JPH07114697B2

JPH07114697B2 - 生理活性物質の産生方法

Info

Publication number: JPH07114697B2
Application number: JP61205044A
Authority: JP
Inventors: 均山下; 真小野田; 隆夫清田
Original assignee: 旭化成工業株式会社
Priority date: 1986-09-02
Filing date: 1986-09-02
Publication date: 1995-12-13
Anticipated expiration: 2010-12-13
Also published as: JPS6360937A

Description

【発明の詳細な説明】（産業上の利用分野）本発明は、ヒトに由来する正常二倍体細胞を利用して、
高収率で新規なプラスミノーゲン活性化因子を生産する
方法に関するものである。

（従来の技術）現在、プラスミノーゲン活性化因子としては、人尿また
は培養腎細胞から分離精製されたウロキナーゼおよび微
生物由来のストレプトキナーゼが、血栓溶解剤として実
用に供されている。

しかし、これらは、フイブリンに対する親和性の点で劣
るので、治療に際し必要な効果を得るには、大量に投与
する場合が多く、内出血などの副作用が発現することが
知られている。すなわち、これらによつて循環血液中で
生成されるプラスミンは、血中のプラスミンインヒビタ
ーと結合して速やかに失活するため、治療効果をあげる
ためには、これらを大量に投与して、血中のプラスミン
インヒビターの量を上回るプラスミンを生成する必要が
ある。その結果、大量のプラスミンが生成され、フイブ
リノーゲンを分解して、出血傾向という副作用を引き起
こすことになる。

これに対しフイブリンに親和性が高く、フイブリン上で
プラスミンを生成することができれば、循環血液中のプ
ラスミンインヒビターの影響を受けることなく、少量で
フイブリンを分解することができ、循環血液中のフイブ
リノーゲンを分解する作用も弱くなる。このような実情
から、フイブリンに対して親和性が高く、少量でかつ血
栓溶解性が高く、しかも副作用の少ない血栓溶解剤が望
まれている。

現在、すでにヒトの正常二倍体細胞の培養液中に、フイ
ブリン親和性が高い新規なプラスミノーゲン活性化因子
が見い出されている。（特開昭59−51220）さらに、ヒトの正常二倍体細胞と接触させて該因子を生
成せしめる溶液中に、多量の動物肉酵素分解ペプトンを
存在させ、該因子の生成量を高める効率的な生産方法
も、すでに見い出されている。（特開昭59−134733）（発明が解決しようとする問題点）しかしながら、該因子を大量に工業的規模で提供するた
めには、上記方法では不十分で、さらに高収量で該因子
を得る生産方法の開発が望まれていた。

（問題点を解決するための手段）本発明者らは、この目的のために鋭意研究を重ねた結
果、ヒトの正常二倍体細胞と動物肉酵素分解ペプトンま
たは植物由来ペプトンと、脂質を同時に添加した溶液と
接触させることによつて、細胞の安定性が高まると共
に、該因子の生成量が飛躍的に増加することを見い出
し、この知見に基づいて本発明を完成するに至つた。

すなわち、本発明は、ヒトに由来する正常二倍体細胞で
あつて、フイブリン親和性の高いプラスミノーゲン活性
化因子を生成する能力を有する細胞を、動物肉酵素分解
ペプトンまたは植物由来ペプトンと、脂質を同時に添加
した溶液と接触させることを特徴とする該因子の産生方
法に関するものである。

本発明で用いられる細胞は、ヒトに由来する正常二倍体
細胞であつて、プラスミノーゲン活性化因子を生成する
能力を有する細胞が対象となる。このようなものとして
は、例えば、ヒトの腎、腸、心臓、輪尿管、皮膚、包
皮、舌、甲状腺、胎盤、子宮由来の細胞および全胎児由
来の細胞を、より好ましくは、ヒトの肺または包皮由来
の細胞をあげることができる。ここでヒト由来の細胞と
は、胎児および新生児由来の細胞を含む。

これらの細胞は、通常の動物細胞の培養に用いられる培
養方法、例えば、「テイシユ・カルチヤー・メソツズ・
アンド・アプリケーシヨン」（ピー・ケイ・クルーズ・
アンド・エム・ケイ・パターソン／アカデミツクプレス
・ニユーヨーク・サンフランシスコ・ロンドン,1973）〔「Tissue Culture Methods and Application」（P.K.
Kruse and M.K.Patterson Academic Press New York Sa
n Fransisco London,1973）〕記載の方法で増殖させた
後、炭素源、窒素源および必要な場合は無機塩類または
／およびその他の添加物を含む溶液と接触させることに
よつて、プラスミノーゲン活性化因子を生産せしめるこ
とができる。共存させる添加物としては、アミノ酸類、
ビタミン類、ペプチド類、糖類、有機酸類などをあげる
ことができる。そのような例としては、天然に存在する
20種類のアミノ酸の他、ｐ−アミノ安息香酸、Ｄ−ビオ
チン、カルシフエロール、Ｄ−パントテン酸カルシウ
ム、コレステロール、塩化コリン、葉酸、ｉ−イノシト
ール、メナジオン、ニコチンアミド、ニコチン酸、ビリ
ドキサール、ピリドキシン、リボフラピン、チアミン、
DL−α−トコフエロール、ツイーン80、ビタミンＡ、ア
デニン、ATP（アデノシン三リン酸）、AMP（アデノシン
−リン酸）、デオキシリボース、リボース、グルタチオ
ン、グアニン、チミン、ヒポキサンチン、ウラシル、キ
サンチン、ラクトアルブミン加水分解物、ポリペプト
ン、カゼイン加水分解物、グルコース、マルトース、フ
ラクトース、マンニツト、デキストラン、フマル酸、リ
ンゴ酸、オキザロ酢酸、クエン酸、コハク酸、ピルビン
酸、NaCl,KCl,MgCl₂,MgSO₄,NaH₂PO₄,Na₂HPO₄,KH₂PO₄,Cu
SO₄,Fe（NO₃）_３、FeSO₄,MnCl₂,（NH₄）₂MoO₄,ZnSO₄等
を挙げることができる。さらに、本発明の方法にしたが
つて、動物肉酵素分解ペプトンまたは植物由来ペプトン
と、脂質を同時に添加することによつて、該因子の生成
量を飛躍的に向上させることができる。

本発明に用いられる動物肉酵素分解ペプトンは、一般に
細菌の培養培地に用いられるものであり、通常、プロテ
オースペプトン、プロテオーゼペプトン、獣肉ペプトン
と呼ばれるものである。この動物肉酵素分解ペプトンの
調製方法は公知であり、例えば、「細菌培地学講座第二
集」（坂崎利一著，納谷書店,1967刊）記載の方法にし
たがえばよい。すなわち、動物肉としては、牛、豚、ニ
ワトリ、羊、クジラなどの肉または内臓が用いられる
が、このうち牛肉が最も普通に用いられる。分解用の酵
素としては、トリプシン、パパイン、ペプシン、パンク
レアチンなどがある。これらの動物肉は細挫され、水と
混合され、炭酸ナトリウム、濃塩酸などで、酵素分解に
適したpHに調整される。これに酵素を加え、20〜40℃で
１〜20日間、通常は37℃で２〜３日間酵素分解を行う。
消化後は分解酵素を不活性化するためと、未消化のタン
パクを熱凝固させるために100℃以上に加熱し、過に
よつてこれを除去した後、濃縮、乾燥、細末化する。濃
縮、乾燥の方法には、煮つめて粉末にするのと、真空装
置を用いて低温で濃縮後、細末化するのがある。市販品
としてはデイフコ（Difco）社のプロテオースペプトン
（Proteose Peptone）、プロテオースペプトンNo.2、プ
ロテオースペプトンNo.3、チオペプトン（Thiopepton
e）、オキソイド（Oxoid）社のプロテオースペプトンL4
6、ペプトンPL46、BBL社のチオトン（Thiotone）、大五
栄養化学社のプロテオースペプトンなどがある。動物肉
酵素分解ペプトンの添加濃度は、用いる細胞、共存させ
るアミノ酸類、ビタミン類、ペプチド類、糖類、有機酸
類の種類、濃度によつて異なるが、通常培地１当り１
〜40gの濃度範囲が好ましい。

本発明に用いられる植物由来ペプトンは、大豆油、綿実
油をトリプシン、パパイン、ペプシン、パンクレアチン
等の蛋白分解酵素を用いて加水分解することにより生産
することができる。市販品としては、大豆油を原料とし
たものとして、ポリペプトンＳ（大五栄養化学（株）社
製）、ソイトンSoyton（デイフコ社製）、フアイトンPh
yton（ボルチモア・パイオロジカル・ラボラトリー社
製）、ペプトンIII、IV（シグマ社製）等を挙げること
ができる。綿実油を原料としたものとしては、コツトン
シード・エンザイマテイツク・ハイドロライゼート（co
ttonseed enzymatic hydrolysate,シグマ社製）等を挙
げることができる。

植物由来ペプトンの添加濃度は、用いる細胞、共存させ
るアミノ酸類、ビタミン類、ペプチド類、糖類、有機酸
類の種類、濃度によつて異なるが、通常、培地１当り
５〜80gの濃度範囲が好ましい。

本発明に用いられる脂質とは、リン脂質、糖脂質、中性
脂質をいう。これらの脂質は、高等動物より得られる天
然物に限らず、合成によつて得られる脂質であつてもよ
く、また、本目的のためには必ずしも高純度のものを用
いる必要はない。

リン脂質としては、フオスフアチジン酸、フオスフアチ
ジルグリセロール、フオスフアチジルコリン、フオスフ
アチジルセリン、フオスフアチジルエタノールアミン、
フオスフアチジルイノノシトール、カルジオリピン、ス
フインゴミエリンおよびこれらの同属体等が挙げられ
る。

糖脂質としては、スフインゴシン、ジヒドロスフインゴ
シン、セラミド、セレブロシド、ガングリオシドおよび
これらの関連化合物が挙げられる。

中性脂質としては、モノグリセリド、ジグリセリド、ト
リグリセリドおよびこれらの同属体等が挙げられる。

市販品としては、シグマ社製、バツケム社製、アバン
チ、ポーラー・リピツズ社製、フルカ・エー・ジー社
製、コーチ・ライト社製、マコール・ケミカル社製、サ
ーダリー・リサーチ・ラボラトリーズ社製等を挙げるこ
とができる。

該脂質の添加濃度は、用いる細胞、共存させるアミノ酸
類、ビタミン類、ペプチド類、糖類、ペプトン類によつ
て異なるが、通常、培地１当り0.01〜100mgの濃度範
囲が好ましい。

添加方法としては、培地中に脂質を溶かし込むことので
きるいかなる方法も利用することができるが、該脂質を
界面活性化剤、例えば、トリトンＸ−100、ツイン80等
とのエマルジヨンにしてペプトンを含む培地に添加する
方法、超音波処理によりリボソームとして添加する方
法、各種包接物質、例えば、アルブミン、シクロデキス
トリン等に包接して添加する方法等が挙げられる。

該因子の生産は、通常、細胞10万個あたり0.2ml以上の
培養液を用いて25〜40℃、好ましくは31〜37℃の温度範
囲で、6.0〜8.0好ましくは7.0〜7.4のpHの範囲で行われ
る。

pHの維持は、CO₂/▲HCO⁻ _３▼の緩衝系を利用して行う
ことができるが、細胞が多量にCO₂、または乳酸等の有
機酸を生産して、上記のpHの維持が困難な場合には、HE
PES（ヒドロキシエチルピペラジンエタンスルホン酸）
等の緩衝剤を用いてもよい。

生産の日数は、通常、４〜30日であるが、30日を越える
ことも可能である。該因子の生産速度は、生産の後半で
は次第に遅くなるので、工業的生産の場合には、最も効
率のよい日数が選ばれる。工業的規模の大量培養を行う
際には、ローラーボトル培養法、多層平板培養法、ホロ
ーフアイバー培養法、プラスチツクバツグ培養法、マイ
クロキヤリア培養法等の培養法を適用することができる
が、より大量の培養を行うには、マイクロキヤリア培養
法が好ましい。

該因子は、前記の条件下で細胞から溶液中に放出され、
その生成量の測定は、次の方法で行つた。

95％凝固フイブリノーゲン（プラスミノーゲン含量約50
カゼイン単位/g凝固蛋白）を原料として作製した寒天加
フイブリン平板を用い、ウロキナーゼを標準品とするプ
レート法で測定した。該因子の溶液を、１％ゼラチン、
0.1M塩化ナトリウムおよび0.1％窒化ナトリウムを含む
0.067Mトリス塩酸緩衝液（pH8.0）で希釈し、フイブリ
ン平板上で10IU/mlのウロキナーゼと同じ溶解窓を示す
該因子溶液の濃度を10U/mlとした。ウロキナーゼが混入
する溶液を測定する場合には、ウサギより得た抗ウロキ
ナーゼIgGを100μg/mlになるように被験溶液に添加して
測定した。所望の生成量または日数に達した時に、溶液
を採集して該因子を回収する。

該因子の回収は、蛋白質の回収方法として通常用いられ
る吸着法、塩析法、透析法、クロマトグラフイー法、ゲ
ル過法などを単独であるいは組合せて適用すればよ
い。そのような精製法の例として、フイブリンを結合さ
せたセフアロースを用いるフイブリンセフアロースカラ
ムクロマトグラフイー、カルボキシメチル基を結合させ
たセフアロースを用いるCMセフアロースカラムクロマト
グラフイー、リジンを結合させたセフアロースを用いる
リジンセフアロースカラムクロマトグラフイー、亜鉛キ
レートセフアロースを用いる配位子交換クロマトグラフ
イー、コンカナバリンＡを結合させたセフアロースを用
いるレクチンカラムクロマトグラフイー、本発明物質と
特異的に結合する抗体を結合した抗体アフイニテイーク
ロマトグラフイー、架橋したデキストラン粒子を用いる
ゲル過等を挙げることができる。

具体的な分離精製の一例を挙げれば、本発明の方法にし
たがつて得た組織培養液を、0.1％ツイン80および0.15M
塩化ナトリウムを含む20mMアセテート緩衝液（pH4.0）
で平衡化したCMセフアロースカラムに吸着させる。0.1
％ツイン80および0.15M塩化ナトリウムを含む20mMアセ
テート緩衝液（pH4.0）で洗浄した後、0.1％ツイン80お
よび1M塩化ナトリウムを含む20mMトリス塩酸緩衝液（pH
8.9）で溶出し、本発明のプラスミノーゲン活性化因子
活性を有する部分の溶液を集める。この溶液を0.1Mロダ
ンカリ、0.1％ツイン80、0.05M塩化ナトリウムを含む20
mMトリス塩酸緩衝液に対して４℃、一晩透析し、これと
同一の緩衝液で平衡化したリジンセフアロースカラムに
吸着させ、平衡化した緩衝液で洗浄した後、0.05M塩化
ナトリウム、1Mロダンカリ、0.2Mε−アミノ−ｎ−カプ
ロン酸および0.1％ツイン80を含む20mMトリス塩酸緩衝
液で溶出する。この溶出液を限外過用中空糸で濃縮
し、セフアクリルＳ−200のカラムにてゲル過を行な
うことによつて目的のプラスミノーゲン活性化因子が得
られる。

かくして得られるプラスミノーゲン活性化因子の物理化
学的性質について、以下に説明する。

（ａ）分子量:59,000±5,000 1.5M塩化ナトリウム、0.1M EDTA、0.1Mアルギニンおよ
び0.1％ツイン80（花王アトラス登録商標）を含む0.01M
リン酸緩衝液（pH7.0）で平衡化したセフアクリルＳ−2
00を用いるゲル過法にて測定した。

SDS（ドデシル硫酸ナトリウム）電気泳動法による非還
元状態の分子量測定結果は68,000であつた。

（ｂ）等電点:6.5〜8.5 アンフオライトを用いた等電点電気泳動法にて等電点分
画し測定した。

（ｃ）フイブリンに対する親和性生理食塩水に溶解したプラスミノーゲンを含有しないフ
イブリノーゲン溶液（0.2％）950μ、本発明によつて
得られるプラスミノーゲン活性化因子溶液（500U/ml）2
0μを加え、室温で１時間放置する。生じたフイブリ
ンを分取し、脱水後、生理食塩水で洗浄する。2Mロダン
アンモニウム溶液1mlでフイブリン中の該因子を抽出し
たところ、該因子は約85％がフイブリンに取り込まれ
た。一方、組織培養ウロキナーゼは全く取り込まれなか
つた。

（ｄ）コンカナバリンＡに対する親和性本発明によつて得られるプラスミノーゲン活性化因子溶
液（30U/ml）2mlを生理食塩水に溶解して、コンカナバ
リンＡ−セフアロース（フアルマシア社製）のカラム
（0.5×4cm）に吸着させ、1M塩化ナトリウム溶液で洗浄
したところ、ほぼ100％が吸着した。

（ｅ）至適pH:7〜9.5 生理食塩水に溶解した本発明によつて得られるプラスミ
ノーゲン活性化因子溶液50μに、10％グリセリンを含
む生理食塩水に溶解したプラスミノーゲン（8U/ml）50
μおよび0.10M塩化ナトリウムを含む0.05Mクエン酸緩
衝液（pH5.0,6.0）、リン酸緩衝液（pH6.0,7.0,8.0）ま
たはグリシン−水酸化ナトリウム緩衝液（pH8.0,9.0,1
0.0,11.0）（pH5.0,6.0,7.0,8.0,9.0,10.0,11.0の７
種）を100μずつ混合し、37℃で30分間プレインキユ
ベートする。次いで、0.15Mトリス塩酸緩衝液（pH8.0）
で溶解したBoc−Glu−Lys−Lys−MCAを500μ加え、さ
らに37℃で15分間インキユベートした後、酢酸1mlを加
え反応を停止させて、生成するアミノメチルクマリンを
螢光法にて測定し、至適pHを求めた。

（ｆ）抗ウロキナーゼ特異抗体との反応性精製ウロキナーゼ（比活性150,000IU/mg蛋白）をフロイ
ンドの完全アジユバントと共に、ウサギに７日間間隔で
35日間免疫した後、採血して精製した50μg/mlの抗ウロ
キナーゼ特異抗体溶液と、本発明によつて得られる20U/
mlのプラスミノーゲン活性化因子の溶液とを、1:1に混
合し、その混合液の活性を前述の方法により測定した
が、活性の低下は全く認められなかつた。

それに対し、比較対照として入れた20IU/mlのウロキナ
ーゼ溶液と該抗ウロキナーゼ抗体溶液の混合液のウロキ
ナーゼ活性は、100％阻害された。

以上のごとく、本発明によつて得られるプラスミノーゲ
ン活性化因子は、抗ウロキナーゼ抗体とは反応しないも
のである。

かくして得られたプラスミノーゲン活性化因子の用途と
しては、血栓溶解剤としての医薬用途以外に、たとえ
ば、人工血管、人工臓器等の材料に結合させ、血栓の形
成を防止する薬剤として、あるいは血栓症等の診断薬と
しての用途があげられる。

（発明の効果）本発明の方法は、従来、用いられてきたウロキナーゼ、
またはストレプトキナーゼより少量で効果を有し、かつ
血栓溶解活性が高く、副作用の少ない、プラスミノーゲ
ン活性化因子を工業的規模で大量に安定供給する生産方
法として好適である。

（実施例）次に、実施例によつて本発明をさらに詳細に説明する。

実施例１ヒト胎児肺由来の正常二倍体細胞（WI−38,フロー・ラ
ボラトリーズ社）に対して、プロテオースペプトンNo.3
（デイフコ社製）またはポリペプトンＳ（大五栄養化学
社製）と脂質（サーダリー・リサーチ・ラボラトリーズ
社製，アバンチ・ポーラー・リピツズ社製）とを共存さ
せた培地のプラスミノーゲン活性化因子生成促進効果に
ついて調べた。

12穴マルチプレートに上記細胞を１×10⁵個／穴の密度
で接種し、10％ウシ胎児血清を含むメジウムMEMを1.0ml
添加して、炭酸ガス培養装置を用いて、37℃、５％炭酸
ガスを含む空気中で充分単層を形成するまで、増殖させ
た。

次いで、生理食塩水で洗浄した後、各種添加物を含むメ
ジウム199を1ml添加し、７日目毎に40μの培地をサン
プリングした。回収した培養液中のプラスミノーゲン活
性化因子の生成量を測定した結果を表１に示す。

実施例２ヒト胎児肺由来の正常二倍体細胞（MRC−5,フロー・ラ
ボラトリーズ社）を用いて、１％プロテオースペプトン
No.3（デイフコ社製）とフオスフアチジルイノシトー
ル、ガングリオシド、1,2−ジグリセリド（以上サーダ
リー・リサーチ・ラボラトリーズ社製）、血小板活性化
因子（アバンチ・ポーラー・リピツズ社製）を各種濃度
で組合わせて、プラスミノーゲン活性化因子生成促進効
果について調べた。

次いで、生理食塩水で洗浄した後、各種添加物を含むメ
ジウム199を1ml添加し、７日間維持した。回収した培養
液中のプラスミノーゲン活性化因子の生成量を測定した
結果を第１図に示す。

実施例３ヒト胎児肺由来の各種の細胞を用いて、ポリペプトンＳ
（大五栄養化学社製）と、フオスフアチジルイノシトー
ル、ガングリオシド、1,2−ジグリセリド（以上サーダ
リー・リサーチ・ラボラトリーズ社製）、血小板活性化
因子（アバンチ・ポーラー・リピツズ社製）のプラスミ
ノーゲン活性化因子生成促進効果について調べた。

12穴マルチプレートに各種細胞を１×10⁵個／穴の密度
で接種し、10％ウシ胎児血清を含むメジウムMEMを1.0ml
添加して、炭酸ガス培養装置を用いて、37℃、５％炭酸
ガスを含む空気中で充分単層を形成するまで、増殖させ
た。

次いで、生理食塩水で洗浄した後、各種添加物を含むメ
ジウム199を1ml添加し、７日間維持した。回収した培養
液中のプラスミノーゲン活性化因子の生成量を測定した
結果を表２に示す。

実施例４ヒト胎児肺由来の正常二倍体細胞（IMR−90,フロー・ラ
ボラトリーズ社）を用いて、種類の異なるペプトン類と
フオスフアチジルイノシトール、ガングリオシド、1,2
−ジグリセリド（以上サーダリー・リサーチ・ラボラト
リーズ社製）、血小板活性化因子（アバンチ・ポーラー
・リピツズ社製）とを組合わせ、プラスミノーゲン活性
化因子生成促進効果について調べた。

12穴マルチプレートに上記細胞を１×10⁵個／穴の密度
で接触し、10％ウシ胎児血清を含むメジウムMEMを1.0ml
添加して、炭酸ガス培養装置を用いて、37℃、５％炭酸
ガスを含む空気中で充分単層を形成するまで、増殖させ
た。

次いで、生理食塩水で洗浄した後、各種添加物を含むメ
ジウム199を1ml添加し、上記条件で培養し、７日間維持
した。回収した培養液中のプラスミノーゲン活性化因子
の生成量を測定した結果を表３に示す。

実施例５ヒト胎児肺細胞（WI−38,フロー・ラボラトリーズ社）
を10容スピナーフラスコに1.2×10⁵cells/mlの密度
で、3mg/ml濃度のサイトデツクスＩ（細胞培養用ビーズ
担体、フアルマシア社登録商標）と共に植え込み、37
℃、５％炭酸ガスを含む空気中で、成育培地として10％
ウシ胎児血清を含むメジウムMEMを８添加し、30rpmの
回転数で撹拌しながら懸濁培養する。６日間培養し、細
胞を充分増殖させた後、生理食塩水で細胞が接着したビ
ーズ担体を洗浄し、血清を含まない１％プロテオースペ
プトンNo.3（デイフコ社）および１μg/mlフオスフアチ
ジルイノシトール（サーダリー・リサーチ・ラボラトリ
ーズ社製）を含むメジウム199 8におきかえ、30rpmの
回転数で撹拌しながら培養する。６日目毎に、この培地
を交換しながら、本発明のプラスミノーゲン活性化因子
を含む培養液を回収する。

このようにして得られた48U/mlの濃度の該因子を含む培
養液５を、0.1％ツイン80および0.15M塩化ナトリウム
を含む20mMアセテート緩衝液（pH4.0）で平衡化したCM
セフアロースカラム（1.5φ×30cm）に吸着させる。0.1
％ツイン80および0.15M塩化ナトリウムを含む20mMアセ
テート緩衝液（pH4.0）で洗浄した後、0.1％ツイン80お
よび1M塩化ナトリウムを含む20mMトリス塩酸緩衝液（pH
8.9）で溶出し、本発明のプラスミノーゲン活性化因子
活性を有する部分の溶液85mlを集める。この溶液を0.1M
ロダンカリ、0.1％ツイン80、0.05M塩化ナトリウムを含
む20mMトリス塩酸緩衝液５に対して４℃、一晩透析
し、これと同一の緩衝液で平衡化したリジンセフアロー
スカラム（2.6φ×10cm）に吸着させ、平衡化した緩衝
液で洗浄した後、0.05M塩化ナトリウム、1Mロダンカ
リ、0.2M ε−アミノ−ｎ−カプロン酸および0.1％ツ
イン80を含む20mMトリス塩酸緩衝液で溶出する。この溶
出液120mlを限外過用中空糸で15mlまで濃縮し、セフ
アクリルＳ−200のカラム（2.6φ×90cm）にてゲル過
を行なつた。本発明のプラスミノーゲン活性化因子活性
を有する部分の溶液32mlを回収する。得られた該プラス
ミノーゲン活性化因子溶液の濃度は、4,300U/mlで41,00
0U/mg蛋白の比活性を示した。

【図面の簡単な説明】

第１図は実施例２において、ヒト胎児肺細胞を用いて得
られた培養液のプラスミノーゲン活性化因子の生成量を
測定した結果を示すグラフである。

Claims

【特許請求の範囲】

【請求項１】ヒトに由来する正常二倍体細胞であつて、
下記の性質を有するプラスミノーゲン活性化因子を生成
する能力を有する細胞を、動物肉酵素分解ペプトンまた
は植物由来ペプトンと、脂質を含有する溶液と接触させ
ることを特徴とする該プラスミノーゲン活性化因子の産
生方法。（ａ）分子量:59,000±5,000 （ｂ）等電点:6.5〜8.5 （ｃ）フイブリンに対する親和性：あり（ｄ）コンカナバリンＡに対する親和性：あり（ｅ）至適pH:7.0〜9.5 （ｆ）抗ウロキナーゼ特異抗体とは反応しない。