JPH07135992A - α−インターフェロンの調製方法 - Google Patents

α−インターフェロンの調製方法

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JPH07135992A
JPH07135992A JP6111150A JP11115094A JPH07135992A JP H07135992 A JPH07135992 A JP H07135992A JP 6111150 A JP6111150 A JP 6111150A JP 11115094 A JP11115094 A JP 11115094A JP H07135992 A JPH07135992 A JP H07135992A
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ハウプトマン ルドルフ
Edgar Falkner
ファルクナー エドガー
Gerhard Bodo
ボードー ゲルハルト
Tilman Voss
フォス ティルマン
Ingrid Maurer-Fogy
マウレル フォギー イングリット
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Boehringer Ingelheim International GmbH
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Abstract

(57)【要約】 【構成】 大腸菌中で発現することによるインターフェ
ロン−αの調製方法であって、 ａ）インターフェロン−αを、大腸菌由来の熱安定性エ
ンテロトキシンII（ＳＴＩＩ）遺伝子のシグナル配列が
成熟ヒトインターフェロン−αをコードする配列に連結
されているベクターを含む細胞内で発現し、 ｂ）その発現されたインターフェロン−αを単離する、
ことを特徴とする上記方法。 【効果】 上記方法により、高純度インターフェロン−
αが経済的に効率良く得られる。

Description

【発明の詳細な説明】
【０００１】
【産業上の利用分野】本発明は、細菌発現して引き続き
単離することによるインターフェロン−α（ＩＦＮα）
の調製方法、そのための発現ベクター及びＩＦＮαの精
製方法に関する。
【０００２】
【従来の技術】ＩＦＮαの細菌発現による調製方法は既
知である。従来の方法は大腸菌 (Escherichia coli) に
おけるタンパク質の細胞質発現に基づくものであり、発
現されたＩＦＮαは細胞内にいわゆる封入体の不溶性形
態として存在するかあるいは細胞壁を開いた後の可溶性
画分中に見られる(Thatcher et Panayotatos,1986; Goe
ddel等,1980; Dworkin-Rastl等,1983)。しかしながら細
胞質発現にはいくつかの欠点がある。合成されたタンパ
ク質が正しく折りたたまれず、細胞質内では還元条件が
優勢であるために必要なジスルフィド架橋を含んでいな
い。従って、形成されたＩＦＮαは調製中に酸化されか
つ再び折りたたまれねばならない。この方法は効率が悪
くかつ望ましくない副生成物を生じ（完全に又は部分的
に還元された形態、分子間ジスルフィド架橋ビルディン
グによって産生されたオリゴマー、偽ジスルフィド架橋
の形成によって間違って折りたたまれた形態）、分離が
困難である。更に、翻訳を開始するＮ−末端メチオニン
が細胞内で合成されたＩＦＮαから部分的にしか切断さ
れないことも１つの課題である。得られたＮ−Ｍｅｔ−
ＩＦＮαはたいてい未変性ＩＦＮαから取り出すことが
不可能である。
【０００３】更に、現在用いられている方法の欠点は、
非誘導状態で完全にスイッチが切れず、化学薬剤の添加
によって誘導しなければならず、誘導状態で発現速度が
不十分なプロモーター、例えば、セラチアマルセッセン
ス (Serratia marcescens)由来のｔｒｐプロモーターを
使用していることである。上記欠点を克服しかつそれで
も経済的な大腸菌系を使用するために、 Breitling等は
細胞膜を通り抜けて周辺腔にインターフェロンを分泌す
ることを可能にするベクターを用いてＩＦＮα及びＩＦ
Ｎα１／２ハイブリッドを発現することを試みた(Breit
ling等,1989)。彼らは、プロモーター、リボソーム結合
部位（ＲＢＳ）及びスタフィロキナーゼ細菌遺伝子（ｓ
ａｋ４２Ｄ）由来のシグナル配列を使用した。このよう
にして産生されたＩＦＮαは、６０−８０％が周辺腔に
分泌された。しかしながら、タンパク質は、ベクター構
築の結果として対応する未変性ＩＦＮαには存在しない
Ｎ−末端アミノ酸を含有した。この発現系の重大な欠点
は、この構築物で形質転換された菌株が遺伝的に安定な
ままでないという事実であり、発現カセットがＩＳ１配
列の自然挿入によって不活性化された。即ち、ヒトＩＦ
Ｎαを調製するために大腸菌中での発現／分泌系を提供
する目的は、従来の技術では達成されていない。
【０００４】大腸菌中でヒト成長因子レセプターの発現
に成功した既知の発現／分泌カセットは、アルカリ性ホ
スファターゼ（ｐｈｏＡ）と熱安定性エンテロトキシン
II（ＳＴＩＩ）のプロモーターからの構築物であった(F
uh等,1990)。組換え体ＩＦＮαの大腸菌中での生産にお
けるもう１つの課題は、タンパク質を細菌溶菌液から精
製することである。多くの方法が既知である(Thatcher
et Panayotatos, 1986; 欧州特許出願第 203 382号）。
タンパク質の固有の折りたたみを得るために、変性及び
沈降段階を必要としない方法を使用することが好まし
い。そのような方法は欧州特許出願第 396 555号に記載
されており、イムノアフィニティークロマトグラフィ
ー、逆相クロマトグラフィー（ＲＰＣ）、陽イオン交換
クロマトグラフィー、限外ろ過による濃縮及びゲルろ過
クロマトグラフィーから構成される。この方法は、他の
既知の方法と同様に、第１段階においてはイムノアフィ
ニティークロマトグラフィーの高い選択性に基づいてい
る。変性／沈降段階とイムノアフィニティークロマトグ
ラフィーとを要しない高度に精製されたＩＦＮα、特に
ＩＦＮα２の調製方法は知られていない。同時に、この
種の方法が経済的及び技術的理由で求められている。イ
ムノアフィニティークロマトグラフィーの場合、モノク
ローナル抗体を必要とするためにコストが高く、同時に
抗体結合マトリックスの寿命が制限されるので、これら
の抗体の連続的供給が必要である。
【０００５】
【発明が解決しようとする課題】本発明の目的は、大腸
菌中で組換え発現することによりインターフェロン−
α、特にインターフェロン−α２を調製するための経済
的で効率の良い方法を提供することである。同時に、タ
ンパク質を周辺腔又は培養液に発現／分泌するための効
率の良い安定な系を確立する課題を解決することを求め
たものである。更に、発現されたタンパク質を穏やか
に、変性／沈降段階なしでイムノアフィニティークロマ
トグラフィーを必要とせずに高度に精製する方法を開発
することを求めたものである。
【０００６】
【課題を解決するための手段】これらの課題は、本発明
によって解決された。大腸菌中でＩＦＮαの安定な発現
／分泌系が成熟ヒトインターフェロン−α、好ましくは
インターフェロン−α２のコード配列に連結された大腸
菌由来の熱安定性エンテロトキシンII（ＳＴＩＩ）のシ
グナル配列（リーダー配列）を含むベクターを構築する
ことにより確立された。発現調節は大腸菌由来のアルカ
リ性ホスファターゼ（ｐｈｏＡ）のプロモーターによっ
て行われる。更に、ＳＴＩＩ遺伝子のリボソーム結合部
位を組込むことが有利であることがわかった。更に、シ
リカゲルによる吸着クロマトグラフィー、疎水性相互作
用クロマトグラフィー（ＨＩＣ）、陽イオン交換クロマ
トグラフィー及び陰イオン交換クロマトグラフィーの段
階からなるインターフェロン−αの精製方法を提供する
ことにより、驚くべき進歩が達成された。即ち、本発明
の１態様は、ＳＴＩＩシグナル配列がＩＦＮα遺伝子に
連結されている発現ベクターを含む形質転換細菌細胞を
用いて細菌発現し、その発現されたＩＦＮαを単離する
ことによりＩＦＮαを調製する方法に関する。もう１つ
の態様によれば、ＳＴＩＩ遺伝子のシグナル配列とＩＦ
Ｎα遺伝子からの構築物を含むＩＦＮαの調製のための
細菌発現ベクター及びＩＦＮαを調製するためのそのベ
クターの使用に関する。第３態様によれば、本発明は、
シリカゲルによる吸着クロマトグラフィー、疎水性相互
作用クロマトグラフィー、陽イオン及び陰イオン交換ク
ロマトグラフィーのクロマトグラフィー段階によるＩＦ
Ｎαの調製方法に関する。
【０００７】ベクター構築の出発点は、この目的に非常
に適切な大腸菌、例えば、プラスミドｐＡＴ１５３(Twi
gg等, 1980) 中で複製できるプラスミドである。ＳＴＩ
Ｉ遺伝子のシグナルペプチドをコードするヌクレオチド
配列は当該技術において既知である (Picken等, 1983；
Lee等, 1983) 。当業者は、この配列の変異型を突然変
異（置換、欠失、挿入、付加）によってその基本的な特
性を変えずに調製することができ、特に遺伝子コードの
変性により同じアミノ酸配列のシグナルペプチドをコー
ドするヌクレオチド配列を調製することができる (Samb
rook等, 1989,特に15章）。ＩＦＮαファミリーの配列
をコードする全配列が既知であり (Mantei等,1980; Str
euli等,1980; Goeddel等,1981)、それらをコードする遺
伝子の相同性は７０％を超える。これらの配列の他の変
異型は、天然に見られるか又は既知の配列から当該技術
において既知の方法、例えば、突然変異誘発によって調
製される (Sambrook等, 1989, 特に15章）。従って、本
発明による "ＩＦＮα" は、既知の配列の他に、その遺
伝子が既知の配列との高い相同度を特徴としかつ生物学
的に活性なＩＦＮαをコードする変異型を包含する。Ｉ
ＦＮα２ｃをコードする配列が特に好ましい(Dworkin-R
astl等, 1983; Bodo, Fogy, 1985) 。
【０００８】発現を調節するｐｈｏＡプロモーターを使
用することが特に好ましく、ＳＴＩＩ遺伝子のリボソー
ム結合部位を組込むことも有利である。ｐｈｏＡプロモ
ーターの配列(Chang等, 1986; Shuttleworth等, 1981)
及びＳＴＩＩリボソーム結合部位 (Picken等,1983; Lee
等,1983)は既知であり、当業者はこれらの配列から等価
な変異型を容易に生産することもできる。ベクターの構
築、適切な大腸菌株の形質転換、発酵及び抽出は本来既
知の方法を用いて行われる (Sambrook等, 1989）。例え
ば、大腸菌株Ｗ３１１０（大腸菌Ｋ１２野性型ｆ- , λ
- ,IＮ（ｒｒｎＤ−ｒｒｎＥ)1) は発現に非常に適して
いる。予備培養物はＬＢ培養液中で巧く産生され、主要
な培養物は、ＯＤ546 ２５０〜２８０まで酸素及び栄養
素の供給をモニターしつつ製造される。適切な抽出法
は、酸不活性化バイオマスを希酢酸にホモジェナイザー
によって懸濁し、ポリエチレンアミンを好ましくは0.２
５％(w/v) の濃度で加え、この混合液をアルカリ性ｐ
Ｈ、好ましくはｐＨ１０に調整し、この混合液を攪拌
し、次いで遠心により細菌を除去することを含んでい
る。精製は本来既知の方法を用いて行われる(Thatcher
et Panayotatos, 1986; 欧州特許出願第 203 382号）。
【０００９】しかしながら、４段階のクロマトグラフィ
ー、即ち、シリカゲルによる吸着クロマトグラフィー、
疎水性相互作用クロマトグラフィー、陽イオン及び陰イ
オン交換クロマトグラフィーを用いた精製方法が特に有
利である。Grace によって製造された９５３Ｗ型ゲルは
シリカクロマトグラフィーのゲル層として非常に適切で
あり、５００−１５００mMの塩化テトラメチルアンモニ
ウム（ＴＭＡＣ）、好ましくは８００mMのＴＭＡＣバッ
ファーを溶離液として用いることが有利であった。疎水
性相互作用クロマトグラフィーの場合、フェニルセファ
ロースがゲル床として良好であった。試料を２０％硫酸
アンモニウムの存在下に加えることが好ましく、カラム
を３０％硫酸アンモニウムを含有するバッファーで平衡
化した。最終濃度が３０％エチレングリコールの直線勾
配を用いてＩＦＮαを溶離した。陽イオン交換クロマト
グラフィーはスルホプロピルイオン交換樹脂を用いて巧
く行われた。試料をｐＨ３〜５、好ましくはｐＨ３で加
え、カラムをｐＨ５まで平衡化した。１０％エチレング
リコールを加えた共通の塩の直線勾配を用いてＩＦＮα
が巧く溶離された。陰イオン交換クロマトグラフィーに
用いられるゲル床はＤＥＡＥ−セファロースからなるこ
とが有利であり、ｐＨ5.５〜6.０、好ましくはｐＨ5.８
において使用及び溶離された。１種以上のゲル材料を発
明の作用のない同様の分離原理に基づく等価な材料と置
き換え、このようにして本発明による方法と等価な方法
を行うことは、当業者の技術的能力範囲内である。
【００１０】驚くべきことに、ＳＴＩＩシグナル配列を
ＩＦＮα遺伝子に連結することにより、前記ｓａｋ４２
Ｄリーダー／ＩＦＮα組合わせでは可能ではなかった安
定な発現／分泌系を確立することが可能であった。この
配列をｐｈｏＡプロモーターの調節によって発現するこ
とが特に有効であった。これに関して、更にＳＴＩＩ遺
伝子のリボソーム結合部位を組込むことが有利であっ
た。発現は培養液中のリン酸塩濃度をモニターすること
により確実に調節することができ（リン酸塩の不足はｐ
ｈｏＡプロモーターを活性化する）、不活性化状態では
検出できる基礎発現がない。活性化に化学薬剤を添加す
る必要がなく、活性化状態の発現速度が高い。合成され
たタンパク質は周辺腔に多量に分泌される。分泌された
タンパク質は正しく折りたたまれ、正しいＮ−末端及び
正しいジスルフィド架橋を含んでいる。大腸菌Ｗ３１１
０中での発現をＳＤＳゲル分析すると、３０−５０％の
合成ＩＦＮαが正しく反応されたことを示し、これは実
際には分泌されたタンパク質すべてに相当する。
【００１１】実施例３に記載された抽出方法を用いる
と、バイオマス中の検出できるすべてのＩＦＮα２ｃ２
9.３±5.９％を抽出することが可能であった。これは、
観測されたプロセシングレベル３０−５０％に相当し
た。バイオマスからの抽出液は、全タンパク質に対して
4.５±1.８％のＩＦＮα２ｃを含有した。シリカゲル吸
着クロマトグラフィーにより、平均純度１6.７±4.４％
のＩＦＮα２ｃがプールされた。収率９3.２±7.３％の
フェニルセファロースクロマトグラフィーでは、純度７
1.２±１5.５％でＩＦＮα２ｃが得られた。スルホプロ
ピルイオン交換クロマトグラフィーでは、収率７0.９±
１4.８％及び純度９7.６±4.６％であった。最終段階、
即ち、ＤＥＡＥイオン交換クロマトグラフィーでは後述
されるように、収率８6.９±9.２％で純度１００％のＩ
ＦＮα２ｃが得られた。６種類の精製で得られたデータ
を表１（収率）及び２（ＩＦＮα２ｃ含量）に示す。図
５〜８は、各精製段階の特徴的なクロマトグラムを示す
ものである。
【００１２】１kgのバイオマスから、３４０±１００mg
の精製ＩＦＮα２ｃが得られた。精製工程の収率は５6.
１±２2.２％である。バイオマスのＩＦＮα２ｃ含量に
対する全収率は１4.４％である。これらのデータを表３
に示す。図９は、最後のクロマトグラフィー段階で溶離
する精製ＩＦＮα２ｃの典型的なＳＤＳ−ＰＡＧＥを示
すものである。ＩＦＮα２ｃの１８ｋＤａバンドのみが
可視バンドである。混入バンドは見られない。図１０
は、典型的な逆相ＨＰＬＣクロマトグラムを示すもので
ある。精製ＩＦＮα２ｃは、２4.８分で均一ピークとし
て溶離する。この材料を均一なアセトニトリル勾配で溶
離すると（図１１）、２本の混入ピークが主ピークの両
側に見られた。全ＩＦＮα２ｃ含量の約1.８％を含むこ
れらの肩は、メチオニン１１１（第１肩）で酸化され又
はＮ−末端（第２肩）でアセチル化される形を示してい
る。
【００１３】
【表１】 表１：６種類のバイオマスの精製手順（ｐ１−ｐ６）に示された各精製段階後に 得られたＩＦＮα２の収率％ p1 p2 p3 p4 p5 p6 M sd ──────────────────────────────────── 抽出 37.9 24.0 34.3 30.7 29.1 20.0 29.3 5.9 シリカ 62.0 95.8 88.2 99.5 74.1 81.0 83.4 12.8 フェニル 100.0 82.2 85.9 100.0 100.0 91.0 93.2 7.3 スルホプロ 64.0 54.3 76.5 100.0 60.0 71.0 70.9 14.8 DEAE 95.0 100.0 83.5 88.2 84.0 71.0 86.9 9.2 ──────────────────────────────────── 最後の２欄は平均（Ｍ）及び標準偏差（ｓｄ）を示す。
【００１４】
【表２】 表２：各精製段階のＩＦＮα２含量 p1 p2 p3 p4 p5 p6 M sd ──────────────────────────────────── 抽出 8.0 2.1 4.1 4.7 3.6 4.4 4.5 1.8 シリカ 12.9 11.6 15.7 15.7 19.4 15.6 16.7 4.4 フェニル 76.6 43.3 62.9 62.9 80.0 93.5 71.2 15.5 スルホプロ 98.5 87.3 100.0 100.0 100.0 100.0 97.6 4.6 DEAE 100.0 100.0 100.0 100.0 100.0 100.0 100.0 0.0 ──────────────────────────────────── データは、表１のように、本精製段階で得られた全タン
パク質含量に対するＩＦＮα２含量の％として示されて
いる。
【００１５】
【表３】 表３：精製工程の全収率 p1 p2 p3 p4 p5 p6 M sd ──────────────────────────────────── バイオマス[g/kg] 1.4 1.0 1.1 1.5 1.1 1.8 1.3 0.2 プロセシング[%] 50 40 40 40 20 40 38.3 8.9 抽出[%] 37.9 24.0 34.3 30.7 29.1 20.0 29.3 4.7 精製[%] 39.7 42.7 57.9 90 44.5 52.3 56.1 22.2 全収量[mg] 538 206 366 480 280 258 340 120 全収率[%] 14.3 20.3 16.6 23.9 10.9 7.4 14.4 6.9 ────────────────────────────────────
【００１６】バイオマスのＩＦＮα２ｃ含量はＩＦＮα
２のｇ／バイオマスのkgとして示されている。プロセシ
ング及び抽出はＩＦＮα２の全含量％として示されてい
る。精製の収量は抽出液のＩＦＮα２含量に相対するＩ
ＦＮα２ｃの％として示されている。全収量はバイオマ
ス１kgに対して得られたＩＦＮα２のmg及び抽出液のＩ
ＦＮα２ｃに対する精製ＩＦＮα２ｃの％として示され
ている。
【００１７】図面の説明 図１： ｐｃＦ２の遺伝子地図である。ｐＡＴ１５３の
ＥｃｏＲＩ−ＢａｍＨＩフラグメントをＩＦＮ−ω１の
発現カセットに置き換えた。 図２： ｐｈｏＡプロモーターを含むＥｃｏＲＩ（破壊
されている）−ＢａｍＨＩ部分、ＳＴＩＩリーダー＋Ｉ
ＦＮω１遺伝子の配列である。 図３： プラスミドｐＤＨ１３の遺伝子地図である。ｐ
ＡＴ１５３のＳｓｐＩ−ＰｓｔＩフラグメントをＩＦＮ
α２ｃ発現カセット（図４のＥｃｏＲＩ−ＰｓｔＩフラ
グメント）に置き換えた。β−ラクタマーゼ遺伝子は破
壊されている。 図４： ｐＤＨ１３のＥｃｏＲＩ−ＨｉｎｄＩＩＩ挿入
物のヌクレオチド配列である。
【００１８】図５： バイオマスから抽出されたＩＦＮ
α２ｃのシリカゲルによる吸着クロマトグラフィー精製
を示すものである。矢印は８００mM塩化テトラメチルア
ンモニウムによる溶離を示す。クロマトグラムの主ピー
クの下の棒線はＩＦＮα２を含むプールを示し、これを
集め、次の段階に用いた。 図６： バイオマスから抽出されたＩＦＮα２ｃのフェ
ニルセファロースによる疎水性相互作用クロマトグラフ
ィー精製を示すものである。溶離は(----)で示される溶
媒Ｂ０〜１００％の直線勾配を用いて行った。クロマト
グラムの主ピークの下の棒線はＩＦＮα２を含むプール
を示し、これを集め、次の段階に用いた。 図７： バイオマスから抽出されたＩＦＮα２ｃのスル
ホプロピル陽イオン交換クロマトグラフィー精製を示す
ものである。溶離は(----)で示される溶媒Ｂ０〜１００
％の勾配を用いて行った。クロマトグラムの主ピークの
下の棒線はＩＦＮα２を含むプールを示し、これを集
め、次の段階に用いた。
【００１９】図８： バイオマスから抽出されたＩＦＮ
α２ｃのＤＥＡＥセファロースによるクロマトグラフィ
ー精製を示すものである。溶離は(----)で示される溶媒
Ｂ０〜１００％の勾配を用いて行った。クロマトグラム
の主ピークの下の棒線はＩＦＮα２を含むプールを示
し、これを集め、次の段階に用いた。 図９： クーマシーブルーで染色した精製ＩＦＮα２ｃ
のＳＤＳ−ＰＡＧＥである。右側欄外の数字は標準タン
パク質の分子量を示す。 トレース１： ＩＦＮα２ｃ標準 トレース２： ３μg のＩＦＮα２ｃ トレース３： ６μg のＩＦＮα２ｃ トレースＭ： 分子量標準 図１０： 精製ＩＦＮα２ｃの逆相ＨＰＬＣによる確認
を示すものである。ＩＦＮα２ｃは２４分に溶媒Ｂ２０
−６８％の直線勾配で溶離した。 図１１： 精製ＩＦＮα２ｃの逆相ＨＰＬＣによる確認
を示すものである。ＩＦＮα２ｃは３０分に溶媒Ｂ４５
−５３％の直線勾配で溶離した。
【００２０】
【実施例１】発現ベクターｐＤＨ１３及びその形質転換
細胞の調製一般法 ＤＮＡの制限エンドヌクレアーゼによる制限消化、ＤＮ
Ａの充填反応、フェノール抽出及び沈降、アガロースゲ
ル電気泳動及びＤＮＡのアガロースゲルからの溶離、Ｄ
ＡＮ分子の連結反応、細菌の形質転換並びに細菌からの
プラスミド単離は標準手順であり、Sambrook等(1989)に
よって記載されているように行った。 プラスミド ｐＣＦ２ ｐＣＦ２はプラスミドｐＡＴ１５３
から調製した(Twigg等,1980)。大腸菌由来のアルカリ性
ホスファターゼのプロモーター（ｐｈｏＡ,Chang等,198
6; Schuttleworth等,1986)、ＳＴＩＩリーダーペプチド
のコード領域 (Picken等,1983; Lee等,1983)及びヒトＩ
ＦＮω１の遺伝子(Hauptmann等,1985)を含んでいる。図
１及び２は各々ｐＣＦ２の遺伝子地図及びその関連部分
の配列を示している。
【００２１】ｐＥＲ２１／１ ｐＥＲ２１／１はＩＦ
Ｎα２ｃの細菌発現ベクターである (ＥＰ ０１１５６
１３） オリゴヌクレオチド（５′→３′）： ＥＢＩ−２７８７： CGTCTTCAAGAATTCGAGATTATCG ＥＢＩ−２７９９： GGCAGATCACATGCATAGGCATTTGTAGCAATAG ＥＢＩ−２７９８： ATGCCTATGCATGTGATCTGCCTCAAACCCACAGC ＥＢＩ−２７９７： GACTTCAGAAGCTTCTGCAGTTACGATCGATCGTTATCATTCC TTACTTCTTAAACTTTC
【００２２】２段階ＰＣＲにおけるｐｈｏＡプロモータ
ー、ＩＦＮα２ｃ配列及びＳＴＩＩリーダー配列の発現
カセットの調製 ｐＥＲ２１／１ＤＮＡをＨｉｎｄＩＩＩで線状にし、ｐ
ＣＦ２−ＤＮＡをＰｖｕＩで線状にした。下記で用いら
れる方法はＳＯＥ−ＰＣＲとして記載されているもので
ある("splicing by overlap extension", Ho等,1989)。 ＰＣＲ１ａ（ＩＦＮα２ｃ遺伝子の増幅）： １００ng
の線状ｐＥＲ２１／１ＤＮＡ、２５ピコモルのＥＢＩ−
２７９７及び２５ピコモルのＥＢＩ−２７９８をパーキ
ンエルマーセタスサーモサイクラーＴＣ−１において５
０mMＫＣｌ、１０mMトリス−ＨＣl,ｐＨ8.３、1.５mMＭ
ｇＣｌ2 、0.０１％ゼラチン、0.２mMｄＡＴＰ、0.２mM
ｄＧＴＰ、0.２mMｄＣＴＰ、0.２mMｄＴＴＰ及び1.２５
単位のＴａｑポリメラーゼを含有した５０μl のバッフ
ァー中でサーモサイクルに供した。９４℃で３分間イン
キュベートした後、１０サイクルを行った（段階１：９
４℃で４０秒、段階２：５５℃で３０秒、段階３：７２
℃で９０秒）。 ＰＣＲ１ｂ（ｐｈｏＡプロモーターとＳＴＩＩリーダー
配列の増幅）： １００ngの線状ｐＣＦ２−ＤＮＡ、２
５ピコモルのＥＢＩ２７８７及び２５ピコモルのＥＢＩ
２７９９をＰＣＲ１ａと同一のバッファー及び同一条件
下でサーモサイクルに供した。
【００２３】得られたＰＣＲ１ａ（５４０ｂｐ）及びＰ
ＣＲ１ｂ（３７４ｂｐ）のＤＮＡ断片をゲル精製した
（ＴＢＥバッファー、１×ＴＢＥ：１0.８ｇトリス／
ｌ、5.５ｇホウ酸／ｌ、0.９３ｇＥＤＴＡ／ｌ中1.２％
低ゲル化型アガロース）。各ＤＮＡ断片を含有するアガ
ロース断片を切り出し、１００μl のＨ2 Ｏを加えて７
０℃に加熱することによりアガロースを溶融した。 ＰＣＲ２： ５μl の各アガロース／ＤＮＡ溶液を合わ
せ、５０ピコモルのＥＢＩ−２７８７及びＥＢＩ−２７
９７を含有する１００μl の溶液中でサーモサイクルに
供した。バッファーはＰＣＲ１ａと同様にした。２０サ
イクルの後に９４℃で５分の遅延時間があるようにサー
モサイクル装置をプログラムした（段階１：９４℃で４
０分、段階２：５５℃で３０分、段階３：７２℃で５
分：段階３を各新しいサイクルで５秒延長した）。増幅
した後、ＤＮＡをフェノール／クロロホルム抽出及びエ
タノール沈降で精製した。ＰＣＲ産物を対応するバッフ
ァーに溶解してＨｉｎｄＩＩＩ及びＥｃｏＲＩで切断し
た。
【００２４】ＰＣＲ産物のクローニング（ｐＤＨ９） Bluescribe M13+ (Stratagene, San Diego, CA, USA)を
ＨｉｎｄＩＩＩ及びＥｃｏＲＩで二重切断し、大きな断
片を1.２％アガロースゲルでゲル精製した。１０ngのBl
uescribe M13+ ＤＮＡとＥｃｏＲＩ／ＨｉｎｄＩＩＩで
切断した５０ngのＰＣＲを５０mMトリス−ＨＣl,ｐＨ7.
６、１０mMＭｇＣｌ2 、２０mMジチオトレイトール、１
mMＡＴＰ、５０ng／mlのウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）
及び２単位のＴ４−ＤＮＡリガーゼ（ＮＥＮ）を含有す
る１０μl の溶液中０℃で１時間及び室温で３時間連結
した。８μl のこの溶液を大腸菌ＪＭ１０１株の受容能
力をもつ細胞（E.coliＫ１２，ＳｕｐＥ，ｔｈｉ，△
（ｌａｃ−ｐｒｏＡＢ), [Ｆ′, ｔｒａＤ３６，ｐｒｏ
ＡＢ，ｌａｃＩＺ△Ｍ１５])の形質転換に用いた。クロ
ーンを選択し、ＤＮＡを単離し、発現カセットの配列を
決定した。配列は理論的に予想された配列と厳密に対応
した（図３及び４）。このプラスミドをｐＤＨ９と称し
た。
【００２５】発現プラスミドｐＤＨ１３の構築 ｐＡＴ１５３をＳｓｐＩ及びＰｓｔＩで二重切断し、大
きな断片を単離した。ｐＤＨ９をＥｃｏＲＩで切断し、
末端をＤＮＡポリメラーゼ１と４つのｄＮＴＰを用いて
充填した。線状ｐＤＨ９−ＤＮＡをフェノール抽出及び
沈降した後、このＤＮＡをＰｓｔＩで切断し、ｐｈｏＡ
プロモーター、ＳＴＩＩリーダー配列及びＩＦＮα２ｃ
遺伝子を含む断片を１％アガロースゲルから単離した。
１０ngのｐＡＴ１５３×ＳｓｐＩ×ＰｓｔＩ及び発現カ
セットを含む３０ngの断片を１０μl の溶液中室温で５
時間連結した。５μl のこの混合液を用いてＨＢ１０１
株の受容能力をもつ大腸菌を形質転換した。形質転換細
菌の選択は、１０μg/mlのテトラサイクリンを含むＬＢ
寒天プレート（１０ngのトリプトン／ｌ、５ｇの酵母エ
キス／ｌ、５ｇのＮａＣｌ／ｌ、１５ｇのバクトアガー
ル／ｌ）上で行った。ｐＤＨ１３の遺伝子地図及び適切
な領域の配列を各々図３及び４に示す。このようにして
得られた種々のコロニーからプラスミドＤＮＡを単離
し、制限分析により正しい組成を調べた。プラスミドを
選択し、ｐＤＨ１３と称した。このプラスミドｐＤＨ１
３を用いて大腸菌Ｗ３１１０（E.coliＫ１２野生型，ｆ
-, γ- ,IＮ（ｒｒｎＤ−ｒｒｎＥ)1）を形質転換する
ために用いた。
【００２６】
【実施例２】 発酵予備培養 ５mg/lのテトラサイクリンを含有する７００mlのオート
クレーブにかけたＬＢ培養液（１０ｇのバクトトリプト
ン/l、５ｇのバクト酵母エキス/l、１０ｇのＮａＣｌ/
l, ｐＨ7.０）を保存培養物の２リットルのガラス容器
中に移植してＯＤ 546 0.０１を得た。培養物を３７℃で
１０時間激しく攪拌（８００rpm)しかつ通気（５発酵槽
量／分 [vvm]) しながらインキュベートした。
【００２７】主培養 培養液の組成発酵槽中 (NH4)2HPO4 1.21 g/l (NH4)2SO4 3.96 g/l K2HPO4 6.53 g/l MgSO4 ×7 H2O 1.23 g/l NaCl 0.32 g/l NH4Cl 0.25 g/l Na3-クエン酸塩 × 2 H2O 1.0 g/l 微量元素濃縮液 1.0 ml/l グルコース 12.5 g/l チアミン-HCl 20 mg/l L-トリプトファン 50 mg/l L-ロイシン 100 mg/l L-メチオニン 50 mg/l テトラサイクリン 5 mg/l
【００２８】微量元素濃縮液(100ml当たりの量) FeCl3 × 6 H2O 3.35 g ZnSO4 × 7 H2O 1.09 g CoCl2 × 6 H2O 0.267 g Na2MoO4 × 2 H2O 0.267 g CuSO4 × 5 H2O 0.221 g H3BO3 0.333 g MnSO4 × H2O 1.37 g 濃HCl 10 ml H2O 全量 100 ml
【００２９】発酵中の供給：（発酵槽の容量に対する
量） グルコース 350 g/l MgSO4 ×7 H2O 3.70 g/l チアミン-HCl 175 mg/l L-トリプトファン 0.50 g/l L-ロイシン 4.0 g/l L-メチオニン 2.0 g/l発酵中消泡剤の計量添加 （発酵槽量に対する） UCON LB625 1.0 ml/l
【００３０】（ＮＨ4)2 ＰＯ4 、（ＮＨ4)2 ＳＯ4 、Ｋ
2 ＨＰＯ4 、ＮａＣｌ、ＮＨ4 Ｃｌ及びクエン酸Ｎａの
塩を発酵槽中で滅菌した。冷却した後、微量元素、Ｍｇ
ＳＯ 4 、グルコース、チアミン、Ｌ−トリプロファン、
Ｌ−ロイシン、Ｌ−メチオニン及びテトラサイクリンを
無菌的に加えて出発容量７リットルを得た。６００mlの
予備培養物を発酵素槽中に自動的に移植した。発酵条件
は攪拌１０００rpm 、通気１vvm 、背圧0.３バール、温
度３7.０±0.１℃とし、ｐＨはＮＨ3 及びＨ2ＳＯ4 を
用いて6.７±0.１に維持した。必要とする（背圧0.３バ
ールにおいて）酸素を多く含む空気を通気することによ
り、溶存酸素の濃度を空気飽和１５％以上に維持した。
最初に存在したグルコースが消費された後、酸素濃度が
自動的な引き金となりグルコース、チアミン、ＭｇＳＯ
4 、Ｌ−トリプトファン、Ｌ−ロイシン及びＬ−メチオ
ニンを含有する供給工程が開始した。供給速度が2.５g/
l/h で開始し、２４時間以内に5.０g/l/h まで連続的に
増大し、発酵工程の終わりまで維持した。３５０g/l の
グルコース全量が添加されると発酵が終了した。このと
きに典型的な光学濃度２５０〜２８０が５４６nmにおい
て得られた。バイオマスを不活性化するために、この混
合液を約１０℃まで冷却し、同時にＨ2 ＳＯ4 を用いて
ｐＨを2.０に調整した。バイオマスを遠心により分離
し、−７０℃で凍結保存した。
【００３１】
【実施例３】 抽出 酸不活性化バイオマス（約0.５kg）をポリトロンホモジ
ェナイザーを用いて５００mlの１％酢酸に懸濁し、この
混合液を０℃で１時間攪拌した。ポリエチレンイミン
（５０％保存液, Serva, Heidelberg)を加えて最終濃度
0.２５％(w/v) を得た。この懸濁液を５N ＮａＯＨを用
いてｐＨ１0.０に調整し、０℃で更に２時間攪拌した。
５N ＨＣｌを用いてｐＨ7.５に調整した後、１７０００
×ｇ(Beckmann J2-21 遠心機）で遠心して細菌を分離し
た。平均抽出収率は、ＩＦＮα２ｃの全含量の２9.３±
5.９％であった。
【００３２】
【実施例４】 クロマトグラフィー精製シリカゲルによる吸着クロマトグラフィー 実施例３で細菌沈降物を分離した後、ＩＦＮαを含む上
清を２０mMトリス−ＨＣl,ｐＨで平衡化したシリカゲル
カラム(Grace, シリカタイプ 953W;３５mgタンパク質／
mlカラム材料、流速２５ml／分）に充填した。カラムを
３０カラム容量の出発バッファーで洗浄し、次いで、２
０mMトリス−ＨＣｌ、１００mM塩化テトラメチルアンモ
ニウム（ＴＭＡＣ),ｐＨ7.５による洗浄段階を行った。
ＴＭＡＣ濃度を８００mMＴＭＡＣまで増大させることに
より、ＩＦＮα２ｃを溶離することができた（図５）。疎水性相互作用クロマトグラフィー シリカゲルカラムから溶離した材料を固体の（ＮＨ4)2
ＳＯ4 を加えることにより硫酸アンモニウム濃度２０％
(W/V) まで調整し、２０mMトリス−ＨＣｌ、３０％硫酸
アンモニウムで平衡化したフェニルセファロースカラム
（フェニルトヨパール, 650S, Tosohaas) に充填した。
ＩＦＮα２ｃを１００％充填条件から１００％２０mMト
リス−ＨＣｌ、３０％エチレングリコール, ｐＨ7.５ま
での直線勾配により流速１５ml／分で溶離した。ＩＦＮ
αプールの純度は７１±１５％であった。
【００３３】陽イオン交換クロマトグラフィー 疎水性相互作用クロマトグラフィーの溶出液を２０mMコ
ハク酸ナトリウム，ｐＨ5.０に対する容量透析により調
整した。最終ｐＨをＨＣｌで3.０に調整した後、２０mM
コハク酸ナトリウム，ｐＨ5.０で平衡化したスルホプロ
ピルイオン交換樹脂(Toyopearl TSK SP 5PW, Tosohaas)
に充填した。ＩＦＮα２ｃを１００％充填条件から１０
０％２０mMコハク酸ナトリウム、５００mMＮａＣｌ、１
０％エチレングリコール, ｐＨ5.５（溶媒Ｂ）までの直
線勾配により流速６ml／分で溶離した。このカラムから
溶離したＩＦＮα２ｃの純度は通常９５％より高かっ
た。 陰イオン交換クロマトグラフィー ＩＦＮαプールを１０mMビストリス，ｐＨ5.８で透析
し、同様のバッファーで平衡化したＤＥＡＥセファロー
ス(DEAE Sepharose FastFlow, Pharmacia)に充填した。
ＩＦＮα２ｃの溶離を１０mMビストリス、５００mMＮａ
Ｃｌ、0.１％トゥイーン20, ｐＨ5.８（溶媒Ｂ）、流速
５ml／分の直線勾配で行った。
【００３４】
【実施例５】 ＩＦＮα２ｃ標品の分析逆相ＨＰＬＣ 無傷ＩＦＮα２ｃを３０℃においてBakerBond-WP-C18カ
ラム [２５０×4.５mm、粒子サイズ５μm]で分析した。
Merck Supersphere 120-4 C-18カラム [１２５×4.５m
m、粒子サイズ４μm]を３７℃で用いてトリプシンペプ
チドを分離した。試料を溶媒Ａ、水中0.１％トリフルオ
ロ酢酸及びＢ、アセトニトリル中0.１％トリフルオロ酢
酸を用いてまた関連説明として図面の説明に記載されて
いる勾配を用いてクロマトグラフィー処理した。ＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動 ＩＦＮα２ｃ試料を標準条件下１６％ＳＤＳポリアクリ
ルアミドゲルで分析した。試料をジチオトレイトールで
還元した後、電気泳動にかけた。タンパク質バンドをク
ーマシーブルー染色で可視化した。ＩＦＮα２ｃのＥＬＩＳＡによる定量化 精製で得られた種々の試料のＩＦＮα２ｃ含量をモノク
ローナル抗体ＯＭＧ−２及びＭＧ−７を用いたサンドイ
ッチＥＬＩＳＡで求めた(Adolf等, 1990) 。
【００３５】参考文献 アドルフ（Adolf,G.R.), Virology 175, 410-417 (199
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9)。 チャンら(Chang C.N., Kuang W.-J., E.Y. Chen), Gene
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16-218 (1980) 。
【図面の簡単な説明】
【図１】ｐｃＦ２の遺伝子地図である。
【図２】ｐｈｏＡプロモーターを含むＥｃｏＲＩ（破壊
されている）−ＢａｍＨＩ部分、ＳＴＩＩリーダー＋Ｉ
ＦＮω１遺伝子の配列である。
【図３】プラスミドｐＤＨ１３の遺伝子地図である。
【図４】ｐＤＨ１３のＥｃｏＲＩ−ＨｉｎｄＩＩＩ挿入
物のヌクレオチド配列である。
【図５】バイオマスから抽出されたＩＦＮα２ｃのシリ
カゲルによる吸着クロマトグラフィー精製を示すもので
ある。
【図６】バイオマスから抽出されたＩＦＮα２ｃのフェ
ニルセファロースによる疎水性相互作用クロマトグラフ
ィー精製を示すものである。
【図７】バイオマスから抽出されたＩＦＮα２ｃのスル
ホプロピル陽イオン交換クロマトグラフィー精製を示す
ものである。
【図８】バイオマスから抽出されたＩＦＮα２ｃのＤＥ
ＡＥセファロースによるクロマトグラフィー精製を示す
ものである。
【図９】クーマシーブルーで染色した精製ＩＦＮα２ｃ
のＳＤＳ−ＰＡＧＥである。
【図１０】精製ＩＦＮα２ｃの逆相ＨＰＬＣによる確認
を示すものである。
【図１１】精製ＩＦＮα２ｃの逆相ＨＰＬＣによる確認
を示すものである。
─────────────────────────────────────────────────────
【手続補正書】
【提出日】平成６年９月１３日
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】図９
【補正方法】変更
【補正内容】
【図９】クーマシーブルーで染色した精製ＩＦＮα２ｃ
の電気泳動ＳＤＳ−ＰＡＧＥの写真である。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.6 識別記号 庁内整理番号 ＦＩ 技術表示箇所 Ｃ０７Ｋ 14/56 8318−4Ｈ Ｃ１２Ｎ 15/09 ＺＮＡ //(Ｃ１２Ｐ 21/02 Ｃ１２Ｒ 1:19） (72)発明者 ゲルハルト ボードー オーストリア アー1120 ウィーン ヘッ ツェンドルファーシュトラーセ 116−１ −４ (72)発明者 ティルマン フォス オーストリア アー2340 メートリング ヴァイセス クロイツ ガッセ 61 (72)発明者 イングリット マウレル フォギー オーストリア アー1238 ウィーン リン ダウエルガッセ 35

Claims (23)

    【特許請求の範囲】
  1. 【請求項１】 大腸菌中で発現することによるインター
    フェロン−αの調製方法であって、 ａ）インターフェロン−αを、大腸菌由来の熱安定性エ
    ンテロトキシンII（ＳＴＩＩ）遺伝子のシグナル配列が
    成熟ヒトインターフェロン−αをコードする配列に連結
    されているベクターを含む細胞内で発現し、 ｂ）その発現されたインターフェロン−αを単離する、
    ことを特徴とする上記方法。
  2. 【請求項２】 ベクターが大腸菌由来のアルカリ性ホス
    ファターゼ（ｐｈｏＡ）のプロモーターを更に含むこと
    を特徴とする請求項１記載の方法。
  3. 【請求項３】 ベクターがＳＴＩＩ遺伝子のリボソーム
    結合部位配列を更に含むことを特徴とする請求項１又は
    ２記載の方法。
  4. 【請求項４】 インターフェロンの単離が下記段階を含
    むことを特徴とする請求項１〜３のいずれか１項に記載
    の方法。 ａ）シリカゲルによる吸着クロマトグラフィー、 ｂ）疎水性相互作用クロマトグラフィー、 ｃ）陽イオン交換クロマトグラフィー、 ｄ）陰イオン交換クロマトグラフィー。
  5. 【請求項５】 疎水性相互作用クロマトグラフィーがフ
    ェニルセファロースで行われることを特徴とする請求項
    ４記載の方法。
  6. 【請求項６】 陽イオン交換クロマトグラフィーがスル
    ホプロピルイオン交換体で行われることを特徴とする請
    求項４記載の方法。
  7. 【請求項７】 陰イオン交換クロマトグラフィーがＤＥ
    ＡＥ−セファロースで行われることを特徴とする請求項
    ４記載の方法。
  8. 【請求項８】 インターフェロン−αがインターフェロ
    ン−α２であることを特徴とする請求項１〜７のいずれ
    か１項に記載の方法。
  9. 【請求項９】 インターフェロン−α２が下記アミノ酸
    配列を含むことを特徴とする請求項８記載の方法。 Cys Asp Leu Pro Gln Thr His Ser Leu Gly Ser Arg Arg Thr Leu Met Leu Leu Ala Gln Met Arg Arg Ile Ser Leu Phe Ser Cys Leu Lys Asp Arg Arg Asp Phe Gly Phe Pro Gln Glu Glu Phe Gly Asn Gln Phe Gln Lys Ala Glu Thr Ile Pro Val Leu His Glu Met Ile Gln Gln Ile Phe Asn Leu Phe Ser Thr Lys Asp Ser Ser Ala Ala Trp Asp Glu Thr Leu Leu Asp Lys Phe Tyr Thr Glu Leu Tyr Gln Gln Leu Asn Asp Leu Glu Ala Cys Val Ile Gln Gly Val Gly Val Thr Glu Thr Pro Leu Met Lys Glu Asp Ser Ile Leu Ala Val Arg Lys Tyr Phe Gln Arg Ile Thr Leu Tyr Leu Lys Glu Lys Lys Tyr Ser Pro Cys Ala Trp Glu Val Val Arg Ala Glu Ile Met Arg Ser Phe Ser Leu Ser Thr Asn Leu Gln Glu Ser Leu Arg Ser Lys Glu
  10. 【請求項１０】 インターフェロン−αの精製方法であ
    って、下記段階を含むことを特徴とする上記方法。 ａ）シリカゲルによる吸着クロマトグラフィー、 ｂ）疎水性相互作用クロマトグラフィー、 ｃ）陽イオン交換クロマトグラフィー、 ｄ）陰イオン交換クロマトグラフィー。
  11. 【請求項１１】 疎水性相互作用クロマトグラフィーが
    フェニルセファロースで行われることを特徴とする請求
    項１０記載の方法。
  12. 【請求項１２】 陽イオン交換クロマトグラフィーがス
    ルホプロピルイオン交換体で行われることを特徴とする
    請求項１０記載の方法。
  13. 【請求項１３】 陰イオン交換クロマトグラフィーがＤ
    ＥＡＥ−セファロースで行われることを特徴とする請求
    項１０記載の方法。
  14. 【請求項１４】 インターフェロン−αが細菌で発現さ
    れることを特徴とする請求項１０〜１３のいずれか１項
    に記載の方法。
  15. 【請求項１５】 インターフェロン−αがインターフェ
    ロン−α２であることを特徴とする請求項１０〜１４の
    いずれか１項に記載の方法。
  16. 【請求項１６】 インターフェロン−α２が下記アミノ
    酸配列を含むことを特徴とする請求項１５記載の方法。 Cys Asp Leu Pro Gln Thr His Ser Leu Gly Ser Arg Arg Thr Leu Met Leu Leu Ala Gln Met Arg Arg Ile Ser Leu Phe Ser Cys Leu Lys Asp Arg Arg Asp Phe Gly Phe Pro Gln Glu Glu Phe Gly Asn Gln Phe Gln Lys Ala Glu Thr Ile Pro Val Leu His Glu Met Ile Gln Gln Ile Phe Asn Leu Phe Ser Thr Lys Asp Ser Ser Ala Ala Trp Asp Glu Thr Leu Leu Asp Lys Phe Tyr Thr Glu Leu Tyr Gln Gln Leu Asn Asp Leu Glu Ala Cys Val Ile Gln Gly Val Gly Val Thr Glu Thr Pro Leu Met Lys Glu Asp Ser Ile Leu Ala Val Arg Lys Tyr Phe Gln Arg Ile Thr Leu Tyr Leu Lys Glu Lys Lys Tyr Ser Pro Cys Ala Trp Glu Val Val Arg Ala Glu Ile Met Arg Ser Phe Ser Leu Ser Thr Asn Leu Gln Glu Ser Leu Arg Ser Lys Glu
  17. 【請求項１７】 大腸菌中でインターフェロン−αを発
    現するベクターであって、ＳＴＩＩ遺伝子のシグナル配
    列と共に成熟ヒトインターフェロン−αをコードする配
    列を含むことを特徴とする上記ベクター。
  18. 【請求項１８】 ｐｈｏＡプロモーターを更に含むこと
    を特徴とする請求項１７記載のベクター。
  19. 【請求項１９】 ＳＴＩＩ遺伝子のリボソーム結合部位
    を更に含むことを特徴とする請求項１７又は１８記載の
    ベクター。
  20. 【請求項２０】 インターフェロン−αがインターフェ
    ロン−α２であることを特徴とする請求項１７〜１９の
    いずれか１項に記載のベクター。
  21. 【請求項２１】 下記ヌクレオチド配列又はその配列と
    ７０％以上相同でインターフェロン−αをコードする配
    列を含むことを特徴とする請求項１７〜１９のいずれか
    １項に記載のベクター。 TGT GAT CTG CCT CAA ACC CAC AGC CTG GGT AGC AGG AGG ACC TTG ATG CTC CTG GCA CAG ATG AGG AGA ATC TCT CTT TTC TCC TGC TTG AAG GAC AGA CGT GAC TTT GGA TTT CCC CAG GAG GAG TTT GGC AAC CAG TTC CAA AAG GCT GAA ACC ATC CCT GTC CTC CAT GAG ATG ATC CAG CAG ATC TTC AAT CTC TTC AGC ACA AAG GAC TCA TCT GCT GCT TGG GAT GAG ACC CTC CTA GAC AAA TTC TAC ACT GAA CTC TAC CAG CAG CTG AAT GAC CTG GAA GCC TGT GTG ATA CAG GGG GTG GGG GTG ACA GAG ACT CCC CTG ATG AAG GAG GAC TCC ATT CTG GCT GTG AGG AAA TAC TTC CAA AGA ATC ACT CTC TAT CTG AAA GAG AAG AAA TAC AGC CCT TGT GCC TGG GAG GTT GTC AGA GCA GAA ATC ATG AGA TCT TTT TCT TTG TCA ACA AAC TTG CAA GAA AGT TTA AGA AGT AAG GAA
  22. 【請求項２２】 下記ヌクレオチド配列を含むことを特
    徴とする請求項２１記載のベクター。 GAATTCGAGATTATCGTCACTGCAATGCTTCGCAATATGGCGCAAAATGACCAACAG CGGTTGATTGATCAGGTAGAGGGGGCGCTGTACGAGGTAAAGCCCGATGCCAGCATT CCTGACGACGATACGGAGCTGCTGCGCGATTACGTAAAGAAGTTATTGAAGCATCCT CGTCAGTAAAAAGTTAATCTTTTCAACAGCTGTCATAAAGTTGTCACGGCCGAGACT TATAGTCGCTTTGTTTTTATTTTTTAATGTATTTGCTCGAGAGGTTGAGGTGATTTT ATG AAA AAG AAT ATC GCA TTT CTT CTT GCA TCT ATG TTC GTT TTT TCT ATT GCT ACA AAT GCC TAT GCA TGT GAT CTG CCT CAA ACC CAC AGC CTG GGT AGC AGG AGG ACC TTG ATG CTC CTG GCA CAG ATG AGG AGA ATC TCT CTT TTC TCC TGC TTG AAG GAC AGA CGT GAC TTT GGA TTT CCC CAG GAG GAG TTT GGC AAC CAG TTC CAA AAG GCT GAA ACC ATC CCT GTC CTC CAT GAG ATG ATC CAG CAG ATC TTC AAT CTC TTC AGC ACA AAG GAC TCA TCT GCT GCT TGG GAT GAG ACC CTC CTA GAC AAA TTC TAC ACT GAA CTC TAC CAG CAG CTG AAT GAC CTG GAA GCC TGT GTG ATA CAG GGG GTG GGG GTG ACA GAG ACT CCC CTG ATG AAG GAG GAC TCC ATT CTG GCT GTG AGG AAA TAC TTC CAA AGA ATC ACT CTC TAT CTG AAA GAG AAG AAA TAC AGC CCT TGT GCC TGG GAG GTT GTC AGA GCA GAA ATC ATG AGA TCT TTT TCT TTG TCA ACA AAC TTG CAA GAA AGT TTA AGA AGT AAG GAA TGATAACGATCGTAACTGCA
  23. 【請求項２３】 インターフェロン−αを調製するため
    の請求項１７〜２２のいずれか１項に記載のベクターの
    使用。
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