JPH0743362B2

JPH0743362B2 - 糖化アルブミン分析用の装置

Info

Publication number: JPH0743362B2
Application number: JP63249066A
Authority: JP
Inventors: 尚史伊藤; 高照内田
Original assignee: 旭化成工業株式会社
Priority date: 1988-10-04
Filing date: 1988-10-04
Publication date: 1995-05-15
Anticipated expiration: 2010-05-15
Also published as: JPH0296657A

Description

【発明の詳細な説明】（産業上の利用分野）本発明は、試料中のアルブミンの分離と、糖化アルブミ
ンと非糖化アルブミンの分離を、クロマトグラフィーの
同一流路内で行う糖化アラブミン分析用の装置に関す
る。

糖尿病のような長器管血糖値が高値を示す疾患では、さ
まざまな生体中の蛋白質が非酵素的に糖化反応を受け
る。血清アルブミンもそれらの蛋白質の一つである。

糖化アルブミンは、その半減期が17日であり、３ケ月前
の空腹時血糖値とよく相関する指標となると言われる糖
化ヘモグロビンと比較すると、血糖状態に速やかに応答
するし、また、血糖値のように一時的な生理条件の影響
を受けて大きく変動することもない。糖尿病の診断で
は、数週間〜１ケ月程度前の血糖状態の情報が有用であ
るため、糖化アルブミンはこの要求に最も応え得る指標
として、最近各方面から注目を浴びている。

例えば、糖化アルブミンは現行の、または新たに変更し
た食餌療法が、その患者に適当か否かを早期に判定する
のに有効である等、その有用性が示唆されている。〔ケ
イ・エフ・マクファーランド，ダイアベッツ（Kay F.Mc
farland etal,DIA−BETS）,28,1011,1979、シー・アー
ル・ガスロウ，プロク・ナタル・アカド・サイ，ユー・
エス・エー（C.Earl Guthrow etal,Proc.Natl.Acad.Sc
i,USA），76,No.9,4258,1979〕（従来の技術）従来、糖化アルブミンの分離方法および検出方法として
は、カルボキシメチル型セルロース等を固定相として用
いるイオン交換クロマトグラフィー〔ジェームス・エフ
・ディ，ジェー・バイオ・ケム（James F.Day etal,J.B
io.Chem.），254,No.3,595,1979〕、セルロース等の軟
質ゲルにジヒドロキシボロニル基を導入し、この官能基
とグルコースとの相互作用を利用するアフィニティーク
ロマトグラフィー〔エイ・ケイ・マリア，アナリィティ
カル・レターズ（A.K.Mallia etal,Analy−tical Lette
rs）,14（B8）,649〜661,1981〕等が試みられている。

上記従来技術は、糖化アルブミンと非糖化アルブミンの
分離は可能であるが、それらと血清、血漿など体液中の
他の成分、例えば、免疫グロブリン類（IgG,IgM等）、
ハプトグロビン、トランスフェリン等との分離ができ
ず、実質的に体液中の糖化アルブミンと非糖化アルブミ
ンを定量することはできない。

したがって、従来は試料中からアルブミンを単離した
後、一旦クロマトグラフィーの系外に出し、濃縮後、改
めて糖化アルブミンと非糖化アルブミンを分離できるカ
ラムに導くという方法がとられていた。すなわち、試料
中からアルブミンを分離する操作と、アルブミンを糖化
アルブミンと非糖化アルブミンとに分離する操作が、少
なくとも２段階の別個の操作として行われており、煩雑
で長時間を要していた。

これらのことが、迅速性、操作性、再現性および自動化
が要求される臨床検査の場で、現在、糖化アルブミンが
測定されず、また、そのための分析装置もない最大の原
因である。

ここで、これらの問題点を克服した糖化アルブミンの分
析方法として、特開昭62−226999号公報に記載の方法が
ある。すなわち、第１カラムで試料中からアルブミンを
分離し、それをクロマトグラフィーの流路系外に出すこ
となく第２カラムに導き、そこでアルブミンを糖化アル
ブミンと非糖化アルブミンとに分離することを特徴とす
るクロマトグラフィーによる糖化アルブミンの分離方法
である。

（発明が解決しようとする課題）上記特開昭62−226999号に記載の実施例によれば、非糖
化アルブミンと糖化アルブミンは、30分以内で分離され
る。しかし、分析が終了して、次の分析を開始するまで
に、第１カラムと第２カラムを再生するための時間を要
するため、分析サイクルは長くなり、そのため、臨床検
査の場で用いるには、特に迅速性の点で、まだ、問題が
残っていた。

（課題を解決するための手段）本発明者らは、前記の問題点を克服するため鋭意研究の
結果、迅速性、操作性、再現性にすぐれ、しかも、自動
化された糖化アルブミンと非糖化アルブミンの分析装置
を開発し、本発明を完成するに至った。

すなわち、本発明は、液体クロマトグラフィーにより、
試料中の糖化アルブミンと非糖化アルブミンを分離分析
する装置において、第１カラムにおいて試料中からア
ルブミンを分離するために用いられる移動相Ａ液の容
器、第１の移動相送液部、試料注入部、および資料中か
らアルブミンを分離する第１カラムがこの順に連結され
てなる第１流路と、第２カラムにおいて非糖化アラブ
ミンを溶出させるために用いられる移動相Ａ液の容器と
糖化アルブミンを溶出するために用いられる移動相Ｂ液
の容器が、移動相切換手段を含む第２の移動相送液部に
並列に接続され、さらにアルブミンを糖化アルブミンと
非糖化アルブミンに分離する第２カラム、および検出器
がこの順に連結されてなる第２流路が、第２の移動相送
液部の下流と第２カラムの上流の間に存在する流路切換
手段を介して、第１カラムの下流部分で連結されている
ことを特徴とする糖化アルブミン分析用の装置を提供す
る。

本発明において、糖化アルブミンとは、グルコースと共
有結合したアルブミン、非糖化アルブミンとは、グルコ
ースと結合していないアルブミンを言う。

また、本発明で言うアルブミンとは、糖化アルブミンと
非糖化アルブミンの両方を指す。

本発明で言う試料とは、少なくとも糖化アルブミンと非
糖化アルブミンのどちらか、もしくはその両方を含有す
るもので、例えば、血清、血漿、溶血液、尿等の体液を
挙げることができる。

本発明で用いる第１カラムは、アルブミンと体液中のそ
の他の成分を分離できるカラムであればよく、特に制限
されない。好ましい例として、アルブミンと親和性の高
い色素シバクロン・ブルーF3G−Ａ等を結合させたゲル
を充填したカラム、血清中の大量成分であるIgG（分子
量：約15万）とアルブミン（分子量：約6.6万）とを分
離できるゲル濾過用充填カラム、アミノ基を有するイオ
ン交換ゲル充填カラム等が挙げられる。

ただし、シバクロン・ブルー等のアルブミンと親和性の
高い物質を導入する担体およびゲル濾過用固定相担体と
しては、機械的強度、化学的安定性にすぐれ、タンパク
質の非特異吸着が少ないという理由で、架橋共重合体重
量当たりアルコール性水酸基1.0〜14.0meq/g、比表面積
５〜1000m²/g、保持し得る水の量が0.5〜6.0g/gである
硬質の親水性架橋共重合体が好ましい。最も好ましい例
として、特開昭57−30945号公報記載のビニルアルコー
ル単位由来のアルコール性水酸基を有する架橋共重合体
を挙げることができる。あるいは特開昭56−64657号お
よび特開昭59−145036号公報記載の架橋共重合体も好ま
しい。

該親水性架橋共重合体にアミノ基を導入する方法として
は、例えば、次の方法を挙げることができる。すなわ
ち、上記の親水性架橋共重合体とエピハロヒドリンビス
エポキシド等を反応させ、エポキシ基含有架橋共重合体
を得、ついで、アンモニア、エチルアミン等の一級アミ
ン、ジエチルアミン等の二級アミンを反応させることに
よって得ることができる。

アミノ基としては、置換基を有しないアミノ基、エチル
アミノ基等の一置換アミノ基、ジエチルアミノ基等の二
置換アミノ基を挙げることができる。アミノ基の量は、
架橋共重合体重量当たり0.02〜5.0meq/gであり、好まし
くは0.05〜2.0meq/gであり、さらに好ましくは0.2〜1.0
meq/gである。

チバクロンブルーF3G−Ａを導入する方法としては、例
えば、該親水性架橋共重合体の水酸基にブロムシアンを
反応させ、ついで、チバクロンブルーF3G−Ａを反応さ
せる方法を挙げることができる。

チバクロンブルーF3G−Ａの量は、架橋共重合体重量当
たり0.002〜1.0meq/gであり、好ましくは0.005〜0.05me
q/gである。

これらのゲルのうち、親水性架橋共重合体にアミノ基を
導入したゲルが特に好ましい。

本発明で用いる最も好ましい例として、特開昭60−1508
39号公報記載のビニルアルコール単位由来のアルコール
性水酸基とジエチルアミノ基を有する架橋共重合体を挙
げることができる。この架橋共重合体は、特願昭60−12
22号記載の方法により、アルブミンと体液中の他の成分
を迅速に分離することが可能である。

本発明で用いる第２カラムは、イオン交換ゲルまたはジ
ヒドロキシボロニル基を有するゲルを充填したカラム等
が挙げられるが、少なくとも糖化アルブミンと非糖化ア
ルブミンが分離できればよく、特に限定されない。

イオン交換ゲルを用いる場合、言うまでもなく、糖化ア
ルブミンと非糖化アルブミンのわずかな等電点の差を利
用するわけであるが、イオン交換基は陽イオン交換基の
方が好ましく、中でもカルボキシル基、スルホン酸基等
が特に好ましい。

また、ジヒドロキシボロニル基は、1,2−シスジオール
を有する化合物と特異的に結合するため、この官能基を
有するゲルを固定相としたアフィニティークロマドグラ
フィーも、糖化アルブミンと非糖化アルブミンの分離に
有効である。

これらの官能基を導入する固定相担体としては、従来液
体クロマトグラフィー用固定相担体として一般的に用い
られるセルロース、アガロース等の多糖類の軟質ゲル、
シリカゲル、スチレン−ジビニルベンゼン系共重合体等
が挙げられるが、機械的強度、化学的安定性にすぐれ、
タンパク質の非特異吸着が少ないという点で、架橋共重
合体重量当たりアルコール性水酸基1.0〜14.0meq/g、比
表面積５〜1000m²/g、保持し得る水の量が0.5〜6.0g/g
である軟質の親水性架橋共重合体が好ましい。最も好ま
しい例として、特開昭57−30945号、特開昭56−64657号
および特開昭54−145036号公報記載の架橋共重合体を挙
げることができる。

上記の親水性架橋共重合体にジヒドロキシボロニル基を
導入する方法としては、次の方法を挙げることができ
る。すなわち、上記の親水性架橋共重合体とエピハロヒ
ドリン、ビスエポキシド等を反応させ、エポキシ基含有
架橋共重合体を得、ついで、メタアミノフェニルボロン
酸を反応させることによって得ることができる。

また、カルボキシル基を導入する方法としては、例え
ば、モノクロロ酢酸やモノブロモ酢酸等のハロゲン化酢
酸を、該親水性架橋共重合体の水酸基と反応させる方法
を挙げることができる。

さらに、スルホン酸基を導入する方法としては、例え
ば、プロパンスルトンを該親水性架橋共重合体の水酸基
と反応させる方法を挙げることができる。

ジヒドロキシボロニル基の量は、架橋共重合体重量当た
り0.05〜5.0meq/gであり、好ましくは0.05〜3.0meq/g、
さらに好ましくは0.1〜2.0meq/gである。

カルボキシル基またはスルホン酸基の量は、架橋共重合
体重量当たり0.02〜5.0meq/gであり、好ましくは0.05〜
2.0meq/gであり、さらに好ましくは0.2〜1.0meq/gであ
る。

これらのゲルのうち、親水性架橋共重合体にジヒドロキ
シボロニル基を導入したゲルが特に好ましい。本発明で
用いる最も好ましい例として、特開昭62−192405号記載
のアルコール性水酸基とジヒドロキシボロニル基を有す
るホウ素含有架橋共重合体を挙げることができる。

本発明において用いられる官能基を固定化したゲルの形
状は、球状、破砕状等種々挙げることができるが、好ま
しくは球状である。その場合、重量平均粒径は１〜500
μｍであり、好ましくは１〜20μｍ、さらに好ましくは
１〜10μｍである。

本発明の装置の一例のフローダイアグラムを第１図に示
して、第１カラム、第２カラム、第１流路および第２流
路の関係を説明する。

第１図において、移動相のＡ液が第１の移動相送液部に
より、第１流路に送られ、また、第２の移動相送液部に
より第２流路に送られる。試料注入部より注入された試
料は、移送相Ａ液とともに第１カラムに送入され、試料
中のアルブミンと他の成分が分離される。次いで、流路
切換手段により、流路が切換えられ、第１カラムで分離
されたアルブミンのみが第２流路を通って第２カラムに
送入される。該アルブミンが第２カラムに送入された
後、流路切換手段により流路が切換えられ、第２の移動
相送液部から送液される移動相Ａ液は、第２流路を通っ
て流路切換手段を介して第２カラムに送入される。移動
相をＡ液からＢ液に切換えることにより、第２カラムで
糖化アルブミンと非糖化アルブミンは分離され、検出器
に送入される。その後、第２の移動相送液部から送液さ
れる移動相はＢ液からＡ液に切換えられ、第２流路を通
り、流路切換手段を介して第２カラムに送られ、第２カ
ラムを再生する。第２カラムの再生が終了すると、次の
分析が可能になる。なお、第１カラムでのアルブミンの
分離の確認のために、第１カラムの出口と流路切換手段
の間に、または第１流路の流路切換手段の下流部分にモ
ニター用の検出器を備えることができる。

次に、本発明で用いる移動相について述べる。

糖化アルブミンと非糖化アルブミンを分離するため、あ
るいは糖化タンパク質と非糖化タンパク質を分離するた
めの充填剤として、ジヒドロキシボロニル基が固定化さ
れたゲルを用い、アルブミンとその他の成分を分離する
ための充填剤として、アミノ基が固定化されたゲルを用
いる場合は、少なくとも２種類の移動相（Ａ液とＢ液）
を用意し、途中でＡ液からＢ液に切り換える方法を好ま
しい方法として挙げることができる。Ａ液からＢ液への
切り換えは、ステップワイズに行うこともできるし、連
続的に比率を変える、いわゆるグラジエント法で行うこ
ともできる。

ここで言うＡ液は、10〜500mMの緩衝用基剤を有し、1,2
−ジスジオールを有する物質を含有しないpH7.5〜9.5の
水溶液が好ましい。緩衝用基剤としては、pH7.5〜9.5に
おいて緩衝能を有する基剤が好ましいが、特に好ましい
基剤としては、酢酸アンモニウム等アンモニウム塩、モ
ルフォリン、Ｎ−２−ヒドロキシエチルピペラジンＮ′
−２−エタンスルホン酸等を挙げることができる。これ
らの緩衝用基剤は、ジヒドロキシボロニル基と糖化アル
ブミンなどの糖化タンパク質の糖の部分の結合を強める
ことができるため、糖化アルブミンなど糖化タンパク質
と、非糖化タンパク質を高度に分離するのに有効であ
る。pH7.5より低いと、ジヒドロキシボロニル基と糖の
結合が弱くなり好ましくない。また、pHが9.5より高く
なると、アルブミン等のタンパク質が変成し、沈澱を生
ずるおそれがあり好ましくない。また、Ａ液は緩衝用基
剤以外の塩を含むことができる。特に、二価金属イオン
の塩、例えば、塩化マグネシウム等を含むことにより、
糖鎖とジヒドロキシボロニル基の結合を強めることがで
き好ましい。二価金属イオンの塩の濃度は、好ましくは
5mM〜100mMである。１価金属イオンの塩、例えば、塩化
ナトリウム等も含むことができ、その濃度は、好ましく
は500mM以下である。

一方、Ｂ液は10〜500mMの緩衝用基剤を有するpH2〜6.5
の水溶液が好ましく、pM7.5以上でも1,2−ジスジオール
を有する物質を含んでいればよい。その場合もpH9.5以
下が好ましい。この条件を用いると、ジヒドロキシボロ
ニル基と糖鎖の結合を弱めることができ、ジヒドロキシ
ボロニル基に結合した糖化アルブミン等の糖化タンパク
質を溶出させることができる。

緩衝用基剤としては、使用pHにおいて緩衝能を有する緩
衝用基剤が好ましいが、特に好ましい例として、トリス
（ヒドロキシメチル）アミノメタン、トリエタノールア
ミン等を挙げることができる。これらの緩衝用基剤は、
ジヒドロキシボロニル基と糖鎖の結合を弱めることがで
き、ジヒドロキシボロニル基と結合した糖化タンパク質
の溶出を容易にする。

1,2−シスオールを有する物質としては、例えば、ソル
ビトール、マンニトール等の糖類を挙げることができ
る。1,2−シスジオールを有する物質の濃度は、50〜200
0mMが好ましい。

さらに、Ａ液が二価金属イオンの塩を含有する場合は、
Ｂ液にエチレンジアミン四酢酸（EDTA）等の金属キレー
ト剤を添加することが好ましい。その場合、金属キレー
ト剤の濃度は５〜100mMが好ましい。A,B両液共に、例え
ば、エタノール、メタノール、ｎ−プロピルアルコー
ル、iso−プロピルアルコール、アセトニトリル、エチ
レングリコール等の水溶性の有機溶媒を少量含有してい
る方が好ましい場合がある。

本発明で用いるカラムの形状は特に限定されないが、好
ましくは内径10mm以下、長さ30cm以下が好ましく、内径
２〜8mm、長さ１〜10cmが特に好ましい。移動相の流量
も特に限定はないが、0.1〜10ml/minが好ましく、特に
好ましくは0.3〜5ml/minである。

本発明における流路切換手段は、第１流路と第２を流路
を切り換えることができるものであれば、特に限定され
ないが、四方切換バルブまたは六方切換バルブ等の流路
切換手段が好ましい。ここで、例えば、サンプルループ
を備えた流路切換手段を用いると、第１カラムから溶出
されたアルブミンを、一旦、該サンプルループに導入し
た後に、流路を切換えて該アルブミンを第２カラムに導
入することが可能になる。

本発明においては、第２カラムの出口に、例えば、紫外
吸光検出器、蛍光検出器等を接続することにより、糖化
アルブミン、非糖化アルブミンをそれぞれ検出、定量す
ることができる。

（発明の効果）本発明の糖化アルブミン分析装置は、１回の試料注入操
作のみで、試料中の糖化アルブミンと非糖化アルブミン
を分離、定量する方法を実施する際に、従来は、長時間
を要した１回の分析時間を大幅に短縮した。

本発明では、第１カラムには常に一定組成の移動相が流
れているため、移動相切換えにともなうカラム再生の時
間が不要である。第２カラムにアルブミンが導入される
までの間は、第２の移動相送液部により送液される移動
相Ａ液により第２カラムが再生されている。また、第２
カラムにアルブミンが導入された後の分析および第２カ
ラム再生のための移動相は、第２の移動相送液部から短
い流路を通って第２カラムに送られる。上記の理由か
ら、分析を始めてから水の分析の開始までの時間が大幅
に短縮された。

本発明の装置は、自動化が可能であり、その結果、迅
速、簡単に、かつ再現性よく、糖化アルブミンと非糖化
アルブミンの分析ができる。

（実施例）本発明の一実施例を第２図に示す構成説明図に基づいて
説明する。

第２図において、（１）は移動相Ａ液用容器で、そこか
らの第１流路には、第１の送液ポンプ（４）、試料注入
部（５）、第１カラム（６）、蛍光検出器Ａ（７）およ
び流路切換バルブ（８）が連結されている。また、
（２）は移動相Ａ液用容器、（３）は移動相Ｂ液用容器
で、その流路は、移動相切換えバルブ（９）および第２
の送液ポンプ（10）を介して流路切換バルブ（８）に連
結された第２流路を形成し、該流路切換バルブ（８）か
らの第２流路には、第２カラム（11）および蛍光検出器
Ｂ（12）が連結されている。（13）はデーター処理機、
（14）は試料冷却機、（15）はカラム用恒温槽、（16）
は自動制御システムである。

第１カラムは、特開昭60−150839号公報の実施例１に記
載のゲル（重量平均粒径9.0μｍ、水酸基密度4.9meq/
g、保持できる水の量が1.9g/g、ジエチルアミノ基が0.5
meq/g）を内径7.6mm、長さ100mmのステンレス製カラム
に充填したものを用いた。

第２カラムは、次のようにして作成したものを用いた。

特開昭57−30945号公報の実施例１に記載のビニルアル
コールコポリマーゲル（X;0.3、水酸基量;7.8meq/g、保
持し得る水の量;1.78g/g、比表面積;78m²/g、粒径;9.0
μｍ）25gに、エピクロルヒドリン116.8g、ジメチルス
ルフォキシド250ml、10N水酸化ナトリウム水溶液12.5ml
を加え、30℃で20時間反応させた。エポキシ基の導入量
は1.0meq/gであった。なお、エポキシ基の定量法は、特
開昭57−190003号公報に記載の方法で行った。

次に、ｍ−アミノフェニルボロン酸ヘミ硫酸塩13gを250
mlの水に溶解し、pH11としたものに先のエポキシ基導入
ポリマー20gを加え、60℃で20時間反応を行った。次
に、残存エポキシ基を保護するために25mMトリス（ヒド
ロキシメチル）アミノメタンを加え、50℃で５時間反応
を行った。ボロン酸の導入量は0.28meq/gであった。ボ
ロン酸の定量は以下の方法によった。

上記のｍ−アミノフェニルボロン酸を導入したポリマー
1gに30％過酸化水素水10mlを加え、５時間反応させるこ
とによって、ホウ素−炭素結合を切断した。次に、ポリ
マーを遠沈し、その上清を採取した。これを脱炭酸後、
糖を加えることによってホウ酸エステルを形成させ、強
酸化し、水酸化ナトリウムを滴定することによってホウ
酸を定量した。

なお、この分析に用いた器具は、すべて石英製である。

ｍ−アミノフェニルボロン製を導入した共重合体の水酸
基密度は9.2meq/g（ジヒロキシボロニル基切断後）、保
持し得る水の量は1.70g/gであった。また、粒径、比表
面積は導入前と同じであった。

なお、保持し得る水の量および比表面積は、特開昭57−
30945号公報に記載の方法で求めた。

上記のアミノフェニルボロン酸導入共重合体を内径6m
m、長さ100mmのステンレス製カラムに充填し、第２カラ
ムとした。

この分析装置の作動について説明すると、流路切換によ
り以下に示すステップに分かれて作動する。

ステップＩ（試料注入から第１カラムでのアルブミン分
離まで）まず、カラム用恒温槽（15）により、第１カラム（６）
および第２カラム（11）を20〜60℃に保持しておく。試
料は試料冷却機（14）により０〜10℃に保持しておく。
移動相Ａ液用容器（１）中の移動相Ａ液を第１の送液ポ
ンプ（４）により送液し、試料注入部（５）から試料を
注入する。注入された試料は、第１カラム（６）に導入
され、分離された後に蛍光検出器Ａ（７）に送られる。
分離されたアルブミンが蛍光検出器Ａ（７）から出るま
での間、第１カラム（６）からの溶出液は、流路切換バ
ルブ（８）を介して流路系外に排出される。

この間、第２の送液ポンプ（10）は、移動相切換えバル
ブ（９）が実線流路の状態で、移動相Ａ液用容器（２）
中の移動相Ａ液を、流路切換バルブ（８）を介して第カ
ラム（11）に送液する。

ステップII（試料中のアルブミンの第２カラムへの導
入）第１カラム（６）により分離された試料中のアルブミン
が蛍光検出器Ａ（７）を通過した後、流路切換バルブ
（８）は破線流路に切り換えられ、その結果、蛍光検出
器Ａ（７）からの溶出液は、流路切換バルブＡ（８）を
経て第２カラム（10）に送られる。

ステップIII（第２流路での糖化アルブミンと非糖化ア
ルブミン分離のための流路変更）試料中のアルブミンが第２カラム（10）に導入された
後、流路切換バルブ（８）は実線流路に切換えられ、そ
の結果、第２の送液ポンプ（10）からの送液は、流路切
換バルブ（８）を介して第２カラム（11）に送られる。

ステップIV（糖化アルブミンと非糖化アルブミン分離の
ステップ）次に、移動相切換バルブ（９）が破線流路に切換えら
れ、移動相Ｂ液用容器（３）中の移動相Ｂ液が第２の送
液ポンプ（10）により、上記ステップIIIの流路を通っ
て第２カラム（11）に送られる。第２カラム（11）で分
離された糖化アルブミンおよび非糖化アルブミンは、蛍
光検出器Ｂ（12）に送られ、その検出結果は、蛍光検出
器Ａ（７）の検出結果とともにデータ処理機（13）によ
り処理される。

ステップＶ（第２カラムの再生）移動相切換バルブ（９）が実線流路に切換えられ、移動
相Ａ液用容器（２）中の移動相Ａ液が第２の送液ポンプ
（10）により、上記ステップIIIの流路を通って第２カ
ラム（11）に送られ、第２カラム（11）を再生する。

なお、以上の作動は、自動制御システム（16）で制御さ
れる。

上記装置を用いて、糖化アルブミンおよび非糖化アルブ
ミンを含む試料の分析を行った一例を示す。分析条件は
以下のとおりである。

試料：健常者血清（５μ）移動相：（Ａ液）250mM酢酸アンモニウム、50mM塩化マ
グネシウムおよび200mM塩化ナトリウムを含む水溶液（p
H8.5）／エタノール＝95/5 （Ｂ液）100mMトリス（ヒドロキシメチル）ア
ミノメタン、100mMソルビトールおよび50mM EDTA 2Naを
含む水溶液（pH8.5）流量:1.0ml/分温度:30℃ 検出：蛍光検出器Ａおよび蛍光検出器Ｂともに励起波
長:285nm、蛍光波長:340nm この結果を第３図および第４図に示す。第３図は第１カ
ラムによる試料中のアルブミンの分離の結果を、第４図
は第２カラムによる糖化アルブミンと非糖化アルブミン
の分離の結果を示すものである。

また、サンプルループを備えた流路切換手段を用いた一
実施例の構成図を第５図に示す第５図において、蛍光検
出器Ａ（７）から溶出された試料中のアルブミンは、一
旦、サンプルループ（17）に導入された後に第２カラム
（11）に導入される。

【図面の簡単な説明】

第１図は本発明の糖化アルブミン分析装置の一例を示す
フローダイアグラム、第２図は本発明の装置の一実施例
を示す構成説明図、第３図および第４図は本発明の装置
を用いて試料の分析を行って得られたクロマトグラム、
第５図は本発明の糖化アルブミン分析装置の別の一例を
示すフローダイアグラムである。１……移動相Ａ液用容器、２……移動相Ａ液用容器、３
……移動相Ｂ液用容器、４……第１の送液ポンプ、５…
…試料注入部、６……第１カラム、７……蛍光検出器
Ａ、８……流路切換バルブ、９……移動相切換バルブ、
10……第２の送液ポンプ、11……第２カラム、12……蛍
光検出器Ｂ、13……データ処理機、14……試料冷却機、
15……カラム用恒温槽、16……自動制御システム、17…
…サンプルループ

Claims

【特許請求の範囲】

【請求項１】液体クロマトグラフィーにより、試料中の
糖化アルブミンと非糖化アルブミンを分離分析する装置
において、第１カラムにおいて試料中からアルブミン
を分離するために用いられる移動相Ａ液の容器、第１の
移動相送液部、試料注入部、および試料中からアルブミ
ンを分離する第１カラムがこの順に連結されてなる第１
流路と、第２カラムにおいて非糖化アラブミンを溶出
させるために用いられる移動相Ａ液の容器と糖化アルブ
ミンを溶出するために用いられる移動相Ｂ液の容器が、
移動相切換手段を含む第２の移動相送液部に並列に接続
され、さらにアルブミンを糖化アルブミンと非糖化アル
ブミンに分離する第２カラム、および検出器がこの順に
連結されてなる第２流路とが、第２の移動相送液部の下
流と第２カラムの上流の間に存在する流路切換手段を介
して、第１カラムの下流部分で連結されていることを特
徴とする糖化アルブミン分析用の装置。