JPH07115912A

JPH07115912A - 乳清蛋白の酵素分解物

Info

Publication number: JPH07115912A
Application number: JP5263818A
Authority: JP
Inventors: Shigeru Suzuki; 鈴木　　茂; Kazunori Yoshimura; 和則吉村
Original assignee: Terumo Corp
Current assignee: Terumo Corp
Priority date: 1993-10-21
Filing date: 1993-10-21
Publication date: 1995-05-09

Abstract

(57)【要約】【構成】分子量７００以下のペプチドを主成分とし、遊
離アミノ酸含有量が２０〜４０％であり、芳香族アミノ
酸量／全アミノ酸量が６.４ｗｔ％以上、分枝アミノ酸
／芳香族アミノ酸のモル比が２〜５であることを特徴と
する抗原性及び苦みが低減した乳清蛋白の酵素分解物お
よびその製造方法。【効果】抗原性及び苦みが低減し、各種栄養剤に有効で
ある。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【産業上の利用分野】本発明は、乳清蛋白を酵素により
加水分解することにより得られる乳清蛋白の酵素分解
物、ならびに乳清蛋白の酵素分解物の製造方法に関す
る。

【０００２】

【従来の技術及び問題点】従来より、乳清蛋白質は、栄
養価が高く卵白及び、大豆タンパクなどと供に治療及
び、栄養補給の目的で栄養剤などの窒素源として広く使
用されてきた。また、タンパクを加水分解して低分子の
ペプチドを得る方法は多く知られている。また、近年窒
素源の腸管吸収に関して、アミノ酸より低分子量ペプチ
ドの方が早く栄養補給及び効果の面から有効であること
が報告され明かにされてきた。また、ペプチドを利用す
ることにより、アミノ酸の場合よりも浸透圧負荷が少な
く、よって下痢などの少ないことも明かにされてきた
（JJPEN．Vol6 No2 1984）。そこで、窒素源として低
分子ペプチドは、消化吸収及び、栄養価の面からも有用
な経腸栄養剤の素材として使用されてきた。

【０００３】しかし、これら低分子ペプチドを素材とし
た経腸栄養剤は、苦みが強く、また、原料蛋白由来の抗
原性を有している可能性があり、アレルギー患者への使
用は、注意を必要とするなどの問題点を有していた。よ
って、抗原性が低く腸管吸収性の良い、味の良好な蛋白
分解物が求められてきた。現在、多くの酵素により製造
されたペプチドが示されている（特開平３−２５１１５
４号公報，特開平４−２４８９５９号公報など）が、そ
れらに示されるペプチドは苦みが強く、経口投与には不
向きであり、また、製造段階において酵素（エキソプロ
テアーゼ、エンドプロテアーゼ）を単独もしくは組み合
わせを用いる方法が主流である。

【０００４】しかし、従来から指摘されるように酵素分
解において、遊離アミノ酸の産生は多く、分解中もしく
は分解後に膜及び樹脂などを使用し、産生した遊離アミ
ノ酸とペプチドの分画（特開平２−１３８９９１号公
報）を行うなどの処理が必要であった。また、酵素によ
る分解のため反応終了後、分解物中に未分解の部分（高
分子）が残存してくる。よって、これら残存する未分解
の部分を除去するために遠心分離及び濾過等が行われて
いる。しかし、公知の方法による分離では、効率よく清
澄な液を得る方法は、開示されていない。

【０００５】

【発明が解決しようとする課題】本発明は、上記問題を
鑑みて、乳清蛋白の酵素分解物及び乳清蛋白の酵素分解
物の製造方法を提供することにある。

【０００６】

【課題を解決するための手段】上記課題は以下の本発明
によって解決される。（１）乳清蛋白の酵素分解物であって、分子量７００
以下のペプチドを主成分とし、抗原性を呈さず、遊離ア
ミノ酸含有量が２０〜４０％であり、芳香族アミノ酸量
／全アミノ酸量が６.４ｗｔ％以上、分枝アミノ酸／芳
香族アミノ酸のモル比が２〜５であることを特徴とする
乳清蛋白の酵素分解物。（２）乳清蛋白を蛋白分解酵素により、抗原性、苦み
の低下をさせる上記（１）記載の乳清蛋白の酵素分解物
の製造方法。

【０００７】（３）乳清蛋白を分解するのに使用する
蛋白分解酵素が、セリン型プロテアーゼ（アルカリプロ
テアーゼ）及び３種類の中性プロテアーゼを組み合わせ
た４種類の酵素である上記（２）記載の乳清蛋白の酵素
分解物の製造方法。（４）上記（２）ないし（３）記載の乳清蛋白の酵素
分解物の製造方法において４種類の酵素を反応させる過
程の中で、中性プロテアーゼと同時にリパーゼを作用さ
せることにより乳清蛋白の酵素分解物の清澄化させる上
記（２）ないし（３）記載の乳清蛋白の酵素分解物の製
造方法。

【０００８】本発明の乳清蛋白の酵素分解物は、含まれ
るペプチドの分子量は７００以下、遊離アミノ酸含有量
２０〜４０％、芳香族アミノ酸量／全アミノ酸量が６.
４ｗｔ％以上、分枝アミノ酸／芳香族アミノ酸のモル比
が２〜５、より好ましくは３〜４である低分子量ペプチ
ド組成物あり、苦みを呈さず、抗原性を減少させてい
る。

【０００９】本発明において原料となる乳清蛋白は、動
物由来、植物由来のものが使用できるが、好ましくは牛
乳より得たものが用いられる。本発明において、窒素源
としての蛋白原料を、分子量が７００以下、具体的には
ジ、トリペプチド及び遊離アミノ酸まで分解させること
により抗原性が原料の蛋白と比較してかなり低減され、
また、苦みについても遊離アミノ酸含量が２０〜４０％
含まれるようにすると軽減ができる。上記に示した乳清
蛋白の酵素分解物を得るために、その製造過程において
使用する可能な加水分解酵素は、セリン型プロテアー
ゼ、中性プロテアーゼが挙げられる。

【００１０】セリン型プロテアーゼとしては、トリプシ
ン、キモトリプシン、オリエンターゼ５ＢＬ（阪急共
栄）、プロチンＡ（大和）、エラスターゼ、バチルス
サブチリス(Bacillus Subtilis)プロテアーゼ等が挙げ
られる。中性プロテアーゼとしては、エキソプロテアー
ゼ、エンドプロテアーゼが使用でき、具体的には、アス
ペルギルス(Aspergillus)プロテアーゼ、フィゾプス(Ph
izopus)プロテアーゼ、ペニシルム(Penicillum)プロテ
アーゼ、バチルスサブチリス(Bacillus Subtilis)プ
ロテアーゼ、アクチナーゼ（科研）、ＰＴＮ（NOVO）、
パンチターゼＮＰ−２（ヤクルト）、ＡＯＳ，ＡＯＳ
（ＴｙｐｅII）（盛進）等が挙げられる。

【００１１】本発明において、セリン型プロテアーゼ及
び上述したうちから少なくとも３種類以上の中性プロテ
アーゼを３種類以上用いることにより、原料の乳清蛋白
より７５％以上のタンパク含量を有する酵素分解物が得
られる。また、これら酵素の組み合わせを利用して得ら
れた酵素分解物は、抗原性及び苦みを著しく低減され
る。

【００１２】本発明の乳清蛋白の酵素分解物の製造方法
は、原料の乳清蛋白にセリン型プロテアーゼを加え反応
させ、次に中性プロテアーゼを加え反応させることによ
って、目的の酵素分解物を得るものであるが、当該乳清
蛋白の酵素分解物を効率よく得るために中性プロテアー
ゼを添加する段階においてリパーゼも使用することによ
り酵素の加熱失活後、膜濾過による固液分離で効率よく
清澄な分解溶液を得ることができる。

【００１３】本発明の乳清蛋白の酵素分解物は、分子量
分布が７００以下と低く、ジ、トリペプチドが７０％近
く含有され、タンパク質の抗原性も低く抑えられ、なお
遊離アミノ酸が２０〜４０％含まれているため味が良好
な素材である。さらに、ペプチドの持っている特徴であ
る消化吸収に優れ、遊離アミノ酸もバランス良く含まれ
ておりまた、酵素分解時にリパーゼを作用させているた
め、脂質をほとんど含有していない特徴を持っている。
これらのことより得られた本発明の乳清蛋白の酵素分解
物は、栄養素材として極めて有用性が高い。

【００１４】また本発明の乳清蛋白の酵素分解物は、芳
香族アミノ酸量／全アミノ酸量が６.４ｗｔ％以上、分
枝アミノ酸／芳香族アミノ酸のモル比（フィシャー比）
が２〜５、より好ましくは３〜４、特に好ましくは３.
４５であり、アミノ酸組成としてバランス良く含まれて
おり、さらに、分子量分布７００以下と低く、味が良好
である。よって、これらの特徴より、本発明の乳清蛋白
の酵素分解物を窒素源とすることで、今までにない多種
多様な栄養剤に使用可能であり、この組成を基にアミノ
酸の添加及び遊離アミノ酸の除去により疾患別栄養剤へ
の利用の拡大などが考えられ、さらに味が良好であるた
め、経管及び経口の２種類の投与方法が可能である。

【００１５】次に、本発明の乳清蛋白の酵素分解物の製
造方法ついて説明する。乳清蛋白（ホエー）溶液（ｐＨ
６.０〜６.５）の調製を行い、液性を中性に調整し、基
質溶液とする。次に、当該基質溶液をあらかじめ５０℃
以上に加温し、その溶液に Bacillus Subtilis属由来も
しくは、アルカリ性プロテアーゼ（セリンプロテアー
ゼ）を対基質１.０w/w％以上になるように添加し、数時
間反応させ加水分解反応させる。反応終了後、温度を低
下させ、Aspergillus 及び Penicillum 属由来の中性プ
ロテアーゼ（エキソ、エンドプロテアーゼ）を３種類組
み合わせ、混合した酵素を添加する。さらに同時に、リ
パーゼを添加し、反応させる。反応終了後、９０℃、２
０分間加熱失活する。失活後、生成した沈澱物を膜によ
る濾過を行い、沈澱物の除去を行う。濾過後、凍結乾燥
もしくはスプレードライにより粉末化し、試料とする。

【００１６】また、分解に使用する酵素は、原料の基質
量に対して１.５w/w％となるようにアルカリプロテアー
ゼ及びエキソ、エンドプロテアーゼ混合物を添加する。
また、酵素の添加に際して、２つの酵素は分けて添加す
る。温度条件は、アルカリプロテアーゼに関しては、３
５℃〜６５℃、又液性条件はｐＨ７〜１０、エキソ、エ
ンドプロテアーゼ混合物に関しては、３５℃〜５５℃、
ｐＨ５〜７に調製し反応を行う。反応時間は、アルカリ
プロテアーゼ１〜６時間、エキソ、エンドプロテアーゼ
混合物１〜１８時間である。

【００１７】次に本発明における各条件の測定方法につ
いて説明する。・遊離アミノ酸の測定アミノ酸自動分析計（日本電子，ＪＬＣ−３００）によ
り、遊離アミノ酸を測定した。・全アミノ酸、芳香族アミノ酸、分枝アミノ酸の測定得られた分解物に６Ｎ−ＨＣｌを加え２４時間加水分解
を行った後、アミノ酸自動分析計（日本電子，ＪＬＣ−
３００）によりそれぞれのアミノ酸を測定した。

【００１８】・抗原性の測定調製した試料について、ＥＬＩＳＡ試験により測定し
た。ウサギ抗乳清タンパク血清を使用して行った。・分子量分布の測定分子量分布の測定は、ゲルフィルトレイション(Gel Fi
ltration)法により測定を行った。条件は、セファデッ
クス(Sephadex)Ｇ-１０（ファルマシア社）を充填した
１.７×９５cmの筒を使用し、溶出液：Ｈ₂Ｏ、流速：１
９.８ml/時間、測定：２２０nm、試料濃度：4mg/Ｎで行
った。

【００１９】・平均分子量及び平均ペプチド鎖長の測定塩酸加水分解を行い、その加水分解試料をとし、一
方、同一の分解前の溶液を試料とする。次に、試料
、のペプチド及びアミノ酸由来のアミノ基の定量を
ＴＮＢＳ（トリニトロベンゼンスルホン酸）法により行
った。平均ペプチド鎖長は、式平均ペプチド鎖長＝
試料の吸光度／試料の吸光度により求めた。次
に平均分子量は、試料に使用した酵素分解物の蛋白量
をセミミクロケルダール法により測定して、ＴＮＢＳ法
により測定した窒素量とのモル比より求めた。

【００２０】

【実施例】以下に実施例を示し、本発明を更に詳細に説
明する。（実施例１）市販乳清蛋白を６w/v％となるように溶解
させ溶液とし、当該溶液の液性を水酸化ナトリウムでｐ
Ｈ７.０に調整した。次に、当該溶液の温度を６５℃に
調整し、オリエンターゼ１０Ｂ（阪急共栄物産）を対基
質１.５w/w％になるように添加し、６時間反応させた。
反応終了後温度を５０℃に調整し、プロテアーゼＡ、プ
ロテアーゼＰ₃、プロテアーゼＢ（天野製薬）を全量で
対基質１.５w/w％になるようにプロテアーゼＡ：プロテ
アーゼＰ₃：プロテアーゼＢ＝１：１：１の割合で混合
し、添加した。また、同時にリパーゼＭ（天野製薬）を
対基質０.２w/w％の濃度で添加し、１８時間酵素加水分
解を行った。９０℃、２０分間加熱失活後、膜濾過によ
り沈澱物を除去した。得られた分解物溶液をスプレード
ライにより粉末にし、乳清蛋白の酵素分解物を得た。

【００２１】得られた乳清蛋白の酵素分解物を分析した
結果、遊離アミノ酸含有量は３２％、平均分子量は２２
０ＭＷ、平均ペプチド鎖長２.２、芳香族アミノ酸量／
全アミノ酸量が７.２ｗｔ％、分枝アミノ酸／芳香族ア
ミノ酸のモル比が３.４５、またSephadex G-10のカラム
により分子量分画を行ない、ペプチド含有量を測定した
ところ、ジ・トリペプチドは６０％含有していた。ま
た、ＥＬＩＳＡ抑制試験では、原料の乳清蛋白と比較し
て１０^-8であった。酵素分解後の未分解物の沈澱濾過に
おいて、固液分離が容易に行え清澄な分解物を得ること
ができた。

【００２２】（参考例）実施例に従って各種酵素を使っ
て分解を行った後、セライト濾過、遠心分離、膜による
精密濾過におけるリパーゼの効果を検討した。結果を表
１に示す。

【００２３】

【表１】

【００２４】以上、リパーゼを使用することにより酵素
分解後の固液分離を効率良く行え清澄化されたタンパク
分解物が得られた。

【００２５】

【発明の効果】本発明の乳清蛋白の酵素分解物は、分子
量７００以下のペプチドを主成分とし、遊離アミノ酸含
有量が２０〜４０％であり、芳香族アミノ酸量／全アミ
ノ酸量が６.４ｗｔ％以上、分枝アミノ酸／芳香族アミ
ノ酸のモル比が２〜５であることを特徴とし、抗原性及
び苦みが低下されており、経腸栄養剤、高齢者用の栄養
補助剤等の各種栄養剤として有効に使用できる。

【００２６】また本発明の乳清蛋白をセリン型プロテア
ーゼ（アルカリプロテアーゼ）及び少なくとも３種類の
中性プロテアーゼを組み合わせた蛋白分解酵素を使用す
る乳清蛋白の酵素分解物の製造方法により、前記乳清蛋
白の酵素分解物を得ることができる。

【００２７】本発明の乳清蛋白の酵素分解物の製造方法
において、酵素を反応させる過程の中で、中性プロテア
ーゼと同時にリパーゼを作用させることにより乳清蛋白
の酵素分解物の清澄化させることができる。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁶ 識別記号庁内整理番号ＦＩ技術表示箇所Ｃ１２Ｐ 21/06 9282−4Ｂ

Claims

【特許請求の範囲】

【請求項１】乳清蛋白の酵素分解物であって、分子量
７００以下のペプチドを主成分とし、抗原性を呈さず、
遊離アミノ酸含有量が２０〜４０％であり、芳香族アミ
ノ酸量／全アミノ酸量が６.４ｗｔ％以上、分枝アミノ
酸／芳香族アミノ酸のモル比が２〜５であることを特徴
とする乳清蛋白の酵素分解物。