JPH0712812A - 真核細胞のプログラム細胞死または誘導細胞死の検出方 法 - Google Patents
真核細胞のプログラム細胞死または誘導細胞死の検出方 法Info
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Abstract
(57)【要約】
【構成】 本発明は、真核細胞のプログラム細胞死また
は誘導細胞死の検出方法、ならびに本検出方法に適した
試験キットに関する。 【効果】 アポトーシスの検出を迅速に行うことができ
る簡便な細胞障害性試験を提供できる。
は誘導細胞死の検出方法、ならびに本検出方法に適した
試験キットに関する。 【効果】 アポトーシスの検出を迅速に行うことができ
る簡便な細胞障害性試験を提供できる。
Description
【０００１】
【産業上の利用分野】本発明は、真核細胞のプログラム
細胞死または誘導細胞死の検出方法、ならびに本検出方
法に適した試験キットに関する。
細胞死または誘導細胞死の検出方法、ならびに本検出方
法に適した試験キットに関する。
【０００２】
【従来の技術】真核細胞は二つの基本的に異なる様式に
て死滅しうる。一つの様式はネクローシス（壊死）であ
り、例えば血液の不十分な供給、および酸素や栄養分の
不十分な供給による損傷の結果、あるいは中毒や物理的
損傷（機械的な創傷、凍傷、または熱傷）の結果として
の細胞死をいう。他の様式は、いわゆるプログラム細胞
死であって、概して組織、器官、有機体の発達と機能性
にとって重要である〔J.Cohen, Advances in immunolog
y 50 (1991), 55-85 〕。このようにして死滅した細胞
は、モノヌクレオソームおよびオリゴヌクレオソームと
して細胞質内でヒストンと会合しているＤＮＡ断片を示
す。そのような現象は、例えば、イオン化放射線〔Yama
daら，Int. J. Radiat. Biol. 53 (1988), 65 〕、ある
いは例えば抗ｆａｓ〔Yoneharaら，J. Exp. Med. 169
(1989), 1747-1756〕または抗ＡＰＯ−１〔Trauthら，S
cience 245 (1989), 301-304 〕のようなある種のモノ
クローナル抗体によって引き起こされるような誘導細胞
死においてもまた観察される。細胞障害性Ｔ細胞および
ナチュラルキラー細胞もまた、記載される特徴を伴う誘
導細胞死を引き起こす〔Sanderson, Biol. Rev. 56 (19
81), 153-197, S. Curnow ら，Cancer Immunol. Immuno
ther. 36 (1993), 149-155およびBerke, Immunol. Toda
y 12 (1991), 396-399〕。
て死滅しうる。一つの様式はネクローシス（壊死）であ
り、例えば血液の不十分な供給、および酸素や栄養分の
不十分な供給による損傷の結果、あるいは中毒や物理的
損傷（機械的な創傷、凍傷、または熱傷）の結果として
の細胞死をいう。他の様式は、いわゆるプログラム細胞
死であって、概して組織、器官、有機体の発達と機能性
にとって重要である〔J.Cohen, Advances in immunolog
y 50 (1991), 55-85 〕。このようにして死滅した細胞
は、モノヌクレオソームおよびオリゴヌクレオソームと
して細胞質内でヒストンと会合しているＤＮＡ断片を示
す。そのような現象は、例えば、イオン化放射線〔Yama
daら，Int. J. Radiat. Biol. 53 (1988), 65 〕、ある
いは例えば抗ｆａｓ〔Yoneharaら，J. Exp. Med. 169
(1989), 1747-1756〕または抗ＡＰＯ−１〔Trauthら，S
cience 245 (1989), 301-304 〕のようなある種のモノ
クローナル抗体によって引き起こされるような誘導細胞
死においてもまた観察される。細胞障害性Ｔ細胞および
ナチュラルキラー細胞もまた、記載される特徴を伴う誘
導細胞死を引き起こす〔Sanderson, Biol. Rev. 56 (19
81), 153-197, S. Curnow ら，Cancer Immunol. Immuno
ther. 36 (1993), 149-155およびBerke, Immunol. Toda
y 12 (1991), 396-399〕。
【０００３】しかしながら、それらはまたネクローシス
において観察されるような細胞膜の透過性亢進を引き起
こす〔Krahenbuhlら，Immunol. Today 12 (1991), 399-
402〕。プログラム細胞死あるいは誘導細胞死の記載さ
れる型は、アポトーシスと称される〔Wyllieら，Int. R
ev. of Cytol. 68 (1980), 251-301〕。それは、細胞膜
の水疱の隆起、細胞質の凝縮、および内因性エンドヌク
レアーゼの活性化により特徴付けられる。ネクローシス
とは対照的に、アポトーシスは、真核細胞の能動的なプ
ロセスである。それゆえ、アポトーシスはまた熱傷、凍
傷、および解凍による細胞死によって、あるいは溶解反
応に活性な抗体〔R. Duke ら，Proc. Natl. Acad. Sci.
80 (1983), 6361-6365 〕を用いた溶解によって引き起
こされるのではない。アポトーシスにおいて活性化され
るカルシウムおよびマグネシウム依存性のエンドヌクレ
アーゼは、ヌクレオソーム間の容易に接触できるリンカ
ー領域内でＤＮＡ二重鎖をモノヌクレオソームよびオリ
ゴヌクレオソームに開裂する。対照的に、ヌクレオソー
ム内のＤＮＡは密接にコアヒストンＨ２Ａ，Ｈ２Ｂ，Ｈ
３，及びＨ４と会合しており、よってエンドヌクレアー
ゼによる開裂から保護されている〔Burgoyneら，Bioche
m. J. 143 (1974), 67およびStach ら，J. Neurohem. 3
3 (1979), 257 〕。従って、アポトーシス細胞に典型的
である“ＤＮＡ断片化（ＤＮＡ ｌａｄｄｅｒ）”、つ
まり約１８０塩基対の長さのＤＮＡ断片の一つのパター
ンあるいはその複合パターン〔Wyllie, Nature 284 (19
80), 555-556およびJ. Cohen, Advances in Immunology
50 (1991), 55-85 〕が、ＤＮＡの抽出とアガロースゲ
ル内での分離後に検出される。細胞の細胞膜はアポトー
シスの初期の段階では完全なままである。モノヌクレオ
ソームおよびオリゴヌクレオソームは死滅細胞の細胞質
内に蓄積する〔Dukeら，Lymphokine Research 5(1986),
289-299 〕。
において観察されるような細胞膜の透過性亢進を引き起
こす〔Krahenbuhlら，Immunol. Today 12 (1991), 399-
402〕。プログラム細胞死あるいは誘導細胞死の記載さ
れる型は、アポトーシスと称される〔Wyllieら，Int. R
ev. of Cytol. 68 (1980), 251-301〕。それは、細胞膜
の水疱の隆起、細胞質の凝縮、および内因性エンドヌク
レアーゼの活性化により特徴付けられる。ネクローシス
とは対照的に、アポトーシスは、真核細胞の能動的なプ
ロセスである。それゆえ、アポトーシスはまた熱傷、凍
傷、および解凍による細胞死によって、あるいは溶解反
応に活性な抗体〔R. Duke ら，Proc. Natl. Acad. Sci.
80 (1983), 6361-6365 〕を用いた溶解によって引き起
こされるのではない。アポトーシスにおいて活性化され
るカルシウムおよびマグネシウム依存性のエンドヌクレ
アーゼは、ヌクレオソーム間の容易に接触できるリンカ
ー領域内でＤＮＡ二重鎖をモノヌクレオソームよびオリ
ゴヌクレオソームに開裂する。対照的に、ヌクレオソー
ム内のＤＮＡは密接にコアヒストンＨ２Ａ，Ｈ２Ｂ，Ｈ
３，及びＨ４と会合しており、よってエンドヌクレアー
ゼによる開裂から保護されている〔Burgoyneら，Bioche
m. J. 143 (1974), 67およびStach ら，J. Neurohem. 3
3 (1979), 257 〕。従って、アポトーシス細胞に典型的
である“ＤＮＡ断片化（ＤＮＡ ｌａｄｄｅｒ）”、つ
まり約１８０塩基対の長さのＤＮＡ断片の一つのパター
ンあるいはその複合パターン〔Wyllie, Nature 284 (19
80), 555-556およびJ. Cohen, Advances in Immunology
50 (1991), 55-85 〕が、ＤＮＡの抽出とアガロースゲ
ル内での分離後に検出される。細胞の細胞膜はアポトー
シスの初期の段階では完全なままである。モノヌクレオ
ソームおよびオリゴヌクレオソームは死滅細胞の細胞質
内に蓄積する〔Dukeら，Lymphokine Research 5(1986),
289-299 〕。
【０００４】多くの試験法がアポトーシスの検出用に開
発された。これらのうちの一つは、特にアポトーシスの
検出やネクローシスとの区別化のための標準定量法とし
ての役割を果たす、前述したアガロースゲル上における
“ＤＮＡ断片化”の検出である。他の方法においては、
試験細胞群は通常 3H −あるいは125I−標識チミジンで
前もって標識され、アポトーシスの誘導と細胞分画化の
後、染色体ＤＮＡ内、断片化ＤＮＡ内および細胞培養上
清中の3Hまたは125I標識の部分を遠心分離段階で測定す
る〔R. Duke ら，Proc. Natl. Acad. Sci. 80 (1983),
6361-6365 およびR. Duke ら，Lymphokine Research 5
(1986), 289-299 〕。この方法の簡便化はいわゆるＪＡ
Ｍ法で、完全なＤＮＡとＤＮＡ断片の分離をガラスファ
イバーフィルターを通す真空濾過の手段で行うものであ
る〔P. Matzinger, J. Immunol.Meth. 145 (1991), 185
-192 〕。しかし、この方法もまた依然として時間がか
かり、放射性標識を使用するために特別な実験施設でし
か行うことができない。これは細胞ＤＮＡを精製し、脱
リン酸後に５’末端を32Ｐで標識し、アガロースゲルに
おいて電気泳動的に分離するというＰ．Ｈｕａｎｇらに
よって記載されるアポトーシスの別の検出方法にも応用
される。続いて放射活性が個々のＤＮＡバンド内で決定
される〔Annal. Biochem. 207 (1992), 163-167 〕。放
射性標識は、例えばアポトーシスにより産生されるＤＮ
Ａ断片をビオチニル化ｄＵＴＰを用いたニックトランス
レーションの手段で前もって標識し、その後蛍光標識ア
ビジンで検出する、Ｌ．Ｍｅｙａａｒｄら、またはＷ．
Ｇｏｒｃｚｙｃａらによって記載される方法に対しては
必要ない。もうひとつの方法においては、細胞質の、断
片化されたＤＮＡを洗い流した後、核ＤＮＡを例えばア
クリジン−オレンジのようなインターカレート（挿入）
する蛍光染料で染色し、続いて蛍光を測定する〔F. Oje
da, J. Immunol. Meth. 152 (1992), 171-176 〕。しか
しながら、これらの方法もまたアポトーシスの検出に対
する常套的な細胞障害試験としては複雑であり、ある場
合は毒性な蛍光染料を使用することや、精巧な装置が必
要であるため特別な実験設備で行うことに限られてしま
う。
発された。これらのうちの一つは、特にアポトーシスの
検出やネクローシスとの区別化のための標準定量法とし
ての役割を果たす、前述したアガロースゲル上における
“ＤＮＡ断片化”の検出である。他の方法においては、
試験細胞群は通常 3H −あるいは125I−標識チミジンで
前もって標識され、アポトーシスの誘導と細胞分画化の
後、染色体ＤＮＡ内、断片化ＤＮＡ内および細胞培養上
清中の3Hまたは125I標識の部分を遠心分離段階で測定す
る〔R. Duke ら，Proc. Natl. Acad. Sci. 80 (1983),
6361-6365 およびR. Duke ら，Lymphokine Research 5
(1986), 289-299 〕。この方法の簡便化はいわゆるＪＡ
Ｍ法で、完全なＤＮＡとＤＮＡ断片の分離をガラスファ
イバーフィルターを通す真空濾過の手段で行うものであ
る〔P. Matzinger, J. Immunol.Meth. 145 (1991), 185
-192 〕。しかし、この方法もまた依然として時間がか
かり、放射性標識を使用するために特別な実験施設でし
か行うことができない。これは細胞ＤＮＡを精製し、脱
リン酸後に５’末端を32Ｐで標識し、アガロースゲルに
おいて電気泳動的に分離するというＰ．Ｈｕａｎｇらに
よって記載されるアポトーシスの別の検出方法にも応用
される。続いて放射活性が個々のＤＮＡバンド内で決定
される〔Annal. Biochem. 207 (1992), 163-167 〕。放
射性標識は、例えばアポトーシスにより産生されるＤＮ
Ａ断片をビオチニル化ｄＵＴＰを用いたニックトランス
レーションの手段で前もって標識し、その後蛍光標識ア
ビジンで検出する、Ｌ．Ｍｅｙａａｒｄら、またはＷ．
Ｇｏｒｃｚｙｃａらによって記載される方法に対しては
必要ない。もうひとつの方法においては、細胞質の、断
片化されたＤＮＡを洗い流した後、核ＤＮＡを例えばア
クリジン−オレンジのようなインターカレート（挿入）
する蛍光染料で染色し、続いて蛍光を測定する〔F. Oje
da, J. Immunol. Meth. 152 (1992), 171-176 〕。しか
しながら、これらの方法もまたアポトーシスの検出に対
する常套的な細胞障害試験としては複雑であり、ある場
合は毒性な蛍光染料を使用することや、精巧な装置が必
要であるため特別な実験設備で行うことに限られてしま
う。
【０００５】
【発明が解決しようとする課題】従って、本発明の目的
は、アポトーシスの検出を迅速に行うことができる簡便
な細胞障害性試験を提供することである。
は、アポトーシスの検出を迅速に行うことができる簡便
な細胞障害性試験を提供することである。
【０００６】
【課題を解決するための手段】本発明の目的は、(a) 非
イオン性界面活性剤で処理して得られた試験細胞の溶解
液を抗ヒストン抗体および抗ＤＮＡ抗体とインキュベー
トし、ここで一方の抗体はインキュベーションの前また
は後に固相に結合されており、他方の抗体は標識抗体で
あり、(b) 該固相と液相を分離し、そして(c) 該標識を
プログラム細胞死または誘導細胞死の指標として該二相
のうちの一方において測定することを特徴とするプログ
ラム細胞死または誘導細胞死の検出方法によって達成さ
れる。
イオン性界面活性剤で処理して得られた試験細胞の溶解
液を抗ヒストン抗体および抗ＤＮＡ抗体とインキュベー
トし、ここで一方の抗体はインキュベーションの前また
は後に固相に結合されており、他方の抗体は標識抗体で
あり、(b) 該固相と液相を分離し、そして(c) 該標識を
プログラム細胞死または誘導細胞死の指標として該二相
のうちの一方において測定することを特徴とするプログ
ラム細胞死または誘導細胞死の検出方法によって達成さ
れる。
【０００７】驚くべきことに、プログラム細胞死または
誘導細胞死によって死滅した細胞（アポトーシス細胞）
は、試験細胞群を前もって標識する必要性なしに、この
簡便な方法を使用して測定されるシグナルを生じること
が判明した。結果として、インビトロで非増殖性細胞を
試験することもまた可能である。本発明による方法は、
非常に迅速な手法で、試験細胞群におけるアポトーシス
の程度の簡便で定量的な測定を可能とし、また非常に高
感度であるので少量の細胞（一回の試験につき５０細胞
が既にひとつのシグナルを生じ、一回の試験につき好ま
しくは１０3 細胞が使用される) しか本試験を行うのに
必要ではない。
誘導細胞死によって死滅した細胞（アポトーシス細胞）
は、試験細胞群を前もって標識する必要性なしに、この
簡便な方法を使用して測定されるシグナルを生じること
が判明した。結果として、インビトロで非増殖性細胞を
試験することもまた可能である。本発明による方法は、
非常に迅速な手法で、試験細胞群におけるアポトーシス
の程度の簡便で定量的な測定を可能とし、また非常に高
感度であるので少量の細胞（一回の試験につき５０細胞
が既にひとつのシグナルを生じ、一回の試験につき好ま
しくは１０3 細胞が使用される) しか本試験を行うのに
必要ではない。
【０００８】アポトーシス細胞から細胞質ＤＮＡ断片を
放出させるために、試験細胞群を非イオン性界面活性剤
で処理する。そのような界面活性剤は当業者に知られて
いるものである。ＮＰ−４０（エチルフェニルポリエチ
レングリコール）、Ｔｗｅｅｎ ２０（ポリオキシエチ
レンソルビタンモノラウレート）またはＴｒｉｔｏｎＸ
−１００（オクチルフェノールポリエチレングルコール
エーテル）が好適に使用される。これらの界面活性剤は
０．１％から１％の濃度で使用される。アポトーシス細
胞の該界面活性剤とのインキュベーションは室温、また
は４℃で１０分から３０分間行う。このようにして得ら
れた溶解液は、不溶性成分（細胞核、例えば遠心分離に
よって）を分離後、抗ヒストン抗体、ならびに抗ＤＮＡ
抗体とインキュベートする。本工程においては、抗ヒス
トン抗体または抗ＤＮＡ抗体のいずれかを固相に結合さ
せる。この結合は、該抗体と細胞質溶解液とのインキュ
ベーションの前か後のいずれかで当業者に知られた方
法、例えば固相への直接吸着結合、ストレプトアビジン
で被覆した固相へのビオチニル化抗体の結合、あるいは
抗ヒストン抗体または抗ＤＮＡ抗体に対する、適切な方
法にて固定化された抗体への結合によって行う。ヌクレ
オソームのヒストンＨ２Ａ，Ｈ２Ｂ，Ｈ３および／また
はＨ４のひとつと反応する抗体であればいずれも抗ヒス
トン抗体として使用できる。ＤＮＡに結合するいかなる
抗体も抗ＤＮＡ抗体として使用できる。そのような抗体
は、例えばAndre-Schwartzら, Clin. Immunol. Immunop
athol.31 (1984), 261 あるいはEiat, Immunol. Today
6 (1985), 123に記載されている。抗ヒストン抗体、な
らびに抗ＤＮＡ抗体は、完全なイムノグロブリンとし
て、またはＦａｂあるいはＦ（ａｂ’）2 断片のような
イムノグロブリンの機能的断片として使用することがで
きる。
放出させるために、試験細胞群を非イオン性界面活性剤
で処理する。そのような界面活性剤は当業者に知られて
いるものである。ＮＰ−４０（エチルフェニルポリエチ
レングリコール）、Ｔｗｅｅｎ ２０（ポリオキシエチ
レンソルビタンモノラウレート）またはＴｒｉｔｏｎＸ
−１００（オクチルフェノールポリエチレングルコール
エーテル）が好適に使用される。これらの界面活性剤は
０．１％から１％の濃度で使用される。アポトーシス細
胞の該界面活性剤とのインキュベーションは室温、また
は４℃で１０分から３０分間行う。このようにして得ら
れた溶解液は、不溶性成分（細胞核、例えば遠心分離に
よって）を分離後、抗ヒストン抗体、ならびに抗ＤＮＡ
抗体とインキュベートする。本工程においては、抗ヒス
トン抗体または抗ＤＮＡ抗体のいずれかを固相に結合さ
せる。この結合は、該抗体と細胞質溶解液とのインキュ
ベーションの前か後のいずれかで当業者に知られた方
法、例えば固相への直接吸着結合、ストレプトアビジン
で被覆した固相へのビオチニル化抗体の結合、あるいは
抗ヒストン抗体または抗ＤＮＡ抗体に対する、適切な方
法にて固定化された抗体への結合によって行う。ヌクレ
オソームのヒストンＨ２Ａ，Ｈ２Ｂ，Ｈ３および／また
はＨ４のひとつと反応する抗体であればいずれも抗ヒス
トン抗体として使用できる。ＤＮＡに結合するいかなる
抗体も抗ＤＮＡ抗体として使用できる。そのような抗体
は、例えばAndre-Schwartzら, Clin. Immunol. Immunop
athol.31 (1984), 261 あるいはEiat, Immunol. Today
6 (1985), 123に記載されている。抗ヒストン抗体、な
らびに抗ＤＮＡ抗体は、完全なイムノグロブリンとし
て、またはＦａｂあるいはＦ（ａｂ’）2 断片のような
イムノグロブリンの機能的断片として使用することがで
きる。
【０００９】固定化に使用されない第２の抗体は標識化
に使用される。そのために、この抗体はそれ自体が標識
されるか、あるいは抗ＤＮＡ抗体または抗ヒストン抗体
に対する別の標識抗体を添加して標識化することができ
る。本件における標識化は当業者によりよく知られた方
法により、例えば、酵素、蛍光、化学発光染料により行
うことができる。液相からの固相の分離後の該固相に結
合している標識が、試験細胞群におけるアポトーシスを
示す直接的な指標となる。各々の場合において、アポト
ーシスが全く誘導されない試験細胞群のパラレル培養を
負のコントロールとして使用する。このパラレル培養で
測定された固相に結合した標識は測定用のブランク値を
与える。このブランク値より再現可能に少なくとも２倍
量となる固相に結合した標識の測定値は、アポトーシス
の存在について正であると評価される。使用される細胞
の経歴ならびに培養条件に基づいてアポトーシスは何ら
誘導されないと考えられる、同じ細胞型で同じ起源の細
胞培養物は、アポトーシスが誘導されない試験細胞群の
パラレル培養として使用される。インビトロで誘導され
るアポトーシスを測定することを意図するならば、試験
細胞群を二つのパラレルな調製物に分け、アポトーシス
誘導剤〔例えば、キャンプトセシン(camptothecin)〕の
存在下、あるいは不存在下で培養する。
に使用される。そのために、この抗体はそれ自体が標識
されるか、あるいは抗ＤＮＡ抗体または抗ヒストン抗体
に対する別の標識抗体を添加して標識化することができ
る。本件における標識化は当業者によりよく知られた方
法により、例えば、酵素、蛍光、化学発光染料により行
うことができる。液相からの固相の分離後の該固相に結
合している標識が、試験細胞群におけるアポトーシスを
示す直接的な指標となる。各々の場合において、アポト
ーシスが全く誘導されない試験細胞群のパラレル培養を
負のコントロールとして使用する。このパラレル培養で
測定された固相に結合した標識は測定用のブランク値を
与える。このブランク値より再現可能に少なくとも２倍
量となる固相に結合した標識の測定値は、アポトーシス
の存在について正であると評価される。使用される細胞
の経歴ならびに培養条件に基づいてアポトーシスは何ら
誘導されないと考えられる、同じ細胞型で同じ起源の細
胞培養物は、アポトーシスが誘導されない試験細胞群の
パラレル培養として使用される。インビトロで誘導され
るアポトーシスを測定することを意図するならば、試験
細胞群を二つのパラレルな調製物に分け、アポトーシス
誘導剤〔例えば、キャンプトセシン(camptothecin)〕の
存在下、あるいは不存在下で培養する。
【００１０】本発明による方法の好ましい態様において
は、固定化に使用される抗体は固相にそれを結合させる
ためにビオチニル化され、かつストレプトアビジンで被
覆された固相が使用される。
は、固定化に使用される抗体は固相にそれを結合させる
ためにビオチニル化され、かつストレプトアビジンで被
覆された固相が使用される。
【００１１】本発明の方法を利用すれば、アポトーシス
を誘導する細胞あるいは化合物の細胞障害を簡便な方法
で測定することが可能である。
を誘導する細胞あるいは化合物の細胞障害を簡便な方法
で測定することが可能である。
【００１２】本発明は、さらに細胞障害性細胞、ナチュ
ラルキラー細胞、イオン化放射線、または例えばモノク
ローナル抗体、ホルモン（例えばグルココルチコイ
ド）、または毒素（例えばダイオキシン）のような化学
物質の細胞障害作用または細胞障害活性の測定への本発
明方法の使用に関する。本件における細胞障害作用また
は細胞障害活性は、標的細胞として使用される細胞群に
おいて本発明方法によって測定されるアポトーシスの程
度で与えられる。
ラルキラー細胞、イオン化放射線、または例えばモノク
ローナル抗体、ホルモン（例えばグルココルチコイ
ド）、または毒素（例えばダイオキシン）のような化学
物質の細胞障害作用または細胞障害活性の測定への本発
明方法の使用に関する。本件における細胞障害作用また
は細胞障害活性は、標的細胞として使用される細胞群に
おいて本発明方法によって測定されるアポトーシスの程
度で与えられる。
【００１３】本発明はまた、抗ヒストン抗体、ならびに
抗ＤＮＡ抗体を含むプログラム細胞死または誘導細胞死
の検出用試薬キットに関する。本件において、二つの抗
体の一方は好ましくは標識化した形態で存在する。しか
しながら、これとは別に、該キットは、抗ヒストン抗体
または抗ＤＮＡ抗体に対する別の標識抗体をさらに含む
こともできる。
抗ＤＮＡ抗体を含むプログラム細胞死または誘導細胞死
の検出用試薬キットに関する。本件において、二つの抗
体の一方は好ましくは標識化した形態で存在する。しか
しながら、これとは別に、該キットは、抗ヒストン抗体
または抗ＤＮＡ抗体に対する別の標識抗体をさらに含む
こともできる。
【００１４】本発明の好ましい態様は、最終的には二つ
の抗体の一方が固相への結合のためにビオチニル化形態
で存在し、かつストレプトアビジンで被覆した固相をさ
らに含む本発明による試薬キットである。
の抗体の一方が固相への結合のためにビオチニル化形態
で存在し、かつストレプトアビジンで被覆した固相をさ
らに含む本発明による試薬キットである。
【００１５】
【実施例】本発明を以下の実施例によりさらに説明す
る。
る。
【００１６】〔実施例１〕 アポトーシス細胞の検出 １．アポトーシスの誘導 指数的成長期にあるヒト前骨髄様白血球細胞株ＨＬ６０
（ＡＴＣＣ ＣＣＬ２４０）の細胞を培養培地で１ｍｌ
あたり１０5 細胞の細胞濃度に調整し、その５００μｌ
をトポイソメラーゼＩインヒビターキャンプトセシン溶
液（０−４μｇキャンプトセシン／ｍｌ培養培地、その
際０μｇ／ｍｌ値を負のコントロールとする）５００μ
ｌと各ケースについて３７℃で５％ＣＯ2 存在下、４時
間培養した。
（ＡＴＣＣ ＣＣＬ２４０）の細胞を培養培地で１ｍｌ
あたり１０5 細胞の細胞濃度に調整し、その５００μｌ
をトポイソメラーゼＩインヒビターキャンプトセシン溶
液（０−４μｇキャンプトセシン／ｍｌ培養培地、その
際０μｇ／ｍｌ値を負のコントロールとする）５００μ
ｌと各ケースについて３７℃で５％ＣＯ2 存在下、４時
間培養した。
【００１７】２．試料の調製 インキュベーション後、細胞を２００ｇで５分間遠心分
離し、上清を吸引し、細胞ペレットを培養培地１ｍｌに
再懸濁した。同条件下で再び遠心分離し、細胞ペレット
を５００μｌのインキュベーションバッファー（下記参
照）に再懸濁し、よく混合し、４℃で約３０分間インキ
ュベートした。この様にして得られた溶解液を２０，０
００ｇで１０分間遠心分離し、上清（細胞質画分）の４
００μｌをペレット（高分子量の細胞核、非断片化ＤＮ
Ａ）を攪拌することなく、注意深く除去した。この様に
して得られた上清を次のイムノアッセイに供するために
インキュベーションバッファーにて１：１０に前もって
希釈した。
離し、上清を吸引し、細胞ペレットを培養培地１ｍｌに
再懸濁した。同条件下で再び遠心分離し、細胞ペレット
を５００μｌのインキュベーションバッファー（下記参
照）に再懸濁し、よく混合し、４℃で約３０分間インキ
ュベートした。この様にして得られた溶解液を２０，０
００ｇで１０分間遠心分離し、上清（細胞質画分）の４
００μｌをペレット（高分子量の細胞核、非断片化ＤＮ
Ａ）を攪拌することなく、注意深く除去した。この様に
して得られた上清を次のイムノアッセイに供するために
インキュベーションバッファーにて１：１０に前もって
希釈した。
【００１８】インキュベーションバッファー：０．２％
Ｔｗｅｅｎ２０、１％ウシ血清アルブミン、および５ｍ
ｍｏｌ／ｌＥＤＴＡを含むＰＢＳ，ｐＨ７．４；ＰＢＳ
＝１３７ｍｍｏｌ／ｌＮａＣｌ，２．７ｍｍｏｌ／ｌ
ＫＣｌ，８ｍｍｏｌ／ｌ Ｎａ2 ＨＰＯ4 および１．５
ｍｍｏｌ／ｌＫＨ2 ＰＯ 4
Ｔｗｅｅｎ２０、１％ウシ血清アルブミン、および５ｍ
ｍｏｌ／ｌＥＤＴＡを含むＰＢＳ，ｐＨ７．４；ＰＢＳ
＝１３７ｍｍｏｌ／ｌＮａＣｌ，２．７ｍｍｏｌ／ｌ
ＫＣｌ，８ｍｍｏｌ／ｌ Ｎａ2 ＨＰＯ4 および１．５
ｍｍｏｌ／ｌＫＨ2 ＰＯ 4
【００１９】３．イムノアッセイ 抗ヒストン抗体をマイクロタイタープレートに結合させ
るために、１００μｌの被覆溶液（Ｎａ2 ＨＣＯ 3／Ｎ
ａＨ 2ＣＯ3 ５０ｍｍｏｌ／ｌ，ｐＨ９．６）をマイク
ロタイタープレートの各ウェルに分注し、室温にて１時
間インキュベートした。続いて、被覆溶液を注意深く吸
引し、２００μｌのインキュベーションバッファーを再
被覆のためにマイクロタイタープレートの各ウェルに分
注し、室温で３０分間インキュベートし、液相を注意深
く吸引により除去した。続いて、各ウェルを１回あたり
２５０−３００μｌの洗浄液〔ＰＢＳ（セクション２参
照）＋０．１％Ｔｗｅｅｎ２０〕にて３回洗浄した。マ
イクロタイタープレートのウェル当たり１００μｌの試
料溶液（セクション２参照）を添加後、室温にて９０分
間インキュベートし、それから上記と同様にして３回洗
浄した。試料溶液から、アポトーシスで死んだ結合ＤＮ
Ａ断片を検出するために、１００μｌのパーオキシダー
ゼ−標識抗ＤＮＡ抗体（ベーリンガーマンハイム Ｇｍ
ｂＨ，Ｎｏ．１５２５７５１）を添加し、室温にて９０
分間インキュベートし、再び上記と同様にして３回洗浄
した。続いてパーオキシダーゼ反応用に１００μｌのＡ
ＢＴＳ（登録商標）基質溶液（ベーリンガーマンハイム
ＧｍｂＨ，カタログＮｏ．７５６４０７および１２０
４５３０）を添加し、発色によりブランク値としての基
質溶液に対し４０５ｎｍにおいて測光評価できるように
なるまで、プレートシェーカー上で混合した（１０−２
０分間）。セクション１で述べたコントロール（アポト
ーシスの誘導がない生細胞）の吸光度値に対する試料溶
液の吸光度値の比は、試験細胞群におけるアポトーシス
細胞部分の指標となる濃度係数を与える。
るために、１００μｌの被覆溶液（Ｎａ2 ＨＣＯ 3／Ｎ
ａＨ 2ＣＯ3 ５０ｍｍｏｌ／ｌ，ｐＨ９．６）をマイク
ロタイタープレートの各ウェルに分注し、室温にて１時
間インキュベートした。続いて、被覆溶液を注意深く吸
引し、２００μｌのインキュベーションバッファーを再
被覆のためにマイクロタイタープレートの各ウェルに分
注し、室温で３０分間インキュベートし、液相を注意深
く吸引により除去した。続いて、各ウェルを１回あたり
２５０−３００μｌの洗浄液〔ＰＢＳ（セクション２参
照）＋０．１％Ｔｗｅｅｎ２０〕にて３回洗浄した。マ
イクロタイタープレートのウェル当たり１００μｌの試
料溶液（セクション２参照）を添加後、室温にて９０分
間インキュベートし、それから上記と同様にして３回洗
浄した。試料溶液から、アポトーシスで死んだ結合ＤＮ
Ａ断片を検出するために、１００μｌのパーオキシダー
ゼ−標識抗ＤＮＡ抗体（ベーリンガーマンハイム Ｇｍ
ｂＨ，Ｎｏ．１５２５７５１）を添加し、室温にて９０
分間インキュベートし、再び上記と同様にして３回洗浄
した。続いてパーオキシダーゼ反応用に１００μｌのＡ
ＢＴＳ（登録商標）基質溶液（ベーリンガーマンハイム
ＧｍｂＨ，カタログＮｏ．７５６４０７および１２０
４５３０）を添加し、発色によりブランク値としての基
質溶液に対し４０５ｎｍにおいて測光評価できるように
なるまで、プレートシェーカー上で混合した（１０−２
０分間）。セクション１で述べたコントロール（アポト
ーシスの誘導がない生細胞）の吸光度値に対する試料溶
液の吸光度値の比は、試験細胞群におけるアポトーシス
細胞部分の指標となる濃度係数を与える。
【手続補正書】
【提出日】平成６年５月３１日
【手続補正２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】特許請求の範囲
【補正方法】変更
【補正内容】
【特許請求の範囲】
Claims (5)
- 【請求項１】 プログラム細胞死または誘導細胞死の検
出方法であって、(a) 非イオン性界面活性剤で処理して
得られた試験細胞の溶解液を抗ヒストン抗体および抗Ｄ
ＮＡ抗体とインキュベートし、ここで一方の抗体はイン
キュベーションの前または後に固相に結合されており、
他方の抗体は標識抗体であり、(b) 該固相と液相を分離
し、そして(c) 該標識をプログラム細胞死または誘導細
胞死の指標として該二相のうちの一方において測定する
ことからなる方法。 - 【請求項２】 固定化される抗体が固相への結合のため
にビオチニル化されており、かつストレプトアビジンで
被覆された固相を使用する、請求項１記載の方法。 - 【請求項３】 細胞障害性細胞、ナチュラルキラー細
胞、イオン化放射線、または特に抗体、ダイオキシンま
たはキャンプトセシン(camptothecin)の如き化合物の細
胞障害作用または細胞障害活性を測定するための、請求
項１または２に記載の方法の使用。 - 【請求項４】 抗ヒストン抗体、ならびに抗ＤＮＡ抗体
を含む、プログラム細胞死または誘導細胞死の検出用試
薬キット。 - 【請求項５】 抗体の一方が、固相への結合のためにビ
オチニル化形態で存在し、かつストレプトアビジンで被
覆された固相をさらに含む、請求項４記載のキット。
Applications Claiming Priority (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| DE4318402A DE4318402A1 (de) | 1993-06-03 | 1993-06-03 | Verfahren zum Nachweis eines programmierten oder induzierten Zelltods eukaryontischer Zeller |
| DE4318402:2 | 1993-06-03 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH0712812A true JPH0712812A (ja) | 1995-01-17 |
| JP2513990B2 JP2513990B2 (ja) | 1996-07-10 |
Family
ID=6489511
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP6118056A Expired - Lifetime JP2513990B2 (ja) | 1993-06-03 | 1994-05-31 | 真核細胞のプログラム細胞死または誘導細胞死の検出方法 |
Country Status (5)
| Country | Link |
|---|---|
| US (1) | US5637465A (ja) |
| EP (1) | EP0628818B1 (ja) |
| JP (1) | JP2513990B2 (ja) |
| AT (1) | ATE183586T1 (ja) |
| DE (2) | DE4318402A1 (ja) |
Cited By (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US9105141B2 (en) | 2008-07-28 | 2015-08-11 | Universal Entertainment Corporation | Game system |
| JP2022525670A (ja) * | 2019-03-18 | 2022-05-18 | アンセルム（アンスティチュ ナシオナル ドゥ ラ サンテ エ ドゥ ラ ルシェルシュ メディカル） | 細胞死を検出するための超高感度方法 |
Families Citing this family (15)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| DE4319506A1 (de) * | 1993-06-12 | 1994-12-15 | Boehringer Mannheim Gmbh | Verfahren zum Nachweis metabolisch markierter DNA |
| FR2736642B1 (fr) * | 1995-07-10 | 1997-09-12 | Pasteur Institut | Immunovecteurs, notamment anticorps et fragments d'anticorps utilisables pour le transport intracellulaire et intranucleaire de principes biologiquement actifs notamment d'haptenes, de proteines et d'acides nucleiques |
| US6727071B1 (en) * | 1997-02-27 | 2004-04-27 | Cellomics, Inc. | System for cell-based screening |
| US5858694A (en) * | 1997-05-30 | 1999-01-12 | Cell Pathways, Inc. | Method for identifying compounds for inhibition of cancerous lesions |
| US6270980B1 (en) * | 1997-06-05 | 2001-08-07 | Idun Pharmaceuticals, Inc. | Rapid methods for identifying modifiers of cellular apoptosis activity |
| US7229772B1 (en) | 1998-03-18 | 2007-06-12 | Roche Diagnostics Gmbh | Detection of apoptotic products |
| ATE329264T1 (de) | 1998-03-18 | 2006-06-15 | Roche Diagnostics Gmbh | Nachweis von produkten von apoptosis |
| US6362317B1 (en) * | 1999-07-12 | 2002-03-26 | The United States Of America As Represented By The Department Of Health And Human Services | Anti-γ-H2A antibody, fusion proteins thereof and method and kit for determining DNA double-stranded breaks |
| EP1118334A1 (en) * | 2000-01-11 | 2001-07-25 | Aventis Behring Gesellschaft mit beschränkter Haftung | Method for the production of conjugates and uses thereof for the prevention and treatment of allergic reactions and autoimmune diseases |
| JP2005506973A (ja) * | 2001-08-03 | 2005-03-10 | ユニバーシティ オブ バージニア パテント ファウンデーション | アポトーシスのマーカーとしてのリン酸化ヒストンｈ２ｂ |
| EP1501869A4 (en) * | 2001-08-03 | 2006-01-11 | Univ Virginia | HISTONE H2B PHOSPHORYLEE AS A MARKER FOR APOPTOSIS |
| GB0425324D0 (en) * | 2004-11-17 | 2004-12-22 | Univ Edinburgh | Assay method |
| ATE517118T1 (de) | 2007-04-05 | 2011-08-15 | Symbiotec Gmbh | Bis-met-histone |
| EP2775304A1 (en) * | 2013-03-07 | 2014-09-10 | Universitätsspital Basel | Methods for detecting inflammatory disorder |
| CN103484450A (zh) * | 2013-09-24 | 2014-01-01 | 张根 | 一种改进的凋亡DNA ladder提取试剂盒 |
Family Cites Families (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US4496654A (en) * | 1983-04-08 | 1985-01-29 | Quidel | Detection of HCG with solid phase support having avidin coating |
| JPS61280282A (ja) * | 1985-06-05 | 1986-12-10 | Teruhiko Beppu | 組換えベクタ−及びその含有微生物 |
-
1993
- 1993-06-03 DE DE4318402A patent/DE4318402A1/de not_active Withdrawn
-
1994
- 1994-05-18 US US08/245,583 patent/US5637465A/en not_active Expired - Lifetime
- 1994-05-27 EP EP94108184A patent/EP0628818B1/de not_active Expired - Lifetime
- 1994-05-27 AT AT94108184T patent/ATE183586T1/de active
- 1994-05-27 DE DE59408631T patent/DE59408631D1/de not_active Expired - Lifetime
- 1994-05-31 JP JP6118056A patent/JP2513990B2/ja not_active Expired - Lifetime
Cited By (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US9105141B2 (en) | 2008-07-28 | 2015-08-11 | Universal Entertainment Corporation | Game system |
| JP2022525670A (ja) * | 2019-03-18 | 2022-05-18 | アンセルム（アンスティチュ ナシオナル ドゥ ラ サンテ エ ドゥ ラ ルシェルシュ メディカル） | 細胞死を検出するための超高感度方法 |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| US5637465A (en) | 1997-06-10 |
| JP2513990B2 (ja) | 1996-07-10 |
| DE59408631D1 (de) | 1999-09-23 |
| EP0628818B1 (de) | 1999-08-18 |
| EP0628818A1 (de) | 1994-12-14 |
| ATE183586T1 (de) | 1999-09-15 |
| DE4318402A1 (de) | 1994-12-08 |
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