JPH0751064B2 - 新規なヒアルロニダ−ゼｓｄ−６７８およびその製造法 - Google Patents

Description

【発明の詳細な説明】 ［発明の属する技術分野］ 本発明は、新規な酵素ヒアルロニダーゼSD−678および
その製造法に関する。

［従来の技術とその問題点］ ヒアルロニダーゼは酸性ムコ多糖の一種であるヒアルロ
ン酸を分解する能力を有する酵素の総称であり、動物組
織およびある種の微生物の培養物中にその存在が知られ
ている。

動物由来のヒアルロニダーゼとしては、例えば、牛や羊
の睾丸から抽出・分離されたものが研究用試薬として市
販されており、また、微生物由来のヒアルロニダーゼと
しては、例えば、ストレプトマイセス・ヒアルロリティ
カス・ノブ・エスピー（Streptomyces hyalurolyticus
NOV.SP.）の培養物から分離されたものが研究用試薬と
して市販されている。

一方、ヒアルロニダーゼのある種のものは、皮下注射に
おける薬剤の吸収拡散促進剤として使用されており、ま
た、内科領域においては心筋梗塞の治療剤として利用す
ることが検討されている。

従来、微生物由来のヒアルロニダーゼとしてはストレプ
トマイセス属、スタフィロコッカス属、ストレプトコッ
カス属、プロピオニバクテリウム属、ペプトストレプト
コッカス属由来のヒアルロニダーゼが知られている。

本発明者等は種々研究の結果、従来のヒアルロニダーゼ
とは種々の点で性質の異なる新規なヒアルロニターゼSD
−678をストレプトコッカス・ディスガラクティエ（Str
eptococcus dysgalactiae）の培養物中に見出し、鋭意
研究の結果、本発明を完成した。

［発明の構成］ I.ヒアルロニダーゼSD−678の性質について： 本発明のヒアルロニダーゼSD−678は次のような理化学
的性質を有する。

ａ）作用： エンドβ−ヘキソサミニダーゼ ｂ）基質特異性： ヒアルロン酸およびコンドロイチンを分解し、コンドロ
イチン硫酸Ａ、コンドロイチン硫酸Ｃ、デルマタン硫
酸、ヘパリン、ヘパラン硫酸およびケラト硫酸を分解せ
ず。

ヒアルロニダーゼSD−678はヒアルロン酸に特異性が高
く、ヒアルロン酸を基質としたときの活性値を100％と
すると、コンドロイチンを基質としたときの相対活性値
は約３％である。

ｃ）至適pHおよび安定pH範囲： イ）至適pH:pH5.8〜6.6 各種pHにおけるヒアルロニダーゼSD−678の酵素活性を
後記の力価測定法において、加える緩衝液を各種pHの酢
酸緩衝液、リン酸緩衝液又はトリス−マレイン酸緩衝液
に代えて測定した。ヒアルロニダーゼSD−678の至適pH
は5.8〜6.6である。

ロ）安定pH:pH5.0〜9.0 ヒアルロニダーゼSD−678をpH3.0〜10.0の各種pHのエチ
レンジアミン−酢酸緩衝液中、37℃で15分間放置した
後、後記の力価測定法に従ってその残存活性を測定し
た。ヒアルロニダーゼSD−678はpH5.0〜9.0の範囲で安
定である。

ｄ）力価測定法： ヒアルロン酸にヒアルロニダーゼSD−678を37℃で作用
させたとき、１分間に１マイクロモル（μmole）の２−
アセトアミド−２−デオキシ−３−Ｏ−（β−Ｄ−グル
コ−４−エネピラノシルウロン酸）−Ｄ−グルコース
（以下「Δdi−HA」と記す）を遊離させる酵素量（力
価）が１単位である。

詳しくは、本酵素はヒアルロン酸又はコンドロイチンの
β−ヘキソサミニド結合を分解するリアーゼ（脱離酵
素）である。

ヒアルロン酸に本酵素を作用させると、ヒアルロン酸か
ら不飽和二糖であるΔdi−HAを遊離させる。それゆえ、
ヒアルロン酸と本酵素を37℃で反応させ、反応物中のΔ
di−HAをMorgan−Elson法で測定することにより力価を
測定する。

詳細な力価測定法は以下に記す。

［ヒアルロニダーゼSD−678の力価測定法］ （イ）ヒアルロン酸溶液の調製 ヒアルロン酸ナトリウム0.2gを水に溶解し、全量を100m
lとする。

（ロ）リン酸緩衝液の調製 リン酸水素二ナトリウム（Na₂HPO₄・12H₂O）6.62gとリ
ン酸二水素ナトリウム（NaH₂PO₄・2H₂O）11.32gおよび
牛血清アルブミン0.2gを水に溶解し、全量を1000mlとす
る。

（ハ）ホウ酸カリウム溶液の調製 ホウ酸カリウム（K₂B₄O₇・4H₂O）5gを水に溶解し、2Mの
水酸化カリウム水溶液でpHを9.0に調整した後、全量を1
00mlとする。

（ニ）ｐ−ジメチルアミノベンズアルデヒド溶液の調製 ｐ−ジメチルアミノベンズアルデヒド16gを酢酸95mlと
塩酸5mlの混液に溶解する。

（ホ）反応および測定 上記ヒアルロン酸溶液0.25mlに上記リン酸緩衝液0.25ml
を加えて攪拌した後、ヒアルロニダーゼSD−678の試料
溶液0.1mlを加えて攪拌し、37℃で10分間反応させる。
反応後、直ちに100℃で１分間加熱した後、氷水中で冷
やし、上記ホウ酸カリウム溶液0.5mlを加えて攪拌し、1
00℃で７分間加熱する。加熱後、氷水中で冷やし、これ
に酢酸5mlと上記ｐ−ジメチルアミノベンズアルデヒド
溶液2mlを加えて攪拌し、37℃で20分間放置した後、比
色計を用いて585nmにおける吸光度を測定する。

ｅ）作用適温の範囲： 至適温度:37℃付近 作用温度:20〜50℃ ヒアルロニダーゼSD−678を前記の力価測定法の反応温
度を所定の温度に変えて10分間反応させ、それぞれの温
度での酵素活性を測定した。ヒアルロニダーゼSD−678
の至適温度は37℃付近であり、作用適温の範囲は20〜50
℃である。

ｆ）pH、温度などによる失活の条件： ｉ）ヒアルロニダーゼSD−678をpH4.5のエチレンジアミ
ン−酢酸緩衝液中、37℃で15分間放置することにより約
80％失活する。

ii）ヒアルロニダーゼSD−678をpH7.2のリン酸緩衝液
中、80℃で30分間放置することにより約100％失活す
る。

iii）ヒアルロニダーゼSD−678を50mMの亜硫酸ナトリウ
ム、システイン又はメルカプトエタノールを含むpH6.5
のリン酸緩衝液中、37℃で10分間放置することにより約
100％失活する。

ｇ）阻害および安定化： ｉ）各種金属の塩化塩をヒアルロニダーゼSD−678に加
えて、前記の力価測定法で活性を測定したところ、50mM
の金属イオン濃度での主な阻害金属イオンはFe²⁺、C
u²⁺、Pb²⁺、Hg²⁺で、これらは90％以上阻害する。ま
た、Zn²⁺は約80％、Cd²⁺は約40％阻害する。

ii）ヒアルロニダーゼSD−678 ５単位を0.05Mリン酸緩
衝液（pH6.2）1mlに溶解した液およびヒアルロニダーゼ
SD−678 ５単位と牛血清アルブミン0.25mg又はゼラチ
ン0.25mgとを0.05Mリン酸緩衝液（pH6.2）1mlに溶解し
た液を４℃に５日間放置し、その残存活性を測定すると
き、牛血清アルブミン又はゼラチンを添加した液の残存
活性は約95％であるが、無添加の液の残存活性は約25％
であり、ヒアルロニダーゼSD−678は牛血清アルブミン
又はゼラチンの添加により安定化する。

ｈ）分子量 セファアクリルＳ−200を用いたゲルろ過法でヒアルロ
ニダーゼSD−678の分子量を測定した。

ヒアルロニダーゼSD−678のゲルろ過法での分子量は12
5,000±10,000である。

ｉ）電気泳動による移動度 結晶構造の解析および元素分析は、ヒアルロニダーゼSD
−678が結晶化されていないので実施できない。そこ
で、ヒアルロニダーゼSD−678の電気泳動での移動度を
測定した。

セルロースアセテート膜を支持体として、0.05Mトリス
−マレイン酸緩衝液（pH6.0）を用いて、0.5mA/cmで30
分間通電してヒアルロニダーゼSD−678の電気泳動を行
い、陽極側に泳動される牛血清アルブミンの移動度を＋
1.0とするとき、ヒアルロニダーゼSD−678の移動度は＋
0.3である。

本発明に用いる微生物としては、ストレプトコッカス・
ディスガラクティエに属する菌株であれば如何なるもの
でもよい。かかる菌株としては、IID678号として東京大
学医科学研究所に寄託されているものが挙げられる。

また、微生物としては、ストレプトコッカス・ディスガ
ラクティエを、例えば、Ｘ線、γ線、紫外線等の照射処
理、又は、エチルメタンスルホネート、ニトロソグアニ
ジン等の薬剤処理、形質転換、形質導入、接合、遺伝子
操作等の通常用いられる菌株変異処理方法によってヒア
ルロニダーゼSD−678の生産能を高めたものを用いても
よい。

従来のヒアルロニダーゼとの比較： ヒアルロニダーゼSD−678は前記したような理化学的性
質を有している。

従来からヒアルロニダーゼは動物の組織やある種の微生
物の培養物中にその存在が知られている。

動物由来のヒアルロニダーゼはいずれも加水分解酵素で
あり、ヒアルロン酸に作用して４糖又は６糖を生成する
ことから、リアーゼであるヒアルロニダーゼSD−678と
はその作用の点で異なっている。

一方、微生物由来のヒアルロニダーゼで、その理化学的
性質が検討されているヒアルロニダーゼとしては、スト
レプトマイセス・ヒアルロリィティカス・ノボ・エスピ
ー、ストレプトマイセス・コガネイエンスNo.8231、ス
タフィロコッカス・アウレウス、ペプトストレプトコッ
カス・エスピー84H14S、プロピオニバクテリウム・アク
ネス又はストレプトコッカス・ピオゲネスの産生するヒ
アルロニダーゼがある。

ここで、これらの微生物由来のヒアルロニダーゼとヒア
ルロニダーゼSD−678の性質を比較して表に示す。

従来から知られている微生物由来のヒアルロニダーゼ
は、ヒアルロン酸のβ−ヘキソサミニド結合を分解する
リアーゼであり、作用の点ではいずれも共通している。

しかし、ストレプトマイセス、ペプトストレプトコッカ
スおよびプロピオニバクテリウム由来のヒアルロニダー
ゼとヒアルロニダーゼSD−678とは基質特異性、至適p
H、分子量などの点でその性質が異なる。また、スタフ
ィロコッカス由来のヒアルロニダーゼとは至適pHや分子
量の点でその性質が異なる。

ヒアルロニダーゼSD−678とストレプトコッカス・ピオ
ゲネスのヒアルロニダーゼとは分子量が異なり、ヒアル
ロニダーゼSD−678の方が分子量が大きい。また、ヒア
ルロニダーゼSD−678の至適pH範囲は広く、使用に際し
有利である。更に、ストレプトコッカス・ピオゲネスの
ヒアルロニダーゼは酸化剤に対しては不安定であるが、
ヒアルロニダーゼSD−678は酸化剤に対してほとんど影
響を受けないので、酸化剤存在下でヒアルロン酸を分解
するときは本酵素の方が適している。他方、ヒアルロニ
ダーゼSD−678は還元剤によって失活するが、ストレプ
トコッカス・ピオゲネスのヒアルロニダーゼは還元剤に
よって安定化することが知られている。

次にヒアルロニダーゼSD−678とストレプトコッカス・
ピオゲネスのヒアルロニダーゼの抗血清を作成し、血清
学的性質を調べた。

［抗血清の調製］ ヒアルロニダーゼSD−678又はストレプトコッカス・ピ
オゲネス由来のヒアルロニダーゼをそれぞれ100単位生
理的食塩液0.5mlに溶解し、等量の完全アジュバントと
混合して懸濁液を作成し、家兎の皮下に0.2mlずつ５ヶ
所に皮下注射をした。この操作を１週間間隔で３回行っ
た後、２週間後にそれぞれに家兎から全血採血し、血清
を分離して、それぞれのヒアルロニダーゼの抗血清を得
た。

［抗血清との反応］ ヒアルロニダーゼSD−678 １単位又はストレプトコッ
カス・ピオゲネス由来のヒアルロニダーゼ １単位を0.
05Mリン酸緩衝液（pH6.2）0.5mlに溶解し、この液にそ
れぞれの抗血清0.5mlを加えて撹拌し、室温に15分間放
置した後、前記力価測定法でその力価を測定した。対照
として正常家兎血清を用いて同様に測定した。

ヒアルロニダーゼSD−678の抗血清はヒアルロニダーゼS
D−678の酵素活性を阻害したが、正常家兎血清およびス
トレプトコッカス・ピオゲネス由来のヒアルロニダーゼ
の抗血清は全く酵素活性を阻害しなかった。一方、スト
レプトコッカス・ピオゲネス由来のヒアルロニダーゼの
抗血清はストレプトコッカス・ピオゲネス由来のヒアル
ロニダーゼの酵素活性を阻害したが、ヒアルロニダーゼ
SD−678の抗血清および正常家兎血清ではその酵素活性
は全く阻害されなかった。

このようにヒアルロニダーゼSD−678の諸性質につい
て、この出願前の公知のヒアルロニダーゼと比較検討し
た結果、本発明のヒアルロニダーゼSD−678は従来より
公知の動物由来のヒアルロニダーゼおよび微生物由来の
ヒアルロニダーゼとは種々の点で質的に相異している新
規なヒアルロニダーゼであることが判明した。

一方、ヒアルロニダーゼSD−678の生産菌であるストレ
プトコッカス・ディスガラクティエは動物の皮膚などか
ら分離される細菌であり、人に対する病原性はほとんど
ないことが知られており、ヒアルロニダーゼSD−678の
生産に際しては一般的な設備を使用できる。他方、スト
レプトコッカス・ピオゲネスは人に対して病原性を有す
るので、そのヒアルロニダーゼ生産に際しては、充分に
注意する必要がある。

なお、ストレプトコッカス・ディスガラクティエIID−6
78又はストレプトコッカス・ピオゲネスIID−715をそれ
ぞれ血液寒天培地（極東製薬製）に接種して、37℃で１
晩培養した後、滅菌処理した酵母エキス２％、ペプトン
0.5％、リン酸水素二カリウム0.4％、グルコース２％
（pH7.2）100mlからなる液体培地に菌を２白金耳接種
し、37℃で24時間振盪培養を行い、得られた培養物を遠
心分離して培養上清を得た。この培養上清のヒアルロニ
ダーゼ活性を前記の力価測定法で測定したところ、スト
レプトコッカス・ディスガラクティエの培養上清の総酵
素活性は230単位であり、ストレプトコッカス・ピオゲ
ネスIID−715の培養上清の総酵素活性の約60倍であっ
た。

このようにこのヒアルロニダーゼSD−678はストレプト
コッカス・ピオゲネス由来のヒアルロニダーゼより製造
がしやすく、かつ、生産性がよい。

II.ヒアルロニダーゼSD−678の製造法について： 本発明のヒアルロニダーゼSD−678は、例えば、ストレ
プトコッカス・ディスガラクティエを培地に培養し、得
られる培養物からヒアルロニダーゼSD−678を分離・精
製することにより製造される。

培養方法は一般的微生物培養方法に準ずれば、いずれの
方法でもよいが、通常は液体培地による振盪又は攪拌培
養法が有利である。

培養に用いる培地としては、ストレプトコッカス・ディ
スガラクティエが栄養源として利用できる培地成分であ
ればよい。

例えば、炭素源としては、グルコース、マンノース、澱
粉、糖蜜、液化澱粉、グリセリン等を用いることができ
る。

また、窒素源としては、例えば肉エキス、酵母エキス、
ペプトン、カゼイン加水分解物、ゼラチン、コーンミー
ル、大豆粉、リン酸アンモニウム、硫酸アンモニウム、
尿素等を用いることができる。

また、リン酸水素ニナトリウム、リン酸二水素カリウ
ム、塩化カリウム、炭酸カルシウム、塩化マンガン、塩
化マグネシウム、硫酸ナトリウム等の各種無機塩類も必
要に応じて添加できる。

一方、ヒアルロニダーゼSD−678誘導物質としてヒアル
ロン酸、コンドロイチン又は部分的に脱硫酸化したコン
ドロイチン硫酸を培地に添加することにより、ヒアルロ
ニダーゼSD−678の生産能を高めることができる。

しかし、ヒアルロニダーゼSD−678は還元剤によって失
活するので、培地中に還元剤を添加することは好ましく
ない。

上記したような培地成分は適宜組合せても、また培養途
中で添加してもよい。

また、培養中発泡の著しい時には、例えば大豆油、亜麻
仁油等の植物油、オクチルアルコール等の高級アルコー
ル類、シリコン化合物等の消泡剤を適宜添加すればよ
い。

培養温度は37℃前後が適当であり、培養時間は10〜30時
間が適当である。

培養容量の増大に従って適宜種培養を行うと好結果が得
られる。

以上述べた培養条件は使用菌株の特性に応じてそれぞれ
最適の条件を選択して適用される。

このようにして培養し、得られた培養物からヒアルロニ
ダーゼSD−678を分離精製する。

ヒアルロニダーゼSD−678は主に培養物中の菌体外に含
有されているので、ろ過、遠心分離等の手段により、培
養物を菌体と培養液に分離し、一般酵素の精製法により
ヒアルロニダーゼSD−678を精製すればよい。

即ち、減圧濃縮、凍結乾燥、透析、硫安分別、限外ろ
過、遠心分離、イオン交換体を使用するクロマトグラフ
ィー、ゲルろ過、有機溶媒を使用する分別沈殿等の酵素
の分離、精製手段を単独あるいは任意に組み合わせて、
また必要に応じて反復して用いることにより培養ろ液か
らヒアルロニダーゼSD−678が分離、精製、採取され
る。

［発明の実施例］ 以下、実施例により本発明を更に詳細に説明するが、こ
れらの実施例は本発明の範囲を何ら制限するものではな
い。

実施例１ ストレプトコッカス・ディスガラクティエIID−678株を
ウマ血液寒天培地（極東製薬製）に接種して、37℃で１
晩培養した。

次に、酵母エキス２％、ペプトン0.5％、リン酸水素二
カリウム0.4％、グルコール２％（pH7.2）からなる培地
溶液を500ml容坂口フラスコ４本にそれぞれ100ml入れ、
121℃で15分間加圧滅菌した。このフラスコに前記培養
菌をそれぞれ２白金耳接種し、37℃で10時間培養した。

別に上記と同じ組成の培地溶液20を30のジャーファ
ーメンターに入れ、121℃で20分間滅菌した後、別に滅
菌した１％ヒアルロン酸ナトリウム溶液２を無菌的に
加えた後、前記の４本のフラスコ培養液を加えて37℃で
12時間培養した。途中、培地のpHは、3N NaOH溶液を適
宜加えて中性に保つ。

このようにして得られた培養液をラジオライト（昭和化
学工業製）をろ過助剤に用いてろ過し、ろ液を得た。こ
のろ液を10℃まで水冷し、70％飽和硫安濃度になるよう
に硫安を加えて、攪拌した後、液温を10℃に保ちながら
２時間放置した。

この塩析で生じた沈殿物を遠心分離して集め、0.025Mト
リス−塩酸緩衝液（pH7.8）50mlに溶解した後、同じ緩
衝液15に対して20時間透析した。次に、この液をDEAE
−セルロースを充填したカラムを通過させ、カラムを0.
025Mトリス−塩酸緩衝液で洗浄した後、0.2M NaClを含
む0.025Mトリス−塩酸緩衝液で溶出して、溶出液を集
め、濃縮した後、0.05Mリン酸緩衝液（pH5.8）に対して
20時間透析した。この液をPhospho−セルロースを充填
したカラムに通過させ、0.05Mリン酸緩衝液（pH5.8）で
よく洗浄した後、0.05MのpH5.8とpH7.0のリン酸緩衝液
を用いてpHグラジエント溶出を行い、目的物を含む画分
を集め20mlまで濃縮した。この液をセファアクリルＳ−
300（ファルマシア社製）を充填したカラムでゲルろ過
を行い、目的物の溶出される画分を集めて凍結乾燥し
て、粉末ヒアルロニダーゼSD−678 12mgを得た。

こうして得たヒアルロニダーゼSD−678の比活性を力価
測定法に従って測定したところ1,500単位/mgであった。

［発明の効果］ 本発明によれば、新規なヒアルロニダーゼを提供するこ
とができる。

Claims (2)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】次の理化学的性質： 作用： エンドβ−ヘキソサミニダーゼ 基質特異性： ヒアルロン酸およびコンドロイチンを分解し、 コンドロイチン硫酸Ａ、コンドロイチン硫酸Ｃ、 デルマタン硫酸、ヘパリン、ヘパラン硫酸およびケラト
   硫酸を分解せず。 至適pHおよび安定pH範囲： 至適pH pH5.8〜6.6 安定pH pH5.0〜9.0 作用適温の範囲： 至適温度:37℃付近 作用適温の範囲:20〜50℃ pH、温度などによる失活の条件： ｉ）pH4.5のエチレンジアミン−酢酸緩衝液中、37℃で1
   5分間放置することにより約80％失活する。 ii）pH7.2のリン酸緩衝液中、80℃で30分間放置するこ
   とにより約100％失活する。 iii）50mMの亜硫酸ナトリウム、システイン又はメルカ
   プトエタノールを含むpH6.5のリン酸緩衝液中、37℃で1
   0分間放置することにより約100％失活する。 阻害および安定化： ｉ）Fe²⁺、Cu²⁺、Pb²⁺およびHg²⁺により阻害される。 ii）牛血清アルブミン又はゼラチンを加えることにより
   安定化する。 分子量： 125,000±10,000（セファアクリルＳ−200によるゲルろ
   過法） 電気泳動による移動度： セルロースアセテート膜を支持体として、0.05Mトリス
   −マレイン酸緩衝液（pH6.0）を用いて、0.5mA/cmで30
   分間通電して電気泳動を行い、陽極側に泳動される牛血
   清アルブミンの移動度を＋1.0とするときの移動度は＋
   0.3である。 を有することを特徴とするストレプトコッカス・ディス
   ガラクティエ（Streptococcus dysgalactiae）由来のヒ
   アルロニダーゼSD−678。
2. 【請求項２】ストレプトコッカス・ディスガラクティエ
   （Streptococcus dysgalactiae）又はその変異株を培地
   に培養し、得られた培養物からヒアルロニダーゼSD−67
   8を分離、採取することを特徴とするヒアルロニダーゼS
   D−678の製造法。