JPH07117519B2 - 酵素固定膜の調製方法 - Google Patents

Description

【発明の詳細な説明】 〔産業上の利用分野〕 本発明は、体液、体組織、食品に含まれるグルコース、
尿素、トリグリセリド、りん脂質、アルコールなどの微
量成分を酵素を利用して選択的に定量するのに使用され
る酵素固定膜の調製方法に関するものである。

〔従来の技術〕 酵素固定膜を備えた電極（酵素膜電極）を、被検液と接
触させると、酵素反応によって電極感知物質（例えば、
過酸化水素）が生成し、この感知物質を電流量として検
知することにより、被検液中の特定物質の量を測定する
ことができる。例えば、血液、尿や食品中のグルコース
を測定する場合、過酸化水素電極を下地センサとする酵
素膜電極を構成し、酵素固定膜を透過した過酸化水素
（グルコースの酵素反応により生成した電極感知物質）
を分解して、過酸化水素の量に比例した電流を発生さ
せ、この電流量からグルコース量を測定することができ
る。

ところで、酵素膜電極を用いて、血液、尿や食品中の特
定物質を正確に測定するにあたってはこれらの被検液に
含まれる尿酸、アルコルビン酸、グルタチオン、メルカ
プト酢酸、アルブミンなど測定対象物質以外の電極活性
物質（妨害物質）を排除することが必要である。

そのため一般的な手法としては、複数の電極を設けて妨
害物質に起因する電流値を差し引いて電極出力とする方
法や電気的に妨害物質を分解させる方法の他、酵素固定
膜自体の妨害物質阻止効果を高める方法がある。

妨害物質阻止効果を高めた酵素固定膜としては 測定物質選択透過層ａ、固定化酵素膜層ｂ、高分子物
質除去層ｃの三層a,b,cを積層した酵素固定膜（第７図
イ）（特公昭56−48070号公報） 一枚の膜で、緻密な膜層ａ′と、多孔質な膜層ｂ′を
有する非対称型の酵素固定膜（第７図ロ）特公昭59−21
500号公報）が既に知られている。

しかしながら、上記の場合、三層a,b,cを均一かつ精
密に積層、接着することが非常に困難であるため、酵素
固定膜の作成が面倒であり、しかも三層a,b,cでは全体
として膜厚が厚くなるので、電極の応答性が悪いという
欠点があった。

の酵素固定膜においては、緻密な膜層ａ′では酵素反
応により生ずる過酸化水素の透過量が小さくなって電流
量も僅かになり、また被検液に接する多孔質膜層ｂ′で
は被検液中の不溶性物質などによる汚染やつまりが生じ
やすくて透過量が少なくなる欠点があった。

〔発明が解決しようとする課題〕

上記の従来欠点に鑑み、本発明は、妨害物質阻止効果の
高い酵素固定膜を容易に作成できる酵素固定膜の調製方
法を提案するものである。

〔課題を解決するための手段〕

上記の目的を達成するために、本発明が講じた技術的手
段は、次のとおりである。即ち、本発明による酵素固定
膜の調製方法は、アミン系界面活性剤で親水処理した多
孔質ポリプロピレン膜とその片面に積層されたアセチル
セルロース膜とからなる担体膜における多孔質ポリプロ
ピレン膜層中の界面活性剤の側鎖中官能基およびアセチ
ルセルロース膜層中の側鎖中官能基に酢酸酸性下でアミ
ノシラン剤を反応させることを特徴としている。

〔発明の効果〕

上記の構成によれば、アミノシラン剤が架橋反応を起こ
して、アミノ基（−NH₂基）をもったシランマトリック
スを形成するので、アミノ基による酵素の固定が可能で
あると共に、シランマトリックスによる妨害物質阻止効
果が発揮されることになる。つまり、アセチルセルロー
ス膜層での妨害物質阻止効果と、アミン系界面活性剤を
含む多孔質ポリプロピレン膜層での、酵素固定に必要な
アミノ基の添加効果とが、一工程の反応処理で実現され
ることになる。

従って、妨害物質阻止効果の高い、しかも酵素固定に必
要なアミノ基をもった酵素固定膜を容易に作成できるの
である。

〔実施例〕

以下、本発明に係る酵素固定膜の調製方法の実施例を図
面に基づいて説明する。

第１図は、酵素固定膜の調製に使用する担体膜を示す。
図示の担体膜は、アミン系界面活性剤で親水処理され
た、厚さ25μｍ、孔径0.4×0.04μｍの多孔質ポリプロ
ピレン膜１とその片面（電極側の面）にラミネートした
厚さ２〜３μｍのアセチルセルロース膜２とから構成さ
れている。（商品名ジュラガードK307） 前記担体膜における多孔質ポリプロピレン膜１層中の界
面活性剤の側鎖中官能基およびアセチルセルロース膜２
層中の側鎖中官能基（例えば、−NH₂,−OH）に、酢酸酸
性下で、アミノシラン剤（例えば、γ−アミノプロピル
トリエトキシシラン、Ｎ−βアミノエチルγアミノプロ
ピルトリメトキシシラン、Ｎ−βアミノエチル−α−メ
チル−γ−アミノプロピルジメトキシシラン、Ｎ−ビス
−βヒドロキシエチル−γ−アミノプロピルトリエトキ
シシラン）を反応させる。

反応条件は次のとおりである。即ち、前記担体膜を、ア
ミノシラン剤0.1〜５％（好ましくは、1.0％）を添加し
たpH2〜４の酢酸水溶液（好ましくはpH3.0、酢酸２％）
中に、90℃で、１時間浸漬し、更に、90℃で１時間乾燥
させる。

しかる後、上記の処理膜（アミノシラン剤で処理した担
体膜）の水洗およびpH7.2の緩衝液による洗浄を行った
後、酵素（例えば、グルコースオキシダーゼ、アルコー
ルオキシターゼ、ウリカーゼ等）と牛アルブミンを2:1
の割合で混合した溶液に、最終濃度１％のグルタルアル
デヒドを混合し、その混合液を、上記の処理膜上に均一
に浸透させ、反応後、1Mグリシン溶液で膜中の未反応基
をブロックする。

上記のようにして調製した酵素固定膜および調製過程で
の担体膜およびその構成要素について、各種の実験を行
った。第２図は本実験に利用した電極測定装置の概念図
を示したものである。同図において、３は酵素電極、４
はミキシングコイル、５はサンプルインジェクター、６
はエアダンパー、７はキャリア緩衝液、８は廃液タン
ク、９はデジタル微少電流計である。

本実験により次の結果を得た。

第３図は、担体膜のアミノシラン処理に使用するアミノ
シラン濃度と、処理膜（アミノシラン剤で処理した担体
膜）を使用して測定した過酸化水素標準液の電極出力お
よび妨害物質であるアスコルビン酸、尿酸の電極出力と
の関係を示す。

第４図は、上記処理膜に固定する酵素としてグルコース
オキシダーゼを用いた場合のグルコースオキシダーゼ電
極出力とアミノシラン濃度との関係を示す。

表１は、次の膜Ａ〜Ｄを使用して、過酸化水素標準液、
妨害物質であるアスコルビン酸・尿酸の混合液および建
常人の原尿を測定した際の電極出力を示す。この表１か
ら、膜Ｃと膜Ｄに妨害物質阻止効果が認められる。この
妨害物質阻止効果はラミネートされるアセチルセルロー
ス膜２との反応によるγアミノプロピルトリエトキシシ
ラン（以下、γAPTES）を用いたアミノシラン処理効果
である。

Ａ…アミン系界面活性剤で親水処理された多孔質ポリプ
ロピレン膜１とその片面にラミネートしたアセチルセル
ロース膜２とから構成されたアミノシラン未処理の膜 Ｂ…アミン系界面活性剤で親水処理された多孔質ポリプ
ロピレン膜１をアミノシラン処理した膜 Ｃ…アセチルセルロース膜２をアミノシラン処理した膜 Ｄ…アミン系界面活性剤で親水処理された多孔質ポリプ
ロピレン膜１とその片面にラミネートしたアセチルセル
ロース膜２とから構成された担体膜をアミノシラン処理
した膜 表２は、次の膜Ａ′〜Ｅ′を使用して、各膜Ａ′〜Ｅ′
が酵素（グルコースオキシダーゼ）をどの程度固定でき
るかを調べたものである。この表２から、膜Ｃ′と膜
Ｄ′に、酵素の固定に必要な官能基（NH₂基）の添加効
果が認められる。このアミノ基添加効果は、アミン系界
面活性剤で親水処理された多孔質ポリプロピレン膜１と
の反応によるγAPTES処理効果である。

Ａ′…多孔質ポリプロピレン膜１ Ｂ′…アミン系界面活性剤で親水処理された多孔質ポリ
プロピレン膜１ Ｃ′…アミン系界面活性剤で親水処理された多孔質ポリ
プロピレン膜１をアミノシラン処理した膜 Ｄ′…アミン系界面活性剤で親水処理された多孔質ポリ
プロピレン膜１とその片面にラミネートしたアセチルセ
ルロース膜２とから構成された担体膜をアミノシラン処
理した膜 Ｅ′…アセチルセルロース膜２をアミノシラン処理した
膜 上記の表１、表２から、アミン系界面活性剤で親水処理
された多孔質ポリプロピレン膜１とこれにラミネートさ
れたアセチルセルロース膜２をγAPTES処理することに
よって、妨害物質阻止効果と、酵素の固定に必要なアミ
ノ基の添加効果とが同時に達成されることが分かる。

尚、上記の表１では、妨害物質阻止効果が、アセチルセ
ルロース膜２のみに起因するものか、アセチルセルロー
ス膜２にγAPTES処理を施したことに起因するものかの
判別ができない。

そこで、γAPTESで処理する代わりに、アミノ基の添加
効果はあるが、反応によってマトリックスを形成しない
アリルアミンで処理して作成した酵素固定膜と、上述の
とおりγAPTES処理して作成した酵素固定膜とを用いて
酵素電極法により血清中のグルコース濃度を測定し、比
色定量法による測定結果と比較した。

これによって得られた酵素電極法と比色定量法との相関
を第５図に示す。

第５図から明らかなように、アリルアミン処理膜では、
γAPTES処理した酵素固定膜よりもグルコース濃度が高
値に測定されている。これは、妨害物質による正誤差に
よるもので、アミノシラン処理法が有効であることを示
す一例でもある。即ちアミノシラン処理した酵素固定膜
では、アミノシラン剤が、アミノ基を有するシランマト
リックスを形成しており、このシランマトリックスが妨
害物質阻止に寄与していると思われる。

第６図は、γAPTES処理して作成した酵素固定膜を用い
て酵素電極法により尿中のグルコース濃度を測定し、比
色定量法による測定結果と比較して得られた酵素電極法
と、比色定量法との相関を示す。

表３は、γAPTES処理して作成した酵素固定膜を用いて
酵素電極法により数種類の食品中のグルコース濃度を測
定し、比式定量法との相関を調べたものである。

表３から明らかなように、γAPTES処理して作成した酵
素固定膜は、血液、尿などと同様に複雑な妨害物質を含
む食品中でも、正確に測定可能である。

また上記の調製方法により作成され、固定する酵素とし
てアルコールオキシダーゼを使用した酵素固定膜を用い
て、清酒類のアルコール濃度を測定した結果、アルコー
ル濃度表示値とよく一致していた。

【図面の簡単な説明】

第１図は本発明の酵素固定膜の調製方法に使用する担体
膜の概略断面図、第２図は実験に使用した電極測定装置
の概念図、第３図は担体膜のアミノシラン処理に使用す
るアミノシラン濃度と、処理膜（アミノシラン剤で処理
した担体膜）を使用して測定した過酸化水素標準液の電
極出力および妨害物質であるアスコルビン酸、尿酸の電
極出力との関係を示すグラフ、第４図は上記処理膜に固
定する酵素としてグルコースオキシダーゼを用いた場合
のグルコースオキシダーゼ電極出力とアミノシラン濃度
との関係を示すグラフ、第５図はアリルアミンで処理し
て作成した酵素固定膜とγAPTES処理して作成した酵素
固定膜とを用いて行った血清中のグルコース濃度の酵素
電極法による測定結果と、比色定量法との相関を示すグ
ラフ、第６図はγAPTES処理して作成した酵素固定膜を
用いて行った尿中のグルコース濃度の酵素電極法による
測定結果と、比色定量法との相関を示すグラフである。 第７図イ，ロは従来例の説明図である。 １……多孔質ポリプロピレン膜、２……アセチルセルロ
ース膜。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁶ 識別記号 庁内整理番号 ＦＩ 技術表示箇所 Ｃ１２Ｑ 1/00 Ｂ 6807−4Ｂ Ｃ 6807−4Ｂ

Claims (1)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】アミン系界面活性剤で親水処理した多孔質
   ポリプロピレン膜１とその片面に積層されたアセチルセ
   ルロース膜２とからなる担体膜における多孔質ポリプロ
   ピレン膜層中の界面活性剤の側鎖中官能基およびアセチ
   ルセルロース膜層中の側鎖中官能基に酢酸酸性下でアミ
   ノシラン剤を反応させることを特徴とする酵素固定膜の
   調製方法。