
をプラスミドpH154/25（第３図）含有大腸菌294形質転
換株から調製し、翌朝カザミノ酸2000μg/ml及びチアミ
ン１μg/ml含有M9培地〔J.H.Miller,同上〕中で約1:100
の比率に希釈する。吸光度が0.5の場合は、最適濃度が1
5μg/mlとなるようにインドリル−３−アクリル酸を加
える。２〜３時間インキュベート後、細菌を遠心分離に
よって除去する。SDSゲル電気泳動では、融合タンパク
質として予想される位置に、インシュリンに対する抗体
と反応する極めて顕著なタンパク質バンドがみられる。
細菌破壊と遠心分離との後に、Ｌ′,D′−プロインシュ
リン融合タンパク質は沈殿物中に存在しているため、再
度著しい量の他のタンパク質を上澄と一緒に次いで除去
する。

本例の場合においても、誘導開始条件が培養物を振盪す
る際に課される。大容量発酵の場合は、カザミノ酸濃度
を変更するか又はＬ−トリプトファンを添加することを
要する。

例８プラスミドpH154/25（第３図）をEcoR Iで開環し、突出
DNA一重鎖をクレノウポリメラーゼで埋填する。このよ
うにして得られたDNAをMlu I酵素と一緒にインキュベー
トし、インシュリンをコードするDNAをプラスミドから
切除する。ゲル電気泳動による分離を行ない、このフラ
グメントを残りのプラスミドから分離し、残留プラスミ
ドを単離する。

西ドイツ特許公開第3,429,430号公報（欧州特許出願第A
10,170,024号明細書）の第３図に示されたプラスミドを
制限酵素Acc I及びSalと反応させ、ヒルジン配列含有DN
Aフラグメントを除去する。Sal I制限部位の突出部位を
クレノウポリメラーゼで埋填した後、DNAセグメントを
次式（N8）： Met Thr ５′ CCC ACG CGT ATG ACG T 3′ ５′ GGG TGC GCA TAC TGC ATA ５′ （N8）の合成DNAと結合させる。結合生成物をMlu Iと一緒にイ
ンキュベートする。酵素を65℃で不活化した後、DNA混
合物を37℃で１時間ウシアルカリホスファターゼにより
処理する。次いで、フェノール抽出によって混合物から
ホスファターゼ及び制限酵素を除去し、DNAをエタノー
ル沈殿により精製する。このように処理されたDNAを、T
4リガーゼによって、残留した開環プラスミドpH154/25
に挿入することにより、プラスミドpK150が得られる
が、これはマキサム−ギルバート（Maxam−Gilbert）法
による制限分析とDNA配列決定とによって特徴づけられ
た。

例９プラスミドpK150（第７図）含有大腸菌294をアンピシリ
ン30〜50μg/ml含有LB培地中37℃で一夜培養する。培養
物をカザミノ酸2000μg/ml及びチアミン１μg/ml含有M9
培地で1:100の比率に希釈し、混合物を連続的に攪拌し
ながら37℃でインキュベートする。600nmにおける吸光
度が0.5又は１の場合は、インドリル−３−アクリル酸
を最終濃度15μg/mlとなるまで加え、混合物を２〜３時
間又は16時間それぞれインキュベートする。細菌を次い
で遠心分離により除去し、加圧下0.1Mリン酸ナトリウム
緩衝液（pH6.5）中で破壊する。難溶性タンパク質を遠
心分離により除去し、SDSポリアクリルアミドゲル電気
泳動で分析する。それによれば、誘導されたtrpオペロ
ンの細胞は、14,000〜20,000ドルトンの領域に、非誘導
細胞中には存在しない新しいタンパク質を含有している
ことを示している。融合タンパク質を単離し、臭化シア
ンと反応させた後、ヒルジンを分離させる。

例10 下記手順により、trp−Ｄ配列をできるだけ多くの範囲
の原核生物発現系に組込むために、各種制限酵素の認識
部位をできるだけ多く含むDNA配列を、trp−Ｄ配列の
５′末端の上流に導入させることができる。

プラスミドpUC12及びpUC13〔（Pharmacia P−L Biochem
icals）セントゴール（St.Goar）5401:分子生物学カタ
ログ（The Molecular Biology Catalogue）1983年、付
録第89頁〕はポリリンカー配列を有するが、これは、プ
ラスミドpUC13において、Xma I及びSac Iの制限切断部
位間に、プラスミドpK150（第７図）由来Hind III−ヒ
ルジン−Sac Iフラグメントを結合せしめられるプラス
ミドp106/4（第２図）由来Mst I−Hind III trpフラグ
メントを挿入するためである。

このためには、プラスミドpUC13のDNAを最初に制限酵素
Xma Iで処理する。直鎖プラスミドの末端をクレノウポ
リメラーゼ反応によって埋填する。エタノール沈殿後、
DNAを酵素Sac Iで処理し、再度エタノールにより反応混
合物から沈殿させる。DNAを次いで、プラスミドpH106/4
から単離されたMst I−Hind III trp−Ｄフラグメン
ト、プラスミドpK150から単離されたHind III−Sac Iヒ
ルジンフラグメント及びT4DNAリガーゼと結合混合物水
溶液中で反応させる。

このようにして得られたプラスミドpK160は、酵素Xma
I、Sma I、BamH I、Xba I、Hinc II、Sal I、Acc I、Ps
t I及びHind IIIの制限部位を含有した多数制限酵素認
識配列を、trp−Ｄ配列のすぐ上流に有している。更
に、EcorR I制限部位が本構造（第８図）におけるヒル
ジン配列の３′末端の下流に存在している。

例11 プラスミドpH131/5は、（未公開の西ドイツ特許出願第P
35 14 113.1号明細書、例１、図１に示されているよ
うに）下記の通りに製造される。

プラスミドptrpL1〔J.C.Edmonら、同上〕をCla Iで開環
し、合成された自己相補的オリゴヌクレオチド（N9）：５′ pCGACCATGGT ３′ （N9）と結合させる。このようにして得られたプラスミドpH13
1/5（第９図）を、この方法で導入された制限酵素Nco I
の制限部位で開環し、得られた突出一重鎖末端をクレノ
ウポリメラーゼ反応によって埋填する。直鎖ブラント末
端DNAを次いで酵素EcoR Iで切断し、得られた二つのDNA
配列のうち大きい法を、エタノール沈殿によって小さい
配列から分離させる。このようにして得られたプラスミ
ドpH131/5の残りのプラスミドDNAを、T4リガーゼとの反
応によって、trp−Ｄ′−ヒルジンをコードするpK160由
来フラグメントと結合させる。このフラグメントを、Hi
nc II及びEcoR Iでプラスミドを開環することにより、
プラスミドpK160から切断させる。こフラグメントをゲ
ル電気泳動によって残留プラスミドから分離し、次いで
ゲル物質から溶出させる。結合生成物を大腸菌K12に形
質転換する。プラスミドDNA含有クローンを単離し、制
限分析及びDNA配列決定分析によって特徴を把握する。
このようにして得られたプラスミドpK170は、Met−Asp
−Ser−Arg−Gly−Ser−Pro−Gly−trp−Ｄ′−（ヒル
ジン）をコードするDNA配列をtrpオペレーター上に融合
して有している（第９図）。

例12 プラスミドpJF118（例６）をEcoR Iで開環し、突出DNA
末端をクレノウポリメラーゼ反応によってブラント末端
に変換する。このようにして処理されたDNAを次いで酵
素Sal Iで切断し、短鎖EcoR I−Sal IIフラグメントを
ゲル電気泳動により除去する。

プラスミドpK170（例11）をNco Iで切断し、突出末端を
クレノウポリメラーゼの使用によりブラント末端に変換
する。プラスミドDNAをエタノール沈殿によって反応混
合物から除去し、酵素Hind III及びBamH Iで処理する。
得られた二つのフラグメント、即ちNco I（末端が埋填
されている）−trp−Ｄ′−Hind IIIフラグメント及びH
ind III−ヒルジン−BamH Iフラグメント（西ドイツ特
許公開第3,429,430号明細書）が単離される。二つのフ
ラグメントをゲル電気泳動による分離後に単離する。

更に、西ドイツ特許公開第3,429,430号明細書の図２に
示されたBamH I−Sal I−ヒルジンIIフラグメントを単
離する。結合反応では、四つのフラグメント、即ち残り
のプラスミドpJF118、Nco I−trp−Ｄ′−Hind IIIフラ
グメント、Hind III−ヒルジン−BamH Iフラグメント及
びヒルジンIIフラグメント、を次いで一緒に反応させ、
得られたフラグメントpK180（第10図）を大腸菌K12−W3
110に形質転換させる。適切なプラスミドか否かは、プ
ラスミドDNA中にEcoR I−trp−Ｄ′−ヒルジン−Sal I
フラグメントを検出することができるかどうかによって
決定される。trp−Ｄ′−ヒルジン配列を次いでtacプロ
モーターに結合させる。融合タンパク質は例６のように
して発現せしめられる。

例13 pH120/14（例１、第１図）、pH154/25（例１、第３
図）、pH256（例４、第５図）、pK150（例８、第７図）
及びpK170（例11、第９図）のようなpBR322由来のプラ
スミドは、図中で時計回り方向に、trpプロモーター及
びオペレーター含有フラグメントの領域内であるが、プ
ロモーター領域外において、融合タンパク質の開始コド
ン（pBR322の29位のHind IIIに相当する）隣のHind III
部位との間に更にPvu II部位を有している。

上記Pvu II部位に結合するDNAセグメントとpBR322の206
6位に位置するPvu II部位との切断によるクローンタン
パク質（即ち、融合タンパク質）の収率は著しく増大す
ることが判明した。

pH154/25^☆を得るためプラスミドpH154/25の短縮化につ
いては下記に例示されており、このためには上記された
他のプラスミドに応じて行なうことが可能である（短縮
化されたプラスミドは、星印^☆によって同様に区別され
ている）。

pH154/25を（製造者の指示に従い）Pvu IIと反応させ
て、三つのフラグメントとする。

フラグメント1: プロインシュリン遺伝子のPvu II制限
部位からpBR322の2066位に位置するPvu II制限部位まで
の断片フラグメント2: trpプロモーター近傍のPvu II制限部
位からプロインシュリン遺伝子のPvu II部位までの断片フラグメント3: trpプロモーターフラグメント近傍のP
vu II部位からpBR322の2066位に位置するPvu II部位ま
での断片フラグメントは、アガロース上での電気泳動により分離
することができ、しかる後単離される〔Maniatis et a
l.,Molecular Cloning,Cold Spring Harbor,1982〕。

フラグメント１及び２を、ブラント末端条件下、酵素T4
DNAリガーゼによって結合させる。大腸菌294への形質転
換後、完全なプロインシュリン配列をもつプラスミドを
含有していて、したがって望ましい順序でフラグメント
を有するコロニーか否かについて試験する。プラスミド
pH154/25^☆は第11図に示されている。

融合タンパク質の量に関し著しい増加が発現に際して観
察されるが、発現は前記諸例に記載されたように行なわ
れる。

例14 プラスミドpH154/25^☆（例13、第11図）をHind III及び
Sal Iで切断し、（プロインシュリン配列をもつ）小フ
ラグメントをゲル電気泳動によって分離する。大フラグ
メントを単離し、合成DNA（N10）：（Ala）Trp Glu Asp Pro Met Ile Glu（Gly）（Arg） A GCT TGG GAG GAT CCT ATG ATC GAG GG （N10） ACC CTC CTA GGA TAC TAG CTC CCA GCT と結合させる。プラスミドpInt13（第12図）が形成され
る。

DNA（N10）は、化学的切断用のいくつかの下記切断部位
を含有したアミノ酸配列をコードしている。

ａ）臭化シアン用のMet、ｂ）Ｎ−ブロモスクシンイミド（NBS又はBSI）用のTr
p、ｃ）タンパク質分解的切断用のAsp−Pro（上流のGlu
は酸の作用によってAsp−Pro結合を更に弱める）。

このコード化ポリペプチドの読取り枠内へのこのHind I
II−Sal I−リンカー（N10）の導入に際し、化学的切断
用として上記の何を選択するかは、所望のタンパク質の
アミノ酸配列及び切断剤に対するその感受性によって決
まる。

図面は、大きさに比例させて描かれてはいない。

【図面の簡単な説明】

第１〜12図は、いずれも本発明によるプラスミドを説明
する説明図である。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (72)発明者フリードリッヒ、ベンゲンマイヤードイツ連邦共和国デー−6238、ホーフハイム、アム、タウヌス、アム、ザイエンバッハ、38

Claims

【特許請求の範囲】

【請求項１】次式の融合タンパク質。 Met−X_n−Ｄ′−Ｙ−Ｚ〔上記式中、ｎは、０又は１である。Ｘは、１〜12個の遺伝的にコード可能なアミノ酸の配列
である。Ｄ′は、大腸菌trpオペロン中のＤ−ペプチドのアミノ
酸23〜93番目の配列領域における約70個のアミノ酸の配
列である。Ｙは、下記アミノ酸配列Ｚを切断させ得る１以上の遺伝
的にコード可能なアミノ酸の配列を表わす。Ｚは、遺伝的にコード可能なアミノ酸の配列である〕
【請求項２】ｎが１で、Ｘが１〜５個のアミノ酸からな
る、特許請求の範囲第１項記載の融合タンパク質。
【請求項３】ｎが１で、Lys−AlaがＸのＮ末端に存在す
る、特許請求の範囲第１項又は第２項記載の融合タンパ
ク質。
【請求項４】Ｙが、Ｃ末端においてMet、Cys、Trp、Arg
又はLys、あるいは（Asp）_ｍ−Pro又はGlu−（Asp）_ｍ
−Pro又はIle−Glu−Gly−Arg（ｍは１、２又は３を表
わす）の基のうち一つを有するかあるいはこれらのアミ
ノ酸又は基からなる、特許請求の範囲第１項〜第３項の
いずれか１項に記載の融合タンパク質。
【請求項５】Ｚがヒトプロインシュリン又はヒルジンの
アミノ酸配列を表わす、特許請求の範囲第１項〜第４項
のいずれか１項に記載の融合タンパク質。
【請求項６】下式の融合タンパク質をコードする遺伝子
構造体を宿主細胞内で発現させ、融合タンパク質を分離
することを特徴とする、下式の融合タンパク質の生産方
法。 Met−X_n−Ｄ′−Ｙ−Ｚ〔上記式中、ｎは、０又は１である。Ｘは、１〜12個の遺伝的にコード可能なアミノ酸の配列
である。Ｄ′は、大腸菌trpオペロン中のＤ−ペプチドのアミノ
酸23〜93番目の配列領域における約70個のアミノ酸の配
列である。Ｙは、下記アミノ酸配列Ｚを切断させ得る１以上の遺伝
的にコード可能なアミノ酸の配列を表わす。Ｚは、遺伝的にコード可能なアミノ酸の配列である〕
【請求項７】明細書中に示したDNA配列ＩがＤ′の遺伝
子構造をコードする、特許請求の範囲第６項記載の方
法。
【請求項８】DNA配列（コード鎖）：５′ AAA GCA AAG GGC ３′がＸの遺伝子構造をコ
ードする、特許請求の範囲第６項又は第７項記載の方
法。
【請求項９】遺伝子構造を、融合タンパク質が不溶性と
なるように選択する、特許請求の範囲第６項〜第８項の
いずれか１項に記載の方法。
【請求項１０】遺伝子構造が、大腸菌trpオペロン由来
Ｌ−ペプチドのプロモーター、オペレーター及びリボソ
ーム結合部位を有するベクター中に相をなして（in pha
se）含有されている、特許請求の範囲第６項〜第９項の
いずれかに記載の方法。
【請求項１１】ベクターがpBR322誘導体であって、29位
のHind III部位から2066位のPvu II部位までのセグメン
トがpBR322DNAから削除されたものである、特許請求の
範囲第10項記載の方法。
【請求項１２】宿主細胞が細菌である、特許請求の範囲
第６項〜第11項のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１３】宿主細胞が大腸菌である、特許請求の範
囲第６項〜第12項のいずれか１項に記載の方法。