JPH07114708B2 - 臨床的に重要な大多数のグラム陽性微生物の抗微生物薬感受性を決定するための方法及び組成物 - Google Patents
臨床的に重要な大多数のグラム陽性微生物の抗微生物薬感受性を決定するための方法及び組成物Info
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Description
【発明の詳細な説明】 発明の分野 本発明は、臨床的に重要な広範なグラム陽性菌の抗微生
物薬に対する感受性を決定する方法に関する。本発明は
また、グラム陽性細菌の増殖を検出するために使用する
蛍光原性基質の混合物にも関する。
物薬に対する感受性を決定する方法に関する。本発明は
また、グラム陽性細菌の増殖を検出するために使用する
蛍光原性基質の混合物にも関する。
発明の背景 患者その他の源から分離された微生物は、抗微生物薬に
対するそれらの感受性及びそれらの代謝上の増殖必須条
件を調べるため日常的に試験される。特に、臨床源より
分離された微生物についての抗微生物薬の最少発育阻止
濃度（MIC）又は分類的解釈（感受性、中等度感受性、
又は抵抗性）は、日常的に決定されている。
対するそれらの感受性及びそれらの代謝上の増殖必須条
件を調べるため日常的に試験される。特に、臨床源より
分離された微生物についての抗微生物薬の最少発育阻止
濃度（MIC）又は分類的解釈（感受性、中等度感受性、
又は抵抗性）は、日常的に決定されている。
感受性試験を実施するために多くの方法及び装置が開発
されてきた。特に、特定量の抗微生物薬又はビタミン等
の増殖促進材料を含有した各コンパートメントを有す
る、マイクロダイリューションパネルのようなマルチコ
ンパートメント化された装置が、増殖及び感受性を決定
するためにしばしば使用されている。これらのコンパー
トメントは、試験すべき薬物に加えて、増殖支持培地を
一般的に含有する。これらの装置は、新しく調製され、
簡便な貯蔵のために凍結し又は乾燥されることができ
る。
されてきた。特に、特定量の抗微生物薬又はビタミン等
の増殖促進材料を含有した各コンパートメントを有す
る、マイクロダイリューションパネルのようなマルチコ
ンパートメント化された装置が、増殖及び感受性を決定
するためにしばしば使用されている。これらのコンパー
トメントは、試験すべき薬物に加えて、増殖支持培地を
一般的に含有する。これらの装置は、新しく調製され、
簡便な貯蔵のために凍結し又は乾燥されることができ
る。
感受性試験を実施するためには、上述の装置は標準化さ
れた微生物学的接種物を接種され、目視し得る増殖が現
れるまでインキュベートされる。これには、典型的には
15乃至24時間かかる。一般的には、液体培地中か固形支
持培地表面上のいずれかの微生物増殖が、直接の肉眼的
認識により又は濁度測定により決定される。感受性試験
の終点は、増殖コンパートメントと比較したときその中
における増殖が阻害されているように見える、抗微生物
薬の最少濃度として定義される。
れた微生物学的接種物を接種され、目視し得る増殖が現
れるまでインキュベートされる。これには、典型的には
15乃至24時間かかる。一般的には、液体培地中か固形支
持培地表面上のいずれかの微生物増殖が、直接の肉眼的
認識により又は濁度測定により決定される。感受性試験
の終点は、増殖コンパートメントと比較したときその中
における増殖が阻害されているように見える、抗微生物
薬の最少濃度として定義される。
一般的に用いられる感受性試験は、結果を得るまでに15
乃至24時間のインキュベーションを要する。正確な抗微
生物薬感受性情報がより早く医師に入手されるなら、よ
り良い患者治療をもたらすことであろう。より早い感受
性決定を達成するための多くの方法が発表されてきた。
それらは、特許番号第4,236,211（Pfizer）、第3,832,5
32（Pfizer）、英国特許第1,554,134（Pfizer）に記載
された細菌集団測定、並びに、特許番号第4,242,447（B
io Research）に記載された酵素活性測定、特許番号第
3,509,026（Litton Systems Inc.）のリン酸エステルの
蛍光原性測定、フランス国特許第2,504,679のフォスフ
ァターゼの蛍光原性測定、ヨーロッパ特許0,091,837B及
び、M.R.Mateo等による、Abstract Annual Meeting,Ame
rican Society for Microbiology,1980,C201,p308の抗
微生物薬感受性試験のためのアミド−クマリン誘導体の
使用を記載した記事のメチルウンベリフェリル誘導体の
使用、及び、T.Urban及びC.JarstrandのJ.Antimicio.Ch
emo（1981）8,363−369のマイクロダイリューションパ
ネル中のテトラゾリウムの還元による代謝活性の測定に
よる、細菌集団の間接的評価に分けることができよう。
次はいずれも、蛍光原性物質の混合物の使用についての
ものである。Nolte etal,J.Clin.Microbio.（1988）26,
1079−1084,Staneck et al,J.Clin.Microbiol.（198
5）,187−191,Doern et al.,J.Clin.Micro.（1987）,14
81−1485、及び、Staneck et al.,J.Clin.Micro.（198
8）v.261−7. 具体的な方法の一つは、抗微生物薬感受性マイクロダイ
リューショントレーを自動的に読み取ることのできる装
置を有するSensititreTMシステムである。この手順にお
いては、微生物の増殖は、蛍光原性物質に対する微生物
の酵素作用によって産生される蛍光の測定により決定さ
れる。蛍光シグナルはその装置によって解釈されMICへ
と変換される。Staneck,（1985）上記187頁を参照。Sen
sititreTM法は、加水分解可能な蛍光原性基質の接種物
への添加の５時間以内のただ１回の測定に基づいてグラ
ム陽性及び陰性細菌に対する最少発育阻止濃度を検出す
るための、蛍光原性の基質調合物の使用を伴う。このグ
ループの細菌のための蛍光原性基質は、７−（Ｎ）−
（アミノアシル）−７−アミド−４−メチルクマリン、
ノナン酸４−メチルウンベリフェリルエステル、リン酸
４−メチルウンベリフェリルエステルより選ばれること
が開示されている。ヨーロッパ特許第0,091,837Bを参
照。
乃至24時間のインキュベーションを要する。正確な抗微
生物薬感受性情報がより早く医師に入手されるなら、よ
り良い患者治療をもたらすことであろう。より早い感受
性決定を達成するための多くの方法が発表されてきた。
それらは、特許番号第4,236,211（Pfizer）、第3,832,5
32（Pfizer）、英国特許第1,554,134（Pfizer）に記載
された細菌集団測定、並びに、特許番号第4,242,447（B
io Research）に記載された酵素活性測定、特許番号第
3,509,026（Litton Systems Inc.）のリン酸エステルの
蛍光原性測定、フランス国特許第2,504,679のフォスフ
ァターゼの蛍光原性測定、ヨーロッパ特許0,091,837B及
び、M.R.Mateo等による、Abstract Annual Meeting,Ame
rican Society for Microbiology,1980,C201,p308の抗
微生物薬感受性試験のためのアミド−クマリン誘導体の
使用を記載した記事のメチルウンベリフェリル誘導体の
使用、及び、T.Urban及びC.JarstrandのJ.Antimicio.Ch
emo（1981）8,363−369のマイクロダイリューションパ
ネル中のテトラゾリウムの還元による代謝活性の測定に
よる、細菌集団の間接的評価に分けることができよう。
次はいずれも、蛍光原性物質の混合物の使用についての
ものである。Nolte etal,J.Clin.Microbio.（1988）26,
1079−1084,Staneck et al,J.Clin.Microbiol.（198
5）,187−191,Doern et al.,J.Clin.Micro.（1987）,14
81−1485、及び、Staneck et al.,J.Clin.Micro.（198
8）v.261−7. 具体的な方法の一つは、抗微生物薬感受性マイクロダイ
リューショントレーを自動的に読み取ることのできる装
置を有するSensititreTMシステムである。この手順にお
いては、微生物の増殖は、蛍光原性物質に対する微生物
の酵素作用によって産生される蛍光の測定により決定さ
れる。蛍光シグナルはその装置によって解釈されMICへ
と変換される。Staneck,（1985）上記187頁を参照。Sen
sititreTM法は、加水分解可能な蛍光原性基質の接種物
への添加の５時間以内のただ１回の測定に基づいてグラ
ム陽性及び陰性細菌に対する最少発育阻止濃度を検出す
るための、蛍光原性の基質調合物の使用を伴う。このグ
ループの細菌のための蛍光原性基質は、７−（Ｎ）−
（アミノアシル）−７−アミド−４−メチルクマリン、
ノナン酸４−メチルウンベリフェリルエステル、リン酸
４−メチルウンベリフェリルエステルより選ばれること
が開示されている。ヨーロッパ特許第0,091,837Bを参
照。
蛍光原性基質を用いて最少発育阻止濃度を予測又は決定
するための単回測定法は、しかしながら、信頼できない
ことが見出されている。正確な最少発育阻止濃度を決定
するためには、十分な増殖と基質の使用とがなければな
らない。異なる細菌種は、最少発育阻止濃度を決定する
に十分な増殖を異なる時間に達成するであろうことか
ら、単回測定は至適条件下での最少発育阻止濃度の正確
な決定を不可能にする。抵抗性の不十分な表現のため
に、ただ１回の早期測定は、最少発育阻止濃度の不正確
な予測をもたらすであろう。ただ１回の遅い測定は、抗
微生物薬含有コンパートメントにおける酵素活性につ
き、増殖コンパートメントのそれとの関係において不正
確な評価をもたらすであろう。ある蛍光レベルに達した
後は、光度法的検出システムは蛍光の正確な定量をする
ことができない。従って、一つの標準化された試験シス
テムにおいて蛍光原性基質を用いて広範なグラム陽性微
生物について最少発育阻止濃度を正確に予測するシステ
ムを開発することの必要が存在する。
するための単回測定法は、しかしながら、信頼できない
ことが見出されている。正確な最少発育阻止濃度を決定
するためには、十分な増殖と基質の使用とがなければな
らない。異なる細菌種は、最少発育阻止濃度を決定する
に十分な増殖を異なる時間に達成するであろうことか
ら、単回測定は至適条件下での最少発育阻止濃度の正確
な決定を不可能にする。抵抗性の不十分な表現のため
に、ただ１回の早期測定は、最少発育阻止濃度の不正確
な予測をもたらすであろう。ただ１回の遅い測定は、抗
微生物薬含有コンパートメントにおける酵素活性につ
き、増殖コンパートメントのそれとの関係において不正
確な評価をもたらすであろう。ある蛍光レベルに達した
後は、光度法的検出システムは蛍光の正確な定量をする
ことができない。従って、一つの標準化された試験シス
テムにおいて蛍光原性基質を用いて広範なグラム陽性微
生物について最少発育阻止濃度を正確に予測するシステ
ムを開発することの必要が存在する。
発明の概要 本発明は、広範な種類のグラム陽性微生物の抗微生物薬
感受性を定量するための方法を含み:a）グラム陽性微生
物の形態学的に近似の十分な数のコロニーを水性懸濁培
地に懸濁し均一に混合して、少なくとも0.5マクファー
ランド硫酸バリウム濁度標準に等価な濁度を有する接種
物を調製し、ｂ）該接種物を、約２×106コロニー形成
単位/mLの名目濃度を達成するに十分な量の増殖支持培
地中に希釈して、ｃ）該接種物の一部を十分な量の、ロ
イシン−７−アミド−４−メチルクマリン、フェニルア
ラニン−７−アミド−４−メチルクマリン及びリン酸４
−メチルウンベリフェリルエステルよりなる蛍光原性基
質及び予め決定した量の抗微生物薬と合わせて混合物を
形成し、ｄ）得られる蛍光強度の増大を検出するため
に、段階（ｃ）から約3 1/2乃至15時間の間、該混合物
の蛍光強度を繰り返しモニターし、そしてｅ）前記グラ
ム陽性微生物の抗微生物薬に対する感受性を決定するた
めに、該検出された蛍光強度を１の対照又は複数の対照
の蛍光強度の変化と比較することよりなる方法である。
上述の方法を実施するためのキットは、個別化したコン
パートメント中の対照、増殖対照、及び抗微生物薬より
なり、前記対照コンパートメントは緩衝剤を含み、前記
増殖対照コンパートメントは緩衝剤及び蛍光原濃縮物を
含み、そして前記抗微生物薬コンパートメントは緩衝
剤、抗微生物薬及び蛍光原濃縮物を含む。キットの生化
学的成分は全て、脱水状態のような安定な形である。
感受性を定量するための方法を含み:a）グラム陽性微生
物の形態学的に近似の十分な数のコロニーを水性懸濁培
地に懸濁し均一に混合して、少なくとも0.5マクファー
ランド硫酸バリウム濁度標準に等価な濁度を有する接種
物を調製し、ｂ）該接種物を、約２×106コロニー形成
単位/mLの名目濃度を達成するに十分な量の増殖支持培
地中に希釈して、ｃ）該接種物の一部を十分な量の、ロ
イシン−７−アミド−４−メチルクマリン、フェニルア
ラニン−７−アミド−４−メチルクマリン及びリン酸４
−メチルウンベリフェリルエステルよりなる蛍光原性基
質及び予め決定した量の抗微生物薬と合わせて混合物を
形成し、ｄ）得られる蛍光強度の増大を検出するため
に、段階（ｃ）から約3 1/2乃至15時間の間、該混合物
の蛍光強度を繰り返しモニターし、そしてｅ）前記グラ
ム陽性微生物の抗微生物薬に対する感受性を決定するた
めに、該検出された蛍光強度を１の対照又は複数の対照
の蛍光強度の変化と比較することよりなる方法である。
上述の方法を実施するためのキットは、個別化したコン
パートメント中の対照、増殖対照、及び抗微生物薬より
なり、前記対照コンパートメントは緩衝剤を含み、前記
増殖対照コンパートメントは緩衝剤及び蛍光原濃縮物を
含み、そして前記抗微生物薬コンパートメントは緩衝
剤、抗微生物薬及び蛍光原濃縮物を含む。キットの生化
学的成分は全て、脱水状態のような安定な形である。
本発明は、SensititreTMヨーロッパ特許第0,091,837に
よって使用されるグラム陽性細菌のための前述の手順と
は、３つの重要な点において異なる。第１に、蛍光原性
酵素基質の混合物、第２に、カバーする微生物の範囲に
おいて、そして第３に、蛍光の繰り返し測定においてで
ある。
よって使用されるグラム陽性細菌のための前述の手順と
は、３つの重要な点において異なる。第１に、蛍光原性
酵素基質の混合物、第２に、カバーする微生物の範囲に
おいて、そして第３に、蛍光の繰り返し測定においてで
ある。
SensititreTM手順においては、基質混合物は、アラニル
−７−アミド−４−メチルクマリン、リン酸４−メチル
ウンベリフェリルエステル及びノナン酸４−メチルウン
ベリフェリルエステルよりなる。この最後の物質は、脱
水後は均一に再溶解することが困難である。更に、乳化
剤と組み合わせて固体の担体上に基質混合物を乾燥させ
る特別の手順が、ヨーロッパ特許第0,091,837号に記載
された好ましい方法であった。該混合物からのこの化合
物の除去は、蛍光原性基質混合物の容易な調製と小分け
とを許容する。本発明においては、フェニルアラニン−
７−アミド−４−メチルクマリン及びロイシン−７−ア
ミド−４−メチルクマリンは、乾燥に際した乳化剤の必
要と、固体の担体上に蛍光原性酵素基質を乾燥する必要
とが取り除かれていることから、前述のものより優れた
混合物を提供する。本蛍光原性基質混合物はまた、前述
のものより広い範囲のグラム陽性種の試験をも許容す
る。加えて、autoSCANR−W/Aの使用は、3 1/2乃至15時
間の間増殖をモニターし、十分な増殖が達成されたとき
に見られる最少発育阻止濃度の決定を許容する。これ
は、各分離物の最少発意阻止濃度決定が至適時間におい
てなされることを保障する。
−７−アミド−４−メチルクマリン、リン酸４−メチル
ウンベリフェリルエステル及びノナン酸４−メチルウン
ベリフェリルエステルよりなる。この最後の物質は、脱
水後は均一に再溶解することが困難である。更に、乳化
剤と組み合わせて固体の担体上に基質混合物を乾燥させ
る特別の手順が、ヨーロッパ特許第0,091,837号に記載
された好ましい方法であった。該混合物からのこの化合
物の除去は、蛍光原性基質混合物の容易な調製と小分け
とを許容する。本発明においては、フェニルアラニン−
７−アミド−４−メチルクマリン及びロイシン−７−ア
ミド−４−メチルクマリンは、乾燥に際した乳化剤の必
要と、固体の担体上に蛍光原性酵素基質を乾燥する必要
とが取り除かれていることから、前述のものより優れた
混合物を提供する。本蛍光原性基質混合物はまた、前述
のものより広い範囲のグラム陽性種の試験をも許容す
る。加えて、autoSCANR−W/Aの使用は、3 1/2乃至15時
間の間増殖をモニターし、十分な増殖が達成されたとき
に見られる最少発育阻止濃度の決定を許容する。これ
は、各分離物の最少発意阻止濃度決定が至適時間におい
てなされることを保障する。
詳細な説明 本発明は、臨床的に重要な大多数のグラム陽性微生物で
ある、staphylococcus属細菌、streptococcus属細菌、e
nterococcus属細菌、及びIisteria属細菌の、約3 1/2乃
至15時間の間の増殖の検出を能率化するために、３種の
蛍光原性化合物を組み合わせる。該３種の化合物の組合
せは、増殖対照及び全ての濃度の抗微生物薬コンパート
メントに加えられる。微生物の増殖は、蛍光単位の増大
によって検出される。
ある、staphylococcus属細菌、streptococcus属細菌、e
nterococcus属細菌、及びIisteria属細菌の、約3 1/2乃
至15時間の間の増殖の検出を能率化するために、３種の
蛍光原性化合物を組み合わせる。該３種の化合物の組合
せは、増殖対照及び全ての濃度の抗微生物薬コンパート
メントに加えられる。微生物の増殖は、蛍光単位の増大
によって検出される。
微生物が増殖するにつれて、蛍光原性化合物を加水分解
する酵素が産生され、こうして、340乃至370nmお範囲の
光によって励起されると440乃至470nmの範囲の範囲の蛍
光を発する蛍光団を遊離する。微生物が増殖しない場合
には、蛍光団部分は化合物から遊離されず、選択した波
長における蛍光の増大は見られない。微生物が3 1/2乃
至15時間の間増殖した後、各個々の濃度の抗微生物薬中
の蛍光の量は増殖対照の蛍光量と比較することができ、
各抗微生物薬の最少発育阻止濃度を決定することができ
る。
する酵素が産生され、こうして、340乃至370nmお範囲の
光によって励起されると440乃至470nmの範囲の範囲の蛍
光を発する蛍光団を遊離する。微生物が増殖しない場合
には、蛍光団部分は化合物から遊離されず、選択した波
長における蛍光の増大は見られない。微生物が3 1/2乃
至15時間の間増殖した後、各個々の濃度の抗微生物薬中
の蛍光の量は増殖対照の蛍光量と比較することができ、
各抗微生物薬の最少発育阻止濃度を決定することができ
る。
増殖を検出するために蛍光原性化合物の組合せを利用す
ることの利点は、増殖を、従って最少発育阻止濃度を迅
速に決定できることである。濁度に基づくものである慣
用の最少発育阻止濃度決定は、読み取りに先立ち15乃至
24時間のインキュベーションを要する。特定の化合物の
組合せの使用は、しかしながら、大多数のグラム陽性微
生物の最少発育阻止濃度を3 1/2乃至15時間以内で決定
することを許容する。
ることの利点は、増殖を、従って最少発育阻止濃度を迅
速に決定できることである。濁度に基づくものである慣
用の最少発育阻止濃度決定は、読み取りに先立ち15乃至
24時間のインキュベーションを要する。特定の化合物の
組合せの使用は、しかしながら、大多数のグラム陽性微
生物の最少発育阻止濃度を3 1/2乃至15時間以内で決定
することを許容する。
蛍光原性化合物の数種の組合せが試験され、本組合せ
が、グラム陽性微生物の殆どの種類の増殖を検出した。
該化合物は、ロイシン−７−アミド−４−メチルクマリ
ン、フェニルアラニン−７−アミド−４−メチルクマリ
ン及びリン酸４−メチルウンベリフェリルエステルであ
る。この組合せは、臨床的に明らかにされたstophyloco
ccus属細菌、streptococcus属細菌、enterococcus属細
菌及びlisteria属細菌の大多数を検出した。表１を参
照。
が、グラム陽性微生物の殆どの種類の増殖を検出した。
該化合物は、ロイシン−７−アミド−４−メチルクマリ
ン、フェニルアラニン−７−アミド−４−メチルクマリ
ン及びリン酸４−メチルウンベリフェリルエステルであ
る。この組合せは、臨床的に明らかにされたstophyloco
ccus属細菌、streptococcus属細菌、enterococcus属細
菌及びlisteria属細菌の大多数を検出した。表１を参
照。
特に、このアッセイにおいては、微生物が増殖する際
に、それは蛍光原性濃縮物の１、２又は３種の全ての成
分を代謝する。代謝活性は、蛍光源すなわちアミノ−４
−メチルクマリン及び／又は４−メチルウンベリフェロ
ンの遊離をもたらし、それらは340乃至370nmの範囲の光
により励起されるとき、440乃至470nmの範囲の光（蛍
光）を発する。微生物が増殖するとき、蛍光量が増大す
る。抗微生物薬の各濃度における蛍光量の増大は、増殖
対照における蛍光量の増大と比較される。判別関数解析
に基づく数学的モデルを用いて、試験した微生物につい
て、各抗微生物薬の最少発育阻止濃度を決定することが
できる。微生物学的パターン認識における判別関数解析
モデルの利用は、T.N.Bryant and J.W.T.Wimpenny
（編）、Computers in Microbiology,a Practical Appr
oach（IRL Press,Oxford）中、S.Bascomb,Computers in
Taxonomy and Systematics,p.65−102に記述されてい
る。代わりの具体例の１つにおいては、試験した微生物
についての各抗微生物薬の最少発育阻止濃度は、ブレー
クポイント若しくは閾値法によって又は線形回帰分析に
よって決定することができる。J.Mekie,et al.,Antimic
robial Agents and Chemotherapy（1980）v.17,813−82
3参照。
に、それは蛍光原性濃縮物の１、２又は３種の全ての成
分を代謝する。代謝活性は、蛍光源すなわちアミノ−４
−メチルクマリン及び／又は４−メチルウンベリフェロ
ンの遊離をもたらし、それらは340乃至370nmの範囲の光
により励起されるとき、440乃至470nmの範囲の光（蛍
光）を発する。微生物が増殖するとき、蛍光量が増大す
る。抗微生物薬の各濃度における蛍光量の増大は、増殖
対照における蛍光量の増大と比較される。判別関数解析
に基づく数学的モデルを用いて、試験した微生物につい
て、各抗微生物薬の最少発育阻止濃度を決定することが
できる。微生物学的パターン認識における判別関数解析
モデルの利用は、T.N.Bryant and J.W.T.Wimpenny
（編）、Computers in Microbiology,a Practical Appr
oach（IRL Press,Oxford）中、S.Bascomb,Computers in
Taxonomy and Systematics,p.65−102に記述されてい
る。代わりの具体例の１つにおいては、試験した微生物
についての各抗微生物薬の最少発育阻止濃度は、ブレー
クポイント若しくは閾値法によって又は線形回帰分析に
よって決定することができる。J.Mekie,et al.,Antimic
robial Agents and Chemotherapy（1980）v.17,813−82
3参照。
一般的に、本発明は該３種の蛍光原性化合物すなわち、
ロイシン−７−アミド−４−メチルクマリン（0.1M）、
フェニルアラニン−７−アミド−４−メチルクマリン
（0.05M）及びリン酸４−メチルウンベリウェリルエス
テル（0.25M）を含有する貯蔵溶液を製造すること、該
化合物をジメチルホルムアミドに溶解すること、ｂ）HE
PES緩衝液、0.01M,pH7.0又は類似の緩衝液である希釈用
液を製造することを伴う。抗微生物薬は0.01M緩衝液に
希釈し、蛍光原性濃縮液（2mL/L）が、緩衝剤のみを含
有する増殖対照と、各異なる濃度の抗微生物に加えられ
る。加えて、本アッセイに緩衝剤のみを含有する対照が
使用される。コンパートメト当たりの蛍光原性成分の最
終濃度は、ロイシン−７−アミド−４−メチルクマリン
が0.2mM、フェニルアラニン−７−アイド−４−メチル
クマリンが0.1mM、及びリン酸４−メチルウンベリフェ
リルエステルが0.5mMである。これらの濃度は、増殖期
間を通じて至適の酵素活性を保障するために選択され
た。マイクロダイリューションパネルの個々のコンパー
トメント中に、115μＬの前記各溶液が配付される。パ
ネルは、脱水され、１袋の乾燥剤とともにホイル包み中
に包装される。この包装は２乃至８℃にて貯蔵される。
ロイシン−７−アミド−４−メチルクマリン（0.1M）、
フェニルアラニン−７−アミド−４−メチルクマリン
（0.05M）及びリン酸４−メチルウンベリウェリルエス
テル（0.25M）を含有する貯蔵溶液を製造すること、該
化合物をジメチルホルムアミドに溶解すること、ｂ）HE
PES緩衝液、0.01M,pH7.0又は類似の緩衝液である希釈用
液を製造することを伴う。抗微生物薬は0.01M緩衝液に
希釈し、蛍光原性濃縮液（2mL/L）が、緩衝剤のみを含
有する増殖対照と、各異なる濃度の抗微生物に加えられ
る。加えて、本アッセイに緩衝剤のみを含有する対照が
使用される。コンパートメト当たりの蛍光原性成分の最
終濃度は、ロイシン−７−アミド−４−メチルクマリン
が0.2mM、フェニルアラニン−７−アイド−４−メチル
クマリンが0.1mM、及びリン酸４−メチルウンベリフェ
リルエステルが0.5mMである。これらの濃度は、増殖期
間を通じて至適の酵素活性を保障するために選択され
た。マイクロダイリューションパネルの個々のコンパー
トメント中に、115μＬの前記各溶液が配付される。パ
ネルは、脱水され、１袋の乾燥剤とともにホイル包み中
に包装される。この包装は２乃至８℃にて貯蔵される。
抗微生物薬は次のものを含む。すなわち：アモキシシリ
ン／クラブラン酸カラム（Aug）、アンピシリン（a
m）、アンピシリン／スルバクタム（A/S）、セファマン
ドール（Cfm）、セファゾリン（Cfz）、セファタキシム
（Cft）、セフトリアクソン（Cax）、セフロキシム（Cr
m）、セファロチン（Cf）、クロラムフェニコール
（Ｃ）、シプロフロキサシン（Cp）、クリンダマイシン
（Cd）、エリスロマイシン（Ｅ），ゲンタマイシン（G
m），ゲンタマイシンシナジースクリーン（Synergy Ser
een）（GmS）、インペネム（Imp）、ニトロフラントイ
ン（Fd）、ノルフロキサシン（Nx）、オキサシリン（O
x）、ペニシリン（Ｐ）、リファンピン（Rif）、ストレ
プトマイシンシナジースクリーン（Synergy Scyeen）
（Sts）（ウェル中の高濃度ストレプトマイシン。スク
リーンは、ストレプトマイシン及び他の抗生物質の組合
せが効果的であることを決定する。）、テトラサイクリ
ン（Te）、トリメトプリム（Ｔ）、トリメトプリム／ス
ルファメトキサゾール（T/S）及びバンコマイシン（V
a）。
ン／クラブラン酸カラム（Aug）、アンピシリン（a
m）、アンピシリン／スルバクタム（A/S）、セファマン
ドール（Cfm）、セファゾリン（Cfz）、セファタキシム
（Cft）、セフトリアクソン（Cax）、セフロキシム（Cr
m）、セファロチン（Cf）、クロラムフェニコール
（Ｃ）、シプロフロキサシン（Cp）、クリンダマイシン
（Cd）、エリスロマイシン（Ｅ），ゲンタマイシン（G
m），ゲンタマイシンシナジースクリーン（Synergy Ser
een）（GmS）、インペネム（Imp）、ニトロフラントイ
ン（Fd）、ノルフロキサシン（Nx）、オキサシリン（O
x）、ペニシリン（Ｐ）、リファンピン（Rif）、ストレ
プトマイシンシナジースクリーン（Synergy Scyeen）
（Sts）（ウェル中の高濃度ストレプトマイシン。スク
リーンは、ストレプトマイシン及び他の抗生物質の組合
せが効果的であることを決定する。）、テトラサイクリ
ン（Te）、トリメトプリム（Ｔ）、トリメトプリム／ス
ルファメトキサゾール（T/S）及びバンコマイシン（V
a）。
一般的に、試験手順は、無菌プルロニックブイヨン中、
0.5マクファーランド硫酸バリウム濁度標準と等価であ
るグラム陽性微生物の懸濁液を調製することを含む。該
懸濁液の300μＬを、接種ブイヨンの25mLに希釈する。
懸濁液を混合する。乾燥したパネルを、懸濁液当たり11
5μＬの接種ブイヨンで再水和する。Rapid PosR Inocul
um Broth（Baxter MicroScan）。パネルを35゜±１℃に
て無CO2インキュベーター中でインキュベートする。指
定時間にパネルを蛍光光度計で読み取る。MicroScan
は、パネルをインキュベートし、指定された時間に自動
的に読み取るautoScanRW/A（Baxter MicroScan）装置を
有する。
0.5マクファーランド硫酸バリウム濁度標準と等価であ
るグラム陽性微生物の懸濁液を調製することを含む。該
懸濁液の300μＬを、接種ブイヨンの25mLに希釈する。
懸濁液を混合する。乾燥したパネルを、懸濁液当たり11
5μＬの接種ブイヨンで再水和する。Rapid PosR Inocul
um Broth（Baxter MicroScan）。パネルを35゜±１℃に
て無CO2インキュベーター中でインキュベートする。指
定時間にパネルを蛍光光度計で読み取る。MicroScan
は、パネルをインキュベートし、指定された時間に自動
的に読み取るautoScanRW/A（Baxter MicroScan）装置を
有する。
次の表は、増殖対照及び抗微生物薬ウェルにおける試薬
と接種物の分布を示す。
と接種物の分布を示す。
特定の抗微生物薬の最少発育阻止濃度を決定するためこ
の試験の有効性を決定するために、上記のアッセイを用
いて、臨床的に重要な大多数のグラム陽性微生物（表３
を参照）につき試験した。
の試験の有効性を決定するために、上記のアッセイを用
いて、臨床的に重要な大多数のグラム陽性微生物（表３
を参照）につき試験した。
表３に示した微生物につき、この試験の以下の効果が、
表４に掲げた抗微生物薬について報告された。標準の最
少発育阻止濃度決定との95.5％一致が得られた。
表４に掲げた抗微生物薬について報告された。標準の最
少発育阻止濃度決定との95.5％一致が得られた。
本発明の実施例を以下に示す。
実施例１ 0.5マクファーランド濁度標準に等価な、細菌分離物の
食塩水−プルロニック中一次接種物懸濁液を調製する。
該一次懸濁液の0.3mL部分を25mLのRapid Pos Inoculum
Broth（B1015−14,Baxter Diagnostics Inc.,MicroScan
Division,West Sacramento,CA）に希釈することによっ
て、最終接種物懸濁液を調製する。該最終接種物の115
μＬを、0.023mMのロイシン−７−アミド−４−メチル
クマリン、0.012mMのフェニルアラニン−７−アミド−
４−メチルクマリン及び0.058mMのリン酸４−メチルウ
ンベリフェリルエステル並びに1.15mMのpH7.0のHEPES緩
衝液に等価な蛍光原性酵素基質の乾燥材料を含有する、
増殖コンパートメントに加える。最終接種物を、増殖ウ
ェル中のものと同一の乾燥材料と種々の濃度の抗微生物
薬とを含有する多くのコンパートメントにも加える。最
終接種物の一部は、乾燥HEPES緩衝液のみを含有する、
対照として働くコンパートメントにも加える。接種済み
のマルチコンパートメント装置（パネル）は、autoSCAN
R−W/Aに挿入される。各コンパートメントの蛍光を、予
め設定された時間測定し、増殖コンパートメントの蛍光
を陰性対照コンパートメントのそれで割ることによっ
て、増殖指数を算出する。表４を参照。
食塩水−プルロニック中一次接種物懸濁液を調製する。
該一次懸濁液の0.3mL部分を25mLのRapid Pos Inoculum
Broth（B1015−14,Baxter Diagnostics Inc.,MicroScan
Division,West Sacramento,CA）に希釈することによっ
て、最終接種物懸濁液を調製する。該最終接種物の115
μＬを、0.023mMのロイシン−７−アミド−４−メチル
クマリン、0.012mMのフェニルアラニン−７−アミド−
４−メチルクマリン及び0.058mMのリン酸４−メチルウ
ンベリフェリルエステル並びに1.15mMのpH7.0のHEPES緩
衝液に等価な蛍光原性酵素基質の乾燥材料を含有する、
増殖コンパートメントに加える。最終接種物を、増殖ウ
ェル中のものと同一の乾燥材料と種々の濃度の抗微生物
薬とを含有する多くのコンパートメントにも加える。最
終接種物の一部は、乾燥HEPES緩衝液のみを含有する、
対照として働くコンパートメントにも加える。接種済み
のマルチコンパートメント装置（パネル）は、autoSCAN
R−W/Aに挿入される。各コンパートメントの蛍光を、予
め設定された時間測定し、増殖コンパートメントの蛍光
を陰性対照コンパートメントのそれで割ることによっ
て、増殖指数を算出する。表４を参照。
もし増殖指数の値がある特定の値と等しいか又はこれを
超えれば、マルチコンパートメント装置中に存在する全
ての抗微生物薬について最少発育阻止濃度が計算され
る。そうでない場合は、装置は元の位置に戻され、次の
読み取り時間に再度測定される。この実施例におけ読み
取り時間は、3.5、4.5、5.5、7.0、8.0、11.0及び15.0
時間である。最少発育阻止濃度の算出のためには、各コ
ンパートメントから対象ウェルの蛍光を引きそしてそれ
を、増殖コンパートメントの蛍光から陰性対照コンパー
トメントの蛍光を引くことによって得られる増殖コンパ
ートメントの蛍光差で割ることにより、種々の濃度の抗
微生物薬を含有するコンパートメントのパーセント蛍光
が算出される。最少発育阻止濃度は、各濃度範囲の抗微
生物薬に特異的な数学モデルを用いて算出する。判別関
数解析に基づく数学モデルを用いて、試験した微生物に
ついての各抗微生物薬の最少発育阻止濃度を決定するこ
とができる。微生物学的パターン認識における判別関数
解析モデルの利用は、T.N.Bryant and J.W.T.Wimpenny
（編）、Computers in Microbiology,a Proctical Appr
oach（IRL Press,Oxford）中、S.Bascomb,Computers in
Taxonomy and Systematics,p.65−102に記述されてい
る。代わりの具体例の１つにおいては、試験した微生物
についての各抗微生物薬の最少発育阻止濃度は、ブレー
クポイント若しくは閾値法によって又は線形回帰分析に
よって決定することができる（J.Mckie,et al.,Antimic
robial Agents and Chemotherapy（1980）v.17,813−82
3.）。
超えれば、マルチコンパートメント装置中に存在する全
ての抗微生物薬について最少発育阻止濃度が計算され
る。そうでない場合は、装置は元の位置に戻され、次の
読み取り時間に再度測定される。この実施例におけ読み
取り時間は、3.5、4.5、5.5、7.0、8.0、11.0及び15.0
時間である。最少発育阻止濃度の算出のためには、各コ
ンパートメントから対象ウェルの蛍光を引きそしてそれ
を、増殖コンパートメントの蛍光から陰性対照コンパー
トメントの蛍光を引くことによって得られる増殖コンパ
ートメントの蛍光差で割ることにより、種々の濃度の抗
微生物薬を含有するコンパートメントのパーセント蛍光
が算出される。最少発育阻止濃度は、各濃度範囲の抗微
生物薬に特異的な数学モデルを用いて算出する。判別関
数解析に基づく数学モデルを用いて、試験した微生物に
ついての各抗微生物薬の最少発育阻止濃度を決定するこ
とができる。微生物学的パターン認識における判別関数
解析モデルの利用は、T.N.Bryant and J.W.T.Wimpenny
（編）、Computers in Microbiology,a Proctical Appr
oach（IRL Press,Oxford）中、S.Bascomb,Computers in
Taxonomy and Systematics,p.65−102に記述されてい
る。代わりの具体例の１つにおいては、試験した微生物
についての各抗微生物薬の最少発育阻止濃度は、ブレー
クポイント若しくは閾値法によって又は線形回帰分析に
よって決定することができる（J.Mckie,et al.,Antimic
robial Agents and Chemotherapy（1980）v.17,813−82
3.）。
実施例１においては、特定量の抗微生物薬を含有するウ
ェル中におけるEnterococcusfaecalisの増殖は、蛍光の
測定によって評価される。表７においては、抗微生物薬
の種々の濃度におけるパーセント蛍光が報告されてい
る。例えば、マイクロダイリューションウェル中には、
0.12、0.25、0.5、１、２、４及び８μg/mLのアンピシ
リン（Am）が存在した。
ェル中におけるEnterococcusfaecalisの増殖は、蛍光の
測定によって評価される。表７においては、抗微生物薬
の種々の濃度におけるパーセント蛍光が報告されてい
る。例えば、マイクロダイリューションウェル中には、
0.12、0.25、0.5、１、２、４及び８μg/mLのアンピシ
リン（Am）が存在した。
数字105、105、67、７、６、５、６は、表４において計
算されたパーセント蛍光値である。これらの数字は、第
12及び13頁において論じた方法に従って感受性を決定す
るために用いられる。
算されたパーセント蛍光値である。これらの数字は、第
12及び13頁において論じた方法に従って感受性を決定す
るために用いられる。
表８に、実施例１についての最少発育阻止濃度が報告さ
れている。抗微生物薬セファロチンについては、微生物
は16μg/mLの濃度において感受性であることが見出され
た。アンピシリン／スルバクタムに関しては、８μg/mL
より低濃度で感受性が観察され、一方、微生物はトリメ
トプリム／スルファメトキサゾールについては、８μg/
mLより高濃度でも耐性であった。微生物は、ノルフロキ
サシン、セフォタキシム及びクロラムフェニコールに対
しては、４μg/mLより低濃度で感受性であり、一方、イ
ミペネム及びエリスロマイシンについては４μg/mLにて
感受性が観察された。加えて微生物は、２μg/mLより低
濃度のバンコマイシン及びアモキシリ／クラブラン酸カ
リウムに感受性であり、そしてリファンピンについては
２μg/mLで感受性であることが見出された。微生物は、
２μg/mLより高濃度のクリンダマイシンに抵抗性であっ
た。微生物は、１μg/mLより低濃度のシプロフロキサシ
ンに感受性であることが見出された。微生物は、0.5μg
/mLのアンピシリンに対して感受性であることが見出さ
れた。微生物は、テトラサイクリンに対しては128μg/m
Lで感受性であることが見出された。微生物は、32μg/m
Lより低濃度のニトロフラントインに対して感受性であ
ることが見出された。微生物は、セファゾリン、セフロ
キシム及びセファマンドールに対しては、16μg/mLより
高濃度で抵抗性であることが見出された。加えて、この
微生物は、ストレプトマイシンシナジースクリーンに対
して感受性であることが判定された。
れている。抗微生物薬セファロチンについては、微生物
は16μg/mLの濃度において感受性であることが見出され
た。アンピシリン／スルバクタムに関しては、８μg/mL
より低濃度で感受性が観察され、一方、微生物はトリメ
トプリム／スルファメトキサゾールについては、８μg/
mLより高濃度でも耐性であった。微生物は、ノルフロキ
サシン、セフォタキシム及びクロラムフェニコールに対
しては、４μg/mLより低濃度で感受性であり、一方、イ
ミペネム及びエリスロマイシンについては４μg/mLにて
感受性が観察された。加えて微生物は、２μg/mLより低
濃度のバンコマイシン及びアモキシリ／クラブラン酸カ
リウムに感受性であり、そしてリファンピンについては
２μg/mLで感受性であることが見出された。微生物は、
２μg/mLより高濃度のクリンダマイシンに抵抗性であっ
た。微生物は、１μg/mLより低濃度のシプロフロキサシ
ンに感受性であることが見出された。微生物は、0.5μg
/mLのアンピシリンに対して感受性であることが見出さ
れた。微生物は、テトラサイクリンに対しては128μg/m
Lで感受性であることが見出された。微生物は、32μg/m
Lより低濃度のニトロフラントインに対して感受性であ
ることが見出された。微生物は、セファゾリン、セフロ
キシム及びセファマンドールに対しては、16μg/mLより
高濃度で抵抗性であることが見出された。加えて、この
微生物は、ストレプトマイシンシナジースクリーンに対
して感受性であることが判定された。
変法又は等価方法：代替方法の一つは、蛍光原性化合物
の他の組合せを使用することであろう。上記の組合せは
最もよく機能して最も多数のグラム陽性微生物を検出し
た。試験した他の化合物は、アラニン−７−アミド−４
−メチルクマリン及びメチオニン−７−アミド−４−メ
チルクマリンであった。化合物の個々の濃度又は混合物
中の各化合物の比率は、変更することができる。
の他の組合せを使用することであろう。上記の組合せは
最もよく機能して最も多数のグラム陽性微生物を検出し
た。試験した他の化合物は、アラニン−７−アミド−４
−メチルクマリン及びメチオニン−７−アミド−４−メ
チルクマリンであった。化合物の個々の濃度又は混合物
中の各化合物の比率は、変更することができる。
フロントページの続き (72)発明者 サンド，テオドール，ティー アメリカ合衆国92064、カリフォルニア、 パウエイ、コルテライート 12745 (72)発明者 バスコム，ショシャーナ アメリカ合衆国95618、カリフォルニア、 デイビス、エルマセロドライブ 4312 (56)参考文献 特表 昭59−500548（ＪＰ，Ａ)
Claims (10)
- 【請求項１】臨床的に重要な大多数のグラム陽性微生物
の抗微生物薬に対する感受性を決定するための方法であ
って、 a. グラム陽性微生物の形態学的に近似の十分な数のコ
ロニーを水性懸濁培地に懸濁し均一に混合して、少なく
とも0.5マクファーランド硫酸バリウム濁度標準に等価
な濁度を有する接種物を調製し、 b. 該接種物を、約２×106コロニー形成単位/mLの名目
濃度を達成するに十分な量の増殖支持培地中に希釈し
て、 c. 該接種物の一部を十分量の、ロイシン−７−アミド
−４−メチルクマリン、フェニルアラニン−７−アミド
−４−メチルクマリン及びリン酸４−メチルウンベリフ
ェリルエステルよりなる蛍光原性基質及び予め決定した
量の抗微生物薬と混合して混合物を形成し、 d. 得られた蛍光強度の増大を検出するために、段階
（ｃ）から約3 1/2乃至15時間の間該混合物の蛍光強度
を繰り返しモニターし、そして e. 抗微生物薬に対する前記グラム陽性微生物の感受性
を決定するために、該検出された蛍光強度を対照の蛍光
強度の変化と比較することよりなる方法。 - 【請求項２】前記対照が増殖対照及び緩衝剤対照よりな
るものである、請求項１に記載の方法。 - 【請求項３】前記グラム陽性微生物が、Staphylococcus
aureus,S.cohnii,S.epidermidis,S.haemolyticus,Shom
inis,S.hyicus−hyicus,S.intermedius,S.lentus,S.sap
rophyticus,S.sciuri,S.similans,S.xylosus,S.kloosi
i,S.caseolyticus,S.chromogenes,S.carnosus,S.caprae
及びS.gallinarum,Streptococcus pyogenes（グループ
Ａ）,St.agalactiae（グループＢ）,St.equi/equismili
s,St.zooepidemicus,St.bovis I,St.bovis II,St.equin
us,St.mutans,St.sanguis I,St.sanguis II,St.anginos
us/milleri,St.constellatus/milleri,St.intermedius/
milleri,St.mitis,St.morbillorum,St.salivarius,St.p
neumoniae,Enterococcus faecalis,Ec.faecium,Ec.dura
ns,Ec.avium及びListeriae monocytogenesよりなる群よ
り選ばれるものである、請求項１に記載の方法。 - 【請求項４】前記抗微生物薬が、アモキシシリン／クラ
ブラン酸カリウム、アンピシリン、アンピシリン／スル
バクタム、セファマンドール、セファゾリン、セフォタ
キシム、セフトリアクソン、セフロキシム、セファロチ
ン、クロラムフェニコール、シプロフロキサシン、クリ
ンダマイシン、エリスロマイシン、ゲンタマイシン、ゲ
ンタマイシンシナジースクリーン、イミペネム、ニトロ
フラントイン、ノルフロキサシン、オキサシリン、ペニ
シリン、リファンピン、ストレプトマイシンシナジース
クリーン、テトラサイクリン、トリメトプリム、トリメ
トプリム／スルファメトキサゾール及びバンコマイシン
よりなる群より選ばれるものである、請求項１に記載の
方法。 - 【請求項５】臨床的に重要な大多数のグラム陽性微生物
の抗微生物薬に対する感受性を決定するための方法であ
って、 a. グラム陽性微生物の形態学的に近似の十分な数のコ
ロニーを水性懸濁培地に懸濁し均一に混合して、少なく
とも0.5マクファーランド硫酸バリウム濁度標準に等価
な濁度を有する接種物を調製し、 b. 前記接種物を、約２×106コロニー形成単位/mLの名
目濃度を達成するに十分な量の増殖支持培地中に希釈
し、 c. 前記接種物の一部を、個々のマイクロウェルダイリ
ューションコンパートメント中のロイシン−７−アミド
−４−メチルクマリン、フェニルアラニン−７−アミド
−４−メチルクマリン及びリン酸４−メチルウンベルフ
ェリルエステルよりなる蛍光原性基質の十分量、予め決
定した量の抗微生物薬、並びに、該蛍光原性基質を安定
化するに十分な量の緩衝剤と混合して抗微生物薬ウェル
を形成し、 d. 前記接種物の一部を、他の個々のマイクロウェル希
釈コンパートメント中のロイシン−７−アミド−４−メ
チルクマリン、フェニルアラニン−７−アミド−４−メ
チルクマリン及びリン酸４−メチルウンベリフェリルエ
ステルより蛍光原性基質の十分量、並びに、該蛍光原性
基質を安定化するに十分な量の緩衝剤と混合して増殖ウ
ェルを形成し、 e. 前記接種物の一部を、個々のマイクロウェル希釈コ
ンパートメント中の前記蛍光原性基質を安定化するに十
分な量の緩衝剤と混合して対照ウェルを形成し、 f. 段階（ｃ），（ｄ）及び（ｅ）の後約3 1/2乃至15
時間の間、前記各ウェルの蛍光強度を繰り返しモニター
し、そして g. 抗微生物薬に対する前記グラム陽性微生物の感受性
を決定するために、前記抗微生物薬ウェルの前記検出さ
れた蛍光強度を前記増殖ウェル及び対照ウェルと比較す
ることよりなる方法。 - 【請求項６】前記グラム陽性微生物が、Staphylococcus
aureus,S.cohnil,S.epidermidis,S.haemolyticus,S.ho
minis,S.hyicus−hyicus,S.intermedius,S.lentus,S.sa
prophyticus,S.sciuri,S.similans,S.xylosus,S.kloosi
i,S.caseolyticus,S.chromogenes,S.carnosus,S.caprae
及びS.gallinarum,Streptococcus pyogenes（グループ
Ａ）,St.agalactiae（グループＢ）,St.equi/equismili
s,St.zooepidemicus,St.bovis I,St.bovis II,St.equin
us,St.mutans,St.sanguis I,St.sanguis II,St.anginos
us/milleri,St.constellatus/milleri,St.intermedius/
milleri,St.mitis,St.morbillorum,St.salivarius,St.p
neumoniae,Enterococcus faecalis,Ec.foecium,Ec.dura
ns,Ec.avium及びListeriae monocytogenesよりなる群よ
り選ばれるものである、請求項５に記載の方法。 - 【請求項７】前記抗微生物薬が、アモキシシリン／クラ
ブラン酸カリウム、アンピシリン、アンピシリン／スル
バクタム、セファマンドール、セファゾリン、セフォタ
キシム、セフトリアクソン、セフロキシム、セファロチ
ン、クロラムフェニコール、シプロフロキサシン、クリ
ンダマイシン、エリスロマイシン、ゲンタマイシン、ゲ
ンタマイシンシナジースクリーン、イミペネム、ニトロ
フラントイン、ノルフロキサン、オキサシリン、ペニシ
リン、リファンピン、ストレプトマイシンシナジースク
リーン、テトラサイクリン、トリメトプリム、トリメト
プリム／スルファメトキサゾール及びバンコマイシンよ
りなる群より選ばれるものである、請求項５に記載の方
法。 - 【請求項８】請求項５に記載の方法を実施するために使
用する試薬キットであって、それぞれが個別化された、
対照コンパートメントと増殖対照コンパートメントと抗
微生物薬コンパーメントよりなり、対照コンパートメン
トは緩衝剤のみを含み、増殖対照コンパートメントは緩
衝剤及び蛍光原性基質を含み、抗微生物薬コンパートメ
ントは緩衝剤及び蛍光原性基質および抗微生物薬を含
み、 前記増殖対照コンパートメントおよび抗微生物薬コンパ
ートメント中の蛍光原性基質は、ロイシン−７−アミド
−４−メチルクマリン及びフェニルアラニン−７−アミ
ド−４−メチルクマリン及びリン酸４−メチルウンベリ
フェリルエステルよりなることを特徴とする試薬キッ
ト。 - 【請求項９】前記蛍光原性基質が濃縮されたものである
請求項８に記載の試薬キット。 - 【請求項１０】各コンパートメント中の試薬は脱水され
ている請求項８に記載の試薬キット。
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