JPH11508134A - 肥満症蛋白質中間体およびその製法と使用 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 本発明は患者に投与した時に、脂肪組織を調節する抗肥満症蛋白質に関する。本発明は肥満症蛋白質再生経路の最終中間体を提供する。本発明はさらにこの中間体の製法およびその生物学的に活性な肥満症蛋白質またはその類似体を製造するための使用法を提供する。

Description

【発明の詳細な説明】 肥満症蛋白質中間体およびその製法と使用 本発明はヒト用医薬品、特に肥満症および肥満症関連疾患の処置、の分野に属 する。最も特定的には、本発明は患者に投与した時に脂肪組織を調節する肥満症 蛋白質を製造するために使用する中間体に関する。 異種宿主生物での蛋白質産生は不活性で難溶な蛋白質凝集体すなわち封入体を 形成する。このような封入体の形成は発現に起因する細胞内の高い蛋白質濃度の 結果である。生物学的に活性な蛋白質を得るためには、封入体を変性して可溶化 し、還元し、次に適当な条件に調整して在来型空間構造の蛋白質第三次元構造を 形成しなければならない。Ｒ．Ｊａｅｎｉｃｋｅ、Ｐｒｏｇ．Ｂｉｏｐｈｙｓ． Ｍｏｌｅｃ．Ｂｉｏｌ．、４９巻：１１７〜２３７頁（１９８７年）。 しかしながら、生物学的活性立体配座への再生は定量的過程ではない−−その 蛋白質の非機能的種および立体配座が多数作成されることもある。生物学的活性 立体配座を形成するように平衡を移動するには、不正な蛋白質立体配座の樹立を 防止し、再生を妨害しない条件を選択する。ポリペプチド鎖を高度に整備された 構造の立体配座に再生する方法を予測することは不可能とは言えないまでも困難 なため、生物学的活性蛋白質の形成に偏る条件は予測できない。 最近、Ｙｉｙｉｎｇ Ｚｈａｎｇとその共同研究者は肥満症および糖尿病にリ ンクするマウス遺伝子の位置的クローニングを発表した。Ｙｉｙｉｎｇ Ｚｈａ ｎｇほか、Ｎａｔｕｒｅ、３７２巻：４２５〜３２頁（１９９４年）。この報告 は専ら脂肪組織に発現し、２１アミノ酸の推測的シグナルペプチドを持つ１６７ アミノ酸の蛋白質をコードする遺伝子を開示した。このペプチドは脂肪調節ホル モンであると推測されている。同様にして、ＭｕｒａｋａｍｉほかはＢｉｏｃｈ ｅｍ．ａｎｄ・Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍ．２０９（３）巻：９４４〜 ５２頁（１９９５年）に肥満ラット遺伝子および蛋白質を開示した。 本発明は肥満症蛋白質への再生経路の最終中間体を提供する。本発明はさらに この中間体の製法およびその生物学的活性肥満症蛋白質またはその類似体を製造 するための使用を提供する。最も顕著な利点はこの中間体を経由することで生物 学的活性蛋白質の本質的収率向上が観察されることである。この中間体は肥満症 蛋白質の大量生産を可能にする顕著な生産上の利点も提供する。 本発明は肥満症蛋白質またはその類似体への正しく折畳まれた中間体を提供す る。さらに特定的には本発明は正しく折畳まれた式（Ｉ）： ［式中、 Ａは基本的に肥満症蛋白質またはその類似体のアミノ酸残基１からアミノ酸残 基９５までから構成されるポリペプチドである。 Ｂは基本的にこの蛋白質のアミノ酸残基９７からアミノ酸残基１４５までから 構成されるポリペプチドである。 Ｒ₁およびＲ₂は独立してＨであるか、またはそれが結合している硫黄とともに 混合ジスルフィドを形成する。 但し、Ｒ₁およびＲ₂の双方がＨであることはないものとする］ で示される蛋白質を指向する。 本発明は肥満症蛋白質またはその類似体をｐＨが約７から約１２までで、変性 剤および濃度が約１から１００ｍＭまでのチオール還元剤を含有する溶液と混合 することを包含する、式Ｉで示される蛋白質の製法も提供する。 本発明はさらに式（ＩＩ）： ［式中、 Ａは基本的に肥満症蛋白質またはその類似体のアミノ酸残基１からアミノ酸残 基９５までから構成されるポリペプチドである。 Ｂは基本的にこの蛋白質のアミノ酸残基９７からアミノ酸残基１４５までから 構成されるポリペプチドである］ で示される正しく折畳まれた蛋白質の製法であって、 （ａ）肥満症蛋白質封入体を この蛋白質を可溶化するために十分な濃度の変性剤、および 約７から約１２のｐＨで、約１から１００ｍＭまでの濃度のチオール還元剤を 含有する溶液中に可溶化すること、 （ｂ）この溶液のチオールおよび変性剤の濃度をジスルフィド結合形成が起き るまで低下させること を包含する製法を提供する。 図面の説明 図１はＺｏｒｂａｘ・Ｃ−８カラムでｐＨ７．６の５０ｍＭ−燐酸アンモニウ ム、０．５％ＳＤＳ、および５％ｎ−プロパノールである緩衝液Ａ、およびｐＨ ７．６の５０ｍＭ−燐酸アンモニウム、０．５％ＳＤＳ、および５０％ｎ−プロ パノールである緩衝液Ｂ、を使用して展開したＨＰＬＣクロマトグラムを示す。 約３８５秒に出るピークは生物学的活性肥満症蛋白質を表し、後で約５７３秒に 溶離するピークは実施例で製造した本発明の中間体を表す。 本明細書中に開示し、請求する本発明の目的では次の用語および略号を以下の 通りに定義する： 塩基対（ｂｐ）−−はＤＮＡまたはＲＮＡに関連する。ＤＮＡ分子にある時、 略号Ａ、Ｃ、ＧおよびＴは（デオキシ）アデニン、（デオキシ）シトシン、（デ オキシ）グアニン、および（デオキシ）チミンの各５’−モノホスフェート型ヌ クレオチドに対応する。ＲＮＡ分子にある時、略号Ｕ、Ｃ、ＧおよびＴはウラシ ル、シチジン、グアニン、およびチミンの各５’−モノホスフェート型ヌクレオ シドに対応する。２本鎖ＤＮＡでは、塩基対はＡとＴまたはＣとＧの組合せを示 すこともある。ＤＮＡ／ＲＮＡヘテロ二本鎖では、塩基対はＴとＵまたはＣとＧ の組合せを示すこともある。 変性試薬または変性剤−−は当技術分野の熟練者に知られている。変性試薬の 例はＲ．Ｊａｅｎｉｃｋｅ著、Ｐｒｏｇ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｍｏｌｅｃ．Ｂｉｏ ｌ．、４９巻：１１７〜２３７頁（１９８７年）に記載されている。好適な試薬 には尿素、チオシアネート、およびグアニジン、最も好ましくは６Ｍから８Ｍ− までの尿素を包含する。 混合ジスルフィド−−はチオール還元試薬とポリペプチドのシステイニル残基 の間でジスルフィド交換可能なその試薬から誘導された基を示す。 肥満症蛋白質−−は肥満症遺伝子から転写およびイントロン除去、蛋白質への 翻訳、および、たとえばＮ−末端バリン−プロリンからＣ−末端システインまで の成熟蛋白質からのプロセッシングなど、分泌シグナルペプチドを除去する成熟 蛋白質へのプロセッシング、によって産生される蛋白質を示す。マウス肥満症蛋 白質およびヒト肥満症蛋白質はＺｈａｎｇほか、Ｎａｔｕｒｅ、３７２巻：４２ ５〜３２頁（１９９４年）に発表された。ラット肥満症蛋白質はＭｕｒａｋａｍ ｉほか、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ・ａｎｄ・Ｂｉｏｐｈｙｓｉｃａｌ・Ｒｅｓ． Ｃｏｍｍ．２０９（３）巻：９４４〜５２頁（１９９５年）に発表された。この 明細書のアミノ酸番号は完全長成熟蛋白質のアミノ末端から順に数えたものであ る。この同一基準の番号付けは当技術分野の通常の熟練者がよく認めるところで ある。ヒト、マウス、ブタ、ウシ、およびラットの肥満症蛋白質では、ジスルフ ィド形成に関与するシステインは９６番および１４６番の残基にある。語句「Ａ は基本的に肥満症蛋白質またはその類似体のアミノ酸残基１からアミノ酸残基９ ５までから構成されるポリペプチドである」はＮ−末端からジスルフィド結合形 成に関与する第一のシステインまでのアミノ酸を含める意図である。語句「Ｂは 基本的に肥満症蛋白質のアミノ酸残基９７からアミノ酸残基１４５までから構成 されるポリペプチドである」は第一のシステインからＣ−末端までのアミノ酸を 含める意図である。天然変種または断片でのアミノ酸１個またはそれ以上の欠失 ならびに、本発明の新規で基本的な特徴に影響を及ぼさない１４６位Ｃｙｓへの 付加を含む、アミノ酸付加はＡおよびＢの定義内に包含するものと理解する。こ の蛋白質のアミノ酸残基の番号付直しは不必要であり、しかも混乱を招くことも ある。例えば、特にマウスおよびヒトの肥満症蛋白質ではデスＧｌｎ（２８）変 種が観察されている。このような変種は本発明に包含する意図である。 肥満症蛋白質類似体は１個またはそれ以上のアミノ酸置換、好ましくは５個ま たはそれ以下、最も好ましくは３個またはそれ以下の置換を持つ肥満症蛋白質を 示し、式（ＩＩＩ）：（配列番号１） ［配列中、２３位のＸａａはＧｌｎまたは不在である、 この蛋白質は次の置換を少なくとも１個有するものとする： ４位のＧｌｎをＧｌｕで置換、 ７位のＧｌｎをＧｌｕで置換、 ２２位のＡｓｎをＧｌｎまたはＡｓｐで置換、 ２７位のＴｈｒをＡｌａで置換、 ２８位のＸａａをＧｌｕで置換、 ３４位のＧｌｎをＧｌｕで置換、 ５４位のＭｅｔをメチオニンスルホキシド、Ｌｅｕ、Ｉｌｅ、Ｖａｌ、Ａｌ ａ、またはＧｌｙで置換、 ５６位のＧｌｎをＧｌｕで置換、 ６２位のＧｌｎをＧｌｕで置換、 ６３位のＧｌｎをＧｌｕで置換、 ６８位のＭｅｔをメチオニンスルホキシド、Ｌｅｕ、Ｉｌｅ、Ｖａｌ、Ａｌ ａ、またはＧｌｙで置換、 ７２位のＡｓｎをＧｌｎ、Ｇｌｕ、またはＡｓｐで置換、 ７５位のＧｌｎをＧｌｕで置換、 ７７位のＳｅｒをＡｌａで置換、 ７８位のＡｓｎをＧｌｎまたはＡｓｐで置換、 ８２位のＡｓｎをＧｌｎまたはＡｓｐで置換、 ９７位のＨｉｓをＧｌｎ、Ａｓｎ、Ａｌａ、Ｇｌｙ、Ｓｅｒ、またはＰｒｏ で置換、 １００位のＴｒｐをＡｌａ、Ｇｌｕ、Ａｓｐ、Ａｓｎ、Ｍｅｔ、Ｉｌｅ、Ｐｈ ｅ、Ｔｙｒ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、Ｇｌｙ、Ｇｌｎ、ＶａｌまたはＬｅｕで置換、 １０１位のＡｌａをＳｅｒ、Ａｓｎ、Ｇｌｙ、Ｈｉｓ、Ｐｒｏ、Ｔｈｒまたは Ｖａｌで置換、 １０２位のＳｅｒをＡｒｇで置換、 １０３位のＧｌｙをＡｌａで置換、 １０５位のＧｌｕをＧｌｎで置換、 １０６位のＴｈｒをＬｙｓまたはＳｅｒで置換、 １０７位のＬｅｕをＰｒｏで置換、 １０８位のＡｓｐをＧｌｕで置換、 １１１位のＧｌｙをＡｓｐで置換、 １１８位のＧｌｙをＬｅｕで置換、 １３０位のＧｌｎをＧｌｕで置換、 １３４位のＧｌｎをＧｌｕで置換、 １３６位のＭｅｔをメチオニンスルホキシド、Ｌｅｕ、Ｉｌｅ、Ｖａｌ、Ａｌ ａ、またはＧｌｙで置換、 １３８位のＴｒｐをＡｌａ、Ｇｌｕ、Ａｓｐ、Ａｓｎ、Ｍｅｔ、Ｉｌｅ、Ｐｈ ｅ、Ｔｙｒ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、Ｇｌｙ、Ｇｌｎ、ＶａｌまたはＬｅｕで置換、 または １３９位のＧｌｎをＧｌｕで置換］ で開示される蛋白質またはその医薬的に許容される塩を包含する。 正しい折り畳みの肥満症蛋白質またはその類似体は肥満症および、たとえば糖 尿病、循環器病および癌腫のような、肥満症に関連する病状の処置に有用な生物 学的活性蛋白質を与える立体配座または３次構造をとる蛋白質である。 Ｏｂ遺伝子−−はＺｈａｎｇほか、Ｎａｔｕｒｅ、３７２巻：４２５〜３２頁 （１９９４年）およびＭｕｒａｋａｍｉほか、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ・ａｎｄ ・Ｂｉｏｐｈｙｓｉｃａｌ・Ｒｅｓｅａｒｃｈ・Ｃｏｍｍ．２０９（３）巻：９ ４４〜５２頁（１９９５年）に開示された在来型Ｏｂ遺伝子遺伝子配列にハイブ リダイズし、また少なくとも５０％相同的、好ましくは７０％相同的、最も好ま しくは８０％相同的な核酸配列のいずれかを示す。このＯｂ遺伝子産物は脂肪組 織 に特異的に発現され、エネルギーの平衡を調節する。 肥満症蛋白質封入体−−は回収すべき肥満症蛋白質を少なくとも部分的に含有 する不溶性蛋白質凝集体または細胞質凝集体を示す。同様にして、肥満症蛋白質 類似体を製造する時は、封入体は回収すべき肥満症蛋白質類似体を少なくとも部 分的に含有する不溶性蛋白質凝集体または細胞質凝集体を示す。 プラスミド−−は染色体外の自己複製遺伝子エレメントである。 読取り枠−−はヌクレオチド配列であって、それからｔ−ＲＮＡの翻訳装置、 リボソームおよび関連因子、によってトリプレットで「読み」取られて翻訳が起 きるもので、各トリプレットは特定のアミノ酸に対応する。トリプレットは各々 別個で、同じ長さなので、コード配列は３の倍数でなければならない。塩基一対 の挿入または欠失（フレームシフト突然変異と呼ばれる）は同じＤＮＡセグメン トがコードする２種類の異なる蛋白質を与えることもある。これを確実に回避す るため、所望ポリペプチドに対応するトリプレットコドンは開始コドンから３の 倍数で並んでいなければならない、すなわち正しい「読取り枠」を維持しなけれ ばならない。 組換えＤＮＡクローニングベクター−−は別のＤＮＡセグメント１個またはそ れ以上を付加できるか、または付加してあるＤＮＡ分子から構成される自律的に 複製する作因のいずれかであって、これに限定するものではないが、プラスミド およびファージを含む。 組換えＤＮＡ発現ベクター−−はプロモーターが組込まれている組換えＤＮＡ クローニングベクターのいずれかである。 レプリコン−−はプラスミドまたはその他のベクターの自律的複製を制御し、 可能にするＤＮＡ配列である。 Ｒ₁およびＲ₂は独立してＨであるか、またはそれが結合している硫黄とともに 混合ジスルフィドを形成する、この混合ジスルフィドはジスルフィド交換が可能 なチオール還元試薬から誘導するものであると認識され、理解される。適当なチ オール試薬には混合ジスルフィドを形成でき、およびジスルフィド交換を作動で きる遊離の−ＳＨを含むメルカプト試薬の１種またはそれ以上を包含する。それ 故、チオールには、これに限定するものではないが、システイン、２−メルカプ トエタノール、グルタチオニン、システアミン、β−メルカプトエタノール（Ｂ ＭＥ）、その他を包含する。たとえばジチオスレイトール（ＤＴＴ）、ジチオエ リスリトール（ＤＴＥ）のようなチオール試薬も本発明に包含する、しかし、こ の試薬で形成する混合ジスルフィドが不安定なため好適さは劣る。従って、Ｒ₁ またはＲ₂で表される好適な基はＳＯ₃、ＳＣＨ₂ＣＨ（ＮＨ₂）（ＣＯＯＨ）、Ｓ ＣＨ₂ＣＨＮＨ₂、ＳＣＨ₂ＣＨ₂ＯＨ、およびＨ₂ＮＣＨ（ＣＯＯＨ）ＣＨ₂ＣＨ₂ ＣＯＮＨＣＨ（ＣＨ₂Ｓ）ＣＯＮＨＣＨ₂ＣＯＯ^-を含む。但し、Ｒ₁およびＲ₂の 両方がＨであることはないものとする。 転写−−はＤＮＡのヌクレオチド配列に含まれる情報が相補的ＲＮＡ配列に伝 達される過程である。 翻訳−−メッセンジャーＲＮＡの遺伝子情報を用いてポリペプチド鎖の合成を 特定し、指示する過程である。 トリス−−はトリス（ヒドロキシメチル）アミノメタンの略称である。 処置−−は疾病、病状または障害を改善する目的で患者を管理し、看護するこ とを記述し、疾病、病状または障害の症状または合併症の発症を防止し、症状ま たは合併症を緩解し、排除するため、本発明化合物を投与することを含む。それ 故、肥満症の処置にはそれを必要とする患者における食事摂取の阻止、体重増加 の阻止、および体重減少の誘導を含む。 ベクター−−は遺伝子操作において細胞の形質転換のために使用するレプリコ ンであって、適当な蛋白質分子に対応するポリヌクレオチド配列を有し、適当な 制御配列と組合せると形質転換する宿主細胞に特定の性質を与える。プラスミド 、ウイルス、およびバクテリオファージは本来レプリコンなので、適切なベクタ ーである。人工的ベクターは制限酵素および連結酵素を用いて異なる起源から得 たＤＮＡ分子を切断し、結合して構築する。ベクターには組換えＤＮＡクローニ ングベクターおよび組換えＤＮＡ発現ベクターを包含する。 アミノ酸の略号は３７ＣＦＲ§１．８２２（ｂ）（２）（１９９３年）に記載 の通り、米国特許商標庁が承認するものである。当技術分野の熟練者はある種の アミノ酸に転位を起こす傾向があることを認識していることであろう。例えば、 １４巻：４８５〜９４頁（１９７９年）およびその引用文献に記載の通り、Ａｓ ｐはアスパルチミドおよびイソアスパリギンに転位することもある。これらの転 位誘導体は本発明の範囲内に含める。特段の記載がない限り、アミノ酸はＬ−配 置である。 前記の通り、本発明は式（Ｉ）： ［式中、 Ａは基本的に肥満症蛋白質またはその類似体のアミノ酸残基１からアミノ酸残 基９５までから構成されるポリペプチドである。 Ｂは基本的にこの蛋白質のアミノ酸残基９７からアミノ酸残基１４５までから 構成されるポリペプチドである。 Ｒ₁およびＲ₂は独立してＨであるか、またはそれが結合している硫黄とともに 混合ジスルフィドを形成する。 但し、Ｒ₁およびＲ₂の双方がＨであることはないものとする］ で示される蛋白質を提供する。 好適な態様ではＡは式：（配列番号２） ［配列中、 Ｒ₃は不在であるか、Ｍｅｔ、Ｍｅｔ−Ｒ₄、またはリーダー配列である。 Ｒ₄はＰｒｏ以外のアミノ酸のいずれかである。 ２８位のＸａａはＧｌｎまたは不在である。 ４位のＧｌｎは所望ならＧｌｕに置換する、 ７位のＧｌｎは所望ならＧｌｕに置換する、 ２２位のＡｓｎは所望ならＧｌｎまたはＡｓｐに置換する、 ２７位のＴｈｒは所望ならＡｌａに置換する、 ２８位のＸａａは所望ならＧｌｕに置換する、 ３４位のＧｌｎは所望ならＧｌｕに置換する、 ５４位のＭｅｔは所望ならメチオニンスルホキシド、Ｌｅｕ、Ｉｌｅ、Ｖａ ｌ、Ａｌａ、またはＧｌｙに置換する、 ５６位のＧｌｎは所望ならＧｌｕに置換する、 ６２位のＧｌｎは所望ならＧｌｕに置換する、 ６３位のＧｌｎは所望ならＧｌｕに置換する、 ６８位のＭｅｔは所望ならメチオニンスルホキシド、Ｌｅｕ、Ｉｌｅ、Ｖａ ｌ、Ａｌａ、またはＧｌｙに置換する、 ７２位のＡｓｎは所望ならＧｌｎ、ＧｌｕまたはＡｓｐに置換する、 ７５位のＧｌｎは所望ならＧｌｕに置換する、 ７７位のＳｅｒは所望ならＡｌａに置換する、 ７８位のＡｓｎは所望ならＧｌｎまたはＡｓｐに置換する、 または ８２位のＡｓｎは所望ならＧｌｎまたはＡｓｐに置換する］ で示されるポリペプチドである。 その他の好適な態様にはＡが式：（配列番号２） ［配列中、２８位のＸａａはＧｌｎまたは不在である］ で示されるポリペプチであるものを含む。 さらに別の好適な態様にはＢが式：（配列番号３） ［配列中、 ９７位のＨｉｓは所望ならＧｌｎ、Ａｓｎ、Ａｌａ、Ｇｌｙ、Ｓｅｒまたは Ｐｒｏに置換する、 １００位のＴｒｐは所望ならＡｌａ、Ｇｌｕ、Ａｓｐ、Ａｓｎ、Ｍｅｔ、 Ｉｌｅ、Ｐｈｅ、Ｔｙｒ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、Ｇｌｙ、Ｇｌｎ、ＶａｌまたはＬｅ ｕに置換する、 １０１位のＡｌａは所望ならＳｅｒ、Ａｓｎ、Ｇｌｙ、Ｈｉｓ、Ｐｒｏ、Ｔｈ ｒまたはＶａｌに置換する、 １０２位のＳｅｒは所望ならＡｒｇに置換する、 １０３位のＧｌｙは所望ならＡｌａに置換する、 １０５位のＧｌｕは所望ならＧｌｎに置換する、 １０６位のＴｈｒは所望ならＬｙｓまたはＳｅｒに置換する、 １０７位のＬｅｕは所望ならＰｒｏに置換する、 １０８位のＡｓｐは所望ならＧｌｕに置換する、 １１１位のＧｌｙは所望ならＡｓｐに置換する、 １１８位のＧｌｙは所望ならＬｅｕに置換する、 １３０位のＧｌｎは所望ならＧｌｕに置換する、 １３４位のＧｌｎは所望ならＧｌｕに置換する、 １３６位のＭｅｔは所望ならメチオニンスルホキシド、Ｌｅｕ、Ｉｌｅ、Ｖａ ｌ、Ａｌａ、またはＧｌｙに置換する、 １３８位のＴｒｐは所望ならＡｌａ、Ｇｌｕ、Ａｓｐ、Ａｓｎ、Ｍｅｔ、Ｉｌ ｅ、Ｐｈｅ、Ｔｙｒ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、Ｇｌｙ、Ｇｌｎ、ＶａｌまたはＬｅｕに 置換する、 または １３９位のＧｌｎは所望ならＧｌｕに置換する］ で示されるポリペプチドである蛋白質を含む。 他の好適な態様にはＢが式：（配列番号３） ［配列中、１００位のＴｒｐは所望ならＡｌａ、Ｇｌｕ、Ａｓｐ、Ａｓｎ、Ｍｅ ｔ、Ｉｌｅ、Ｐｈｅ、Ｔｙｒ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、Ｇｌｙ、Ｇｌｎ、Ｖａｌまたは Ｌｅｕに置換する］ で示されるポリペプチである蛋白質を含む。 当技術分野の熟練者は肥満症蛋白質またはその類似体の原核生物発現系での生 産では蛋白質のＮ−末端にＮ−末端延長付加物を有する蛋白質を発現することが 必要なことを認識しているであろう。このＮ−末端延長は所望ならば投与の前に 蛋白質から切断する。好適なＮ−末端延長はＭｅｔまたはＭｅｔ−Ｒ₄であり、 ここにＲ₄はＰｒｏを除いたアミノ酸のいずれかである。 本発明はまた精製またはその他の目的に使用してもよいアミノ酸リーダー配列 １個またはそれ以上を所望ならばＡに含む蛋白質も包含する。 最も好適なリーダー配列には次のものを含む： （配列番号４）Ｇｌｙ−Ｓｅｒ−Ｈｉｓ−Ｍｅｔ、 （配列番号５）Ｍｅｔ−Ｇｌｙ−Ｓｅｒ−Ｓｅｒ−Ｈｉｓ−Ｈｉｓ−Ｈｉｓ− Ｈｉｓ−Ｈｉｓ−Ｈｉｓ−Ｓｅｒ−Ｓｅｒ−Ｇｌｙ−Ｌｅｕ−Ｖａｌ−Ｐｒｏ− Ａｒｇ−Ｇｌｙ−Ｓｅｒ−Ｈｉｓ−Ｍｅｔ、 （配列番号６）Ｌｅｕ−Ｇｌｕ−Ｌｙｓ−Ａｒｇ−Ｇｌｕ−Ａｌａ−Ｇｌｕ− Ａｌａ、 （配列番号７）Ｇｌｕ−Ａｌａ−Ｇｌｕ−Ａｌａ、 （配列番号８）Ｌｅｕ−Ｇｌｕ−Ｌｙｓ−Ａｒｇ−、 （配列番号９）Ｍｅｔ−Ｇｌｙ−Ｓｅｒ−Ｓｅｒ−Ｈｉｓ−Ｈｉｓ−Ｈｉｓ− Ｈｉｓ−Ｈｉｓ−Ｈｉｓ−Ｓｅｒ−Ｓｅｒ−Ｇｌｙ−Ｌｅｕ−Ｖａｌ−Ｐｒｏ− Ａｒｇ−Ｇｌｙ−Ｓｅｒ−Ｐｒｏ、 および （配列番号１０）Ｇｌｙ−Ｓｅｒ−Ｐｒｏ−。 このようなＮ−末端延長および／またはリーダー配列はこの発明の基本的な特性 および新規性のある特性には影響を及ぼさない。 式（Ｉ）で示される化合物は生物学的活性肥満症蛋白質の折り畳み中間体であ る。好適な肥満症蛋白質は在来型配列および、たとえばＢａｓｉｎｓｋｉほか、 １９９５年２月６日出願の米国出願番号０８／３８３６３８号および１９９６年 １月１９日出願の出願番号０８／５８８０６１号に記載されている式（ＩＩＩ） で示される類似体である。マウスおよびウシの配列はＨａｎｓｅｎ・Ｍ．Ｈｓｉ ｕｎｇおよびＤｅｎｎｉｓ・Ｐ．Ｓｍｉｔｈ、１９９５年５月１９日出願の米国 特許出願番号０８／４４５３０５号に記載されており、ここに参考のために引用 する。本発明の最も好適な蛋白質には式（ＩＩＩ）、配列番号１１、配列番号１ ２、配列番号１３、および配列番号１４で示される蛋白質を包含する。 （配列番号１１） ［配列中、２８位のＸａａはＧｌｎまたは不在である］ （配列番号１２） （配列番号１３） ［配列中、２８位のＸａａはＧｌｎまたは不在である］ ヒト肥満症蛋白質 （配列番号１４） ［配列中、２８位のＸａａはＧｌｎまたは不在である］ 本発明のその他の好適な蛋白質は式（ＩＩＩ）で示される蛋白質であって、 その式中： ４位のＧｌｎをＧｌｕに置換、 ７位のＧｌｎをＧｌｕに置換、 ２２位のＡｓｎをＧｌｎまたはＡｓｐに置換、 ２７位のＴｈｒをＡｌａに置換、 ２８位のＧｌｎをＧｌｕに置換、 ３４位のＧｌｎをＧｌｕに置換、 ５４位のＭｅｔをメチオニンスルホキシド、Ｌｅｕ、またはＡｌａに置換、 ５６位のＧｌｎをＧｌｕに置換、 ６２位のＧｌｎをＧｌｕに置換、 ６３位のＧｌｎをＧｌｕに置換、 ６８位のＭｅｔをメチオニンスルホキシド、またはＬｅｕに置換、 ７２位のＡｓｎをＧｌｎまたはＡｓｐに置換、 ７５位のＧｌｎをＧｌｕに置換、 ７８位のＡｓｎをＧｌｎまたはＡｓｐに置換、 ８２位のＡｓｎをＧｌｎまたはＡｓｐに置換、 １３０位のＧｌｎをＧｌｕに置換、 １３４位のＧｌｎをＧｌｕに置換、 １３６位のＭｅｔをメチオニンスルホキシド、Ｌｅｕ、Ｉｌｅに置換、 または １３９位のＧｌｎをＧｌｕに置換、 したものである。 その他の好適な蛋白質は式（ＩＩＩ）で示される蛋白質であって、 その式中、 ２２位のＡｓｎをＧｌｕまたはＡｓｐに置換、 ２７位のＴｈｒをＡｌａに置換、 ５４位のＭｅｔをメチオニンスルホキシド、Ｌｅｕ、またはＡｌａに置換、 ６８位のＭｅｔをメチオニンスルホキシド、またはＬｅｕに置換、 ７２位のＡｓｎをＧｌｎまたはＡｓｐに置換、 ７８位のＡｓｎをＧｌｎまたはＡｓｐに置換、 ８２位のＡｓｎをＧｌｎまたはＡｓｐに置換、 または １３６位のＭｅｔをメチオニンスルホキシド、Ｌｅｕ、Ｉｌｅに置換、 したものである。 さらになお追加的に好適な蛋白質は式（ＩＩＩ）で示される蛋白質であって、 その式中、 ２２位のＡｓｎをＧｌｎ、またはＡｓｐに置換、 ２７位のＴｈｒをＡｌａに置換、 ５４位のＭｅｔをＬｅｕ、またはＡｌａに置換、 ６８位のＭｅｔをＬｅｕに置換、 ７２位のＡｓｎをＧｌｎ、またはＡｓｐに置換、 ７８位のＡｓｎをＧｌｎ、またはＡｓｐに置換、 ８２位のＡｓｎをＧｌｎ、またはＡｓｐに置換、 または １３６位のＭｅｔをＬｅｕ、またはＩｌｅに置換、 したものである。 最も顕著な利点のある他の好適な態様は配列番号１で示される蛋白質のアミノ 酸残基９７からアミノ酸残基１１１までおよび／またはアミノ酸残基１３８での 特異的な置換体である。この置換体は安定性が顕著に改善され、優れた治療薬を 与える。この特定蛋白質はさらに製剤化し易く、医薬的に単純精密で、治療用量 の送達に優れている。 従って、好適な態様は式（ＩＶ）：（配列番号１） ［配列中、 ２８位のＸａａはＧｌｎまたは不在である、 この蛋白質は次の置換から構成される群から選択した置換を少なくとも１個有 する： ９７位のＨｉｓをＧｌｎ、Ａｓｎ、Ａｌａ、Ｇｌｙ、ＳｅｒまたはＰｒｏに 置換、 １００位のＴｒｐをＡｌａ、Ｇｌｕ、Ａｓｐ、Ａｓｎ、Ｍｅｔ、Ｉｌｅ、Ｐｈ ｅ、Ｔｙｒ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、Ｇｌｙ、Ｇｌｎ、ＶａｌまたはＬｅｕに置換、 １０１位のＡｌａをＳｅｒ、Ａｓｎ、Ｇｌｙ、Ｈｉｓ、Ｐｒｏ、Ｔｈｒまたは Ｖａｌに置換、 １０２位のＳｅｒをＡｒｇに置換、 １０３位のＧｌｙをＡｌａに置換、 １０５位のＧｌｕをＧｌｎに置換、 １０６位のＴｈｒをＬｙｓまたはＳｅｒに置換、 １０７位のＬｅｕをＰｒｏに置換、 １０８位のＡｓｐをＧｌｕに置換、 １１１位のＧｌｙをＡｓｐに置換、 または １３８位のＴｒｐをＡｌａ、Ｇｌｕ、Ａｓｐ、Ａｓｎ、Ｍｅｔ、Ｉｌｅ、Ｐｈ ｅ、Ｔｙｒ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、Ｇｌｙ、Ｇｌｎ、ＶａｌまたはＬｅｕに置換］ で示される蛋白質またはその医薬的に許容される塩である。 好適な蛋白質は式（Ｖ）：（配列番号１５） で示される蛋白質またはその医薬的に許容される塩であって、その蛋白質は次の 置換から構成される群から選択した置換を少なくとも１個有する： ９７位のＨｉｓをＧｌｎ、Ａｓｎ、Ａｌａ、Ｇｌｙ、Ｓｅｒ、またはＰｒｏ に置換、 １００位のＴｒｐをＡｌａ、Ｇｌｕ、Ａｓｐ、Ａｓｎ、Ｍｅｔ、Ｉｌｅ、Ｐｈ ｅ、Ｔｙｒ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、Ｇｌｙ、Ｇｌｎ、ＶａｌまたはＬｅｕに置換、 １０１位のＡｌａをＳｅｒ、Ａｓｎ、Ｇｌｙ、Ｈｉｓ、Ｐｒｏ、Ｔｈｒまたは Ｖａｌに置換、 １０２位のＳｅｒをＡｒｇに置換、 １０３位のＧｌｙをＡｌａに置換、 １０５位のＧｌｕをＧｌｎに置換、 １０６位のＴｈｒをＬｙｓまたはＳｅｒに置換、 １０７位のＬｅｕをＰｒｏに置換、 １０８位のＡｓｐをＧｌｕに置換、 １１１位のＧｌｙをＡｓｐに置換、 または １３８位のＴｒｐをＡｌａ、Ｇｌｕ、Ａｓｐ、Ａｓｎ、Ｍｅｔ、Ｉｌｅ、Ｐｈ ｅ、Ｔｙｒ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、Ｇｌｙ、Ｇｌｎ、ＶａｌまたはＬｅｕに置換。 式（Ｖ）で示される、さらに好適な蛋白質は次のものである： ９７位のＨｉｓがＧｌｎ、Ａｓｎ、Ａｌａ、Ｇｌｙ、Ｓｅｒ、またはＰｒｏ に置換されている、 １００位のＴｒｐがＡｌａ、Ｇｌｕ、Ａｓｐ、Ａｓｎ、Ｍｅｔ、Ｉｌｅ、Ｐｈ ｅ、Ｔｙｒ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、Ｇｌｙ、ＧｌｎまたはＬｅｕに置換されている、 １０１位のＡｌａがＳｅｒ、Ａｓｎ、Ｇｌｙ、Ｈｉｓ、Ｐｒｏ、Ｔｈｒまたは Ｖａｌに置換されている、 １０５位のＧｌｕがＧｌｎに置換されている、 １０６位のＴｈｒがＬｙｓまたはＳｅｒに置換されている、 １０７位のＬｅｕがＰｒｏに置換されている、 １０８位のＡｓｐがＧｌｕに置換されている、 １１１位のＧｌｙがＡｓｐに置換されている、 または １３８位のＴｒｐがＡｌａ、Ｇｌｕ、Ａｓｐ、Ａｓｎ、Ｍｅｔ、Ｉｌｅ、Ｐｈ ｅ、Ｔｙｒ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、Ｇｌｙ、Ｇｌｎ、ＶａｌまたはＬｅｕに置換され ている。 式（Ｖ）で示される、その他の好適な蛋白質は次のものである： ９７位のＨｉｓがＳｅｒまたはＰｒｏに置換されている、 １００位のＴｒｐがＡｌａ、Ｇｌｙ、Ｇｌｎ、Ｖａｌ、Ｉｌｅ、またはＬｅｕ に置換されている、 １０１位のＡｌａがＴｈｒに置換されている、 または １３８位のＴｒｐがＡｌａ、Ｉｌｅ、Ｇｌｙ、Ｇｌｎ、Ｖａｌ、またはＬｅｕ に置換されている。 式（Ｖ）で示される、さらに別の好適な蛋白質は次のものである： ９７位のＨｉｓがＳｅｒまたはＰｒｏに置換されている、 １００位のＴｒｐがＡｌａ、Ｇｌｎ、またはＬｅｕに置換されている、 １０１位のＡｌａがＴｈｒに置換されている、 または １３８位のＴｒｐがＧｌｎに置換されている。 式（Ｖ）で示される最も好適な種は配列番号１６および１７の分子種を含む。 （配列番号１６） （配列番号１７） 最も顕著な利点は、本発明は肥満症蛋白質の生物学的活性蛋白質立体配座への 非常に効率的な変換を誘導する中間体を提供する。それ故、本発明中間体を製造 することによって生物学的活性蛋白質の３次構造が最初に形成される。こうして ジスルフィド結合の殆ど定量的な変換が可能になる。Ｓ−Ｓリンク二量体または その他の多量体の形成は減少する。 本発明の蛋白質は組換えＤＮＡ技術によってまたは、たとえば液相または固相 ペプチド合成または蛋白質断片から始めて通常の液相法を経て組合せた半合成の ようなよく知られている化学操作法によって調製する。式（ＩＩＩ）または配列 番号１１、１２、１３、または１４で示される蛋白質は組換え合成によって調製 するのが好ましい。 好収率を望むなら組換え法が好適である。蛋白質組換え生産の基本的工程には 次の段階を含む： ａ）その蛋白質をコードする合成または半合成（または天然起源から分離）Ｄ ＮＡの構築、 ｂ）その蛋白質の単独蛋白質または融合蛋白質として発現に適する様式による そのコード配列の発現ベクターへの組込み、 ｃ）その発現ベクターによる適当な原核生物宿主細胞の形質転換、および ｄ）組換え生産蛋白質の回収および精製。ａ．遺伝子構築 試験管内または生体内での転写および翻訳が蛋白質の生産を起こす合成遺伝子 は当技術分野でよく知られている技術で構築してもよい。遺伝子コードの天然縮 重のため、熟練した専門家はこの蛋白質をコードする多数であるが限定された数 のＤＮＡ配列が構築しうることを認識するであろう。本発明の好適な実行では、 合成を組換えＤＮＡ技術で達成する。 合成遺伝子構築の方法論は当技術分野でよく知られている。例えばＢｒｏｗｎ ほか（１９７９年）、Ｍｅｔｈｏｄｓ・ｉｎ・Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ、Ａｃａｄ ｅｍｉｃ・Ｐｒｅｓｓ社、ＮＹ、６８巻：１０９〜１５１頁参照。合成蛋白質遺 伝子に対応するＤＮＡ配列はたとえばＡｐｐｌｉｅｄ・Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社 ３８０Ａ型または３８０Ｂ型ＤＮＡ合成装置（Ａｐｐｌｉｅｄ・Ｂｉｏｓｙｓｔ ｅｍｓ社、８５０リンカーンセンタードライブ・フォスター市、ＣＡ９４４０４ から購入できる）のような通常のＤＮＡ合成装置を用いて作製してもよい。 適用によっては、融合蛋白質構築物からシグナルペプチドの制御された切除を 促進するため好都合なプロテアーゼ感受性切断部位をたとえばシグナルペプチド と構造蛋白質の間などに導入するように蛋白質のコード配列を修正することが望 ましいこともある。例えばＭ１３プライマー突然変異誘発など、既知配列を持つ ＤＮＡの所定部位に置換突然変異を起こす技術はよく知られている。本抗肥満症 蛋白質をコードするＤＮＡに誘発する突然変異は配列を読取り枠の外に出しては ならず、また二次的ｍＲＮＡ構造を作ることがあるかも知れない相補領域を作成 しないものが好ましい。ＤｅＢｏｅｒほか、欧州特許第７５４４４Ａ号（１９８ ３年）参照。 本蛋白質をコードする遺伝子はポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）を用いて作製 してもよい。鋳型はｃＤＮＡライブラリー（ＣＬＯＮＥＴＥＣＨ社またはＳＴＲ ＡＴＡＧＥＮＥ社から購入できる）でも、ヒト脂肪組織から分離したｍＲＮＡで もよい。その方策は当技術分野でＭａｎｉａｔｉｓほか、「分子クローニング： 実験室便覧（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ・Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ・Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ ・ Ｍａｎｕａｌ）」、Ｃｏｌｄ・Ｓｐｒｉｎｇ・Ｈａｒｂｏｒ・Ｐｒｅｓｓ社、Ｃ ｏｌｄ・Ｓｐｒｉｎｇ・Ｈａｒｂｏｒ・Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ、Ｃｏｌｄ・Ｓｐ ｒｉｎｇ・Ｈａｒｂｏｒ、ニューヨーク（１９８９年）などによく知られている 。ｂ．融合蛋白質の直接的発現 この肥満症蛋白質は直接的発現によって、またはこの蛋白質を含む融合蛋白質 として、製造した後に酵素的または化学的切断をしてもよい。ポリペプチドを特 定部位で切断して消化するか、またはペプチド鎖のアミノ末端（たとえばジアミ ノペプチダーゼ）またはカルボキシ末端から切断する種々のペプチダーゼ（たと えばトリプシン）が知られている。さらにその上、特殊な化学薬品（たとえばシ アノーゲンブロミド）にはポリペプチド鎖を特定部位で切断する。熟練した専門 家は部位特異的な内部切断部位を導入するためのアミノ酸配列（および組換え手 法を採用するなら合成的または半合成的コード配列）への必要な修正を認識する ものであろう。例えば「蛋白質の精製：分子機構から大量生産まで（Ｐｒｏｔｅ ｉｎ・Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ：Ｆｒｏｍ・Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ・Ｍｅｃｈａ ｎｉｓｍｓ・ｔｏ・Ｌａｒｇｅ・Ｓｃａｌｅ・Ｐｒｏｃｅｓｓｅｓ）」、米国化 学会、ワシントン、ＤＣ（１９９０年）、第１３章のＣａｒｔｅｒ，Ｐ．、融合 蛋白質の部位特異的蛋白質分解（Ｓｉｔｅ・Ｓｐｅｃｉｆｉｃ・Ｐｒｏｔｅｏｌ ｙｉｓｉｓ・ｏｆ・Ｆｕｓｉｏｎ・Ｐｒｏｔｅｉｎ）参照。ｃ．ベクターの構築 所望のコード配列および制御配列を含有する適当なベクターの構築は標準的な 連結技術を採用する。分離したプラスミドまたはＤＮＡ断片を制限酵素によって 消化し、仕立て、連結して必要なプラスミドを形成する。 所望蛋白質に翻訳させるため、適切な組換えＤＮＡ発現ベクター多数の何れか に適当な制限エンドヌクレアーゼを用いて加工した合成ＤＮＡ配列を挿入する。 合成コード配列は転写物の両端に制限エンドヌクレアーゼ部位を持つように設計 して発現プラスミドからの分離および増幅プラスミドへの挿入を促進する。分離 したｃＤＮＡコード配列は当技術分野でよく知られている技術によって所望クロ ーニングベクターへのこの配列挿入を促進するため合成リンカーを使用すること によって容易に修飾しうる。採用する特定エンドヌクレアーゼは採用する親発現 ベクターの制限エンドヌクレアーゼ切断パターンによって支配される。制限部位 の選択では制御配列とともにコード配列が正しい方向に向くように選択して正し い枠内読取りおよび蛋白質発現を達成させる。 一般に、宿主細胞に適合する種に由来するプロモーターおよび制御配列を含有 するプラスミドベクターを用いる。通常、このベクターは複製部位ならびに形質 転換された細胞に表現型選択を与えることのできるマーカー配列を有する。例え ば、大腸菌は典型的には大腸菌種に由来するプラスミドであるｐＢＲ３２２を使 用して形質転換する（Ｂｏｌｉｖａｒほか、Ｇｅｎｅ、２巻：９５頁（１９７７ 年））。プラスミドｐＢＲ３２２はアンピシリン耐性遺伝子およびテトラサイク リン耐性遺伝子を含み、形質転換細胞の容易な確認手段を提供する。このｐＢＲ ３２２プラスミドまたはその他の微生物プラスミドは組換えＤＮＡ技術で通常に 使用するプロモーターおよびその他の制御エレメントを含んでいるか、または含 めるように修正しなければならない。 所望のコード配列は宿主細胞内で機能するプロモーターおよびリボソーム結合 部位の両者から転写翻訳するために正しい方向に発現ベクターに挿入する。かか る発現ベクターの例はＢｅｌａｇａｊｅほか、米国特許第５３０４４９３号に記 載のプラスミドであって、その教示を参考のために引用する。米国特許第５３０ ４４９３号に記載のあるＡ−Ｃ−Ｂプロインスリンをコードする遺伝子は制限酵 素ＮｄｅＩおよびＢａｍＨＩでプラスミドｐＲＢ１８２から除去できる。本発明 の蛋白質をコードする遺伝子はプラスミド骨格のＮｄｅＩ／ＢａｍＨＩ制限断片 カセットに挿入できる。ｄ．原核生物発現 一般に本発明に有用なベクターを構築するには原核生物を使用してＤＮＡ配列 をクローニングする。例えば大腸菌Ｋ１２の２９４株（ＡＴＣＣ３１４４６）は 殊に有用である。その他の使用しうる微生物株には大腸菌Ｂおよび大腸菌Ｘ１７ ７６株（ＡＴＣＣ３１５３７）を含む。これらの例は単なる例示であって、限定 ではない。 また、原核生物は組換え蛋白質の発現にも使用する。前記の株ならびに大腸菌 Ｗ３１１０株（原栄養株、ＡＴＣＣ２７３２５）、枯草菌のようなバチラス種、 およびその他サルモネラ・ティフィムリウムまたはセラチア・マルセッセンスの ような腸内細菌類、および種々のシュードモナス種も利用しうる。原核生物宿主 における使用に適するプロモーターにはβ−ラクタマーゼプロモーターシステム （ベクターｐＧＸ２９０７［ＡＴＣＣ３９３４４］はレプリコンおよびβ−ラク タマーゼ遺伝子を含有する）、乳糖プロモーターシステム（Ｃｈａｎｇほか、Ｎ ａｔｕｒｅ、２７５巻：６１５頁（１９７８年）；Ｇｏｅｄｄｅｌほか、Ｎａｔ ｕｒｅ、２８１巻：５４４頁（１９７９年））、アルカリホスファターゼ、トリ プトフアン（ｔｒｐ）プロモーターシステム（ベクターｐＡＴＨ１［ＡＴＣＣ３ ７６９５］はｔｒｐプロモーター制御下にｔｒｐＥ融合蛋白質として読取り枠の 発現を促進するように設計されている）およびたとえばｔａｃプロモーター（プ ラスミドｐＤＲ５４０、ＡＴＣＣ３７２８２から分離できる）のようなハイブリ ッドプロモーターを含む。しかしながら、ヌクレオチド配列が一般に知られてい る他の機能的細菌プロモーターに本蛋白質をコードするＤＮＡをリンカーまたは アダプターを用いて連結し、必要な制限部位を供給することが当技術分野の熟練 者には可能になる。細菌系で用いるプロモーターに蛋白質をコードするＤＮＡに 作動可能に連結するシャイン−ダルガノ配列を含めるとよい。 次の製造例は本明細書に記載する蛋白質の製造法をさらに例示するために提供 するものである。 製造例１ Ｎ−末端延長Ｍｅｔ−Ａｒｇとともに配列番号１４の蛋白質をコードするＤＮ Ａ配列は標準的ＰＣＲ法を使用して調製した。正方向プライマー（５’−ＧＧ ＧＧ ＣＡＴ ＡＴＧ ＡＧＧ ＧＴＡ ＣＣＴ ＡＴＣ ＣＡＧ ＡＡＡ Ｇ ＴＣ ＣＡＧ ＧＡＴ ＧＡＣ ＡＣ、配列番号１８）および逆方向プライマー （５’−ＧＧ ＧＧ ＧＧＡＴＣ ＣＴＡ ＴＴＡ ＧＣＡ ＣＣＣ ＧＧＧ ＡＧＡ ＣＡＧ ＧＴＣ ＣＡＧ ＣＴＧ ＣＣＡ ＣＡＡ ＣＡＴ、配列番号 １９）を使用してヒト肥満細胞ライブラリー（ＣＬＯＮＥＴＥＣＨ社から購入で きる）から得た配列を増幅した。このＰＣＲ産物をＰＣＲ・Ｓｃｒｉｐｔ（ＳＴ ＲＡＴＡＧＥＮＥ社から購入できる）にクローニングし、配列決定した。 製造例２ ベクター構築 所望の蛋白質をコードするＤＮＡ配列を含むプラスミドをＮｄｅＩおよびＢａ ｍＨＩ制限部位を含めて構築する。クローニングしたＰＣＲ産物を有するプラス ミドをＮｄｅＩおよびＢａｍＨＩ制限酵素で消化する。小さな〜４５０ｂｐ断片 をゲル精製し、Ａ−Ｃ−Ｂプロインスリンをコードする配列を除去したベクター ｐＲＢ１８２に連結する。連結産物でＥ．ｃｏｌｉ・ＤＨ１０Ｂ（ＧＩＢＣＯ− ＢＲＬ社から購入できる）を形質転換し、テトラサイクリン１０μｇ／ｍＬ添加 トリプトン−イースト（ＤＩＦＣＯ社）プレート上で増殖するコロニーを分析す る。プラスミドＤＮＡを分離し、ＮｄｅＩおよびＢａｍＨＩで消化し、得られた 断片をアガロースゲル電気泳動で分離する。所期の〜４５０ｂｐＮｄｅＩおよび ＢａｍＨＩ制限部位断片を含むプラスミドを保存する。Ｅ．ｃｏｌｉ・Ｂ・ＢＬ ２１（ＤＥ３）（ＮＯＶＯＧＥＮ社から購入できる）をこの蛋白質産生用培養に 適する第二の発現プラスミドで形質転換する。 前記のベクターで細胞を形質転換する技術は当技術分野でよく知られており、 たとえばＭａｎｉａｔｉｓなど（１９８８年）「分子クローニング：実験室便覧 （Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ・Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ・Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ・Ｍａｎｕ ａｌ）」、Ｃｏｌｄ・Ｓｐｒｉｎｇ・Ｈａｒｂｏｒ・Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ、Ｃ ｏｌｄ・Ｓｐｒｉｎｇ・Ｈａｒｂｏｒ・Ｐｒｅｓs社、Ｃｏｌｄ・Ｓｐｒｉｎｇ ・Ｈａｒｂｏｒ、ニューヨークまたは「分子生物学における最新プロトコル（Ｃ ｕｒｒｅｎｔ・Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ・ｉｎ・Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ・Ｂｉｏｌｏｇ ｙ） 」（１９８９年）とその補遺のような一般的参考文献にも見出される。本明細書 に例示するような本発明の好適な実行に使用するＥ．ｃｏｌｉ細胞の形質転換に 関する技術は当技術分野でよく知られている。形質転換されたＥ．ｃｏｌｉ細胞 を培養する精密な条件は採用するＥ．ｃｏｌｉ宿主細胞系列および発現またはク ローニングベクターの性質に依存する。例えばｃ１８５７温度誘導性ラムダ−フ ァージプロモーター−オペレーター領域のような温度誘導性プロモーター−オペ レーター領域を導入したベクターは蛋白質合成を誘導するために約３０℃から約 ４０℃への温度シフトが必要である。 本発明の好適な態様ではＥ．ｃｏｌｉ・Ｋ１２・ＲＶ３０８細胞を宿主細胞と して採用するが、これに限定するものではないが、たとえばＥ．ｃｏｌｉ・Ｋ１ ２・Ｌ２０１、Ｌ６８７、Ｌ６９３、Ｌ５０７、Ｌ６４０、Ｌ６４１、Ｌ６９５ 、Ｌ８１４（Ｅ．ｃｏｌｉ・Ｂ）のようなその他多数の細胞系列も採用できる。 次に発現プラスミドに存在する耐性遺伝子に対応する抗生物質の選択圧下の適当 な培地に形質転換した宿主細胞を塗布する。次に採用する宿主細胞系列に適する 時間と温度で培養物をインキュベーションする。 高レベルの細菌発現システムで発現すると、蛋白質は凝集し、過剰発現蛋白質を 高濃度で含む顆粒体または封入体を形成することが多い。ＧｉｅｒａｓｃｈとＫ ｉｎｇ編、「蛋白質の折畳み（Ｐｒｏｔｅｉｎ・Ｆｏｌｄｉｎｇ）」中、Ｋｒｅ ｕｇｅｒなど、Ａｍｅｒｉｃａｎ・Ａｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ・ｆｏｒ・ｔｈｅ・ Ａｄｖａｎｃｅｍｅｎｔ・ｏｆ・Ｓｃｉｅｎｃｅ・Ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎ、第 ８９−１８Ｓ、ワシントン、ＤＣ。蛋白質を可溶化するため十分な濃度の変性剤 、好ましくは約６Ｍから８Ｍまでの尿素でｐＨ約７からｐＨ約１２まで、より好 ましくは８から１２までのｐＨ、に肥満症蛋白質を含む封入体を可溶化する。最 も好ましくは、封入体を約６Ｍから７Ｍ−尿素にｐＨ約８から１０で可溶化する 。所望の蛋白質濃度は約０．１ｍｇ／ｍＬからその溶液における本蛋白質の溶解 度まで、より好ましくは０．１から５０ｍｇ／ｍＬ、最も好ましくは０．５ｍｇ ／ｍＬから５．０ｍｇ／ｍＬである。これらの条件下に本蛋白質は変性する。変 性した蛋白質分子は注意深く制御した条件で再生を行うと在来型立体配座を再取 得 する。しかしながら、生物学的活性立体配座への再生は定量的な過程ではなく、 分子の非機能的種および立体配座が多数形成することもある。本発明はこの再生 における鍵となる中間体を提供するものである。 本発明の中間体は約１ｍＭから１００ｍＭ、好ましくは１ｍＭから２０ｍＭ、 最も好ましくは１ｍＭから１０ｍＭのチオール還元剤を添加することによって製 造する。このチオール型還元剤はジスルフィド交換を作動できる遊離−ＳＨを含 み、好ましくはシステイン、シスタミン、ＢＭＥ、その他である。好適なチオー ル試薬はシステインおよびシステアミンである。本発明の中間体は約１分間から ２４時間に生成する。この中間体は濾過、クロマトグラフィーまたはその他の通 常の方策によって精製できる。この中間体は正しい３次構造（在来型立体配座） を有するので、この中間体は生物学的活性治療剤として使用でき、効果または作 用の始動にも利点を示すであろう。しかしながら、この中間体を式ＩＩＩで示さ れる生物学的活性蛋白質に変換するのが好ましい。 最も予想が外れたのは、この中間体から生物学的活性蛋白質への変換が極めて 効率的で、凝集した蛋白質の沈降が殆どまたは全く認められず、共有結合二量体 または高次な多量体の形成が最低だったことである。混合ジスルフィド形成によ るこの蛋白質のシステイン残基の保護および中間体の形成によってジスルフィド 結合形成とほとんど無関係な３次構造形成が可能になる。この条件は生物学的活 性単量体蛋白質における分子内ジスルフィド結合形成に有利に働く。溶液中のチ オール還元試薬濃度および変性剤濃度を低下させることによってこの中間体にジ スルフィド結合を形成させて式ＩＩで示される生物学的活性蛋白質に変換する。 チオールおよび変性剤の減少は希釈、透析、透析濾過またはその他の当技術分野 で認められている技術によって実行してもよい。好ましくは、封入体の可溶化と 中間体の形成の後、溶液を蛋白質濃度約０．０５ｍｇ／ｍＬから約５．０ｍｇ／ ｍＬ、およびチオール約１ｍＭから２０ｍＭまで希釈し、次に透析または透析濾 過をする。好ましくは、透析または透析濾過に使用する緩衝液はＰＢＳ（約５ｍ Ｍから約１０ｍＭ−燐酸および５０ｍＭから５００ｍＭ−ＮａＣｌの燐酸緩衝食 塩水）、ｐＨ約７．０から１２．０、より好ましくは７．５から９．０である。 その他の適当な緩衝液には、これに限定するものではないが、４−（２−ヒドロ キシエチル）−１−ピペラジンエタンスルホン酸（ＨＥＰＥＳ）、またはトリス （ヒドロキシメチル）アミノメタン（ＴＲＩＳ）を含む。好ましくは、チオール 還元剤および変性剤の濃度はＰＢＳまたは約５ｍＭから１０ｍＭ−ＴＲＩＳに対 する透析濾過または透析によって低下させる。 この中間体から生物学的活性立体配座への変換は最も顕著な利点である−−定 量的変換に近い。そこで、この中間体を経ることにより、式ＩＩで示される生物 学的活性蛋白質が高収率で産生される。この中間体の形成で遊離ＳＨから直接に 行う折畳みよりも高蛋白質濃度で折畳みを行うことが可能になる。好適な範囲は ０．０５から５ｍｇ／ｍＬ、好ましくは０．１から３ｍｇ／ｍＬ、最も好ましく は１．０から２ｍｇ／ｍＬである。高濃度での折畳みは低容積（小さいタンク） および下流での操作減少を意味する。この折畳みは蛋白質凝集防止用グリセリン またはその他の添加試薬の不在下に行ってもよい。このような試薬、殊にグリセ リン、は下流の精製において除去しなければならないので、この試薬不在下に折 畳みする性能は多量生産では顕著な利点である。 そこで、この中間体を経て操作することによって、本発明は式ＩＩで示される 蛋白質の効率的な製法をさらに提供する。すなわち： （ａ）蛋白質を可溶化するために十分な濃度の変性剤および ｐＨ約７から約１２まで、濃度１ｍＭから１００ｍＭまでのチオール還元試薬 を含む溶液に肥満症蛋白質封入体を可溶化すること、および （ｂ）この溶液のチオールおよび変性剤の濃度を低下させてジスルフィド結合 を形成させること、 からなる。 好ましくは、約６から８Ｍ−尿素および約３から７ｍＭ−システイン添加８ｍ Ｍから１２ｍＭ−トリス緩衝液中、ｐＨ約８から１２、さらに好ましくはｐＨ約 ８から１０で封入体を添加して可溶化する。この条件で混合ジスルフィド中間体 が形成され、所望ならば濾過および／またはクロマトグラフィーによって精製す る。顕著な利点はこの中間体から鎖内単一ジスルフィドが形成する効率が希釈、 透析濾過または透析前のチオール還元試薬の追加によって増大することである。 好ましくはチオールを過剰当量−−好ましくは１から６０００倍、より好ましく は３から６０００倍過剰に−−添加する。最も好ましくは、５ｍＭのチオール、 好ましくはシステイン、を添加する。 生物学的活性蛋白質に変換した後、この蛋白質を反応混合物から、たとえばイ オン交換クロマトグラフィー、サイズ排除クロマトグラフィー、逆相クロマトグ ラフィー、その他のような当技術分野で認められている技術によって精製する。 式（Ｉ）で示される中間体は変性剤の存在下または不在下に安定である。この 中間体はＰＢＳに可溶性であって、正しい３次構造の形成を示唆する。所望なら ば、この中間体はサイズ排除クロマトグラフィー、イオン交換、逆相クロマトグ ラフィーを含む当技術分野で知られている技術によって精製してもよい。この中 間体はＨＰＬＣで特性解析した。代表的な本発明中間体のクロマトグラムを図１ に示す。さらにその上、この中間体はＳＤＳ−ＰＡＧＥ（ドデシル硫酸ナトリウ ム−ポリアクリルアミドゲル電気泳動）で生物学的活性蛋白質よりも移動の遅い 分子種として確認される。 以下の実施例はさらに本明細書に記載する本発明を例示するために提供する。 本発明の範囲が下記実施例のみから構成されるものとは理解すべきではない。 比較実施例１ 配列番号１４で示される蛋白質であって、２８位のＸａａがＧｌｎであって、 Ｍｅｔ−Ａｒｇ−Ｎ−末端延長を持つものを顆粒体（封入体）として産生した。 この顆粒体を分別遠心分離を使用する標準的操作法によって分離した。顆粒体を ６Ｍ−グアニジンＨＣｌ、１０ｍＭ−酢酸ナトリウム（ｐＨ５．０）、１ｍＭ− ＤＴＴに室温、１時間で可溶化した。本発明の混合ジスルフィドはこの条件では 検出できなかった。肥満症蛋白質のシステインはこの条件下にプロトン化されて （−ＳＨ）を形成する。溶解した蛋白質を遠心分離により透明にし、よく混合し ながら２０％グリセリン、５ｍＭ−酢酸ナトリウム（ｐＨ５．０）、５ｍＭ−Ｃ ａＣｌ₂で最終蛋白質濃度０．０２５ｍｇ／ｍＬまで希釈（希釈倍率１：１５０ ０）することによって透明になった蛋白質溶液の再生を開始した。この溶液は希 釈直後に濁り、蛋白質凝集が認められた。希釈した蛋白質溶液を室温で８時間混 合せずに放置後、固体トリス塩基を１０ｍＭまで加えて溶液のｐＨを８．６８に 上昇させた。この溶液を遠心分離で透明にし、非還元条件のＳＤＳ−ＰＡＧＥ、 逆相ＨＰＬＣおよびＥＳＩ−質量分析によって分析した。分析結果はこの蛋白質 の通算回収率６８％を示し、その中で７％は共有結合性二量体であって、単量体 蛋白質６３％を回収し、蛋白質３２％を損失した。 比較実施例２ 配列番号１４で示される蛋白質であって、２８位のＸａａがＧｌｎであって、 Ｍｅｔ−Ａｒｇ−Ｎ−末端延長を持つものを顆粒体（封入体）として産生した。 この顆粒体を分別遠心分離を使用する標準的操作法によって分離した。顆粒体を ６Ｍ−グアニジンＨＣｌ、１０ｍＭ−酢酸ナトリウム（ｐＨ４．５）、１ｍＭ− ＤＴＴに蛋白質濃度１．３ｍｇ／ｍＬで室温、１時間で可溶化した。本発明の混 合ジスルフィドはこの条件下には検出できなかった。システインはこの条件下に プロトン化されて（−ＳＨ）を形成する。 可溶化した蛋白質を遠心分離により透明にし、よく混合しながら２０％グリセ リン、２０ｍＭ−トリス（ｐＨ８．４）、２.５ｍＭ−ＣａＣｌ₂で最終蛋白質濃 度０．０２５ｍｇ／ｍＬまで希釈（希釈倍率１：５５）することによって透明に なった蛋白質溶液の再生を開始した。希釈蛋白質溶液を室温で１８時間混合せず に放置した。この溶液を遠心分離で透明にし、非還元条件のＳＤＳ−ＰＡＧＥ、 逆相ＨＰＬＣ、およびＥＳＩ−質量分析によって分析した。分析結果はこの蛋白 質の通算回収率＞９５％を示し、その中で１６％は共有結合性二量体であって、 単量体蛋白質８０％を回収した。 実施例１ 配列番号１４で示される蛋白質であって、２８位のＸａａがＧｌｎであって、 Ｍｅｔ−Ａｒｇ−Ｎ−末端延長を持つものを顆粒体（封入体）として産生した。 この顆粒体を分別遠心分離を使用する標準的操作法によって分離した。顆粒体を ８Ｍ−尿素、１０ｍＭ−トリス（ｐＨ８．０）、５ｍＭ−システインに蛋白質濃 度０．１ｍｇ／ｍＬで可溶化した。この蛋白質溶液の再生をＰＢＳに対する透析 により開始して過剰な変性剤とシステインを除去した。溶液を遠心分離によって 透明にし、非還元条件のＳＤＳ−ＰＡＧＥ、逆相ＨＰＬＣ、およびＥＳＩ−質量 分析によって分析した。分析結果はこの蛋白質の回収率＞９５％を示し、その中 で＜１％が共有結合性二量体であって、単量体蛋白質通算回収率９４％を得た。 実施例２ 配列番号１１で示される蛋白質であって、２８位のＸａａがＧｌｎであって、 Ｍｅｔ−Ａｓｐ−Ｎ−末端延長を持つものを顆粒体（封入体）として産生した。 顆粒体を分別遠心分離を使用する標準的操作法によって分離した。この顆粒体を 下記精製の出発材料とした。顆粒体を緩衝液Ａ（８Ｍ−尿素、１０ｍＭ−トリス （ｐＨ８．０）、５ｍＭ−システイン）に懸濁したところ、高濃度で（４０ｍｇ 蛋白質／ｍＬまで）溶解することを見出した。可溶化した蛋白質を遠心分離また は濾過で透明にした。この蛋白質は非還元性ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルにダブレット バンドとして移動し、還元性ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルでは単一バンドとして移動し た。これは内部ジスルフィド結合を有するある量の蛋白質および緩衝液のシステ インとの混合ジスルフィドとして存在するシステイン残基を持つある量の蛋白質 の存在に起因する。この蛋白質を先ず緩衝液Ａの存在下にＤＥＡＥアニオン交換 クロマトグラフィーで精製した。ＤＥＡＥ樹脂に結合した蛋白質を０．２５０ｍ ＭまでのＮａＣｌ勾配で溶離した。各画分の非還元性ＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析で殆 どの夾雑蛋白質は主たるＯｂピークの先端に存在することが判明した。ＤＥＡＥ 画分の保存的収集で比較的純粋な再生用Ｏｂ蛋白質を得た。ＰＢＳ中でこの蛋白 質を０．１ｍｇ／ｍＬまで希釈することによってこの蛋白質の再折畳みを開始し た。 この実施例を緩衝液Ａへの希釈およびＰＢＳに対する透析による変性剤とチオ ールの除去によって反復した。透析後も蛋白質は可溶性で、非還元性ＳＤＳ−Ｐ ＡＧＥに単一バンドを示した。この蛋白質を還元すると、ＳＤＳ−ＰＡＧＥで僅 かに遅い易動度を示す単一バンドを示し、再生の過程でジスルフィド結合が完全 に形成されたことを示す。蛋白質の最終的精製はサイズ排除クロマトグラフィー （スーパーデックス７５カラム、ＰＢＳ）で行い、精製したＯｂ蛋白質はＳＤＳ −ＰＡＧＥで単一バンドとして移動し、ＥＳＩ−質量分析によって単一なＮ−末 端アミノ酸配列を持つことが確認された。 実施例３ 配列番号１２で示される蛋白質を実施例１と類似の方法で製造した。 実施例４ 配列番号１３で示される蛋白質を実施例１と類似の方法で製造した。 実施例５ 配列番号１４で示され、Ｍｅｔ−Ａｓｐ−Ｎ−末端延長を持つ部分精製蛋白質 を８Ｍ−尿素、１０ｍＭ−トリス、５ｍＭ−システイン、ｐＨ８．０中、４℃で ４８時間インキュベーションしてこの蛋白質の各型の混合物を得た。非還元性の ＳＤＳ−ＰＡＧＥは約半分の蛋白質が内部ジスルフィド結合を持ち、他の半分は 持っていないことを示した。この蛋白質溶液をスルフヒドリル試薬ＤＴＮＢで分 析すると溶液には遊離スルフヒドリルは存在していなかった。これは溶液中のシ ステインがＯｂ蛋白質のシステインと混合ジスルフィドを形成したことを示す。 こうして生物学的活性Ｏｂ蛋白質への折畳み中間体を捕捉した。 この溶液の所定量をＰＢＳで０．１ｍｇ／ｍＬに希釈した。第二の所定量を２ ０ｍＭ−ＤＴＴ添加ＰＢＳで０．１ｍｇ／ｍＬに希釈した。両希釈試料を１００ ００倍過剰のＰＢＳに対して２４時間透析した。透析に続いて各試料を非還元性 ＳＤＳ−ＰＡＧＥで分析した。ＰＢＳで希釈した試料は内部ジスルフィド結合を 持つＯｂ蛋白質および内部ジスルフィド結合を持たないＯｂ蛋白質（可溶性中間 体）を含有していた。ＰＢＳ／ＤＴＴで希釈した試料は内部ジスルフィド結合を 持つＯｂ蛋白質のみを含有していた。 一度形成されると、Ｏｂ蛋白質とシステインの間の混合ジスルフィドは変性剤 除去後にも安定であった。この混合ジスルフィドＯｂ蛋白質はＰＢＳに可溶性で あって正しい２次構造の形成を示唆する。チオール試薬を過剰に添加するとジス ルフィド交換が刺激され、チオール試薬が徐々に外れて内部ジスルフィド結合を 有するＯｂ分子の形成を有利にする。 実施例６ 式（ＩＩＩ）（配列番号１）で示される蛋白質であって、２８位のＸａａがＧ ｌｎであり、１００位のＴｒｐがＧｌｕに置換され、Ｍｅｔ−Ａｒｇ−Ｎ−末端 延長を持つものを顆粒体（封入体）として産生した。この顆粒体を分別遠心分離 を使用する標準的操作法によって分離した。この顆粒体を下記精製のための出発 材料とした。この封入体を８Ｍ−尿素、１０ｍＭ−トリス（ｐＨ８．０）、５ｍ Ｍ−システインに可溶化し、混合ジスルフィド蛋白質をアニオン交換クロマトグ ラフィーで精製した。精製した蛋白質を緩衝液Ａと４８時間４℃でインキュベー ションした。システインが混合ジスルフィド（Ｒ₁＝ＳＣＨ₂Ｃ（ＣＯＯＨ）（Ｎ Ｈ₂））を形成したことの確認は１０ｍＭ−ＤＴＮＢ含有０．１Ｍ−トリス、ｐ Ｈ８（遊離−ＳＨ不在下に測定した値）を使用して行った。可溶化した蛋白質の 再生はこの蛋白質を８Ｍ−尿素、１０ｍＭ−トリス、ｐＨ８．０で０．１ｍｇ／ ｍＬまで希釈し、ＰＢＳに対する透析で開始した。２４時間後、試料１ｍＬをＣ １８・ＨＰＬＣから３０〜７０％直線状ＣＨ₃ＣＮ勾配１ｍＬ／分で溶離した。 非還元性緩衝液中、ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルで別々のバンド２個として移動するピ ーク２個を集めた。早く溶離するピークはＳＤＳ−ＰＡＧＥでは遅く移動し、そ の質量が本発明の混合ジスルフィド含有中間体に期待される質量であることをＥ ＳＩ−質量分析で確認した。遅く溶離するピークはＳＤＳ−ＰＡＧＥで速く移動 した。式ＩＩで示される鎖内ジスルフィド含有蛋白質に期待される質量を確認し た。この分析結果は蛋白質がジスルフィド含有蛋白質に変換される前に本発明の 混合ジスルフィド中間体が形成していることを確認した。 実施例７ 式（ＩＩＩ）（配列番号１）で示される蛋白質であって、２８位のＸａａがＧ ｌｎであり、１００位のＴｒｐがＧｌｕに置換され、Ｍｅｔ−Ａｒｇ−Ｎ−末端 延長を持つものを顆粒体（封入体）として産生した。この顆粒体を分別遠心分離 を使用する標準的操作法によって分離した。この顆粒体を下記精製のための出発 材料とした。この顆粒体を８Ｍ−尿素、１０ｍＭ−トリス（ｐＨ８．０）、５ｍ Ｍ−システインに可溶化した。この蛋白質を０．１ｍｇ／ｍＬまで希釈し、ＰＢ Ｓに対して透析して過剰な変性剤およびシステインを除去して蛋白質の再生を開 始した。 実施例８ 式（ＩＩＩ）（配列番号１）で示される蛋白質であって、２８位のＸａａがＧ ｌｎであり、１００位のＴｒｐがＡｌａに置換され、Ｍｅｔ−Ａｒｇ−Ｎ−末端 延長を持つものを顆粒体（封入体）として産生した。この顆粒体を分別遠心分離 を使用する標準的操作法によって分離した。この顆粒体を下記精製のための出発 材料とした。この顆粒体を８Ｍ−尿素、１０ｍＭ−トリス（ｐＨ８．０）、５ｍ Ｍ−システインに懸濁した。この蛋白質を０．１ｍｇ／ｍＬまで希釈し、ＰＢＳ に対して透析して過剰な変性剤およびシステインを除去することによって蛋白質 の再生を開始した。 Ｎ−末端Ｍｅｔ−Ａｒｇジペプチドはジペプチジルアミノペプチダーゼ（ｄＤ ＡＰ）を用いる当技術分野で認められている技術によって除去した。この蛋白質 はカチオン交換クロマトグラフィーで精製した。 実施例９ 式（ＩＩＩ）（配列番号１）で示される蛋白質であって、２８位のＸａａがＧ ｌｎであり、１００位のＴｒｐがＡｌａに置換され、Ｍｅｔ−Ａｒｇ−Ｎ−末端 延長を持つものを顆粒体（封入体）として産生した。この顆粒体を分別遠心分離 を用いる標準的操作法によって分離した。この顆粒体を下記精製のための出発材 料とした。この顆粒体を７Ｍ−尿素および５ｍＭ−システイン添加１０ｍＭ−ト リス、ｐＨ約８．０の添加によって可溶化した。可溶化した標本を濾過して透明 にした。この条件でこの蛋白質のシステイン残基は還元されたものとシステイニ ル混合ジスルフィドとなったものとの組合せとして存在していた。尿素で溶解し た混合ジスルフィド中間体を７Ｍ−尿素、１０ｍＭ−トリス、５ｍＭ−システイ ン、ｐＨ約８中、Ｂｉｇ・Ｂｅａｄ・Ｑ−セファロースカラム（Ｐｈａｒｍａｃ ｉａ・Ｆｉｎｅ・Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ社）アニオン交換クロマトグラフィーで精 製した。産物を直線状ＮａＣｌ勾配で溶離した。アニオン交換精製した中間体に システインを追加して、ｐＨを約９に調整した。この中間体を次に７Ｍ−尿素で 約２ｍｇ／ｍＬまで希釈した。折畳みおよび単一鎖内ジスルフィド結合形成はｐ Ｈ約９の１０ｍＭ−トリスに対する膜限外濾過／膜透析濾過を用いる尿素とシス テインの除去で行った。名目１００００ダルトンの分子量カットオフ限外濾過膜 を用いた。Ｎ−末端Ｍｅｔ−Ａｒｇジペプチドは当技術分野で認められている技 術によってジペプチジルジアミノペプチダーゼ（ｄＤＡＰ）を用いて除去した。 この蛋白質は約１から１０００μｇ／ｋｇの間の用量で投与する。好適な用量 は活性化合物約１０から１００μｇ／ｋｇまでである。成人に対する典型的な日 用量は約０．５から１００ｍｇまでである。この方法を実行するに当たって、式 （Ｉ）で示される化合物は毎日単回または多回投与できる。長期間の投与計画が 必要なこともある。投与あたりの用量または全投与量は医師が決定するものであ って、たとえば疾病の性質および重症度、患者の年齢および一般的健康状態およ びその化合物に対する患者の寛容度のような因子に依存する。 ここに本発明の原理、好適な態様および操作の様式を記載した。しかしながら それらの記載は説明用記載であるが限定用記載ではないので、本明細書によって 保護を求める本発明は開示の特定の型によって限定されると理解すべきでない。 当技術分野の熟練者は本発明の本質から逸脱することなく、種々の変種や変化を 行うことができるものである。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁶ 識別記号 ＦＩ Ｃ０７Ｋ 14/47 ＺＮＡ Ｃ０７Ｋ 14/47 ＺＮＡ Ｃ１２Ｐ 21/02 Ｃ１２Ｐ 21/02 Ｃ //(Ｃ１２Ｐ 21/02 Ｃ１２Ｒ 1:19） (81)指定国 ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＤＥ， ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，Ｌ Ｕ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ，ＣＦ ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＭＬ，ＭＲ，ＮＥ， ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＫＥ，ＬＳ，ＭＷ，ＳＤ，Ｓ Ｚ，ＵＧ)，ＵＡ(ＡＭ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ，ＭＤ ，ＲＵ，ＴＪ，ＴＭ)，ＡＬ，ＡＭ，ＡＴ，ＡＵ，ＡＺ ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ，ＣＨ，ＣＮ，ＣＺ， ＤＥ，ＤＫ，ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ，ＧＥ，ＨＵ，Ｉ Ｌ，ＩＳ，ＪＰ，ＫＥ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＫ ，ＬＲ，ＬＳ，ＬＴ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＫ， ＭＮ，ＭＷ，ＭＸ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，Ｒ Ｕ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ，ＴＪ，ＴＭ，ＴＲ ，ＴＴ，ＵＡ，ＵＧ，ＵＳ，ＵＺ，ＶＮ

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １．式（Ｉ）： ［式中、 Ａは基本的に肥満症蛋白質またはその類似体のアミノ酸残基１からアミノ酸残 基９５までから構成されるポリペプチドである。 Ｂは基本的にこの蛋白質のアミノ酸残基９７からアミノ酸残基１４５までから 構成されるポリペプチドである。 Ｒ₁およびＲ₂は独立してＨであるか、またはそれが結合する硫黄とともに混合 ジスルフィドを形成する。 但し、Ｒ₁およびＲ₂の双方がＨであることはないものとする］ で示される正しく折畳まれた蛋白質。 ２．Ａが式：（配列番号２） ［式中、 Ｒ₃は不在であるか、Ｍｅｔ、Ｍｅｔ−Ｒ₄であるか、またはリーダー配列であ る。 Ｒ₄はＰｒｏ以外のアミノ酸のいずれかである。 ２８位のＸａａはＧｌｎまたは不在である。 ４位のＧｌｎは所望ならばＧｌｕに置換する。 ７位のＧｌｎは所望ならばＧｌｕに置換する。 ２２位のＡｓｎは所望ならばＧｌｎまたはＡｓｐに置換する。 ２７位のＴｈｒは所望ならばＡｌａに置換する。 ２８位のＸａａは所望ならばＧｌｕに置換する。 ３４位のＧｌｎは所望ならばＧｌｕに置換する。 ５４位のＭｅｔは所望ならばメチオニンスルホキシド、Ｌｅｕ、Ｉｌｅ、Ｖａ ｌ、Ａｌａ、またはＧｌｙに置換する。 ５６位のＧｌｎは所望ならばＧｌｕに置換する。 ６２位のＧｌｎは所望ならばＧｌｕに置換する。 ６３位のＧｌｎは所望ならばＧｌｕに置換する。 ６８位のＭｅｔは所望ならばメチオニンスルホキシド、Ｌｅｕ、Ｉｌｅ、Ｖａ ｌ、Ａｌａ、またはＧｌｙに置換する。 ７２位のＡｓｎは所望ならばＧｌｎ、Ｇｌｕ、またはＡｓｐに置換する。 ７５位のＧｌｎは所望ならばＧｌｕに置換する。 ７７位のＳｅｒは所望ならばＡｌａに置換する。 ７８位のＡｓｎは所望ならばＧｌｎまたはＡｓｐに置換する。 または ８２位のＡｓｎは所望ならばＧｌｎまたはＡｓｐに置換する］ で示されるポリペプチドである請求項１の蛋白質。 ３．Ａが式：（配列番号２） ［式中、２８位のＸａａはＧｌｎまたは不在である］ で示されるポリペプチドである請求項２の蛋白質。 ４．Ｂが式：（配列番号３） ［式中、 ９７位のＨｉｓは所望ならばＧｌｎ、Ａｓｎ、Ａｌａ、Ｇｌｙ、Ｓｅｒ、また はＰｒｏに置換する。 １００位のＴｒｐは所望ならばＡｌａ、Ｇｌｕ、Ａｓｐ、Ａｓｎ、Ｍｅｔ、Ｉ ｌｅ、Ｐｈｅ、Ｔｙｒ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、Ｇｌｙ、Ｇｌｎ、Ｖａｌ、またはＬｅ ｕに置換する。 １０１位のＡｌａは所望ならばＳｅｒ、Ａｓｎ、Ｇｌｙ、Ｈｉｓ、Ｐｒｏ、Ｔ ｈｒ、またはＶａｌに置換する。 １０２位のＳｅｒは所望ならばＡｒｇに置換する。 １０３位のＧｌｙは所望ならばＡｌａに置換する。 １０５位のＧｌｕは所望ならばＧｌｎに置換する。 １０６位のＴｈｒは所望ならばＬｙｓまたはＳｅｒに置換する。 １０７位のＬｅｕは所望ならばＰｒｏに置換する。 １０８位のＡｓｐは所望ならばＧｌｕに置換する。 １１１位のＧｌｙは所望ならばＡｓｐに置換する。 １１８位のＧｌｙは所望ならばＬｅｕに置換する。 １３０位のＧｌｎは所望ならばＧｌｕに置換する。 １３４位のＧｌｎは所望ならばＧｌｕに置換する。 １３６位のＭｅｔは所望ならばメチオニンスルホキシド、Ｌｅｕ、Ｉｌｅ、Ｖ ａｌ、Ａｌａ、またはＧｌｙに置換する。 １３８位のＴｒｐは所望ならばＡｌａ、Ｇｌｕ、Ａｓｐ、Ａｓｎ、Ｍｅｔ、Ｉ ｌｅ、Ｐｈｅ、Ｔｙｒ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、Ｇｌｙ、Ｇｌｎ、Ｖａｌ、またはＬｅ ｕに置換する。 または １３９位のＧｌｎは所望ならばＧｌｕに置換する］ で示されるポリペプチドである請求項２の蛋白質。 ５．Ｂが式：（配列番号３） で示されるポリペプチドである請求項４の蛋白質。 ６．Ｂが式：（配列番号３） ［式中、１００位のＴｒｐはＡｌａ、Ｇｌｕ、Ａｓｐ、Ａｓｎ、Ｍｅｔ、Ｉｌｅ 、Ｐｈｅ、Ｔｙｒ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、Ｇｌｙ、Ｇｌｎ、Ｖａｌ、またはＬｅｕに 置換する］ で示されるポリペプチドである請求項４の蛋白質。 ７．Ｒ₃が （配列番号４）Ｇｌｙ−Ｓｅｒ−Ｈｉｓ−Ｍｅｔ、 （配列番号５）Ｍｅｔ−Ｇｌｙ−Ｓｅｒ−Ｓｅｒ−Ｈｉｓ−Ｈｉｓ−Ｈｉｓ− Ｈｉｓ−Ｈｉｓ−Ｈｉｓ−Ｓｅｒ−Ｓｅｒ−Ｇｌｙ−Ｌｅｕ−Ｖａｌ−Ｐｒｏ− Ａｒｇ−Ｇｌｙ−Ｓｅｒ−Ｈｉｓ−Ｍｅｔ、 （配列番号６）Ｌｅｕ−Ｇｌｕ−Ｌｙｓ−Ａｒｇ−Ｇｌｕ−Ａｌａ−Ｇｌｕ− Ａｌａ、 （配列番号７）Ｇｌｕ−Ａｌａ−Ｇｌｕ−Ａｌａ、 （配列番号８）Ｌｅｕ−Ｇｌｕ−Ｌｙｓ−Ａｒｇ−、 （配列番号９）Ｍｅｔ−Ｇｌｙ−Ｓｅｒ−Ｓｅｒ−Ｈｉｓ−Ｈｉｓ−Ｈｉｓ− Ｈｉｓ−Ｈｉｓ−Ｈｉｓ−Ｓｅｒ−Ｓｅｒ−Ｇｌｙ−Ｌｅｕ−Ｖａｌ−Ｐｒｏ− Ａｒｇ−Ｇｌｙ−Ｓｅｒ−Ｐｒｏ、 または （配列番号１０）Ｇｌｙ−Ｓｅｒ−Ｐｒｏ− から構成される群から選択したリーダー配列である請求項２から６までのいずれ か一つの蛋白質。 ８．Ｒ₃が （配列番号４）Ｇｌｙ−Ｓｅｒ−Ｈｉｓ−Ｍｅｔ、 （配列番号５）Ｍｅｔ−Ｇｌｙ−Ｓｅｒ−Ｓｅｒ−Ｈｉｓ−Ｈｉｓ−Ｈｉｓ− Ｈｉｓ−Ｈｉｓ−Ｈｉｓ−Ｓｅｒ−Ｓｅｒ−Ｇｌｙ−Ｌｅｕ−Ｖａｌ−Ｐｒｏ− Ａｒｇ−Ｇｌｙ−Ｓｅｒ−Ｈｉｓ−Ｍｅｔ、 （配列番号６）Ｌｅｕ−Ｇｌｕ−Ｌｙｓ−Ａｒｇ−Ｇｌｕ−Ａｌａ−Ｇｌｕ− Ａｌａ、 （配列番号７）Ｇｌｕ−Ａｌａ−Ｇｌｕ−Ａｌａ、 （配列番号８）Ｌｅｕ−Ｇｌｕ−Ｌｙｓ−Ａｒｇ−、 （配列番号９）Ｍｅｔ−Ｇｌｙ−Ｓｅｒ−Ｓｅｒ−Ｈｉｓ−Ｈｉｓ−Ｈｉｓ− Ｈｉｓ−Ｈｉｓ−Ｈｉｓ−Ｓｅｒ−Ｓｅｒ−Ｇｌｙ−Ｌｅｕ−Ｖａｌ−Ｐｒｏ− Ａｒｇ−Ｇｌｙ−Ｓｅｒ−Ｐｒｏ、 または （配列番号１０）Ｇｌｙ−Ｓｅｒ−Ｐｒｏ− から構成される群から選択したリーダー配列である請求項２から６までのいずれ か一つの蛋白質。 ９．Ｒ₃がＭｅｔ−Ａｒｇである請求項２から６までのいずれか一つの蛋白 質。 １０．肥満症蛋白質またはその類似体を変性剤および約１から１００ｍＭチオ ール濃度のチオール還元剤を含むｐＨ約７から約１２までの溶液と混合すること を含む請求項１から９までのいずれか一つの蛋白質の製法。 １１．肥満症蛋白質またはその類似体を変性剤および約１から１００ｍＭチオ ール濃度のチオール還元剤を含むｐＨ約８から約１２までの溶液と混合すること を含む請求項１から９までのいずれか一つの蛋白質の製法。 １２．式（ＩＩ）： ［式中、 Ａは基本的に肥満症蛋白質またはその類似体のアミノ酸残基１からアミノ酸残 基９５までから構成されるポリペプチドである。 Ｂは基本的にその蛋白質のアミノ酸残基９６からアミノ酸残基１４５までから 構成されるポリペプチドである］ で示される生物学的活性蛋白質の製法であって、 （ａ）肥満症蛋白質封入体を その蛋白質を可溶化するために十分な濃度の変性剤、および ｐＨ約７から約１２までで約１から１００ｍＭ−濃度のチオール を含む溶液に可溶化すること、 （ｂ）その溶液のチオールおよび変性剤の濃度を低下させてジスルフィド結合 を形成させること、 を含む製法。 １３．Ａが式：（配列番号２） ［式中、Ｒ₃は不在であるか、Ｍｅｔ、Ｍｅｔ−Ｒ₄であるか、またはリーダー配 列である。 Ｒ₄はＰｒｏ以外のアミノ酸のいずれかである。 ２８位のＸａａはＧｌｎまたは不在である］ で示される請求項１２の製法。 １４．Ｂが式：（配列番号３） で示される請求項１３の製法。 １５．Ｂが式：（配列番号３） ［式中、１００位のＴｒｐはＡｌａ、Ｇｌｕ、Ａｓｐ、Ａｓｎ、Ｍｅｔ、Ｉｌｅ 、Ｐｈｅ、Ｔｙｒ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、Ｇｌｙ、Ｇｌｎ、Ｖａｌ、またはＬｅｕに 置換する］ で示される請求項１３の製法。 １６．チオールおよび変性試薬の濃度低下を透析によって行う請求項１２から １５までのいずれか一つの製法。 １７．チオールおよび変性試薬の濃度低下を透析濾過によって行う請求項１２ から１５までのいずれか一つの製法。 １８．チオールおよび変性試薬の濃度低下を希釈によって行う請求項１２から １５までのいずれか一つの製法。 １９．式（ＩＩ）： ［式中、 Ａは基本的に肥満症蛋白質またはその類似体のアミノ酸残基１からアミノ酸残 基９５までから構成されるポリペプチドである。 Ｂは基本的にこの蛋白質のアミノ酸残基９７からアミノ酸残基１４５までから 構成されるポリペプチドである］ で示される生物学的活性蛋白質の製法であって、 （ａ）肥満症蛋白質封入体を その蛋白質を可溶化するために十分な濃度の変性剤、および ｐＨ約７から約１２までで１から１００ｍＭ−濃度のチオール還元剤、 を含む溶液に可溶化すること、 （ｂ）約１から２０ｍＭのチオール還元剤を添加することによってその溶液の 蛋白質濃度を約０．０５ｍｇ／ｍＬから５．０ｍｇ／ｍＬに調整すること、 （ｃ）ジスルフィド結合形成を起こすまで溶液のチオールおよび変性剤濃度を 低下させること、 からなる製法。 ２０．請求項１０から１９までのいずれか一つの製法によって製造したもので ある蛋白質。