JPH0711515B2

JPH0711515B2 - 糖化アルブミンの分離方法

Info

Publication number: JPH0711515B2
Application number: JP62234741A
Authority: JP
Inventors: 高照内田; 隆浜口
Original assignee: 旭化成工業株式会社
Priority date: 1987-09-21
Filing date: 1987-09-21
Publication date: 1995-02-08
Anticipated expiration: 2010-02-08
Also published as: JPS6478154A

Description

【発明の詳細な説明】（産業上の利用分野）本発明は、試料中のアルブミンの分離と、糖化アルブミ
ンと非糖化アルブミンの分離を、クロマトグラフイーの
同一流路内で行なう糖化アルブミンの分離方法に関す
る。

糖尿病のような長期間血糖値が高値を示す疾患では、さ
まざまな生体中の蛋白質が非酵素的に糖化反応を受け
る。血清アルブミンもそれらの蛋白質の一つである。

従来、糖尿病の診断には、血糖、尿糖、インスリン、グ
ルカゴンの測定、経口ブドウ糖負荷試験等が用いられて
いるが、生理条件あるいは測定方法により結果が影響さ
れ易いとか、被験者にも負担がかかる等の問題点があ
る。それに対して、生体中の糖化蛋白質の濃度は、一時
的な生理条件の影響が少なく、過去数週間〜数ケ月の血
中の平均的糖濃度の指標となるため、近年注目されてい
る。

例えば糖化ヘモグロビンは、過去１〜３ケ月の血糖値の
平均的指標となり、糖尿病患者の重症度と正の相関があ
ることから、糖尿病の新たな診断法、血糖コントロール
の指標としてすでに臨床応用されている。特に、全ヘモ
グロビンに対する糖化ヘモグロビンの割合は、３ケ月前
の空腹時血糖値とよく相関すると言われている。

ところが、臨床上は数週間〜１ケ月程度前の血糖状態の
情報が有用であり、糖化アルブミンはその半減期が17日
であることから、この要求に最も応え得る指標として、
最近各方面から注目を浴びている。

すなわち、糖化アルブミンは糖化ヘモグロビンと比較す
ると、血糖状態に速やかに応答するし、また、血糖値の
ように一時的な生理条件の影響を受けて大きく変動する
こともない。

例えば、糖化アルブミンは現行の、または新たに変更し
た食餌療法が、その患者に適当か否かを早期に判定する
のに有効である等、その有用性が示唆されている。〔ケ
イ・エフ・マクフアーランド，ダイアベツツ（Kay F.Mc
farland etal,DIABETS）,28,1011,1979、シー・アール
・ガスロウ，プロク・ナタル・アカド・サイ，ユー・エ
ス・エー（C.Earl Guthrow etal,Proc.Natl.Acad.Sci.U
SA），76,No.9.4258,1979〕（従来の技術）従来、糖化アルブミンの分離方法および検出方法として
は、カルボキシメチル型セルロース等を固定相として用
いるイオン交換クロマトグラフイー〔ジエームス・エフ
・デイ，ジエー・バイオ・ケム（James F.Day etal,J.B
io.Chem.），254,No.3,595,1979〕、セルロース等の軟
質ゲルにジヒドロキシボロニル基を導入し、この官能基
とグルコースとの相互作用を利用するアフイニテイーク
ロマトグラフイー〔エイ・ケイ・マリア，アナリイテイ
カル・レターズ（A.K.Mallia etal,Analytical Letter
s）,14（B8）,649〜661,1981〕等が試みられている。

（発明が解決しようとする問題点）血清、血漿など体液中の糖化アルブミン、非糖化アルブ
ミンを分離、定量するには、アルブミンと血清、血漿中
のその他の成分、例えば、免疫グロブリン類（IgG IgM
等）、ハブトグロビン、トランスフエリン等を分離する
必要がある。

上記従来技術は、糖化アルブミンと非糖化アルブミンの
分離は可能であるが、それらと血清、血漿など体液中の
他の成分との分離ができず、実質的に体液中の糖化アル
ブミンと非糖化アルブミンを定量することはできない。
イオン交換クロマトグラフイーの場合には、体液中にプ
レアルブミン、α−グロブリンの一部等アルブミンの等
電点に近い物質が多数あるためであり、アフイニテイー
クロマトグラフイーの場合には、体液中のアルブミンを
除くタンパク質のほとんどが糖タンパクであるからであ
る。

したがって、アルブミンと親和性の高い色素、例えば、
チバクロン・ブルー（Cibacron Blue）F3G−Ａ（チバガ
イギー社の商品名）等を結合させたゲルを用いて、体液
中からアルブミンのみを単離するという前処理が必須で
あつた。

しかし、従来は試料中からアルブミンを単離した後、一
旦クロマトグラフイーの系外に出し、濃縮後、改めて糖
化アルブミンと非糖化アルブミンを分離できるカラムに
導びくという方法がとられていた。すなわち、試料中か
らアルブミンを分離する操作と、アルブミンを糖化アル
ブミンと非糖化アルブミンとに分離する操作が、少なく
とも２段階の別個の操作として行なわれており、煩雑で
長時間を要していた。

また、チオバルビツール酸法に代表される発色反応を利
用して定量する方法〔ケイ・エフ・マクフアーランド，
ダイアベツツ（Kay F.Mcfarland et.al.,DIABETES），2
8,1011,1979〕も挙げられるが、この場合も発色反応の
前に、あらかじめアルブミンとその他の成分を分離する
必要があり、やはり、煩雑で長時間を要していた。

これらのことが、迅速性、操作性、再現性および自動化
が要求される臨床検査の場で、現在、糖化アルブミンが
測定されていない最大の原因である。

（問題点を解決するための手段）本発明者らは、前記の問題点を克服するため鋭意研究の
結果、迅速性、操作性、再現性にすぐれ、さらには、自
動化の容易な糖化アルブミンと非糖化アルブミンの分離
方法を見出し、本発明を完成するに至つた。

すなわち、本発明は、液体クロマトグラフイーによって
試料中の糖化アルブミンと非糖化アルブミンを分離する
方法において、アルコール性水酸基を有する硬質の親水
性架橋共重合体にジヒドロキシボロニル基を結合したゲ
ルに接触させて試料を糖化蛋白質と非糖化蛋白質とに分
離し、ついで同一流路内においてアルブミンと親和性の
高い色素もしくはアミノ基に接触させることを特徴とす
る試料中の糖化アルブミンと非糖化アルブミンの液体ク
ロマトグラフイーによる分離方法に関する。

本発明において、糖化アルブミンとはグルコースと共有
結合したアルブミン、非糖化アルブミンとはグルコース
と結合していないアルブミンを言う。

また、本発明で言うアルブミンとは、糖化アルブミンと
非糖化アルブミンの両方を指す。

本発明で言う試料とは、少なくとも糖化アルブミンと非
糖化アルブミンのどちらか、もしくはその両方を含有す
るもので、例えば、血清、血漿、尿等の体液を挙げるこ
とができる。

本発明においては、アルコール性水酸基を有する硬質の
親水性架橋共重合体にジヒドロキシボロニル基を結合し
たゲル、およびアルブミンと親和性の高い色素もしくは
アミノ基を有するゲルを、それぞれカラムに充填して用
いる。ジヒドロキシボロニル基は、1,2−シスジオール
を有する化合物と特異的に結合するため、この官能基を
有するゲルは、糖化アルブミンと非糖化アルブミンの分
離に有効である。アルブミンと親和性の高い色素もしく
はアミノ基を有するゲルは、いずれもアルブミンとその
他の成分を分離するのに有効である。

上記官能基を導入する担体としては、機械的強度、化学
的に安定性にすぐれ、タンパク質の非特異吸着が少ない
という点で、架橋共重合体重量当りアルコール性水酸基
1.0〜14.0meq/g、比表面積５〜1000m²/g、保持し得る水
の量が0.5〜6.0g/gである硬質の親水性架橋共重合体が
好ましい。

アルコール性水酸基の量は、好ましくは1.5〜11.0meq/g
である。また、保持できる水の量は、好ましくは0.5〜
3.0g/gであり、さらに好ましくは1.0〜2.5g/gである。
好ましい例として、特開昭57−30945号公報記載のビニ
ルアルコール単位由来のアルコール性水酸基を有する架
橋共重合体を挙げることができる。あるいは特開昭56−
64657号公報記載のゲルも挙げることができる。

上記の親水性架橋共重合体にジヒドロキシボロニル基を
導入する方法としては、次の方法を挙げることができ
る。すなわち、上記の親水性架橋共重合体とエピハロヒ
ドリン、ビスエポキシド等を反応させ、エポキシ基含有
架橋共重合体を得、ついで、メタアミノフエニルボロン
酸を反応させることによつて得ることができる。

該親水性架橋共重合体にアミノ基を導入する方法として
は、例えば、次の方法を挙げることができる。すなわ
ち、上記の親水性架橋共重合体とエピハロヒドリンビス
エポキシド等を反応させ、エポキシ基含有架橋共重合体
を得、ついで、アンモニア、エチルアミン等の一級アミ
ンジエチルアミン等の二級アミンを反応させることによ
つて得ることができる。

アルブミンと親和性の高い色素を導入する方法として
は、例えば、該親水性架橋共重合体の水酸基にブロムシ
アンを反応させ、ついで、チバクロンブルーF3G−Ａを
反応させる方法を挙げることができる。

ジヒドロキシボロニル基の量は、架橋共重合体重量当り
0.05〜5.0meq/gであり、好ましくは0.05〜3.0meq/g、さ
らに好ましくは0.1〜2.0meq/gである。

アミノ基としては、置換基を有しないアミノ基、エチル
アミノ基等の一置換アミノ基、ジエチルアミノ基等の二
置換アミノ基を挙げることができる。アミノ基の量は、
架橋共重合体重量当り0.02〜5.0meq/gであり、好ましく
は0.05〜2.0meq/gであり、さらに好ましくは0.2〜1.0me
q/gである。

アルブミンと親和性の高い色素の量は、架橋共重合体重
量当り0.002〜1.0meq/gであり、好ましくは0.005〜0.05
meq/gである。

本発明において用いられる官能基を固定化したゲルの形
状は、球状、破砕状等種々挙げることができるが、好ま
しくは球状である。その場合、重量平均粒径は１〜500
μｍであり、好ましくは１〜20μｍ、さらに好ましくは
１〜10μｍである。

本発明で用いる装置としては、例えば、第１図に示す装
置を挙げることができる。第１図に示す装置において
は、第１のカラムには糖化アルブミンと非糖化アルブミ
ンを分離するための充填剤、ジヒドロキシボロニル基が
固定化されたゲルが充填されている。第２のカラムに
は、アルブミンとその他の成分を分離するための充填
剤、例えば、アミノ基を固定化したゲルが充填されてい
る。

第１図においては、移動相のＡ液とＢ液がそれぞれポン
プでインジエクターに送られ、サンプルはインジエクタ
ーから移動相と共に第１のカラムに送入される。

この際、高速液体クロマトグラフイーでよく用いられる
グラジエントミキサーをポンプの吸引側に取り付けれ
ば、ポンプを一台にすることもできる。

次に、本発明で用いる移動相について述べる。

糖化アルブミンと非糖化アルブミンを分離するため、あ
るいは糖化タンパク質と非糖化タンパク質を分離するた
めの充填剤として、ジヒドロキシボロニル基が固定化さ
れたゲルを用い、アルブミンとその他の成分を分離する
ための充填剤として、アミノ基が固定化されたゲルを用
いる場合は、少なくとも２種類の移動相（Ａ液とＢ液）
を用意し、途中でＡ液からＢ液に切り換える方法を好ま
しい方法として挙げることができる。Ａ液からＢ液への
切り換えは、ステツプワイズに行うこともできるし、連
続的に比率を変える、いわゆるグラジエント法で行なう
こともできる。

ここで言うＡ液は、10〜500mMの緩衝用基剤を有し、1,2
−シスジオールを有する物質を含有しないpH7.5〜9.5の
水溶液が好ましい。緩衝用基剤としては、pH7.5〜9.5に
おいて緩衝能を有する基剤が好ましいが、特に好ましい
基剤としては、酢酸アンモニウム等のアンモニウム塩、
モルフオリン、Ｎ−２−ヒドロキシエチルピペラジン
Ｎ′−２−エタンスルホン酸等を挙げることができる。
これらの緩衝用基剤は、ジヒドロキシボロニル基と糖化
アルブミンなどの糖化タンパク質の糖の部分の結合を強
めることができるため、糖化アルブミンなどの糖化タン
パク質と、非糖化タンパク質を高度に分離するのに有効
である。pHが7.5より低いと、ジヒドロキシボロニル基
と糖の結合が弱くなり好ましくない。また、pHが9.5よ
り高くなると、アルブミン等のタンパク質が変性し、沈
殿を生ずるおそれがあり好ましくない。また、Ａ液は緩
衝用基剤以外の塩を含むことができる。特に、二価金属
イオンの塩、例えば、塩化マグネシウム等を含むことに
より、糖鎖とジヒドロキシボロニル基の結合を強めるこ
とができ好ましい。二価金属イオンの塩の濃度は、好ま
しくは5mM〜100mMである。一価金属イオンの塩、例え
ば、塩化ナトリウム等も含むことができ、その濃度は、
好ましくは500mM以下である。

一方、Ｂ液は10〜500mMの緩衝用基剤を有するpH2〜6.5
の水溶液が好ましく、pH7.5以上でも1,2−シスジオール
を有する物質を含んでいればよい。その場合もpH9.5以
下が好ましい。この条件を用いると、ジヒドロキシボロ
ニル基と糖鎖の結合を弱めることができ、ジヒドロキシ
ボロニル基に結合した糖化アルブミン等の糖化タンパク
質を溶出させることができる。

緩衝用基剤としては、使用pHにおいて緩衝能を有する緩
衝用基剤が好ましいが、特に好ましい例として、トリス
ヒドロキシメチル、アミノメタン、トリエタノールアミ
ン等を挙げることができる。これらの緩衝用基剤は、ジ
ヒドロキシボロニル基と糖鎖の結合を弱めることがで
き、ジヒドロキシボロニル基と結合した糖化タンパク質
の溶出を容易にする。

1,2−シスジオールを有する物質としては、例えば、ソ
ルビトール、マンニトール等の糖類を挙げることができ
る。1,2−シスジオールを有する物質の濃度は、50〜200
0mMが好ましい。

さらに、Ａ液が二価金属イオンの塩を含有する場合は、
Ｂ塩にエチレンジアミン四酢酸（EDTA）等の金属キレー
ト剤を添加することが好ましい。その場合、金属キレー
ト剤の濃度は５〜100mMが好ましい。A,B両液共に、例え
ば、エタノール、メタノール、アセトニトリル、エチレ
ングリコール等の水溶性の有機溶媒を少量含有している
方が好ましい場合がある。

本発明で用いるカラムの形状は特に限定はされないが、
好ましくは内径10mm以下、長さ30cm以下が好ましく、内
径２〜8mm、長さ１〜10cmが特に好ましい。移動相の流
量も特に限定はないが、0.1〜10ml/mmが好ましく、特に
好ましくは0.3〜5ml/mmである。

本発明においては、分離用カラムの出口に、例えば、紫
外吸光検出器、螢光検出器等を接触することにより、糖
化アルブミン、非糖化アルブミンをそれぞれ検出、定量
することができる。

（発明の効果）本発明の糖化アルブミンと非糖化アルブミンの分離方法
は、液体クロマトグラフイーにおいて、試料を液体クロ
マトグラフイーの流路内に導入した後、流路内を連続的
に移動させつつ糖化アルブミンと非糖化アルブミンを分
離することを特徴とする。

従来、アルブミン以外の成分を含む試料中から糖化アル
ブミンと非糖化アルブミンを分離するには、前述のよう
に、少なくとも２段階の別個の操作が必要であり、した
がつて、操作が繁雑で長時間を要し、かつ、誤差を生ず
る可能性があつた。

一方、本発明の方法によれば、一つの操作、すなわち、
試料注入口に１回注入するだけで、試料中の糖化アルブ
ミンと非糖化アルブミンが分離でき、それぞれの定量も
可能である。

本発明の方法によれば、一般の臨床検査室で簡便かつ迅
速に、さらには再現性良く、糖化アルブミンと非糖化ア
ルブミンの分析ができ、また、自動化も容易である。よ
つて、本発明は、糖化アルブミンの分析の普及に寄与す
るところ大である。

（実施例）以下に本発明の実施例を示すが、本発明の範囲は、これ
らの実施例により限定されるものではない。

実施例１第１カラムの作製特開昭57−30945号公報の実施例１に記載のビニルアル
コールコポリマーゲル（X;0.3、水酸基量;7.8meq/g、保
持し得る水の量;1.78g/g、比表面積;78m²/g、粒径;9.0
μｍ）25gに、エピクロルヒドリン116.8g、ジメチルス
ルフオキシド250ml、10N水酸化ナトリウム水溶液12.5ml
を加え、30℃で20時間反応させた。エポキシ基の導入量
は1.0meq/gであつた。なお、エポキシ基の定量法は、特
開昭57−190003号公報に記載の方法で行なつた。

次に、アミノフエニルボロン酸ヘミ硫酸塩13gを250mlの
水に溶解し、pH11としたものに先のエポキシ基導入ポリ
マー20gを加え、60℃で20時間反応を行つた。次に、残
存エポキシ基を保護するために25mMトリス（ヒドロキシ
メチル）アミノメタンを加え、50℃で５時間反応を行つ
た。ホウ酸の導入量は0.28meq/gであつた。ホウ酸の定
量は以下の方法によつた。

上記のアミノフエニルボロン酸を導入したポリマー1gに
30％過酸化水素水10mlを加え、５時間反応させることに
よつて、ホウ素−炭素結合を切断した。次に、ポリマー
を遠沈し、その上清を採取した。これを脱炭酸後、糖を
加えることによつてホウ酸エステルを形成させ、強酸化
し、水酸化ナトリウムで滴定することによつてホウ酸を
定量した。

なお、この分析に用いた器具は、すべて石英製である。

アミノフエニルボロン酸を導入した共重合体の水酸基密
度は9.2meq/g（ジヒドロキシボロニル基切断後）、保持
し得る水の量は1.70g/gであつた。また、粒径、比表面
積は導入前と同じであつた。

なお、保持し得る水の量および比表面積は、特開昭57−
30945号公報に記載の方法で求めた。

上記のアミノフエニルボロン酸導入共重合体を内径7.6m
m、長さ100mmのステンレス製カラムに充填し、第１のカ
ラムとした。

第２のカラム作製特開昭60−150839号公報の実施例１に記載のゲル（重量
平均粒径9.0μｍ、水酸基密度4.9meq/g、保持できる水
の量が1.9g/g、ジエチルアミノ基が0.5meq/g）を内径7.
6mm、長さ100mmのステンレス製カラムに充填したものを
用いた。

第１カラムと第２カラムを用いた高速液体クロマトグラ
フの流路系の概略を第１図に示す。

クロマトグラフイーの詳細な条件を以下に示す。

試料：健常人血清（５μｌ）移動相：（Ａ液）250mM酢酸アンモニウム、 50mM塩化マグネシウムおよび 500mM塩化ナトリウムを含む水溶液（pH8.5）／エタノール＝98/2 （Ｂ液）100mMトリスヒドロキシメチルアミノメタン、1000mMソルビトール、500mM塩化ナトリウムおよび 50mM EDTAを含む水溶液／エタノール＝95/5 （注）Ａ液を通液しつつ試料を注入し、８分後にＢ液に
切り換えた。

グラジエントミキサー：日本分光工業（株）商品名GP−
A40 ポンプ：日本分光工業（株）商品名 TRIROTAR−Ｖ（流
量0.5ml/min）検出器：日本分光工業（株）商品名ケイ光検出器FP−210 温度:35℃ 上記の装置および条件を用いて、血清中の糖化アルブミ
ンと非糖化アルブミンを分離し、得られたクロマトグラ
ムを第２図に示す。

第２図において、Hpはハプトグロビン、Tfはトランスフ
エリン、IgGは免疫グロブリンＧ、IgMは免疫グロブリン
Ｍ、IgAは免疫グロブリンＡである。

それぞれのピークの同定は、電気泳動およびラジオイム
ノアツセイで行つた。

【図面の簡単な説明】

第１図は実施例１において用いた高速液体クロマトグラ
フの流路系の説明図、第２図は実施例１において健常人
血清から糖化アルブミンと非糖化アルブミンを分離した
クロマトグラムである。

Claims

【特許請求の範囲】

【請求項１】液体クロマトグラフイーによって試料中の
糖化アルブミンと非糖化アルブミンを分離する方法にお
いて、アルコール性水酸基を有する硬質の親水性架橋共
重合体にジヒドロキシボロニル基を結合したゲルに接触
させて試料を糖化蛋白質と非糖化蛋白質とに分離し、つ
いで同一流路内においてアルブミンと親和性の高い色素
もしくはアミノ基に接触させることを特徴とする試料中
の糖化アルブミンと非糖化アルブミンの液体クロマトグ
ラフイーによる分離方法。