JPH0714340B2 - アスタキサンチン生産性酵母細胞，その製造方法及びその使用 - Google Patents
アスタキサンチン生産性酵母細胞，その製造方法及びその使用Info
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- JPH0714340B2 JPH0714340B2 JP63503601A JP50360188A JPH0714340B2 JP H0714340 B2 JPH0714340 B2 JP H0714340B2 JP 63503601 A JP63503601 A JP 63503601A JP 50360188 A JP50360188 A JP 50360188A JP H0714340 B2 JPH0714340 B2 JP H0714340B2
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Description
【発明の詳細な説明】 本発明は、アスタキサンチン生産性酵母細胞株、その製
造方法、その培養方法、及び該酵母細胞からアスタキサ
ンチンを単離する方法に関する。さらに、本発明は、ア
スタキサンチン生産性酵母細胞又はそれから回収された
アスタキサンチンを含有する食品又は飼料、並びに食品
又は飼料の製造方法及び該飼料による動物の飼育方法に
関する。
造方法、その培養方法、及び該酵母細胞からアスタキサ
ンチンを単離する方法に関する。さらに、本発明は、ア
スタキサンチン生産性酵母細胞又はそれから回収された
アスタキサンチンを含有する食品又は飼料、並びに食品
又は飼料の製造方法及び該飼料による動物の飼育方法に
関する。
サケ又はマスのごとき遡行魚類の肉の赤色が、該魚類に
よって消費される食餌中に存在するアスタキサンチンの
ごとき赤色色素に基くことが知られている。天然環境に
おいて、魚はその赤色を甲穀類又は他のアスタキサンチ
ン含有生物から得るが、しかし養魚場で飼育される場
合、魚はこれらの天然色素源に接近せず、そしてそれ故
に赤色色素が飼料中に供給されない限り魅力的な赤色を
獲得しない。
よって消費される食餌中に存在するアスタキサンチンの
ごとき赤色色素に基くことが知られている。天然環境に
おいて、魚はその赤色を甲穀類又は他のアスタキサンチ
ン含有生物から得るが、しかし養魚場で飼育される場
合、魚はこれらの天然色素源に接近せず、そしてそれ故
に赤色色素が飼料中に供給されない限り魅力的な赤色を
獲得しない。
従って、甲穀類廃棄物から単離された又は合成的に製造
されたアスタキサンチン、及びカンタキサンチンのごと
き他の合成赤色色素が魚餌中の成分として使用されてき
た。しかしながら、幾つかの国においては動物飼料中で
のカンタキサンチンの使用は禁止されており、そして合
成的アスタキサンチン製造及び天然アスタキサンチンの
単離方法はどちらかと言えば高価であり、そしてしばし
ば季節的変動にさらされる。
されたアスタキサンチン、及びカンタキサンチンのごと
き他の合成赤色色素が魚餌中の成分として使用されてき
た。しかしながら、幾つかの国においては動物飼料中で
のカンタキサンチンの使用は禁止されており、そして合
成的アスタキサンチン製造及び天然アスタキサンチンの
単離方法はどちらかと言えば高価であり、そしてしばし
ば季節的変動にさらされる。
他の天然アスタキサンチン源が知られており、特に酵母
ファフィア・ロドチーマ（Phaffia rhodozyma）及び若
干の微小藻類、例えば緑藻クラミドモナス・ニバリス
（Chlamydomonas nivalis）の単細胞群が挙げられる〔G
ert Knotsonら、「Pigmentering of laks med astaxant
hin fra mikroalger」,Norsk Fiskeopdraet,No3,4−６
頁、55（1980）〕。これらの生物によって生産されるア
スタキサンチンは遡行魚類に好ましい赤色を付与するこ
とが示されている〔Eric A.Johnsonら、「Phaffia rhod
ozyma as an astaxanthin source in salmonid diet
s」,Aquaculture 20,123−134頁（1980）及びJP-4 57-2
06342〕。しかしながら、魚の栄養として大量の酵母細
胞の使用は望ましくない。なぜなら、この飼料は効率的
に変化しないからである。他方、生物により生産されそ
して栄養的に許容される量の酵母細胞中に存在するアス
タキサンチンの量は所望の着色を得るためには十分でな
く、そして既知の方法による酵母からのアスタキサンチ
ンの単離はどちらかと言えばコスト高である。
ファフィア・ロドチーマ（Phaffia rhodozyma）及び若
干の微小藻類、例えば緑藻クラミドモナス・ニバリス
（Chlamydomonas nivalis）の単細胞群が挙げられる〔G
ert Knotsonら、「Pigmentering of laks med astaxant
hin fra mikroalger」,Norsk Fiskeopdraet,No3,4−６
頁、55（1980）〕。これらの生物によって生産されるア
スタキサンチンは遡行魚類に好ましい赤色を付与するこ
とが示されている〔Eric A.Johnsonら、「Phaffia rhod
ozyma as an astaxanthin source in salmonid diet
s」,Aquaculture 20,123−134頁（1980）及びJP-4 57-2
06342〕。しかしながら、魚の栄養として大量の酵母細
胞の使用は望ましくない。なぜなら、この飼料は効率的
に変化しないからである。他方、生物により生産されそ
して栄養的に許容される量の酵母細胞中に存在するアス
タキサンチンの量は所望の着色を得るためには十分でな
く、そして既知の方法による酵母からのアスタキサンチ
ンの単離はどちらかと言えばコスト高である。
しかしながら、もしこれらの生物からのより高いアスタ
キサンチン生産性が得られるなら、季節条件に依存しな
い有利なアスタキサンチン製造が可能であろう。
キサンチン生産性が得られるなら、季節条件に依存しな
い有利なアスタキサンチン製造が可能であろう。
本発明は、動物肉の着色又は動物の生産が望まれる遡行
魚類及び他の動物のための飼料として又は飼料中で使用
することができる程十分に高い濃度でアスタキサンチン
を含有する酵母細胞を提供する。本発明はさらに、アス
タキサンチン含有酵母細胞、特に高含量のアスタキサン
チンを有する前記酵母細胞からアスタキサンチンを得る
ための魅力的な方法を提供する。本発明の重要な観点
は、アスタキサンチン生産性細胞を培養するための特定
の方法、及び／又はアスタキサンチン生産の本来の能力
が改善されている変異株の提供に基いている。
魚類及び他の動物のための飼料として又は飼料中で使用
することができる程十分に高い濃度でアスタキサンチン
を含有する酵母細胞を提供する。本発明はさらに、アス
タキサンチン含有酵母細胞、特に高含量のアスタキサン
チンを有する前記酵母細胞からアスタキサンチンを得る
ための魅力的な方法を提供する。本発明の重要な観点
は、アスタキサンチン生産性細胞を培養するための特定
の方法、及び／又はアスタキサンチン生産の本来の能力
が改善されている変異株の提供に基いている。
従って、本発明の１つの観点は、50mlの培地を収容して
おり２枚のバッフルを有する、150rpmの回転振とうにか
けられた500mlの振とうフラスコ中で、30mmol/／時の
酵素移動速度、ディフコYM培地が20〜22℃にて５日間、
接種量がYM−培地中４日間培養物100μ、の条件下で
増殖した場合に、20mlのメタノール中0.2gの酵母乾物の
懸濁液を氷水による冷却ジャケットを有する、直径0.4m
mのガラスボール15gを含むガラスボールミル中で20℃以
下の温度で、0.5分間の間隔で５×１分行われる破砕に
かけることにより調製された酵母のメタノール抽出物に
対する、標準として純粋なアスタキサンチンを用いるHP
LC分析により決定された場合に、酵母乾物ｇ当り300μ
ｇ以上の量でアスタキサンチンを生産する酵母細胞に関
する。
おり２枚のバッフルを有する、150rpmの回転振とうにか
けられた500mlの振とうフラスコ中で、30mmol/／時の
酵素移動速度、ディフコYM培地が20〜22℃にて５日間、
接種量がYM−培地中４日間培養物100μ、の条件下で
増殖した場合に、20mlのメタノール中0.2gの酵母乾物の
懸濁液を氷水による冷却ジャケットを有する、直径0.4m
mのガラスボール15gを含むガラスボールミル中で20℃以
下の温度で、0.5分間の間隔で５×１分行われる破砕に
かけることにより調製された酵母のメタノール抽出物に
対する、標準として純粋なアスタキサンチンを用いるHP
LC分析により決定された場合に、酵母乾物ｇ当り300μ
ｇ以上の量でアスタキサンチンを生産する酵母細胞に関
する。
前記の増殖条件及び測定条件は、得られた結果が問題の
酵母の本来のアスタキサンチン生産能力を反映するよう
に増殖及び試験方法を標準化するために与えられる。こ
の方法は、本件出願人会社により行われた幾つかの実験
により、実施するのが容易で適切で且つ再現性のある方
法であることが見出された。この測定方法は従来文献に
おいて使用されているそれとは同一でないことに注目す
べきである。文献、例えばEric A.Johnsonら、「Astaxa
nthin formation by the yeast Phaffia rhodozyma」,J
ournal of general microbiology 115,1979,173−83
頁、において今まで使用された方法は1cmキャベットに
おけるアセトン中１％（W/V）溶液の吸収1600に基いて
おり、他方Hoffman-La Rocheからのアスタキサンチン標
準を測定することにより得られる値は2100である。この
値は出願人会社自身の測定及びHoffman-La Rocheにより
提供された情報に基いている。
酵母の本来のアスタキサンチン生産能力を反映するよう
に増殖及び試験方法を標準化するために与えられる。こ
の方法は、本件出願人会社により行われた幾つかの実験
により、実施するのが容易で適切で且つ再現性のある方
法であることが見出された。この測定方法は従来文献に
おいて使用されているそれとは同一でないことに注目す
べきである。文献、例えばEric A.Johnsonら、「Astaxa
nthin formation by the yeast Phaffia rhodozyma」,J
ournal of general microbiology 115,1979,173−83
頁、において今まで使用された方法は1cmキャベットに
おけるアセトン中１％（W/V）溶液の吸収1600に基いて
おり、他方Hoffman-La Rocheからのアスタキサンチン標
準を測定することにより得られる値は2100である。この
値は出願人会社自身の測定及びHoffman-La Rocheにより
提供された情報に基いている。
さらに、既知の測定方法は酵母の全色素含量を測定し、
他方本出願において使用される前記の標準法はアスタキ
サンチン含量のみを測定する。前記の標準化された方法
により得られる値を文献中に記載されている値と比較す
る場合、文献中に記載されている値は前記の標準化され
た方法により得られる真の値よりかなり高いことを心に
留めておくべきである。従って、本発明の全色素含量を
文献の記載と比較する場合、文献に記載されている全色
素含量を1600/2100で乗ずることにより吸光係数の差の
補正を行うべきである。
他方本出願において使用される前記の標準法はアスタキ
サンチン含量のみを測定する。前記の標準化された方法
により得られる値を文献中に記載されている値と比較す
る場合、文献中に記載されている値は前記の標準化され
た方法により得られる真の値よりかなり高いことを心に
留めておくべきである。従って、本発明の全色素含量を
文献の記載と比較する場合、文献に記載されている全色
素含量を1600/2100で乗ずることにより吸光係数の差の
補正を行うべきである。
前記の増殖条件は、本来のアスタキサンチン生産能力の
測定のために再現性があり且つ有意義であることが本件
出願人会社により見出されているものである。酵母菌株
の本来のアスタキサンチン生産能力を測定するために使
用される増殖及び測定条件のより詳細な説明は実施例と
関連させて記載する。
測定のために再現性があり且つ有意義であることが本件
出願人会社により見出されているものである。酵母菌株
の本来のアスタキサンチン生産能力を測定するために使
用される増殖及び測定条件のより詳細な説明は実施例と
関連させて記載する。
本発明の酵母細胞は好ましくはファフィア（Phaffia）
属に属する酵母細胞であり、そして特に現在知られてい
る唯一のファフィアの種であるファフィア・ロドチーマ
（Phaffia rhodozyma）種に属するものである。
属に属する酵母細胞であり、そして特に現在知られてい
る唯一のファフィアの種であるファフィア・ロドチーマ
（Phaffia rhodozyma）種に属するものである。
現在、ファフィア・ロドチーマはアスタキサンチンを生
産することが知られている唯一の酵母である。野性型P.
ロドチーマは落葉樹の浸出物から単離され、そしてこの
様な野性型株のサンプルはアメリカン・タイプ・カルチ
ュア・コレクション（American Type Culture Collecti
on）に寄託番号ATCC 24261として寄託されている。
産することが知られている唯一の酵母である。野性型P.
ロドチーマは落葉樹の浸出物から単離され、そしてこの
様な野性型株のサンプルはアメリカン・タイプ・カルチ
ュア・コレクション（American Type Culture Collecti
on）に寄託番号ATCC 24261として寄託されている。
P.ロドチーマの栄養細胞は異形担子菌酵母（heteroba-s
idiomycetous yeast）のように出芽を形成する。厚膜胞
子が出芽によって出現するが、前菌糸体及び真の胞子形
成は起らない。厚膜胞子は、栄養細胞より脂質含量の多
い比較的大きな球形細胞である。二核菌糸及び冬胞子の
形成を得るために種々の株を交配せしめる試は成功して
いない。従って、P.ロドチーマはブラストミセーテス
（Blastomycetes）目のドイテロミコチナ（Deuteromyco
tina）属に分類されている（International Journal of
systematic bacteriology 26:2,1976,286−292頁、M.
W.Millerら、「Phaffia,a new yast genus in the deut
eromycotina（Blastomycefes）」を参照のこと）。
idiomycetous yeast）のように出芽を形成する。厚膜胞
子が出芽によって出現するが、前菌糸体及び真の胞子形
成は起らない。厚膜胞子は、栄養細胞より脂質含量の多
い比較的大きな球形細胞である。二核菌糸及び冬胞子の
形成を得るために種々の株を交配せしめる試は成功して
いない。従って、P.ロドチーマはブラストミセーテス
（Blastomycetes）目のドイテロミコチナ（Deuteromyco
tina）属に分類されている（International Journal of
systematic bacteriology 26:2,1976,286−292頁、M.
W.Millerら、「Phaffia,a new yast genus in the deut
eromycotina（Blastomycefes）」を参照のこと）。
栄養細胞は長円形（3.6−7.5）×（5.5−10.5）であ
り、そして液体培地中では個別に、対になって、そして
ある場合には短い連鎖状に、又は小さい房状に存在す
る。真の菌糸は発達せず、しかし未発達の擬菌糸が存在
する場合がある。出芽は細胞上の同じ点から数回生ず
る。P.ロドチーマは多層から成る強い細胞膜を有し、そ
してカプセル物質は表面に粒状の外観を与え、そして上
記の房を形成せしめる。
り、そして液体培地中では個別に、対になって、そして
ある場合には短い連鎖状に、又は小さい房状に存在す
る。真の菌糸は発達せず、しかし未発達の擬菌糸が存在
する場合がある。出芽は細胞上の同じ点から数回生ず
る。P.ロドチーマは多層から成る強い細胞膜を有し、そ
してカプセル物質は表面に粒状の外観を与え、そして上
記の房を形成せしめる。
生活の性周期は観察されていない。厚膜胞子の発達中、
栄養細胞が出芽により形成される。これらの細胞は、ア
ソスポロン（Aessospron）について記載されているよう
に胞子を伴う前菌糸体と考えるろことはできない（J.P.
van der Walt,「The perfect and imperfect states of
Sporobolomyces salminicolor」,J.Microbiol.Serol.3
6,1970,49−55頁を参照のこと）。厚膜胞子はゴノトコ
ンター（gonotoconter）（性的に分離された胞子）と考
えることができず、そしてその出芽は一培体世代と考え
ることができない。いずれの増殖段階においても核染色
により二倍体化証明することは不可能であった。透過電
子顕微鏡写真はすべての増殖相において１個の単一核の
みを示している（M.W.Millerら、前掲）。従って、P.コ
ドチーマは一倍体のようであるが、これはまだ証明され
ていない。
栄養細胞が出芽により形成される。これらの細胞は、ア
ソスポロン（Aessospron）について記載されているよう
に胞子を伴う前菌糸体と考えるろことはできない（J.P.
van der Walt,「The perfect and imperfect states of
Sporobolomyces salminicolor」,J.Microbiol.Serol.3
6,1970,49−55頁を参照のこと）。厚膜胞子はゴノトコ
ンター（gonotoconter）（性的に分離された胞子）と考
えることができず、そしてその出芽は一培体世代と考え
ることができない。いずれの増殖段階においても核染色
により二倍体化証明することは不可能であった。透過電
子顕微鏡写真はすべての増殖相において１個の単一核の
みを示している（M.W.Millerら、前掲）。従って、P.コ
ドチーマは一倍体のようであるが、これはまだ証明され
ていない。
YM寒天（ディフコ・ラボラトリース社、ディフコマニュ
アル；脱水培地及び顕微鏡写真用試薬、第10版、デトロ
イト、1984）上での２〜４週間の増殖の後、線状（stri
ng）培養物は菌株に応じてオレンジ〜サーモンピンク色
である。
アル；脱水培地及び顕微鏡写真用試薬、第10版、デトロ
イト、1984）上での２〜４週間の増殖の後、線状（stri
ng）培養物は菌株に応じてオレンジ〜サーモンピンク色
である。
P.ロドチーマは、27℃より高温では増殖しないという特
殊な性質を有する。このものはＤ−グルコース、マルト
ース、シュークロース及びラフィノースを発酵するが、
Ｄ−ガラクトース及びメリビオースを発酵しない。ほと
んどの一般的な炭素源は資化されるが、しかしながらＤ
−ガラクトース、Ｌ−ソルボース、メリビオース、ラク
トース、グリセロール及びクエン酸塩は資化されない。
この酵母はビオチンを添加しなければビタミン不含有培
地で増殖することができない（M.W.Millerら、前掲）。
尿素を含むほとんどの一般的窒素源が資化される。硝酸
カリウム及びエチルアミンは資化されない。この酵母は
50重量％のグルコース−酸エキス寒天上で増殖すること
ができず、10重量％の塩化ナトリウム−酵母エキス寒天
上でも増殖することができない。この酵母によるチョー
ク寒天上での酸生成は弱く、そしてゼラチンの液化もそ
の通りである。0.1μg/mlのシクロヘキシミドの存在下
での増殖、カゼインの加水分解及び解重合（depolyti
c）活性は存在せず、他方この酵母はpHに依存すること
なく澱粉様化合物を合成することができる。Ｇ＋Ｃのモ
ル％は48.3±0.18と測定される（Miller等、前掲）。
殊な性質を有する。このものはＤ−グルコース、マルト
ース、シュークロース及びラフィノースを発酵するが、
Ｄ−ガラクトース及びメリビオースを発酵しない。ほと
んどの一般的な炭素源は資化されるが、しかしながらＤ
−ガラクトース、Ｌ−ソルボース、メリビオース、ラク
トース、グリセロール及びクエン酸塩は資化されない。
この酵母はビオチンを添加しなければビタミン不含有培
地で増殖することができない（M.W.Millerら、前掲）。
尿素を含むほとんどの一般的窒素源が資化される。硝酸
カリウム及びエチルアミンは資化されない。この酵母は
50重量％のグルコース−酸エキス寒天上で増殖すること
ができず、10重量％の塩化ナトリウム−酵母エキス寒天
上でも増殖することができない。この酵母によるチョー
ク寒天上での酸生成は弱く、そしてゼラチンの液化もそ
の通りである。0.1μg/mlのシクロヘキシミドの存在下
での増殖、カゼインの加水分解及び解重合（depolyti
c）活性は存在せず、他方この酵母はpHに依存すること
なく澱粉様化合物を合成することができる。Ｇ＋Ｃのモ
ル％は48.3±0.18と測定される（Miller等、前掲）。
炭水化物−及び／又は窒素−制限条件下での増殖の間、
フェド−バッチ発酵にかけられた場合、P.ロドチーマは
炭水化物蓄積物としてトレハロースを生産する。このこ
とは、出願人会社により行われまだ報告されていない全
く新しい観察である。
フェド−バッチ発酵にかけられた場合、P.ロドチーマは
炭水化物蓄積物としてトレハロースを生産する。このこ
とは、出願人会社により行われまだ報告されていない全
く新しい観察である。
文献によれば、P.ロドチーマは多数のカロチノイドを生
産し、その内アスタキサンチンが83〜87％、β−カロチ
ンが２〜2.5％、エチネノンが２〜４％、そしてフェニ
コキサンチンが５〜７％を占める。しかしながら実際に
は、P.ロドチーマにより生産される全色素に対するアス
タキサンチンの比率は酵母細胞の増殖条件及び色素の測
定法に依存して大きく異ることが見出され、そして50〜
80％範囲にあることが見出された。
産し、その内アスタキサンチンが83〜87％、β−カロチ
ンが２〜2.5％、エチネノンが２〜４％、そしてフェニ
コキサンチンが５〜７％を占める。しかしながら実際に
は、P.ロドチーマにより生産される全色素に対するアス
タキサンチンの比率は酵母細胞の増殖条件及び色素の測
定法に依存して大きく異ることが見出され、そして50〜
80％範囲にあることが見出された。
アスタキサンチンをはじめとするヒドドキシル化された
すべての色素は非結合形として記載されており、エステ
ル又は多の誘導体としては記載されていない（G.Andrew
sら著、「Carotenoids of Phaffia rhodozyma,a red-pi
gmented fermenting yeast」,Phytochemistry 15,1976,
1003−1007頁）。アスタキサンチンの３つの光学異性体
形（3S,3′Ｓ），（3R,3′Ｒ）及び（3S,3R）が存在
し、それぞれが種々のトランス−及びシス−配置で存在
する。P.ロドチーマは（3R,3′Ｒ）−アスタキサンチン
のみを生産することが報告されている（G.Andrewsら、
「（3R,3′Ｒ）−astaxanthin from the yeast Phaffia
rhodozyma」前掲、1009−1011頁）。この場合、「アス
タキサンチン」はアスタキサンチンのトランス−配置及
びシス−配置について用いられる。
すべての色素は非結合形として記載されており、エステ
ル又は多の誘導体としては記載されていない（G.Andrew
sら著、「Carotenoids of Phaffia rhodozyma,a red-pi
gmented fermenting yeast」,Phytochemistry 15,1976,
1003−1007頁）。アスタキサンチンの３つの光学異性体
形（3S,3′Ｓ），（3R,3′Ｒ）及び（3S,3R）が存在
し、それぞれが種々のトランス−及びシス−配置で存在
する。P.ロドチーマは（3R,3′Ｒ）−アスタキサンチン
のみを生産することが報告されている（G.Andrewsら、
「（3R,3′Ｒ）−astaxanthin from the yeast Phaffia
rhodozyma」前掲、1009−1011頁）。この場合、「アス
タキサンチン」はアスタキサンチンのトランス−配置及
びシス−配置について用いられる。
細胞を顕微鏡観察する場合、個々のP.ロドチーマ細胞中
の色素は見えず、このことは色素が細胞全体に分散して
いることを示している。しかしながら、色素を細胞のあ
る部分に濃縮することも可能である。
の色素は見えず、このことは色素が細胞全体に分散して
いることを示している。しかしながら、色素を細胞のあ
る部分に濃縮することも可能である。
アスタキサンチンは酸化されたカロチノイドであり、そ
してそれ故にキサントフィル群に属する。多のカロチノ
イドと同様に、アスタキサンチンは８個のイソプレノイ
ド単位から構成されている。分解物（catabolite）抑制
されるアスタキサンチンの生合成において、アセチル−
CoAからイソペンテニルピロリン酸が次のようにして生
成する。
してそれ故にキサントフィル群に属する。多のカロチノ
イドと同様に、アスタキサンチンは８個のイソプレノイ
ド単位から構成されている。分解物（catabolite）抑制
されるアスタキサンチンの生合成において、アセチル−
CoAからイソペンテニルピロリン酸が次のようにして生
成する。
３つのプレニルトランスフェラーゼ反応により、イソプ
レニルピロホスフェートはゼラニルピロホスフェート及
びファルネシルピロホスフェートを介してゲラニル−ゲ
ラニルピロホスフェートを次の様にして生成せしめる。
レニルピロホスフェートはゼラニルピロホスフェート及
びファルネシルピロホスフェートを介してゲラニル−ゲ
ラニルピロホスフェートを次の様にして生成せしめる。
２分子のゲラニルゲラニルピロホスフェートの縮合がフ
ィトエンを生成せしめ、これが脱水素段階及び環形成を
経てβ−カロチンからアスタキサンチンを生成せしめ
る。生合成の最後の部分は明確には決定されていない
が、Andrewsら（前掲）はP.ロドチーマの色素組成に基
いて下記の代謝経路を提案している。
ィトエンを生成せしめ、これが脱水素段階及び環形成を
経てβ−カロチンからアスタキサンチンを生成せしめ
る。生合成の最後の部分は明確には決定されていない
が、Andrewsら（前掲）はP.ロドチーマの色素組成に基
いて下記の代謝経路を提案している。
ゲラニルケラニルピロホスフェートをアスタキサンチン
に転換する酵素系は知られておらず、そしてそれ故にな
ぜP.ロドチーマが（3R,3′Ｒ）−アスタキサンチンを生
産するか、及び生合成のこの部分の間に幾つかの制御段
階があるか否かは知られていない。他方、P.ロドチーマ
以外のイソプレノイド生産菌におけるイソペンテニルピ
ロホスフェートへのアセチル−CoAの転換、及びそれを
行う酵素は比較的詳細に記載されている。イソペンテニ
ルピロホスフェートをゲラニルゲラニルピロホスフェー
トに転換する酵素〔イソペンテニルピロホスフェートイ
ソメラーゼ及びプレニルトランスフェラーゼ〔J.W.Port
er,S.L.Spurgeon編、“Biosynthesis of isoprenoid co
mpounds",New York,1981-1983）〕についてはほとんど
知られていない。
に転換する酵素系は知られておらず、そしてそれ故にな
ぜP.ロドチーマが（3R,3′Ｒ）−アスタキサンチンを生
産するか、及び生合成のこの部分の間に幾つかの制御段
階があるか否かは知られていない。他方、P.ロドチーマ
以外のイソプレノイド生産菌におけるイソペンテニルピ
ロホスフェートへのアセチル−CoAの転換、及びそれを
行う酵素は比較的詳細に記載されている。イソペンテニ
ルピロホスフェートをゲラニルゲラニルピロホスフェー
トに転換する酵素〔イソペンテニルピロホスフェートイ
ソメラーゼ及びプレニルトランスフェラーゼ〔J.W.Port
er,S.L.Spurgeon編、“Biosynthesis of isoprenoid co
mpounds",New York,1981-1983）〕についてはほとんど
知られていない。
P.ロドチーマの蛋白質含量は、培養条件に依存して酵母
乾燥重量の25〜50％の範囲で異る。これは比較的低い蛋
白質含量である。これに対して、脂質含量は非常に高い
（14〜27％）。核酸が他の酵母と同様８％を構成し、そ
してアミノ酸組成が、サッカロミセス セレビシエー
（Saccharomyces cerevisiae）のごとき他の既知酵母に
おける組成と類似しており、そしてそれ故に、ある種の
アミノ酸、例えばメチオニン及びシステインの含量が非
常に低い（Gerald Reed及びHenry J.Peppler,Yeast Tec
hnology,1973,329頁、The AVI Publishing Company,In
c.を参照のこと）。このこと、及び高核酸含量を構成す
る全体酵母組成が、上記のように、酵母が単一の栄養源
である場合に、酵母を動物栄養目的のために不便なもの
にしている。従って、ある種のアミノ酸及び他の栄養成
分を添加しなければ、酵母は魚又は他の動物のための適
切な主栄養成分ではないであろう。
乾燥重量の25〜50％の範囲で異る。これは比較的低い蛋
白質含量である。これに対して、脂質含量は非常に高い
（14〜27％）。核酸が他の酵母と同様８％を構成し、そ
してアミノ酸組成が、サッカロミセス セレビシエー
（Saccharomyces cerevisiae）のごとき他の既知酵母に
おける組成と類似しており、そしてそれ故に、ある種の
アミノ酸、例えばメチオニン及びシステインの含量が非
常に低い（Gerald Reed及びHenry J.Peppler,Yeast Tec
hnology,1973,329頁、The AVI Publishing Company,In
c.を参照のこと）。このこと、及び高核酸含量を構成す
る全体酵母組成が、上記のように、酵母が単一の栄養源
である場合に、酵母を動物栄養目的のために不便なもの
にしている。従って、ある種のアミノ酸及び他の栄養成
分を添加しなければ、酵母は魚又は他の動物のための適
切な主栄養成分ではないであろう。
野性型P.ロドチーマが通常の既知条件下で増殖する場合
に該P.ロドチーマにより生産されるアスタキサンチンの
全量は酵母細胞に赤色を付与するためには十分である
が、酵母細胞から経済的にアスタキサンチンを回収する
ためには十分でない。
に該P.ロドチーマにより生産されるアスタキサンチンの
全量は酵母細胞に赤色を付与するためには十分である
が、酵母細胞から経済的にアスタキサンチンを回収する
ためには十分でない。
実施例の第２表及び第６表に示すように、文献に記載さ
れているファフィア・ロドチーマ種には、前記の標準法
により測定した場合に酵母乾燥ｇ当り300μｇ以上の本
来的アスタキサンチン生産能力を有するものはない。し
かしながら、本発明によれば、前記の標準法により増殖
及び測定を行った場合に酵母乾物ｇ当り450μｇ以上、
例えば酵母乾物ｇ当り600μｇ以上、好ましくは酵母乾
物ｇ当り700μｇ以上、さらに好ましくは酵母乾物ｇ当
り1000μｇ以上、特に酵母乾物ｇ当り1500μｇ以上、そ
して最も好ましくは酵母乾物ｇ当り2000μｇ以上の量で
アスタキサンチンを製造することができる酵母を得るこ
とができることが見出された。これらの酵母細胞は天然
のファフィア・ロドチーマから変異誘発により作られ
た。従って、本発明の１つの観点は、上記の高い本来的
アスタキサンチン生産能力を示す酵母細胞を作る方法に
関し、この方法は酵母細胞を変異原により処理し、そし
て前記の方法により測定した場合に酵母乾物ｇ当り300
μｇ以上の量でアスタキサンチンを生産することができ
る変異株を選択することを含んで成る。
れているファフィア・ロドチーマ種には、前記の標準法
により測定した場合に酵母乾燥ｇ当り300μｇ以上の本
来的アスタキサンチン生産能力を有するものはない。し
かしながら、本発明によれば、前記の標準法により増殖
及び測定を行った場合に酵母乾物ｇ当り450μｇ以上、
例えば酵母乾物ｇ当り600μｇ以上、好ましくは酵母乾
物ｇ当り700μｇ以上、さらに好ましくは酵母乾物ｇ当
り1000μｇ以上、特に酵母乾物ｇ当り1500μｇ以上、そ
して最も好ましくは酵母乾物ｇ当り2000μｇ以上の量で
アスタキサンチンを製造することができる酵母を得るこ
とができることが見出された。これらの酵母細胞は天然
のファフィア・ロドチーマから変異誘発により作られ
た。従って、本発明の１つの観点は、上記の高い本来的
アスタキサンチン生産能力を示す酵母細胞を作る方法に
関し、この方法は酵母細胞を変異原により処理し、そし
て前記の方法により測定した場合に酵母乾物ｇ当り300
μｇ以上の量でアスタキサンチンを生産することができ
る変異株を選択することを含んで成る。
変異誘発は単一の変異誘発として行うことができるが、
２回以上の逐次的変異誘発を行うのが好ましい。各変異
誘発段階によりアスタキサンチンを生産する本来的能力
が改良され得ることが見出されたからである。変異誘発
にかけられる出発酵母細胞は、通常は、前記の条件下で
増殖せしめ前記の方法で測定した場合に酵母乾物ｇ当り
300μｇ未満の量でアスタキサンチンを生産する酵母細
胞であるが、変異誘発処理のための通常の候補はできる
だけ高い本来的アスタキサンチン生産性を有する自然の
酵母細胞であることが明らかである。この様な酵母細胞
は普通、前記のようにファフィア属に属する酵母細胞、
特にファフィア・ロドチーマ種に属する酵母細胞であ
る。
２回以上の逐次的変異誘発を行うのが好ましい。各変異
誘発段階によりアスタキサンチンを生産する本来的能力
が改良され得ることが見出されたからである。変異誘発
にかけられる出発酵母細胞は、通常は、前記の条件下で
増殖せしめ前記の方法で測定した場合に酵母乾物ｇ当り
300μｇ未満の量でアスタキサンチンを生産する酵母細
胞であるが、変異誘発処理のための通常の候補はできる
だけ高い本来的アスタキサンチン生産性を有する自然の
酵母細胞であることが明らかである。この様な酵母細胞
は普通、前記のようにファフィア属に属する酵母細胞、
特にファフィア・ロドチーマ種に属する酵母細胞であ
る。
変異誘発処理は任意の適当な変異原を用いて行うことが
できる（これに関して、「変異原」なる語は、その広義
において、例えば変異原効果を有する薬剤のみならずUV
照射のごとき変異原効果を有する処理をも含むものと理
解すべきである。適当な変異原の例としてエチルメタン
スルホネート、UV照射、Ｎ−メチル−Ｎ′−ニトロ−Ｎ
−ニトロソグアニジン、ブロモウラシルのごときヌクレ
オチド塩基類似体及びアクリジン類が挙げるが、他の任
意の効果的な変異原が処理のために適当であろう。
できる（これに関して、「変異原」なる語は、その広義
において、例えば変異原効果を有する薬剤のみならずUV
照射のごとき変異原効果を有する処理をも含むものと理
解すべきである。適当な変異原の例としてエチルメタン
スルホネート、UV照射、Ｎ−メチル−Ｎ′−ニトロ−Ｎ
−ニトロソグアニジン、ブロモウラシルのごときヌクレ
オチド塩基類似体及びアクリジン類が挙げるが、他の任
意の効果的な変異原が処理のために適当であろう。
常用の変異誘発技法に従えば、変異誘発に続き最高のア
スタキサンチン生産性を有する細胞の適切な選択を行
う。アスタキサンチンが色素であるという事実のため、
この選択は通常の視覚的手段、例えば単一コロニーの簡
単な観察により行うことができる。これに代る方法は、
単一コロニーから作られた培養物の分析を、例えば前記
の標準的培養条件及び測定条件を用いて行うことであ
る。
スタキサンチン生産性を有する細胞の適切な選択を行
う。アスタキサンチンが色素であるという事実のため、
この選択は通常の視覚的手段、例えば単一コロニーの簡
単な観察により行うことができる。これに代る方法は、
単一コロニーから作られた培養物の分析を、例えば前記
の標準的培養条件及び測定条件を用いて行うことであ
る。
本発明の変異誘発法により作られそして特に高いアスタ
キサンチン生産性を有する２つの株が1987年４月６日
に、Centraalbureau voor Schimmelcultures（CBS）,Oo
sterstraat1,Postbus 273,NL-3740 AG Baarn、オラン
ダ、にそれぞれNo.224-87及び225-87として寄託されて
おり、そしてCBS 225-87の再分離株である１つの株（実
施例１を参照のこと）が1988年３月23日にCBSにNo.215-
88として寄託されており、そして本発明の１つの観点は
これらの酵母株、並びにこれらの株のアスタキサンチン
生産能を実質的に維持しており又はさらに改良している
変異株又は誘導株に関する。
キサンチン生産性を有する２つの株が1987年４月６日
に、Centraalbureau voor Schimmelcultures（CBS）,Oo
sterstraat1,Postbus 273,NL-3740 AG Baarn、オラン
ダ、にそれぞれNo.224-87及び225-87として寄託されて
おり、そしてCBS 225-87の再分離株である１つの株（実
施例１を参照のこと）が1988年３月23日にCBSにNo.215-
88として寄託されており、そして本発明の１つの観点は
これらの酵母株、並びにこれらの株のアスタキサンチン
生産能を実質的に維持しており又はさらに改良している
変異株又は誘導株に関する。
本発明はまた、アスタキサンチン含有酵母細胞又は細胞
の部分、あるいはこれらの細胞又は細胞の部分に由来す
るアスタキサンチンの製造方法に関する。この方法は、
アスタキサンチン生産性酵母細胞を好気的条件下で、炭
水化物源、資化性窒素源及びリン、微量栄養素並びにビ
オチンを含有する培地中で15〜26℃の範囲の温度におい
て培養することにより、前記の方法により測定した場合
に酵母乾物ｇ当り300μｇ以上の量でアスタキサンチン
を含有する生物体を得、そして所望により次の工程の１
つ又は幾つかを任意の順序で行うことを含んで成る。
の部分、あるいはこれらの細胞又は細胞の部分に由来す
るアスタキサンチンの製造方法に関する。この方法は、
アスタキサンチン生産性酵母細胞を好気的条件下で、炭
水化物源、資化性窒素源及びリン、微量栄養素並びにビ
オチンを含有する培地中で15〜26℃の範囲の温度におい
て培養することにより、前記の方法により測定した場合
に酵母乾物ｇ当り300μｇ以上の量でアスタキサンチン
を含有する生物体を得、そして所望により次の工程の１
つ又は幾つかを任意の順序で行うことを含んで成る。
◎ 培養物から細胞を収得して酵母クリームを得る； ◎ 機械的、化学的及び／又は酵素的処理により、及び
／又は細胞を超音波、自己消化、浸透圧溶解（osmolysi
s）及び／又は原形質溶解（plasmolysis）にかけること
により、場合によっては適当な薬剤、例えば洗浄、酸、
塩基、酵素、自己消化増強物質、浸透圧溶解剤、例えば
塩及び／又は原形質溶解剤を添加して、細胞を開く、例
えば細胞壁を破る； ◎ 細胞をホモゲナイズしてモホジネートを得る； ◎ 細胞、細胞片又はモホジネートを乾燥させて好まし
くは12重量％以下の水含量、好ましくは10重量％以下の
水含量にする； ◎ 細胞、細胞片又はモホジネートからアスタキサンチ
ンを抽出する。
／又は細胞を超音波、自己消化、浸透圧溶解（osmolysi
s）及び／又は原形質溶解（plasmolysis）にかけること
により、場合によっては適当な薬剤、例えば洗浄、酸、
塩基、酵素、自己消化増強物質、浸透圧溶解剤、例えば
塩及び／又は原形質溶解剤を添加して、細胞を開く、例
えば細胞壁を破る； ◎ 細胞をホモゲナイズしてモホジネートを得る； ◎ 細胞、細胞片又はモホジネートを乾燥させて好まし
くは12重量％以下の水含量、好ましくは10重量％以下の
水含量にする； ◎ 細胞、細胞片又はモホジネートからアスタキサンチ
ンを抽出する。
前記のアスタキサンチン量、すなわち酵母乾物ｇ当り30
0μｇは文献中に報告されているいずれのアスタキサン
チン濃度よりも高い。Johnsonら、前掲、は酵母乾物ｇ
当り295μｇのアスタキサンチン含量を報告している
が、この値はアスタキサンチン含量を含むのみならず、
酵母細胞の全色素含量を含む。さらに、この色素含量は
1cmのキュベットにおいてアセトン中１％（w/v）溶液の
吸収の値1600を用いて測定されたものであり、その値は
本出願人により測定されたもの（2100）より低いので、
Johnsonらにより報告された値は、酵母乾物ｇ当り全色
素（アスタキサンチンのみならず）最大295×1600/2100
＝225μｇに相当する。文献からのこの色素含量を本発
明の酵母株の全色素含量、CBS 224-87株については酵母
乾物ｇ当り885μｇ、CBS 225-87株については酵母乾物
ｇ当り1176μｇ、そしてCBS 215-88株については酵母乾
物ｇ当り約1340μｇ、あるいはさらに高い酵母乾物ｇ当
り2000μｇ以上と比較すべきである。
0μｇは文献中に報告されているいずれのアスタキサン
チン濃度よりも高い。Johnsonら、前掲、は酵母乾物ｇ
当り295μｇのアスタキサンチン含量を報告している
が、この値はアスタキサンチン含量を含むのみならず、
酵母細胞の全色素含量を含む。さらに、この色素含量は
1cmのキュベットにおいてアセトン中１％（w/v）溶液の
吸収の値1600を用いて測定されたものであり、その値は
本出願人により測定されたもの（2100）より低いので、
Johnsonらにより報告された値は、酵母乾物ｇ当り全色
素（アスタキサンチンのみならず）最大295×1600/2100
＝225μｇに相当する。文献からのこの色素含量を本発
明の酵母株の全色素含量、CBS 224-87株については酵母
乾物ｇ当り885μｇ、CBS 225-87株については酵母乾物
ｇ当り1176μｇ、そしてCBS 215-88株については酵母乾
物ｇ当り約1340μｇ、あるいはさらに高い酵母乾物ｇ当
り2000μｇ以上と比較すべきである。
本発明の酵母細胞中の高いアスタキサンチン濃度は部分
的には後に説明する特定の培養条件の使用によって得ら
れ、そして部分的には高い本来的アスタキサンチン生産
性を有する酵母株、好ましくは上に検討した酵母株、の
選択により得られ、そして特に特定の培養条件と特定の
アスタキサンチン生産酵母株の使用とを組合わせるのが
好ましい。
的には後に説明する特定の培養条件の使用によって得ら
れ、そして部分的には高い本来的アスタキサンチン生産
性を有する酵母株、好ましくは上に検討した酵母株、の
選択により得られ、そして特に特定の培養条件と特定の
アスタキサンチン生産酵母株の使用とを組合わせるのが
好ましい。
倍養は好ましくは、アルコールが実質的に生成しない条
件下でフェドーバッチ（fed-batch）発酵として行われ
る。前記のように、培養の温度は15〜26℃の範囲であ
る。15℃未満では工業的生産のために許容されるには低
過ぎる傾向があり、そして28℃より高温では培養物の生
存が深刻に障害される。好ましい温度範囲は20〜22℃で
ある。
件下でフェドーバッチ（fed-batch）発酵として行われ
る。前記のように、培養の温度は15〜26℃の範囲であ
る。15℃未満では工業的生産のために許容されるには低
過ぎる傾向があり、そして28℃より高温では培養物の生
存が深刻に障害される。好ましい温度範囲は20〜22℃で
ある。
発酵又は少なくともその部分は通常、細胞のための適当
な多量−又は微量−栄養素、例えば炭水化物源としての
糖蜜又はサッカロース、及び窒素源、例えばコーンスチ
ープリカー、硫酸アンモニウム、リン酸アンモニウム、
水酸化アンモニウム又は尿素、リン源、例えばリン酸ア
ンモニウム及びリン酸、並びに添加された微量栄養素又
は鉱物塩、例えば硫酸マグネシウム、硫酸亜鉛、並びに
ビオチン又はデスチオビオチンを含んで成る培地中で行
われる。酵母製造において使用される常法に従えば糖蜜
又はサッカロースは好ましくは他の成分から分離して培
地に供給される。培地が糖蜜を含有する場合、酵母細胞
の増殖は発酵槽中の糖又はその中に存在する他の増殖阻
害物質の濃度により影響されることが見出された。この
効果は、培地がコーンスチープリカー又は固形物を含有
する場合に観察された。従って、発酵槽中の糖の濃度
（グルコース及びサッカロースの合計濃度として表わさ
れる）が8g/以下、好ましくは5g/以下、そして最も
好ましくは1g/以下であるように発酵を制御するのが
有利であることが証明される。
な多量−又は微量−栄養素、例えば炭水化物源としての
糖蜜又はサッカロース、及び窒素源、例えばコーンスチ
ープリカー、硫酸アンモニウム、リン酸アンモニウム、
水酸化アンモニウム又は尿素、リン源、例えばリン酸ア
ンモニウム及びリン酸、並びに添加された微量栄養素又
は鉱物塩、例えば硫酸マグネシウム、硫酸亜鉛、並びに
ビオチン又はデスチオビオチンを含んで成る培地中で行
われる。酵母製造において使用される常法に従えば糖蜜
又はサッカロースは好ましくは他の成分から分離して培
地に供給される。培地が糖蜜を含有する場合、酵母細胞
の増殖は発酵槽中の糖又はその中に存在する他の増殖阻
害物質の濃度により影響されることが見出された。この
効果は、培地がコーンスチープリカー又は固形物を含有
する場合に観察された。従って、発酵槽中の糖の濃度
（グルコース及びサッカロースの合計濃度として表わさ
れる）が8g/以下、好ましくは5g/以下、そして最も
好ましくは1g/以下であるように発酵を制御するのが
有利であることが証明される。
培養物は全発酵期間にわたり通気される。すなわちそれ
は好気的条件下で増殖される。「好気的条件」なる語
は、発酵中に酸素の制限が実質的に生じない様に酸素の
供給が十分であるべきことを意味する。
は好気的条件下で増殖される。「好気的条件」なる語
は、発酵中に酸素の制限が実質的に生じない様に酸素の
供給が十分であるべきことを意味する。
前記のように本発明の特定の観点に従えば、得られる生
物体中のアスタキサンチンの濃度は選択された条件下で
培養を行うことによって増加する。これらの条件は、実
質的にすべての増殖条件に関して実質的に十分である条
件下での増殖期及びそれに続く増殖制限期を含んで成る
培養に関する。増殖制限期は好ましくは、連続通気下で
の増殖培地が少なくとも１つの増殖因子を消耗し、この
結果それに続く期間にアスタキサンチンの生産が増強さ
れる条件を提供することにより達成される。
物体中のアスタキサンチンの濃度は選択された条件下で
培養を行うことによって増加する。これらの条件は、実
質的にすべての増殖条件に関して実質的に十分である条
件下での増殖期及びそれに続く増殖制限期を含んで成る
培養に関する。増殖制限期は好ましくは、連続通気下で
の増殖培地が少なくとも１つの増殖因子を消耗し、この
結果それに続く期間にアスタキサンチンの生産が増強さ
れる条件を提供することにより達成される。
増殖制限期は一般に、細胞の大部分が増殖を停止する期
間を意味すると理解されるべきである。言うまでもなく
この期間は培地が少なくとも１つの増殖因子を消耗する
時に起こるが、発酵槽中に存在する細胞の量が該発酵槽
の通気能力を十分に超える場合に炭水化物添加期間の最
後の部分にも観察される。
間を意味すると理解されるべきである。言うまでもなく
この期間は培地が少なくとも１つの増殖因子を消耗する
時に起こるが、発酵槽中に存在する細胞の量が該発酵槽
の通気能力を十分に超える場合に炭水化物添加期間の最
後の部分にも観察される。
引き続く増殖制限期がアスタキサンチンの生産をかなり
増加せしめる驚くべき効果を有する（例えば、後の実施
例の１つにおいて得られるように酵母乾物ｇ当り231〜3
69μｇ）を有する理由は知られていないが、増殖期間中
にアスタキサンチンの前駆体が生産されており、そして
それに続く増殖制限期間がアスタキサンチンの最終生産
を促進する条件、おそらく、増殖が停止した時に得られ
る酸素過剰による酸化的条件、を提供するものと予想さ
れる。いずれにしても、後に続く増殖制限期を通じて通
気が続けられるのが必須のようである。後に続く増殖制
限期の持続期間は好ましくは約16時間以上、例えば16〜
24時間であり、より短い持続時間は得られる余分の効果
を減少せしめる傾向があり、他方増殖制限期間を約24時
間より延長することにより得られる実質的な効果はない
ようである。
増加せしめる驚くべき効果を有する（例えば、後の実施
例の１つにおいて得られるように酵母乾物ｇ当り231〜3
69μｇ）を有する理由は知られていないが、増殖期間中
にアスタキサンチンの前駆体が生産されており、そして
それに続く増殖制限期間がアスタキサンチンの最終生産
を促進する条件、おそらく、増殖が停止した時に得られ
る酸素過剰による酸化的条件、を提供するものと予想さ
れる。いずれにしても、後に続く増殖制限期を通じて通
気が続けられるのが必須のようである。後に続く増殖制
限期の持続期間は好ましくは約16時間以上、例えば16〜
24時間であり、より短い持続時間は得られる余分の効果
を減少せしめる傾向があり、他方増殖制限期間を約24時
間より延長することにより得られる実質的な効果はない
ようである。
機能的に表現すれば、増殖制限期間の条件は、この期間
なくして得られる生産の1.2倍以上、例えばこの期間な
くして得られる生産の1.3倍以上、好ましくはこの期間
なくして得られる生産の1.5倍以上、そして最も好まし
くはこの期間なくして得られる生産の1.5倍以上にアス
タキサンチンの生産を増強するように調整されるべきで
ある。
なくして得られる生産の1.2倍以上、例えばこの期間な
くして得られる生産の1.3倍以上、好ましくはこの期間
なくして得られる生産の1.5倍以上、そして最も好まし
くはこの期間なくして得られる生産の1.5倍以上にアス
タキサンチンの生産を増強するように調整されるべきで
ある。
引き続く増殖制限期を伴う特定の培養に付される酵母細
胞は、該増殖制限段階のためにそのアスタキサンチン生
産性が増加する野性典のアスタキサンチン生産酵母細
胞、例えばファフィア属の、特にファフィア・ロドチー
マ種の野生形酵母細胞であることができるが、培養に付
される酵母細胞はアスタキサンチンを生産する本来の且
つ改良された能力を有する酵母細胞、典型的には前に説
明したような変異誘発により得られた酵母細胞であるこ
とが好ましい。本来の増加したアスタキサンチン生産性
を有するこれらの酵母細胞を用いて、増殖制限期を含む
特定の培養法を用いる場合に得られる生物体中のアスタ
キサンチンの濃度は、前記のようにして測定した場合、
酵母乾物ｇ当り600μｇ以上、好ましくは800μｇ以上、
さらに好ましくは1000μｇ以上、特に酵母乾物ｇ当り15
00μｇ以上、例えば酵母乾物ｇ当り2000μｇ以上、そし
て最も好ましくは酵母乾物3000μｇ以上である。
胞は、該増殖制限段階のためにそのアスタキサンチン生
産性が増加する野性典のアスタキサンチン生産酵母細
胞、例えばファフィア属の、特にファフィア・ロドチー
マ種の野生形酵母細胞であることができるが、培養に付
される酵母細胞はアスタキサンチンを生産する本来の且
つ改良された能力を有する酵母細胞、典型的には前に説
明したような変異誘発により得られた酵母細胞であるこ
とが好ましい。本来の増加したアスタキサンチン生産性
を有するこれらの酵母細胞を用いて、増殖制限期を含む
特定の培養法を用いる場合に得られる生物体中のアスタ
キサンチンの濃度は、前記のようにして測定した場合、
酵母乾物ｇ当り600μｇ以上、好ましくは800μｇ以上、
さらに好ましくは1000μｇ以上、特に酵母乾物ｇ当り15
00μｇ以上、例えば酵母乾物ｇ当り2000μｇ以上、そし
て最も好ましくは酵母乾物3000μｇ以上である。
通常、そして前記のように、酵母細胞又は酵母細胞部分
中の全色素含量及びアスタキサンチン含量は酵母乾物ｇ
当りのμｇとして記載される。しかしながら、全色素及
びアスタキサンチン含量を記載する他の方法が便利であ
ることが見出されよう。例えば、全色素含量及びアスタ
キサンチン含量をそれが存在する懸濁液、例えば増殖培
地ml当りμｇとして記載するのが有用であろう。従っ
て、アスタキサンチン又は全色素がそこから回収される
酵素乾物の重量を測定する必要がない。従って、酵母細
胞の培養又は発酵中、酵母細胞のアスタキサンチン及び
／又は色素含量を容易に結決することができる。
中の全色素含量及びアスタキサンチン含量は酵母乾物ｇ
当りのμｇとして記載される。しかしながら、全色素及
びアスタキサンチン含量を記載する他の方法が便利であ
ることが見出されよう。例えば、全色素含量及びアスタ
キサンチン含量をそれが存在する懸濁液、例えば増殖培
地ml当りμｇとして記載するのが有用であろう。従っ
て、アスタキサンチン又は全色素がそこから回収される
酵素乾物の重量を測定する必要がない。従って、酵母細
胞の培養又は発酵中、酵母細胞のアスタキサンチン及び
／又は色素含量を容易に結決することができる。
高アスタキサンチン含量を有する酵母細胞を得るための
前記の培養の後、培養物をそれに続く細胞単離のための
前記の処理、及び／又はそれに続いて例えば細胞の破壊
によりそれを使用するための処理に付く、そして／又は
アスタキサンチンを細胞から抽出することができる。
前記の培養の後、培養物をそれに続く細胞単離のための
前記の処理、及び／又はそれに続いて例えば細胞の破壊
によりそれを使用するための処理に付く、そして／又は
アスタキサンチンを細胞から抽出することができる。
これらの処理の次の重要な例をさらに詳細に検討する。
細胞を上昇した圧力及び次の該圧力の開放にかけること
により該細胞を破壊することができる。
により該細胞を破壊することができる。
細胞をバルブホモジナイザーを有する系に通すことによ
り上昇した圧力及び該圧力の開放にかけることができ、
この場合、上昇した圧力はバルブホモジナイザーの前で
達成される。バルブホモジナイザーは、細胞懸濁液が高
圧下で通過するエアロジェット、及び該バルブを通過し
た実質的に後にジェットがそれに当る障害部材を有す
る。細胞粉砕バルブの例は1985年３月のAPV Gaulin Tec
hical Bulletin（APV Gaulin International SA,P.O.Bo
x 58,1200 AB Hilversum、オランダ）に記載されてお
り、引例によりこの明細書に組み入れる。適当な細胞破
壊ホモジナイザーの例として前記刊行物に記載されてい
るCR型の細胞破壊バルブを有するAPV Gaulin MC4 ホモ
ジナイザーを挙げることができる。このホモジナイザー
は熱交換器に連結され、その熱交換器中を、破壊された
細胞を含有する懸濁液が細胞破壊バルブから通過する。
バルブの前での細胞懸濁液の圧力は約400〜1200bar、例
えば約700barであろう。この処理は例えば３回、その間
に熱交換器中でホモジネートの冷却を行いながら反復す
る。
り上昇した圧力及び該圧力の開放にかけることができ、
この場合、上昇した圧力はバルブホモジナイザーの前で
達成される。バルブホモジナイザーは、細胞懸濁液が高
圧下で通過するエアロジェット、及び該バルブを通過し
た実質的に後にジェットがそれに当る障害部材を有す
る。細胞粉砕バルブの例は1985年３月のAPV Gaulin Tec
hical Bulletin（APV Gaulin International SA,P.O.Bo
x 58,1200 AB Hilversum、オランダ）に記載されてお
り、引例によりこの明細書に組み入れる。適当な細胞破
壊ホモジナイザーの例として前記刊行物に記載されてい
るCR型の細胞破壊バルブを有するAPV Gaulin MC4 ホモ
ジナイザーを挙げることができる。このホモジナイザー
は熱交換器に連結され、その熱交換器中を、破壊された
細胞を含有する懸濁液が細胞破壊バルブから通過する。
バルブの前での細胞懸濁液の圧力は約400〜1200bar、例
えば約700barであろう。この処理は例えば３回、その間
に熱交換器中でホモジネートの冷却を行いながら反復す
る。
後で説明するように、アスタキサンチン含量の利用性は
問題の動物の消化系に利用され得る細胞含量に大きく依
存するから、細胞が飼料中で使用される場合はそれが破
壊されるか又は他の処理がなされなければならない。
問題の動物の消化系に利用され得る細胞含量に大きく依
存するから、細胞が飼料中で使用される場合はそれが破
壊されるか又は他の処理がなされなければならない。
破壊された酵母細胞は該破壊された細胞を濃縮するため
に限外濾過又は蒸発にかけられる。限外濾過は、例えば
De Denske Sukkerfabrikkerから得られる1alユニット
系、例えば、タイプRC70の0.88m2の全フィルター面積の
限外濾過膜３枚を有するシステム37において行うことが
できる。破壊された細胞を濃縮するための他の方法は、
細胞の懸濁液からの水の真空蒸発を行うことである。
に限外濾過又は蒸発にかけられる。限外濾過は、例えば
De Denske Sukkerfabrikkerから得られる1alユニット
系、例えば、タイプRC70の0.88m2の全フィルター面積の
限外濾過膜３枚を有するシステム37において行うことが
できる。破壊された細胞を濃縮するための他の方法は、
細胞の懸濁液からの水の真空蒸発を行うことである。
破壊された細胞は噴霧乾燥又はドラム乾燥により乾燥せ
しめることができる。乾燥の前にキャリヤー、例えばナ
トリウムカゼイン、酸化防止剤及び／又は乳化剤を添加
するのが好ましい。噴霧乾燥は、例えば、破壊された細
胞及び場合によっては好ましくは水溶液の形のナトリウ
ムカゼインのごときキャリヤーの均一に混合されたスラ
リーを噴霧乾燥にかけることにより行うことができる。
噴霧乾燥は、ナトリウムカゼインの水溶液と酵母スラリ
ーと混合して約２〜10％（w/v）のナトリウムカゼイン
濃度を得ることによって好適に得られる。次に、得られ
る混合物を窒素雰囲気中に攪拌しながら置き、この後噴
霧乾燥塔にポンプ輸送し、その中で例えば150〜230℃、
例えば約180℃の温度での乾燥に付して酵母細胞材料の
水含量を例えば10％以下に減少せしめる。次に酵母細胞
材料を噴霧ホイールにより霧化する。噴霧乾燥処理から
得られた粉末状酵母材料はサイクロンにより好適に回収
され、そして場合によっては次に篩別しそして包装す
る。適当な噴霧乾燥装置の例はAnhydroからのタイプEAK
-1の噴霧塔である。あるいは、破壊された酵母細胞を、
例えば密閉されたドラム乾燥装置において150〜200℃の
温度でドラム乾燥にかけることができる。
しめることができる。乾燥の前にキャリヤー、例えばナ
トリウムカゼイン、酸化防止剤及び／又は乳化剤を添加
するのが好ましい。噴霧乾燥は、例えば、破壊された細
胞及び場合によっては好ましくは水溶液の形のナトリウ
ムカゼインのごときキャリヤーの均一に混合されたスラ
リーを噴霧乾燥にかけることにより行うことができる。
噴霧乾燥は、ナトリウムカゼインの水溶液と酵母スラリ
ーと混合して約２〜10％（w/v）のナトリウムカゼイン
濃度を得ることによって好適に得られる。次に、得られ
る混合物を窒素雰囲気中に攪拌しながら置き、この後噴
霧乾燥塔にポンプ輸送し、その中で例えば150〜230℃、
例えば約180℃の温度での乾燥に付して酵母細胞材料の
水含量を例えば10％以下に減少せしめる。次に酵母細胞
材料を噴霧ホイールにより霧化する。噴霧乾燥処理から
得られた粉末状酵母材料はサイクロンにより好適に回収
され、そして場合によっては次に篩別しそして包装す
る。適当な噴霧乾燥装置の例はAnhydroからのタイプEAK
-1の噴霧塔である。あるいは、破壊された酵母細胞を、
例えば密閉されたドラム乾燥装置において150〜200℃の
温度でドラム乾燥にかけることができる。
アスタキサンチンは高温において非常に容易に分解され
るので、破壊された酵母細胞を高温にかける時間を可及
的に短かくすることが重要である。さらに、アスタキサ
ンチンは酸素に感受性であるため、乾燥は好ましくは非
酸化条件下で、例えば不活性雰囲気中、例えば水蒸気
（これは酵母懸濁液から蒸発した水蒸気であることがで
きる）、窒素、及び／又は二酸化炭素中で行うべきであ
る。
るので、破壊された酵母細胞を高温にかける時間を可及
的に短かくすることが重要である。さらに、アスタキサ
ンチンは酸素に感受性であるため、乾燥は好ましくは非
酸化条件下で、例えば不活性雰囲気中、例えば水蒸気
（これは酵母懸濁液から蒸発した水蒸気であることがで
きる）、窒素、及び／又は二酸化炭素中で行うべきであ
る。
乾燥に先立って、破壊された細胞は場合によっては適当
な乳化剤、例えばソルビタンモノステアレート又は酸化
防止剤、ビチルヒドロキシトルエン（BHT）、ブチルヒ
ドロキシアニソール（BHA）、ビタミンＥ、アスコルビ
ン酸、アスコルビン酸の（II）サルフェート又は（II）
ホスフェートエステル、あるいはアスコルビルパルミテ
ートと混合される。
な乳化剤、例えばソルビタンモノステアレート又は酸化
防止剤、ビチルヒドロキシトルエン（BHT）、ブチルヒ
ドロキシアニソール（BHA）、ビタミンＥ、アスコルビ
ン酸、アスコルビン酸の（II）サルフェート又は（II）
ホスフェートエステル、あるいはアスコルビルパルミテ
ートと混合される。
破壊された乾燥細胞は、例えば後で説明するように、動
物飼料の成分としてそのまま有用である。
物飼料の成分としてそのまま有用である。
酵母細胞の含有アスタキサンチンは、種々の抽出剤及び
抽出方法を用いてそこから抽出して、酵母細胞からのア
スタキサンチンの実質的な全抽出が得られることを保証
することができる。ほとんどの場合、抽出は破壊された
細胞材料において行われなければならない。すなわち、
乾燥していても湿っていてもよい破壊された細胞材料は
有機溶剤、例えば石油エーテルは水相から分離した相を
形成するので湿った細胞材料の場合に好適に使用される
石油エーテルにより抽出することができる。他の適当な
有機溶剤はアセトン又はアルコール、例えばメタノール
もしくはエタノール、エーテル、ケトン及び塩素化炭化
水素である。抽出により、アスタキサンチンは有機溶剤
中に溶解する。アスタキサンチンは溶液から溶剤を除去
することにより、例えば落下フィルム蒸発系での蒸発及
びその後の乾燥により得ることができる。しかしなが
ら、ある目的のためには有機溶剤中アスタキサンチンの
濃縮物が便利である。濃縮物はそれ自体飼料又は食品の
製造において使用することができ、あるいは濃縮物は稀
釈し、そして稀釈された状態で飼料又は食品の製造にお
いて使用することができ、例えば飼料又は食品の構成成
分を前記溶液により含浸せしめることにより、又は油脂
のごとき食品成分を着色するために前記溶液（又は濃縮
物）を使用することができる。
抽出方法を用いてそこから抽出して、酵母細胞からのア
スタキサンチンの実質的な全抽出が得られることを保証
することができる。ほとんどの場合、抽出は破壊された
細胞材料において行われなければならない。すなわち、
乾燥していても湿っていてもよい破壊された細胞材料は
有機溶剤、例えば石油エーテルは水相から分離した相を
形成するので湿った細胞材料の場合に好適に使用される
石油エーテルにより抽出することができる。他の適当な
有機溶剤はアセトン又はアルコール、例えばメタノール
もしくはエタノール、エーテル、ケトン及び塩素化炭化
水素である。抽出により、アスタキサンチンは有機溶剤
中に溶解する。アスタキサンチンは溶液から溶剤を除去
することにより、例えば落下フィルム蒸発系での蒸発及
びその後の乾燥により得ることができる。しかしなが
ら、ある目的のためには有機溶剤中アスタキサンチンの
濃縮物が便利である。濃縮物はそれ自体飼料又は食品の
製造において使用することができ、あるいは濃縮物は稀
釈し、そして稀釈された状態で飼料又は食品の製造にお
いて使用することができ、例えば飼料又は食品の構成成
分を前記溶液により含浸せしめることにより、又は油脂
のごとき食品成分を着色するために前記溶液（又は濃縮
物）を使用することができる。
アスタキサンチンはまた酵母細胞から超臨界条件下で二
酸化炭素を使用することにより抽出することができる。
二酸化炭素は適当なエントレイナー、例えば有機溶剤、
特に前記のタイプの溶剤、又はクロロホルムもしくはア
セトニトリルのごとき溶剤、又は氷酢酸と組み合わせて
使用することができる。超臨界抽出にかけられる酵母細
胞は湿った又は乾燥した全体酵母細胞又は破壊された、
例えばホモジナイズされた酵母細胞であることができ
る。
酸化炭素を使用することにより抽出することができる。
二酸化炭素は適当なエントレイナー、例えば有機溶剤、
特に前記のタイプの溶剤、又はクロロホルムもしくはア
セトニトリルのごとき溶剤、又は氷酢酸と組み合わせて
使用することができる。超臨界抽出にかけられる酵母細
胞は湿った又は乾燥した全体酵母細胞又は破壊された、
例えばホモジナイズされた酵母細胞であることができ
る。
培養物からアスタキサンチン含有全体細胞を単離するた
めの好ましい方法は、例えば、フィルタープレス又は回
転ドラムフィルター上で酵母クリームを濾過して約25〜
35％の乾物含量のフィルターケーキを得ることである。
次に、フィルターケーキを好適に、孔を有するプレート
を装着した押出機においてひも状物、例えば約0.5〜2.0
mmの直径を有するひも状物にして押出し、酵母粒子から
成るひもを得ることができる。ひもは好ましくは流動床
中の熱空気中に直接押出され、そこで乾燥される。流動
床での蒸発は好ましくは、酵母粒子の温度が50℃未満、
例えば30〜40℃に保持されるように調節し、そして酵素
乾物量により測定した水分含量（この方法は実施例に記
載する）10重量％未満、好ましくは８重量％未満となっ
た時にこの工程を停止する。あるいは、流動床における
のと同じ条件下トレイ乾燥器中で乾燥を行うことができ
る。次に、乾燥した全体細胞材料をCoball（商標）のご
ときボール攪拌ミル中で粉砕し、そして次に抽出にかけ
る。
めの好ましい方法は、例えば、フィルタープレス又は回
転ドラムフィルター上で酵母クリームを濾過して約25〜
35％の乾物含量のフィルターケーキを得ることである。
次に、フィルターケーキを好適に、孔を有するプレート
を装着した押出機においてひも状物、例えば約0.5〜2.0
mmの直径を有するひも状物にして押出し、酵母粒子から
成るひもを得ることができる。ひもは好ましくは流動床
中の熱空気中に直接押出され、そこで乾燥される。流動
床での蒸発は好ましくは、酵母粒子の温度が50℃未満、
例えば30〜40℃に保持されるように調節し、そして酵素
乾物量により測定した水分含量（この方法は実施例に記
載する）10重量％未満、好ましくは８重量％未満となっ
た時にこの工程を停止する。あるいは、流動床における
のと同じ条件下トレイ乾燥器中で乾燥を行うことができ
る。次に、乾燥した全体細胞材料をCoball（商標）のご
ときボール攪拌ミル中で粉砕し、そして次に抽出にかけ
る。
特定の方法に従えば、例えば前記のようにして得た全体
細胞乾燥材料を油相、例えば可食性油脂、例えば大豆油
もしくは魚油又は他の有機溶剤、例えば前に検討したタ
イプの溶剤と混合することができる。温度は好ましくは
20〜30℃の範囲である。細胞材料と油相又は有機溶剤と
から得られる混合物はミル、例えばボールミル、例えば
ボール攪拌ミル、例えばCoball（商標）ミル中で粉砕し
て細胞を破壊しそして細胞からアスタキサンチンを放出
せしめることができる。生ずる懸濁液をそのまま飼料中
に使用することができ、あるいはアスタキサンチンを含
有する油相を細胞残渣から分離した後に使用することが
できる。麦芽浸出液から細菌を分離するのに用いられる
のと同じ原理で、初流（fast running）遠心機中での遠
心分離により、前記の分離を好適に行うことができる。
言うまでもなく、他の可能性は前記の方法により得られ
た破壊された乾燥細胞材料を油相と混合することであ
り、これは前記の油相へのアスタキサンチンの抽出及び
分離の実施の同様にして行う。油相は前記の方法と同様
にして飼料を着色するために用いることができる。
細胞乾燥材料を油相、例えば可食性油脂、例えば大豆油
もしくは魚油又は他の有機溶剤、例えば前に検討したタ
イプの溶剤と混合することができる。温度は好ましくは
20〜30℃の範囲である。細胞材料と油相又は有機溶剤と
から得られる混合物はミル、例えばボールミル、例えば
ボール攪拌ミル、例えばCoball（商標）ミル中で粉砕し
て細胞を破壊しそして細胞からアスタキサンチンを放出
せしめることができる。生ずる懸濁液をそのまま飼料中
に使用することができ、あるいはアスタキサンチンを含
有する油相を細胞残渣から分離した後に使用することが
できる。麦芽浸出液から細菌を分離するのに用いられる
のと同じ原理で、初流（fast running）遠心機中での遠
心分離により、前記の分離を好適に行うことができる。
言うまでもなく、他の可能性は前記の方法により得られ
た破壊された乾燥細胞材料を油相と混合することであ
り、これは前記の油相へのアスタキサンチンの抽出及び
分離の実施の同様にして行う。油相は前記の方法と同様
にして飼料を着色するために用いることができる。
破壊された細胞材料に対して行われなければならない前
記のような最も従来的な抽出方法に対して、破壊されて
いない全体酵母細胞からアスタキサンチンを抽出するた
めに氷酢酸を好結果に使用することができることが見出
された。すなわち、本発明の１つの観点に従えば、アス
タキサンチンは全体酵母細胞から氷酢酸を含有する溶剤
によって抽出することができ、この抽出は好ましくは溶
剤の氷点より高い温度、例えば20〜100℃の範囲、好ま
しくは20〜80℃の範囲、そしてさらに好ましくは20〜60
℃の範囲において行われる。抽出をより低い温度で行え
ばアスタキサンチンのさらに選択的な抽出を得ることが
できると考えられる。脂肪及び他の抽出され得る成分の
同時抽出がこれらの低い温度では制限されるであろうか
らである。溶剤中の氷酢酸の濃度は好ましくは５〜10
0、10〜70の範囲である。氷酢酸による抽出は、細胞の
色素の約70〜90％の抽出をもたらす。すなわち、酵母細
胞の実質上すべての色素及びアスタキサンチン含量が氷
酢酸抽出物中に見出される。さらに、抽出物は通常約30
〜35％の酵母乾物を含有する。適切には、氷酢酸による
抽出にかけられる酵母は乾燥酵母、すなわち、濾過さ
れ、そして次に流動床に押出され、そこで乾燥された酵
母である。この様に処理された酵母細胞は抽出処理によ
り破壊されない（抽出処理が酵母細胞の激しい機械的処
理を伴わない限り）からである。これは、破壊され又は
ホモジナイズされた細胞の抽出に比べて酵母細胞からの
色素を含む抽出物のその後の分離を促進するであろう。
破壊又はホモジナイズされた細胞は非破壊細胞に比べて
比較的小サイズであるため、使用されるフィルターの孔
を閉塞する傾向が非常に大であるからである。氷酢酸抽
出を実施例９に例示する。氷酢酸による湿酵母の抽出も
また有用であることが証明されよう。
記のような最も従来的な抽出方法に対して、破壊されて
いない全体酵母細胞からアスタキサンチンを抽出するた
めに氷酢酸を好結果に使用することができることが見出
された。すなわち、本発明の１つの観点に従えば、アス
タキサンチンは全体酵母細胞から氷酢酸を含有する溶剤
によって抽出することができ、この抽出は好ましくは溶
剤の氷点より高い温度、例えば20〜100℃の範囲、好ま
しくは20〜80℃の範囲、そしてさらに好ましくは20〜60
℃の範囲において行われる。抽出をより低い温度で行え
ばアスタキサンチンのさらに選択的な抽出を得ることが
できると考えられる。脂肪及び他の抽出され得る成分の
同時抽出がこれらの低い温度では制限されるであろうか
らである。溶剤中の氷酢酸の濃度は好ましくは５〜10
0、10〜70の範囲である。氷酢酸による抽出は、細胞の
色素の約70〜90％の抽出をもたらす。すなわち、酵母細
胞の実質上すべての色素及びアスタキサンチン含量が氷
酢酸抽出物中に見出される。さらに、抽出物は通常約30
〜35％の酵母乾物を含有する。適切には、氷酢酸による
抽出にかけられる酵母は乾燥酵母、すなわち、濾過さ
れ、そして次に流動床に押出され、そこで乾燥された酵
母である。この様に処理された酵母細胞は抽出処理によ
り破壊されない（抽出処理が酵母細胞の激しい機械的処
理を伴わない限り）からである。これは、破壊され又は
ホモジナイズされた細胞の抽出に比べて酵母細胞からの
色素を含む抽出物のその後の分離を促進するであろう。
破壊又はホモジナイズされた細胞は非破壊細胞に比べて
比較的小サイズであるため、使用されるフィルターの孔
を閉塞する傾向が非常に大であるからである。氷酢酸抽
出を実施例９に例示する。氷酢酸による湿酵母の抽出も
また有用であることが証明されよう。
抽出されたアスタキサンチン及び全体乾燥細胞材料は、
アスタキサンチンを分解から保護するために好ましくは
酸素欠乏条件下に保持される。すなわち、アスタキサン
チン含有酵母細胞又は抽出されたアスタキサンチンは好
ましくは酸化防止剤、例えばブチルヒドロキシアニソー
ル（BHA）、ブチルヒドロキシトルエン（BHT）、ビタミ
ンＥ又はアスコルビン酸、アスコルビン酸の（II）サル
フェート又は（II）ホスフェートエステル、あるいはア
スコルビルパルミテート、及び／又は乳化剤、例えばモ
ノグリセライド又はソルビタンエステルにより保持さ
れ、そして密閉条件下で保持される。
アスタキサンチンを分解から保護するために好ましくは
酸素欠乏条件下に保持される。すなわち、アスタキサン
チン含有酵母細胞又は抽出されたアスタキサンチンは好
ましくは酸化防止剤、例えばブチルヒドロキシアニソー
ル（BHA）、ブチルヒドロキシトルエン（BHT）、ビタミ
ンＥ又はアスコルビン酸、アスコルビン酸の（II）サル
フェート又は（II）ホスフェートエステル、あるいはア
スコルビルパルミテート、及び／又は乳化剤、例えばモ
ノグリセライド又はソルビタンエステルにより保持さ
れ、そして密閉条件下で保持される。
本発明はまた、前記の方法により測定した場合に酵母乾
物ｇ当り300μｇ以上の量でアスタキサンチンを含有す
る酵母細胞又は酵母細胞部分を他の飼料成分と組み合わ
せて含んで成る飼料に関する。好ましくは、アスタキサ
ンチン含有酵母細胞又は酵母細胞部分は、全飼料組成物
の乾物に対して10重量％以下、好ましくは５％以下、そ
してさらに好ましくは３％以下を占める。これらの値
は、動物に投与されるべき最終飼料に基いて計算され
る。高濃度の酵母細胞を有する飼料プレミックスを調製
することも可能である。酵母細胞、酵母細胞部分又はア
スタキサンチンは場合によっては、該アスタキサンチン
を水中分散性にすることができる乳化剤と混合される。
さらに、アスタキサンチン含有酵母細胞又は酵母細胞部
分は酸化防止剤及び／又は上記の乳化剤により酸化に対
して保護することができ、そして／又は動物飼料を気密
性のそして場合によっては真空にした容器中に詰めるこ
とができる。
物ｇ当り300μｇ以上の量でアスタキサンチンを含有す
る酵母細胞又は酵母細胞部分を他の飼料成分と組み合わ
せて含んで成る飼料に関する。好ましくは、アスタキサ
ンチン含有酵母細胞又は酵母細胞部分は、全飼料組成物
の乾物に対して10重量％以下、好ましくは５％以下、そ
してさらに好ましくは３％以下を占める。これらの値
は、動物に投与されるべき最終飼料に基いて計算され
る。高濃度の酵母細胞を有する飼料プレミックスを調製
することも可能である。酵母細胞、酵母細胞部分又はア
スタキサンチンは場合によっては、該アスタキサンチン
を水中分散性にすることができる乳化剤と混合される。
さらに、アスタキサンチン含有酵母細胞又は酵母細胞部
分は酸化防止剤及び／又は上記の乳化剤により酸化に対
して保護することができ、そして／又は動物飼料を気密
性のそして場合によっては真空にした容器中に詰めるこ
とができる。
アスタキサンチン含有酵母細胞はまた、それ自体飼料成
分として使用するために包装することができ、あるいは
酵母細胞はそれ自体、通常の又は適合された飼料混合物
が供与された動物に与えられる。
分として使用するために包装することができ、あるいは
酵母細胞はそれ自体、通常の又は適合された飼料混合物
が供与された動物に与えられる。
酵母細胞又は酵母細胞の部分は好適にはそして通常は、
蛋白質及び炭水化物源、油脂並びに微量栄養素、例えば
ビタミン及びミネラルから選択される他の栄養素と混合
される。蛋白質源の例として、カゼイン、アルブミン、
小麦グルテン、魚粉、濃縮魚類残渣（ニベ粉末及び血
粉）が挙げられる。炭水化物源の例として糊化澱粉、押
麦、糖蜜、野菜粉末、及びコーンスターチが挙げられ
る。飼料中の脂肪成分は例えば魚油及びタラの肝油及び
／又は植物油、例えばトウモロコシ油であることができ
る。ミネラルは、カルシウム、リン、ナトリウム、カリ
ウム、塩素、マグネシウム、銅、マンガン、亜鉛、コバ
ルト及びセレンの無機化合物又は単純な有機化合物から
選択される。ビタミンの例として、ビタミンB12、プロ
リン、ビタミンＡ、ビタミンＤ、ビタミンＥ、ビタミン
Ｋ、チアミン、アスコルビン酸、リボフラビン、ピリド
キシン、ナフトエ酸、ナイアシン、ビオチン、コリン及
びイノシト−ルが挙げられる。
蛋白質及び炭水化物源、油脂並びに微量栄養素、例えば
ビタミン及びミネラルから選択される他の栄養素と混合
される。蛋白質源の例として、カゼイン、アルブミン、
小麦グルテン、魚粉、濃縮魚類残渣（ニベ粉末及び血
粉）が挙げられる。炭水化物源の例として糊化澱粉、押
麦、糖蜜、野菜粉末、及びコーンスターチが挙げられ
る。飼料中の脂肪成分は例えば魚油及びタラの肝油及び
／又は植物油、例えばトウモロコシ油であることができ
る。ミネラルは、カルシウム、リン、ナトリウム、カリ
ウム、塩素、マグネシウム、銅、マンガン、亜鉛、コバ
ルト及びセレンの無機化合物又は単純な有機化合物から
選択される。ビタミンの例として、ビタミンB12、プロ
リン、ビタミンＡ、ビタミンＤ、ビタミンＥ、ビタミン
Ｋ、チアミン、アスコルビン酸、リボフラビン、ピリド
キシン、ナフトエ酸、ナイアシン、ビオチン、コリン及
びイノシト−ルが挙げられる。
本発明はまた、酵母から、好ましくは本発明の酵母又は
本発明の方法により製造された酵母から例えば前記の方
法のいずれかにより抽出されたアスタキサンチンを含ん
で成る食品又は飼料に関する。アスタキサンチンは前記
の飼料成分との混合物として、そしてさらに他の食品又
は栄養成分との混合物として、並びに他の着色剤との混
合物として使用することができる。すなわち、酵母細胞
から抽出されたアスタキサンチンは、可食性油、バタ
ー、マーガリン、ショートニング、マヨネーズ、パテ、
スープ、スタック製品、すり身製品、デザート、アイス
クリーム、菓子、焼製品及び飲み物中で使用するために
他の着色剤と混合して、又は単独で使用するのに非常に
適当である。アスタキサンチンがほとんど水又は水相か
ら成る食品に使用される場合、アスタキサンチンは好ま
しくは前記の乳化剤と混合され、この乳化剤は、結晶化
のなんらの傾向を伴わないでそしてアスタキサンチンを
溶解するのに油相の添加を必要としないでアスタキサン
チンを水相中に分散性にするものである。
本発明の方法により製造された酵母から例えば前記の方
法のいずれかにより抽出されたアスタキサンチンを含ん
で成る食品又は飼料に関する。アスタキサンチンは前記
の飼料成分との混合物として、そしてさらに他の食品又
は栄養成分との混合物として、並びに他の着色剤との混
合物として使用することができる。すなわち、酵母細胞
から抽出されたアスタキサンチンは、可食性油、バタ
ー、マーガリン、ショートニング、マヨネーズ、パテ、
スープ、スタック製品、すり身製品、デザート、アイス
クリーム、菓子、焼製品及び飲み物中で使用するために
他の着色剤と混合して、又は単独で使用するのに非常に
適当である。アスタキサンチンがほとんど水又は水相か
ら成る食品に使用される場合、アスタキサンチンは好ま
しくは前記の乳化剤と混合され、この乳化剤は、結晶化
のなんらの傾向を伴わないでそしてアスタキサンチンを
溶解するのに油相の添加を必要としないでアスタキサン
チンを水相中に分散性にするものである。
さらに、本発明は動物の肉の及び／又は該動物により生
産される生成物の赤の着色を得るために動物を飼育する
方法に関し、この方法は、前記の方法により測定した場
合に酵母乾物ｇ当り300μｇ以上の量でアスタキサンチ
ンを含有する酵母細胞又は細胞部分、あるいはそのよう
な酵母細胞又は細胞部分から抽出したアスタキサンチン
を含有する飼料を動物に供与することを含んで成る。
産される生成物の赤の着色を得るために動物を飼育する
方法に関し、この方法は、前記の方法により測定した場
合に酵母乾物ｇ当り300μｇ以上の量でアスタキサンチ
ンを含有する酵母細胞又は細胞部分、あるいはそのよう
な酵母細胞又は細胞部分から抽出したアスタキサンチン
を含有する飼料を動物に供与することを含んで成る。
アスタキサンチン又はアスタキサンチン含有酵母細胞も
しくは酵母細胞部分を含有する飼料の動物に投与する量
は、問題の動物種、及びアスタキサンチンにより得るこ
とが望まれる着色効果に依存するであろう。明らかに、
従うべき原理は、動物が通常の推奨される日用量の大量
−及び微量栄養素を摂取し、そしてさらに問題の動物の
肉又は動物産物の所望の着色をもたらすであろう形態及
び量のアスタキサンチンを摂取することである。幾つか
のケースにおいて、供与されるべきアスタキサンチンの
量は季節に依存し、従って例えば、牛が生草を摂取する
時にはバターの着色は適切であると一般に考えられるの
で、夏場にバターの着色を得るために牛にアスタキサン
チン又は他のカロチノイドを投与するのは好ましくない
であろう。さらに、アスタキサンチン又はアスタキサン
チン含有酵母細胞もしくは細胞の部分が動物に投与され
る量は幾つかの場合には季節に依存するであろう。すな
わち、例えば、サケ又はマスのごとき魚類の場合、夏場
に魚により消費される量とは対象的に冬場に魚により消
費される量は相対的に少い。しかしながら、魚に供与さ
れる適当な量は一日当り魚体重の約1.5％であり、これ
はCalifornia State Department of Fish and Gameによ
り与えられた推奨に相当する。
しくは酵母細胞部分を含有する飼料の動物に投与する量
は、問題の動物種、及びアスタキサンチンにより得るこ
とが望まれる着色効果に依存するであろう。明らかに、
従うべき原理は、動物が通常の推奨される日用量の大量
−及び微量栄養素を摂取し、そしてさらに問題の動物の
肉又は動物産物の所望の着色をもたらすであろう形態及
び量のアスタキサンチンを摂取することである。幾つか
のケースにおいて、供与されるべきアスタキサンチンの
量は季節に依存し、従って例えば、牛が生草を摂取する
時にはバターの着色は適切であると一般に考えられるの
で、夏場にバターの着色を得るために牛にアスタキサン
チン又は他のカロチノイドを投与するのは好ましくない
であろう。さらに、アスタキサンチン又はアスタキサン
チン含有酵母細胞もしくは細胞の部分が動物に投与され
る量は幾つかの場合には季節に依存するであろう。すな
わち、例えば、サケ又はマスのごとき魚類の場合、夏場
に魚により消費される量とは対象的に冬場に魚により消
費される量は相対的に少い。しかしながら、魚に供与さ
れる適当な量は一日当り魚体重の約1.5％であり、これ
はCalifornia State Department of Fish and Gameによ
り与えられた推奨に相当する。
家禽により生産される卵の黄味及び／又は家禽の肉もし
くは皮膚の着色のために前記の方法により家禽を飼育す
る場合、飼料は常用の家禽飼料成分により構成すること
ができ、その例は、好ましくは蛋白質及び炭水化物源、
例えば大豆粉、大豆蛋白質、セルロス、澱粉及び脂肪
源、例えば大豆油、ビタミン、例えば全ビタミン混合
物、及びミネラル、例えば家禽のための一般的ミネラル
成分の混合物、並びに卵殻のためのカルシウム源、好ま
しくは炭酸カルシウム及びリン酸水素カルシウムを含有
するものである。少量の塩化ナトリウムも存在すること
ができる。飼料は常用の供与量で供与することができ
る。
くは皮膚の着色のために前記の方法により家禽を飼育す
る場合、飼料は常用の家禽飼料成分により構成すること
ができ、その例は、好ましくは蛋白質及び炭水化物源、
例えば大豆粉、大豆蛋白質、セルロス、澱粉及び脂肪
源、例えば大豆油、ビタミン、例えば全ビタミン混合
物、及びミネラル、例えば家禽のための一般的ミネラル
成分の混合物、並びに卵殻のためのカルシウム源、好ま
しくは炭酸カルシウム及びリン酸水素カルシウムを含有
するものである。少量の塩化ナトリウムも存在すること
ができる。飼料は常用の供与量で供与することができ
る。
次に実験例によりこの発明をさらに説明する。
材料及び方法 培養物の維持 ファフィア・ロドチーマの培養物を次の２つの方法によ
り維持する。
り維持する。
１）寒天スラント（YM−寒天）上で。スラントを20℃に
て１週間インキュベートし、そして４℃にて１ヶ月保持
し、あらたなスラントを作る前にYM−液体培地中で再培
養する。
て１週間インキュベートし、そして４℃にて１ヶ月保持
し、あらたなスラントを作る前にYM−液体培地中で再培
養する。
２）−80℃での凍結保存。凍結バイアル又はスラントか
ら菌株を250mlの振とうフラスコ中50mlのYM−液体培地
に接種する。振とうフラスコを回転振とう機（150rpm）
上で20℃にて４〜５日間インキュベートする。酵母細胞
を沈澱せしめ、そして液をデカントする。沈降物をグリ
セロール中に20％の濃度に混合し、凍結バイアルに分注
し、そしてディープ・フリーザー中で−80℃にて貯蔵す
る。
ら菌株を250mlの振とうフラスコ中50mlのYM−液体培地
に接種する。振とうフラスコを回転振とう機（150rpm）
上で20℃にて４〜５日間インキュベートする。酵母細胞
を沈澱せしめ、そして液をデカントする。沈降物をグリ
セロール中に20％の濃度に混合し、凍結バイアルに分注
し、そしてディープ・フリーザー中で−80℃にて貯蔵す
る。
酵母乾物含量の測定 5mlの酵母細胞培養物を秤量したザルステッド（Sarsted
t）チューブ（110℃にて一定重量になるまで乾燥したも
の）中で10,000×ｇにて５分間遠心し、そして脱塩水で
２回洗浄する。液をデカントにより除去し、そして110
℃にて一定重量にまで乾燥した後、細胞を含むチューブ
の重量を測定する。これにより酵母細胞の重量（Yg）が
得られる。次に、酵母乾物含量（YDMC）を次の様にして
計算する。
t）チューブ（110℃にて一定重量になるまで乾燥したも
の）中で10,000×ｇにて５分間遠心し、そして脱塩水で
２回洗浄する。液をデカントにより除去し、そして110
℃にて一定重量にまで乾燥した後、細胞を含むチューブ
の重量を測定する。これにより酵母細胞の重量（Yg）が
得られる。次に、酵母乾物含量（YDMC）を次の様にして
計算する。
YDMC（g/）＝Y/5.00×1,000 記載される含量は２個の測定の平均値である。
全色素の測定のための分光光度法分析 メタノール抽出物中の全色素の含量は、B.H.Davies,「C
aroteuoids」,T.W.Goodwin（編集）、Chemistry and Bi
ochemistry of plant pigments,New York,Vol.2,149頁
により記載されているようにして、λmaxの平均及びベ
ール（Beer）の法則により分光光度法により測定され
る。使用する分光光度計は島津UV可視記録分光光度計UV
260である。色素含量は後記の式1,1a,2,2b、及び下記
第１表の吸光係数を用いて計算される。
aroteuoids」,T.W.Goodwin（編集）、Chemistry and Bi
ochemistry of plant pigments,New York,Vol.2,149頁
により記載されているようにして、λmaxの平均及びベ
ール（Beer）の法則により分光光度法により測定され
る。使用する分光光度計は島津UV可視記録分光光度計UV
260である。色素含量は後記の式1,1a,2,2b、及び下記
第１表の吸光係数を用いて計算される。
色素の抽出及び分析−方法１ 約30mlの酵母培養物をサルステッドチューブに移し、そ
して10,000×ｇにて５分間遠心した。酵母細胞を脱イオ
ン水中で洗浄し、そして約20mlのメタノールに懸濁し
た。ローターが直径0.4mmのガラスボール（ガラスボー
ル約15g）で覆われているBead Beater型ガラスボールミ
ル（Biospec Products Inc.,米国）にメタノール懸濁液
を添加して残りの遊離ボールミル容量をうめた。ミルを
30秒間の間隔をおいて１分間ずつ５回運転することによ
り破砕処理を行い、破砕処理の温度を20℃未満に維持す
るように冷却ジャケットに氷水を保持した。破砕処理の
直後にホモジネートの一部をサルステッドチューブに移
し、そして前記のようにして、但し遠心をしないで酵母
乾物を測定した。既知量（bg）のホモジネートを10mlの
メスフラスコに移し、そして溶剤を加えて10mlとした。
この溶液の吸収を測定した。
して10,000×ｇにて５分間遠心した。酵母細胞を脱イオ
ン水中で洗浄し、そして約20mlのメタノールに懸濁し
た。ローターが直径0.4mmのガラスボール（ガラスボー
ル約15g）で覆われているBead Beater型ガラスボールミ
ル（Biospec Products Inc.,米国）にメタノール懸濁液
を添加して残りの遊離ボールミル容量をうめた。ミルを
30秒間の間隔をおいて１分間ずつ５回運転することによ
り破砕処理を行い、破砕処理の温度を20℃未満に維持す
るように冷却ジャケットに氷水を保持した。破砕処理の
直後にホモジネートの一部をサルステッドチューブに移
し、そして前記のようにして、但し遠心をしないで酵母
乾物を測定した。既知量（bg）のホモジネートを10mlの
メスフラスコに移し、そして溶剤を加えて10mlとした。
この溶液の吸収を測定した。
酵母乾物ｇ当りの全色素量μｇ次の様にして決定され
る。
る。
色素の抽出及び分析−方法２ 所定量の酵母培養物（a ml）をサルステッドチューブに
移し、そして10,000×ｇにて５分間遠心分離した。酵母
細胞を脱イオン水中で洗浄し、そして約20mlのメタノー
ルに懸濁する。ローターが直径0.4mmのガラスボールで
覆われている（ガラスボール約15g）Bead Beater型ガラ
スボールミル（Bio-spec Products Inc.米国）にメタノ
ール懸濁液を加えて残りの遊離ボールミル容量をうめ
た。ミルを30秒間の間隔をおいて１分間ずつ５回運転す
ることにより破砕処理を行い、破砕処理の温度を20℃未
満に維持するように冷却ジャケットに氷水を保持した。
破砕処理の直後に液体を50mlのメスフラスコに移した。
ミル中のガラスビースを４×8mlのメタノールで洗浄し
た。画分を集め、そして混合し、そしてメタノールを加
えて50mlとした。メタノール抽出物を濾過した後に色素
を分析する。培養物中の酵母乾物は前記のようにして測
定する。
移し、そして10,000×ｇにて５分間遠心分離した。酵母
細胞を脱イオン水中で洗浄し、そして約20mlのメタノー
ルに懸濁する。ローターが直径0.4mmのガラスボールで
覆われている（ガラスボール約15g）Bead Beater型ガラ
スボールミル（Bio-spec Products Inc.米国）にメタノ
ール懸濁液を加えて残りの遊離ボールミル容量をうめ
た。ミルを30秒間の間隔をおいて１分間ずつ５回運転す
ることにより破砕処理を行い、破砕処理の温度を20℃未
満に維持するように冷却ジャケットに氷水を保持した。
破砕処理の直後に液体を50mlのメスフラスコに移した。
ミル中のガラスビースを４×8mlのメタノールで洗浄し
た。画分を集め、そして混合し、そしてメタノールを加
えて50mlとした。メタノール抽出物を濾過した後に色素
を分析する。培養物中の酵母乾物は前記のようにして測
定する。
サンプルml当りの全色素含量を次のようにして決定す
る。
る。
酵母乾物ｇ当り全色素含量は次のようにして決定する。
Y:色素μg/酵母乾物ｇ YDMC:酵母乾物g/培養液 アスタキサンチンの測定のためのHPLC分析−方法１ 装 置 カラム:LKB Ultropac Precolum,Lichrosorb RP18 7μm,
4×30mm; LKB Ultropac Colum,Lichrosorb RP18 5μm,4
×250mm。
4×30mm; LKB Ultropac Colum,Lichrosorb RP18 5μm,4
×250mm。
検 出:LKB 2151可変波長モニター。
積分機:Waters 740 Date Module。
コントローラー:LKB 2152 HPLCコントローラー。
ポンプ:LKB 2150 HPLCポンプ。
自動サンプラー：可変ループを有するLKB 2157オートサ
ンプラー。
ンプラー。
手動注入:Rheodyne 20μループ。
溶 剤 A:860mlのアセトニトリル＋100mlの水＋40mlの
蟻酸。
蟻酸。
B:960mlの酢酸エチル＋40mlの蟻酸。
すべての溶剤はHPLCグレードであった。
流 速 1.0ml/分。
グラジエント 0-100％ Ｂ 20分間、直線グラジエン
ト 100-0％ Ｂ 10分間、直線グラジエ
ント 検出器 471nm。
ト 100-0％ Ｂ 10分間、直線グラジエ
ント 検出器 471nm。
温 度 周囲温度。
標準溶液 ホフマン・ラ・ロシュ（Hoffmann.La Roche
により供給される純アスタキサンチン（融点 220-222
℃、1cmキュベット中１％w/vアセトン溶液の吸収2100
0）（以後、アスタキサンチン標準と称する）を秤量
し、そして500mlのアセトンに溶解する。
により供給される純アスタキサンチン（融点 220-222
℃、1cmキュベット中１％w/vアセトン溶液の吸収2100
0）（以後、アスタキサンチン標準と称する）を秤量
し、そして500mlのアセトンに溶解する。
HPLC分析のため、問題のサンプル20μをHPLCクロマト
グラフィー装置に注入する。
グラフィー装置に注入する。
アスタキサンチンの測定のためのHPLC分析−方法２ HPLCデータ 装 置 カラム:Supelcoプレカラム Supelco LC 18-DB、粒子サイズ ５μ カラム寸法 4.5×250cm。
検出器:LKB 2151可変波長モニター。
積分器:Waters 740 Date Module。
コントローラー:LKB 2152 HPLCコントローラー。
ポンプ:LKB 2150 HPLCポンプ。
自動サンプラー：可変ループを有するLKB 2157オートサ
ンプラー。
ンプラー。
手動注入:Rheodyne 20μループ。
溶 剤 A:400ml テトラヒドロフラン 400ml メタノール 200ml 0.02Mグリシン緩衝液pH2.6 B:1000ml テトラヒドロフラン。
緩衝液以外のすべての溶剤はHPLCグレートである。緩衝
液は使用前に0.22μｍフィルターを通して無菌化する。
液は使用前に0.22μｍフィルターを通して無菌化する。
検出器 480nm。
温 度 室温。
標準溶液 5mgのアスタキサンチン標準を秤量し、そし
て500mlのテトラヒドロフランに溶解する。
て500mlのテトラヒドロフランに溶解する。
HPLC分析のため、問題のサンプル20μをHPLCクロマト
グラフィー装置に注入する。
グラフィー装置に注入する。
サルステッドチューブ Hounisens Laboratory,rhus,デンマークにより供給さ
れるタイプ55533のポリプロピレン栓を有するポリプロ
ピレン遠心チューブ。
れるタイプ55533のポリプロピレン栓を有するポリプロ
ピレン遠心チューブ。
化学物質 実験室規模で使用する化学物質は分析グレードのもので
ある。発酵に使用する化学物質は食品グレードのもので
ある。グルコース及びシュークロース濃度はベーリンガ
ー・マンハイムからのキット（Best.No.139041）を用い
て分析した。
ある。発酵に使用する化学物質は食品グレードのもので
ある。グルコース及びシュークロース濃度はベーリンガ
ー・マンハイムからのキット（Best.No.139041）を用い
て分析した。
振とうフラスコ培養及び寒天プレート用培地 Difco Laboratories Incorporatedにより供給されるYM
（Yeast Morphology）培地（ディフコ・マニュアル:Deh
ydrated culture media and reagents for microbiolog
y,第10版、デトロイト、1984）。
（Yeast Morphology）培地（ディフコ・マニュアル:Deh
ydrated culture media and reagents for microbiolog
y,第10版、デトロイト、1984）。
凍結バイアル Technunc,Roskilde,デンマークにより供給されるタイプ
363401の2.0ml容量のポリプロピレンチューブ。
363401の2.0ml容量のポリプロピレンチューブ。
例1. 変異誘発 変異誘発 各場合において、処理された培養物の生存の程度が１〜
５％であるように変異誘発処理を行った。寒天プレート
に単一コロニーとしてプレートした場合に変異株の赤色
の強さを視覚的に比較することによって適当な変異体を
選択した。
５％であるように変異誘発処理を行った。寒天プレート
に単一コロニーとしてプレートした場合に変異株の赤色
の強さを視覚的に比較することによって適当な変異体を
選択した。
UV−照射 YM培地中に20〜22℃にて増殖したATCC 24261のちょうど
濁っている４日培養物を0.9％NaCl溶液中に、それぞれ1
0-1,10−1.5,10-2,10−2.5及び10-3の濃度に稀釈し、そ
してこれらの稀釈物のそれぞれの0.3mlを寒天プレート
上にプレートし、100〜300コロニーを含む寒天プレート
を得た。次に、これらのプレートを照射原（Vilbert Lo
urmat VL 30LC）から20cmの距離で254nmにて30秒間紫外
線照射にかけ、そして次に20〜22℃にて10日間増殖せし
め、この後、生じたコロニーの色を比較した。
濁っている４日培養物を0.9％NaCl溶液中に、それぞれ1
0-1,10−1.5,10-2,10−2.5及び10-3の濃度に稀釈し、そ
してこれらの稀釈物のそれぞれの0.3mlを寒天プレート
上にプレートし、100〜300コロニーを含む寒天プレート
を得た。次に、これらのプレートを照射原（Vilbert Lo
urmat VL 30LC）から20cmの距離で254nmにて30秒間紫外
線照射にかけ、そして次に20〜22℃にて10日間増殖せし
め、この後、生じたコロニーの色を比較した。
EMS（エチル−メタン−スルホネート）処理 振とうボード上YM培地中で20〜22℃にて増殖したATCC 2
4261の４日間培養物２×15mlを、MSE Major遠心機中で1
250×ｇにて15分間遠心し、そしてペレットを200mlの遠
心チューブ中無菌0.9％NaCl溶液２×15ml中に懸濁し
た。細胞懸濁液の１つを対照として用いた。他の細胞懸
濁液に1gのEMS（Serva 28755）を添加した。20℃にて30
分間の処理の後、150mlの冷無菌0.9％NaCl溶液を加え
た。酵母細胞を無菌0.9％NaCl中で２回洗浄し、そして
0.9％NaClに懸濁した。次に、UV−処理について前記し
たのと同じ方法で酵母細胞懸濁液を稀釈しそして寒天プ
レート上にプレートした。単離された変異株の１つを19
87年４月15日にCBS（Centraal-bureau voor Schimmelcu
ltures）にPhaffia rhodozyma E10の名称のもとにブタ
ペスト条約に基く国際寄託としてCBS 224-87として寄託
した。
4261の４日間培養物２×15mlを、MSE Major遠心機中で1
250×ｇにて15分間遠心し、そしてペレットを200mlの遠
心チューブ中無菌0.9％NaCl溶液２×15ml中に懸濁し
た。細胞懸濁液の１つを対照として用いた。他の細胞懸
濁液に1gのEMS（Serva 28755）を添加した。20℃にて30
分間の処理の後、150mlの冷無菌0.9％NaCl溶液を加え
た。酵母細胞を無菌0.9％NaCl中で２回洗浄し、そして
0.9％NaClに懸濁した。次に、UV−処理について前記し
たのと同じ方法で酵母細胞懸濁液を稀釈しそして寒天プ
レート上にプレートした。単離された変異株の１つを19
87年４月15日にCBS（Centraal-bureau voor Schimmelcu
ltures）にPhaffia rhodozyma E10の名称のもとにブタ
ペスト条約に基く国際寄託としてCBS 224-87として寄託
した。
Ｎ−メチル−Ｎ′−ニトロ−Ｎ−ニトロソグアニジンに
よる処理 25mgのＮ−メチル−Ｎ′−ニトロ−Ｎ−ニトロソグアニ
ジン（Aldrich Chemie BDR）を、ガラス栓を有する10ml
の目方を量った目盛付きシリンダーに加えた。水を加え
た全容10mlとし、そしてその中でＮ−メチル−Ｎ′−ニ
トロ−Ｎ−ニトロソグアニジンを振とうにより溶解し
た。この溶液から10×1mlのストック溶液を得た。
よる処理 25mgのＮ−メチル−Ｎ′−ニトロ−Ｎ−ニトロソグアニ
ジン（Aldrich Chemie BDR）を、ガラス栓を有する10ml
の目方を量った目盛付きシリンダーに加えた。水を加え
た全容10mlとし、そしてその中でＮ−メチル−Ｎ′−ニ
トロ−Ｎ−ニトロソグアニジンを振とうにより溶解し
た。この溶液から10×1mlのストック溶液を得た。
振とうボード上YM培地中で20〜22℃にて増殖したCBS 22
4-87（前記EMS処理により得られた変異株）の４日培養
物２×20mlをサルステッドチューブに移し、そして２回
の遠心分離にかけた。ペレットを1.5mlの0.9％無菌NaCl
溶液に懸濁し、そして上に調製した1mlのストック溶液
を加えた。20〜22℃にて１時間のインキュベーションの
後、酵母細胞を５回、10mlの冷無菌0.9％NaCl溶液中で
洗浄し、これによってＮ−メチル−Ｎ′−ニトロ−Ｎ−
ニトロソグアニジンを除去した。次に、UV−処理につい
て前記したようにして酵母細胞を稀釈し、そして寒天プ
レート上にプレートした。単離された変異株の１つを19
87年４月15日にCBSにPhaffia rhodozyma N16の名称のも
とにブタペスト条約に基く国際寄託としてCBS 225-87と
して寄託した。
4-87（前記EMS処理により得られた変異株）の４日培養
物２×20mlをサルステッドチューブに移し、そして２回
の遠心分離にかけた。ペレットを1.5mlの0.9％無菌NaCl
溶液に懸濁し、そして上に調製した1mlのストック溶液
を加えた。20〜22℃にて１時間のインキュベーションの
後、酵母細胞を５回、10mlの冷無菌0.9％NaCl溶液中で
洗浄し、これによってＮ−メチル−Ｎ′−ニトロ−Ｎ−
ニトロソグアニジンを除去した。次に、UV−処理につい
て前記したようにして酵母細胞を稀釈し、そして寒天プ
レート上にプレートした。単離された変異株の１つを19
87年４月15日にCBSにPhaffia rhodozyma N16の名称のも
とにブタペスト条約に基く国際寄託としてCBS 225-87と
して寄託した。
再単離 CBS 225-87を次に記載するようにして単離に付した。凍
結乾燥したバイアルから酵母をYM培地に懸濁し、そして
20〜22℃にて５日間インキュベートした。培養物をYMプ
レート上にプレートし、そして20〜22℃にて10日間イン
キュベートし、そして新しいコロニーを単離した。コロ
ニーの１つを1988年３月23日にCBSにN-16（５）の名称
のもとにブタペスト条約に基く国際寄託としてCBS 215-
88として寄託した。
結乾燥したバイアルから酵母をYM培地に懸濁し、そして
20〜22℃にて５日間インキュベートした。培養物をYMプ
レート上にプレートし、そして20〜22℃にて10日間イン
キュベートし、そして新しいコロニーを単離した。コロ
ニーの１つを1988年３月23日にCBSにN-16（５）の名称
のもとにブタペスト条約に基く国際寄託としてCBS 215-
88として寄託した。
例2. 野性型ファフィア・ロドチーマ株及び例１において調製
された変異株のアスタキサンチン含量の測定 この例において記載される酵母細胞の培養及びアスタキ
サンチンの測定は、一方において、酵母株の本来的アス
タキサンチン生産能を測定するための本件出願人の前記
標準法において酵母細胞が増殖する条件を構成し、そし
て他方においてアスタキサンチンを測定する条件を構成
する。これらは、請求の範囲に記載するのと同じ標準条
件である。
された変異株のアスタキサンチン含量の測定 この例において記載される酵母細胞の培養及びアスタキ
サンチンの測定は、一方において、酵母株の本来的アス
タキサンチン生産能を測定するための本件出願人の前記
標準法において酵母細胞が増殖する条件を構成し、そし
て他方においてアスタキサンチンを測定する条件を構成
する。これらは、請求の範囲に記載するのと同じ標準条
件である。
振とうフラスコ培養 振とうボード上YM培地中で20〜22℃にて増殖したATCC 2
4261の４日培養物100μを２個のバッフルを有する500
ml振とうフラスコ中の50mlのYM培地に接種した。この培
養物を150rpm、４日間、20〜22℃、そして30mmol/／
時の酸素移動速度での振とうボード上での増殖に付し、
これにより0.6％の酵母細胞培養密度を得た。
4261の４日培養物100μを２個のバッフルを有する500
ml振とうフラスコ中の50mlのYM培地に接種した。この培
養物を150rpm、４日間、20〜22℃、そして30mmol/／
時の酸素移動速度での振とうボード上での増殖に付し、
これにより0.6％の酵母細胞培養密度を得た。
色素の分析 抽出物中のアスタキサンチン含量を次の３つの方法によ
り決定した。
り決定した。
1. メタノール抽出調製物について前記した様にして調
製されたアセトン、メタノール及びエタノール抽出物を
分光光度スキャンニングにかけ、そして第１表に示すλ
max値を得た。
製されたアセトン、メタノール及びエタノール抽出物を
分光光度スキャンニングにかけ、そして第１表に示すλ
max値を得た。
2. 前記の方法と同様にして調製した10mlのエタノール
抽出液の半分に50mg以上のカリウムボロビドリドを加
え、そしてその混合物を30分間攪拌した。抽出物及びカ
リウムボロヒドリド処理したサンプルの吸収を分光光度
計上で変化する波長を用いて測定した。文献に記載され
ている値に対応して、遊離アスタキサンチンは480nmに
広いピークを示し、そして還元されたアスタキサンチン
は450及び476nmに２個のピークを示した。
抽出液の半分に50mg以上のカリウムボロビドリドを加
え、そしてその混合物を30分間攪拌した。抽出物及びカ
リウムボロヒドリド処理したサンプルの吸収を分光光度
計上で変化する波長を用いて測定した。文献に記載され
ている値に対応して、遊離アスタキサンチンは480nmに
広いピークを示し、そして還元されたアスタキサンチン
は450及び476nmに２個のピークを示した。
3.前記の標準的条件下HPLCでのアスタキサンチン含有抽
出物の保持時間を前に定義した標準溶液の保持時間と比
較した。すなわち、標準的条件下でのHPLCにおける本発
明のアスタキサンチンが含有サンプルのピークをHPLCに
おける標準溶液のピークと比較した。保持時間が同一で
あることが見出された。
出物の保持時間を前に定義した標準溶液の保持時間と比
較した。すなわち、標準的条件下でのHPLCにおける本発
明のアスタキサンチンが含有サンプルのピークをHPLCに
おける標準溶液のピークと比較した。保持時間が同一で
あることが見出された。
本発明の変異株（CBS 224-87及びCBS 225-87）並びに既
知のすべての寄託されているアスタキサンチン生産性P.
ロドチーマ株を上記のようにして増殖せしめ、そして分
析した。これらの株の全色素含量及びアスタキサンチン
含量を下記の第２表に示す。
知のすべての寄託されているアスタキサンチン生産性P.
ロドチーマ株を上記のようにして増殖せしめ、そして分
析した。これらの株の全色素含量及びアスタキサンチン
含量を下記の第２表に示す。
全色素の分析は、「色素の抽出及び分析−方法１」に従
って行った。アスタキサンチンは、「アスタキサンチン
の測定のためのHPLC分析−方法１」に行って行った。
って行った。アスタキサンチンは、「アスタキサンチン
の測定のためのHPLC分析−方法１」に行って行った。
これらの値は４個の独立した測定の平均値である。本発
明の変異株がかなり増加したアスタキサンチン含量を示
すことが注目されよう。
明の変異株がかなり増加したアスタキサンチン含量を示
すことが注目されよう。
例3. 発 酵 孔を有する空気パイプから成る静止通気系を有するBubb
le Columm型の十分に洗浄されそして殺菌された4m3の発
酵槽中で炭水化物制限下でフェドーバッチ発酵として発
酵を行った。この発酵槽はpH電極、pH調整剤及び消泡剤
用の入口、並びに排出される空気中のアルコールを測定
するためのアルコール検出器を装着していた。発酵槽の
ジャケットは温度調節した。
le Columm型の十分に洗浄されそして殺菌された4m3の発
酵槽中で炭水化物制限下でフェドーバッチ発酵として発
酵を行った。この発酵槽はpH電極、pH調整剤及び消泡剤
用の入口、並びに排出される空気中のアルコールを測定
するためのアルコール検出器を装着していた。発酵槽の
ジャケットは温度調節した。
出発培地は次の組成、すなわち20g/の糖蜜、0.6g/
の硫酸アンモニウム、0.8g/のリン酸水素二アンモニ
ウム及び0.125g/の硫酸マグネシウムを有し、これら
を適当量の水（100の増殖発酵槽中に30、そして4m3
の生産発酵槽中に2000）と共に発酵槽中で30分が煮沸
した後、発酵槽に接種した。フェドーバッチ発酵におい
て発酵槽にフィードされる培地は２つの異る貯槽、すな
わち10kgの硫酸アンモニウム、5.6kgのリン酸水素二ア
ンモニウム及び80の水から成る化学貯槽、並びに450k
gの糖蜜及び1000の水から成るオートクレーブ殺菌さ
れた糖蜜貯槽から取った。培地の残りを供給する直前に
0.1mgのデスチオビオチン及び1.6kgの硫酸マグネシウム
を発酵槽に直接供給した。すべての化学物質は食品グレ
ードのものであった。糖蜜はDe Manske Sukker-fabrikk
erからのビート糖蜜であった。
の硫酸アンモニウム、0.8g/のリン酸水素二アンモニ
ウム及び0.125g/の硫酸マグネシウムを有し、これら
を適当量の水（100の増殖発酵槽中に30、そして4m3
の生産発酵槽中に2000）と共に発酵槽中で30分が煮沸
した後、発酵槽に接種した。フェドーバッチ発酵におい
て発酵槽にフィードされる培地は２つの異る貯槽、すな
わち10kgの硫酸アンモニウム、5.6kgのリン酸水素二ア
ンモニウム及び80の水から成る化学貯槽、並びに450k
gの糖蜜及び1000の水から成るオートクレーブ殺菌さ
れた糖蜜貯槽から取った。培地の残りを供給する直前に
0.1mgのデスチオビオチン及び1.6kgの硫酸マグネシウム
を発酵槽に直接供給した。すべての化学物質は食品グレ
ードのものであった。糖蜜はDe Manske Sukker-fabrikk
erからのビート糖蜜であった。
発酵中の通気は8.4m3/分であった。消泡剤としてContra
spum 210（Zschimmer ＆ Schwartz）を用い、そしてpH
調整剤として硫酸を用いた。
spum 210（Zschimmer ＆ Schwartz）を用い、そしてpH
調整剤として硫酸を用いた。
ATCC 24261株の酵母細胞をスラントから5mlのYM培地を
含む直径2cmの試験管に移し、この培地中で４日間振と
うボード上で十分な通気のもとで20〜22℃の温度にて培
養して増殖せしめ、次にこの培養物を１のYM培地を含
む２のエルレンマイヤースラスコに移した。振とうボ
ード上、十分な通気のもとで20〜22℃の温度で３日間イ
ンキュベートした後、１の培養物を30の出発培地を
含む100の発酵槽に移した。培養物を、1g/の酵母乾
物量が得られるまで20〜22℃にてバッチ増殖せしめた。
次に、栄養の供給を開始し、そして20〜22℃にてフェド
ーバッチ発酵を行った。２日間の増殖の後、30の培養
物を無菌条件下でペリスタルポンプにより、2000の出
発培地を含む4m3の発酵槽に移送した。この培養物を、
培養物中1g/の酵母乾物含量が得られるまで20〜22℃
でバッチ増殖せしめた。次に、糖蜜の供給を開始し、そ
して38時間続け、この後糖蜜貯槽は空になった。化学物
質は糖蜜と並行して最初の24時間供給した。フェドーバ
ッチ発酵は20〜22℃の温度にて行った。糖蜜貯槽中の糖
蜜の量は、発酵液中４％を越えない酵母乾物含量が得ら
れるように調整した。
含む直径2cmの試験管に移し、この培地中で４日間振と
うボード上で十分な通気のもとで20〜22℃の温度にて培
養して増殖せしめ、次にこの培養物を１のYM培地を含
む２のエルレンマイヤースラスコに移した。振とうボ
ード上、十分な通気のもとで20〜22℃の温度で３日間イ
ンキュベートした後、１の培養物を30の出発培地を
含む100の発酵槽に移した。培養物を、1g/の酵母乾
物量が得られるまで20〜22℃にてバッチ増殖せしめた。
次に、栄養の供給を開始し、そして20〜22℃にてフェド
ーバッチ発酵を行った。２日間の増殖の後、30の培養
物を無菌条件下でペリスタルポンプにより、2000の出
発培地を含む4m3の発酵槽に移送した。この培養物を、
培養物中1g/の酵母乾物含量が得られるまで20〜22℃
でバッチ増殖せしめた。次に、糖蜜の供給を開始し、そ
して38時間続け、この後糖蜜貯槽は空になった。化学物
質は糖蜜と並行して最初の24時間供給した。フェドーバ
ッチ発酵は20〜22℃の温度にて行った。糖蜜貯槽中の糖
蜜の量は、発酵液中４％を越えない酵母乾物含量が得ら
れるように調整した。
フェドーバッチ発酵中の発酵槽への糖蜜の供給は、μ＝
0.15時-1の酵母細胞の比増殖速度を達成することを目標
に調整し、そしてさらに発酵液中のエタノール濃度が0.
1容量％未満となるように制御した。すなわち、エタノ
ール濃度をしばしば測定し、そしてこれが高過ぎること
が見出された場合、許容されるエタノール濃度が再び達
成されるまで糖蜜供給速度を低下せしめた。
0.15時-1の酵母細胞の比増殖速度を達成することを目標
に調整し、そしてさらに発酵液中のエタノール濃度が0.
1容量％未満となるように制御した。すなわち、エタノ
ール濃度をしばしば測定し、そしてこれが高過ぎること
が見出された場合、許容されるエタノール濃度が再び達
成されるまで糖蜜供給速度を低下せしめた。
発酵した液の通気をなんらの栄養も供給することなく20
〜22℃にて16時間続けた。
〜22℃にて16時間続けた。
酵母細胞の組成、並びに全色素含量及びアスタキサンチ
ン含量を、０時、すなわち4m3発酵槽への栄養の供給を
開始する直前、発酵及び増殖が停止した時である38時間
後、並びに発酵した液の16時間の通気の後に測定した。
全色素含量及びアスタキサンチン含量を例２に記載した
ようにして測定し、そして酵母細胞の組成を常法に従っ
て測定した。すなわち、全窒素含量をキュルダール分析
により測定し、トレハロース含量をLourn.Am.Chem.Soc.
72,1950,2059頁に記載されているようにして測定し、そ
してリン酸含量をWater and Waste-water,American Pub
lic Health Association,Inc.,199頁（1960）に記載さ
れているようにして測定した。エタノール分析は少量の
エタノールを測定するためのボイデン（Boidin）法（An
nal.de la brusserie et de la distillerre,1924-25,1
77頁）により測定した。結果を第３表に示す。
ン含量を、０時、すなわち4m3発酵槽への栄養の供給を
開始する直前、発酵及び増殖が停止した時である38時間
後、並びに発酵した液の16時間の通気の後に測定した。
全色素含量及びアスタキサンチン含量を例２に記載した
ようにして測定し、そして酵母細胞の組成を常法に従っ
て測定した。すなわち、全窒素含量をキュルダール分析
により測定し、トレハロース含量をLourn.Am.Chem.Soc.
72,1950,2059頁に記載されているようにして測定し、そ
してリン酸含量をWater and Waste-water,American Pub
lic Health Association,Inc.,199頁（1960）に記載さ
れているようにして測定した。エタノール分析は少量の
エタノールを測定するためのボイデン（Boidin）法（An
nal.de la brusserie et de la distillerre,1924-25,1
77頁）により測定した。結果を第３表に示す。
全色素の分析は方法−１に従って行った。HPLCによるア
スタキサンチンの分析は方法−１により行った。
スタキサンチンの分析は方法−１により行った。
例4. 例３に記載した実験と同様の方法で、ATCC 24261を用い
るフェドーバッチ発酵を行い、相違は出発培地の容量を
1000とし、4m3発酵槽への接種物として前記の様にし
て増殖せしめたATCC 24261を６×１使用し、化学貯槽
が0.5kgの硫酸アンモニウム、2.5kgのリン酸水素二アン
モニウム及び80の水から成り、そして糖蜜貯槽が250k
gの糖蜜及び1000の水から成る点のみであった。フェ
ドーバッチ発酵中栄養を発酵槽に最初に65時間フィード
し、そしてこの後栄養の供給を停止し、そして培養物を
72時間の通気に付した。
るフェドーバッチ発酵を行い、相違は出発培地の容量を
1000とし、4m3発酵槽への接種物として前記の様にし
て増殖せしめたATCC 24261を６×１使用し、化学貯槽
が0.5kgの硫酸アンモニウム、2.5kgのリン酸水素二アン
モニウム及び80の水から成り、そして糖蜜貯槽が250k
gの糖蜜及び1000の水から成る点のみであった。フェ
ドーバッチ発酵中栄養を発酵槽に最初に65時間フィード
し、そしてこの後栄養の供給を停止し、そして培養物を
72時間の通気に付した。
結果を下の第４表に示す。
例5. 本発明の変異株CBS 225-87を用いる実験を例４に記載し
たのと同様にして行い、1000の出発培地容量を用い、
接種物として例３に記載した方法により増殖せしめたCB
S 225-87を６×１用い、化学貯槽は5kgの硫酸アンモ
ニウム、2.8kgのリン酸水素二アンモニウム及び80の
水から成った。フェドーバッチ発酵中アルコールは生成
されず、そして栄養は０〜57時間の間供給し、この後培
養物を栄養供給を伴わない通気にかけた。80時間目にお
ける酵母細胞組成は、酵母乾物中窒素6.5％酵母乾物中
五酸化リン2.5％、及び酵母乾物中トレハロース6.6％で
あった。フェドーバッチ発酵中、全色素、アスタキサン
チン及び酵母乾物を測定し、下の第５表に示す値が得ら
れた。
たのと同様にして行い、1000の出発培地容量を用い、
接種物として例３に記載した方法により増殖せしめたCB
S 225-87を６×１用い、化学貯槽は5kgの硫酸アンモ
ニウム、2.8kgのリン酸水素二アンモニウム及び80の
水から成った。フェドーバッチ発酵中アルコールは生成
されず、そして栄養は０〜57時間の間供給し、この後培
養物を栄養供給を伴わない通気にかけた。80時間目にお
ける酵母細胞組成は、酵母乾物中窒素6.5％酵母乾物中
五酸化リン2.5％、及び酵母乾物中トレハロース6.6％で
あった。フェドーバッチ発酵中、全色素、アスタキサン
チン及び酵母乾物を測定し、下の第５表に示す値が得ら
れた。
全色素及びアスタキサンチン含量（μg/ml）は分析され
た酵母乾物含量と全色素及びアスタキサンチンのμg/g
値から計算した。
た酵母乾物含量と全色素及びアスタキサンチンのμg/g
値から計算した。
例6. CBS 215-88並びにP.ロドチーマ変異株DBT406及びDBT40
3、並びに野性型株CBS 5905及びATCC 24261の色素及び
アスタキサンチン含量を測定した。
3、並びに野性型株CBS 5905及びATCC 24261の色素及び
アスタキサンチン含量を測定した。
振とうフラスコ培養 寒天斜面から酵母細胞をYM培地に接種し、そして20〜22
℃にて２日間インキュベートした。1mlのこの培養物
を、４個のバッフルを有する250mlの振とうフラスコ中
の50mlのYM培地中に接種した。培養物を、150rpmで回転
する振とうボード上での20〜22℃にて５日間の増殖に付
した。
℃にて２日間インキュベートした。1mlのこの培養物
を、４個のバッフルを有する250mlの振とうフラスコ中
の50mlのYM培地中に接種した。培養物を、150rpmで回転
する振とうボード上での20〜22℃にて５日間の増殖に付
した。
全色素の定量測定は方法−２に従って行った。アスタキ
サンチンの測定は方法−２に従って行った。
サンチンの測定は方法−２に従って行った。
計算の例（CBS 215-88について） メタノール抽出物中の全色素を分光光度法分析により測
定した。50mlの抽出物の吸収マイナスメタノールの吸収
をＥ＝1.189であると測定した。サンプルの容量は29ml
であった。式（２）に従って計算される酵母抽出物中の
全色素含量は次の通りである。
定した。50mlの抽出物の吸収マイナスメタノールの吸収
をＥ＝1.189であると測定した。サンプルの容量は29ml
であった。式（２）に従って計算される酵母抽出物中の
全色素含量は次の通りである。
Ｘ′＝1.160×50/2100/29×10,000μg/ml＝9.52μg/ml 酵母乾物は6.7g/であると測定された。酵母乾物ｇ当
りの全色素含量は次の様に決定される。
りの全色素含量は次の様に決定される。
Ｙ＝9.52/7.1×1,000μg/g＝1340μg/g メタノール中のアスタキサンチンの濃度はHPLC分析によ
り6.4μg/mlと決定され、これは、 6.8μg/7.1g/＝880μｇアスタキサンチン/g酵母乾物
に相当する。
り6.4μg/mlと決定され、これは、 6.8μg/7.1g/＝880μｇアスタキサンチン/g酵母乾物
に相当する。
すべての株を上記のようにして増殖せしめ、そして分析
した。菌株の全色素及びアスタキサンチン含量を第６表
に示す。
した。菌株の全色素及びアスタキサンチン含量を第６表
に示す。
例7. 本発明の変異株CBS 215-88のフェドーバッチ発酵を、例
３に記載したとの同じ4m3発酵槽中で、炭水化物源とし
てのシュークロース及びコーン・スティーブ・ソリドを
用いて行った。
３に記載したとの同じ4m3発酵槽中で、炭水化物源とし
てのシュークロース及びコーン・スティーブ・ソリドを
用いて行った。
次の成分： 10 kg コーン・スティーブ・ソリド 12 〃 シュークロース 10 〃 硫酸アンモニウム ３ 〃 リン酸二水素カリウム １ 〃 硫酸マグネシウム 0.05g ビオチン 300 ml 消泡剤Contraspum 210 1000 水 から成る出発培地をpH4.6において蒸発の導入により95
℃にて１時間殺菌し、そして22℃に冷却した後、前記の
ようにして増殖させた６×１のCBS 215-88を接種物と
して加えた。35時間の通気（4.2m3/分）の後、シューク
ロース溶液（0.30g/）の供給を開始した。添加速度は
2.3／時であった。通気を8.2m3/分に増加し、そしてp
H調整器をスタートさせた（セットポイント4.0）。培地
中のシュークロース濃度が28時間後に約1g/に低下し
た時、シュークロースの供給を7.3／時に増加し、そ
してこの速度を24時間維持した。次にシュークロースの
供給を停止し、そして通気速度を4.2m3/分に低下せしめ
て72時間続けた。フェドーバッチ発酵中に全色素及びア
スタキサンチンを測定した。その値を第７表に示す。
℃にて１時間殺菌し、そして22℃に冷却した後、前記の
ようにして増殖させた６×１のCBS 215-88を接種物と
して加えた。35時間の通気（4.2m3/分）の後、シューク
ロース溶液（0.30g/）の供給を開始した。添加速度は
2.3／時であった。通気を8.2m3/分に増加し、そしてp
H調整器をスタートさせた（セットポイント4.0）。培地
中のシュークロース濃度が28時間後に約1g/に低下し
た時、シュークロースの供給を7.3／時に増加し、そ
してこの速度を24時間維持した。次にシュークロースの
供給を停止し、そして通気速度を4.2m3/分に低下せしめ
て72時間続けた。フェドーバッチ発酵中に全色素及びア
スタキサンチンを測定した。その値を第７表に示す。
De Laval OA5M遠心分離機中での遠心分離により培地か
ら酵母細胞を分離し、そして水で２回洗浄した。FILTOR
OXフィルター・タイプVARIO×40/40での濾過により酵母
クリームから酵母を分離し、そして26.3％の乾物を含む
フィルターケーキを1ab流動床乾燥機（GLATT,Haltingen
-Binzen Bd.）中で1mm篩を通して押出し、そして30℃に
て90分間乾燥せしめた。乾燥酵母（乾物91.6％）は、 酵母乾物ｇ当り1360μｇの全色素、及び 酵母乾物ｇ当り1080μｇのアスタキサンチン を含有していた。
ら酵母細胞を分離し、そして水で２回洗浄した。FILTOR
OXフィルター・タイプVARIO×40/40での濾過により酵母
クリームから酵母を分離し、そして26.3％の乾物を含む
フィルターケーキを1ab流動床乾燥機（GLATT,Haltingen
-Binzen Bd.）中で1mm篩を通して押出し、そして30℃に
て90分間乾燥せしめた。乾燥酵母（乾物91.6％）は、 酵母乾物ｇ当り1360μｇの全色素、及び 酵母乾物ｇ当り1080μｇのアスタキサンチン を含有していた。
例8. 下流処理 例３の方法により得られた酵母細胞をDe Laval OA5M遠
心分離機中での遠心分離により発酵液から単離した。こ
の細胞を水で２回洗浄し、そして13％の酵母乾物を含有
する酵母クリームを得た。硫酸を添加して酵母クリーム
pHを4.0に調整し、そしてこの酵母クリームに安息香酸
ナトリウムを0.2％（w/v）の濃度に添加した。単離され
た酵母細胞を処理する間、これらを窒素のもとにおくこ
とにより酵母細胞のアスタキサンチンの実質的な酸化を
防止し、そして温度を約10℃に保持した。
心分離機中での遠心分離により発酵液から単離した。こ
の細胞を水で２回洗浄し、そして13％の酵母乾物を含有
する酵母クリームを得た。硫酸を添加して酵母クリーム
pHを4.0に調整し、そしてこの酵母クリームに安息香酸
ナトリウムを0.2％（w/v）の濃度に添加した。単離され
た酵母細胞を処理する間、これらを窒素のもとにおくこ
とにより酵母細胞のアスタキサンチンの実質的な酸化を
防止し、そして温度を約10℃に保持した。
細胞破壊バルブ及び熱交換器を装着したAPV-Gaulin MC4
ホモジナイザーから成る系に前記酵母クリームを３回通
し、そこで酵母クリームを700barの圧力の破砕に付し、
これにより温度が10〜15℃上昇し、次に熱交換器での冷
却により15℃の温度を得た。この系の中で酵母クリーム
を250／時の速度で循環せしめた。
ホモジナイザーから成る系に前記酵母クリームを３回通
し、そこで酵母クリームを700barの圧力の破砕に付し、
これにより温度が10〜15℃上昇し、次に熱交換器での冷
却により15℃の温度を得た。この系の中で酵母クリーム
を250／時の速度で循環せしめた。
破砕された細胞中のアスタキサンチン含量を次の様にし
て測定した。0.5mlのホモジナイズされた酵母クリーム
の重量を量り、そしてサルステッドチューブに移し、そ
して5mlのアセトンと共に振とうした。サンプルを遠心
分離し、10mlの目盛付シリンダーに移し、そして遠心分
離及び定量的移送を行いながらアセトンにより３回洗浄
した。全色素含量を方法１により測定し、そしてアスタ
キサンチン含量をHPLC−方法１により測定し、そしてこ
の含量を、「材料及び方法」の項で前記した方法により
測定したサンプル中の全乾物含量と関連付けた。この例
に従ってホモジナイズされた酵母クリーム中の抽出可能
なアスタキサンチン含量を、細胞が完全に破砕されてい
る方法１により測定された酵母クリーム中の含量と比較
することにより、この例における破砕の程度が全細胞の
90％以上であると決定された。
て測定した。0.5mlのホモジナイズされた酵母クリーム
の重量を量り、そしてサルステッドチューブに移し、そ
して5mlのアセトンと共に振とうした。サンプルを遠心
分離し、10mlの目盛付シリンダーに移し、そして遠心分
離及び定量的移送を行いながらアセトンにより３回洗浄
した。全色素含量を方法１により測定し、そしてアスタ
キサンチン含量をHPLC−方法１により測定し、そしてこ
の含量を、「材料及び方法」の項で前記した方法により
測定したサンプル中の全乾物含量と関連付けた。この例
に従ってホモジナイズされた酵母クリーム中の抽出可能
なアスタキサンチン含量を、細胞が完全に破砕されてい
る方法１により測定された酵母クリーム中の含量と比較
することにより、この例における破砕の程度が全細胞の
90％以上であると決定された。
窒素で覆われているこうして破砕された細胞に、７％の
ナトリウムカゼインを約45℃の温度において攪拌しなが
ら添加した。次に、ナトリウムカゼインと混合された酵
母細胞ホモジネートを、入口温度が180℃であるAn hydr
o型の噴霧塔において噴霧乾燥にかけた。酵母細胞材料
は噴霧ホイールの使用によって霧化され、そして噴霧塔
の出口の空気の温度は約90℃であった。生ずる酵母粉末
をサイクロンを用いて回収した。この酵母粉末の水分含
量は10重量％未満であった。
ナトリウムカゼインを約45℃の温度において攪拌しなが
ら添加した。次に、ナトリウムカゼインと混合された酵
母細胞ホモジネートを、入口温度が180℃であるAn hydr
o型の噴霧塔において噴霧乾燥にかけた。酵母細胞材料
は噴霧ホイールの使用によって霧化され、そして噴霧塔
の出口の空気の温度は約90℃であった。生ずる酵母粉末
をサイクロンを用いて回収した。この酵母粉末の水分含
量は10重量％未満であった。
例9. 氷酢酸による全色素の抽出 95％の乾物含量を有しそして酵母乾物ｇ当り523μｇの
アスタキサンチンを含有する20gの破砕されていないフ
ァフィア・ロドチーマ酵母細胞（濾過し、そして次に流
動床に押出し、そこで乾燥させたもの）を長さ12cm及び
内径2.4cmのカラムに導入した。このカラムはジャケッ
トを有し、その中に75℃の温度の水を循環せしめた。こ
のカラムの底部において、少量の酸洗浄砂（サンドフィ
ルター）を綿層上に配置した。酵母細胞を75℃の温度の
氷酢酸５×100mlにより抽出し、そして各抽出物中の、
及び抽出された酵母細胞材料（カラム中に残留する氷酢
酸約100mlを含む）中のアスタキサンチンの量を測定し
た。アスタキサンチンの測定を行う前に、抽出された酵
母細胞材料蒸発乾燥せしめた（16.16gの材料が生ず
る）。結果を次の第８表に示す。
アスタキサンチンを含有する20gの破砕されていないフ
ァフィア・ロドチーマ酵母細胞（濾過し、そして次に流
動床に押出し、そこで乾燥させたもの）を長さ12cm及び
内径2.4cmのカラムに導入した。このカラムはジャケッ
トを有し、その中に75℃の温度の水を循環せしめた。こ
のカラムの底部において、少量の酸洗浄砂（サンドフィ
ルター）を綿層上に配置した。酵母細胞を75℃の温度の
氷酢酸５×100mlにより抽出し、そして各抽出物中の、
及び抽出された酵母細胞材料（カラム中に残留する氷酢
酸約100mlを含む）中のアスタキサンチンの量を測定し
た。アスタキサンチンの測定を行う前に、抽出された酵
母細胞材料蒸発乾燥せしめた（16.16gの材料が生ず
る）。結果を次の第８表に示す。
従って、酵母細胞のアスタキサンチン含量の77.9％（81
43.6/10460×100％）が抽出により放出された。
43.6/10460×100％）が抽出により放出された。
例10. ボールミル中でのハモゲナイゼーションによる酵母細胞
の破砕 流動床において乾燥されそして酵母乾物ｇ当り336μｇ
のアスタキサンチンを含有することが見出されたファフ
ィア・ロドチーマ酵母細胞を大豆油中に40％（w/w）の
濃度で懸濁した。この懸濁液を、ジルコニウムボール
（0.1〜1.5mm）を含みそしてビーズを70〜75％満たした
ボールミル（CoBall-Mill、タイプMSZ-12）にポンプ輸
送した。ローターのスピードは13m/秒であった。各試行
の後にサンプルを採取し、そしてサンプルのアスタキサ
ンチン含量をHPLC上で分析した。ボールミルの温度は40
℃〜50℃に保持した。
の破砕 流動床において乾燥されそして酵母乾物ｇ当り336μｇ
のアスタキサンチンを含有することが見出されたファフ
ィア・ロドチーマ酵母細胞を大豆油中に40％（w/w）の
濃度で懸濁した。この懸濁液を、ジルコニウムボール
（0.1〜1.5mm）を含みそしてビーズを70〜75％満たした
ボールミル（CoBall-Mill、タイプMSZ-12）にポンプ輸
送した。ローターのスピードは13m/秒であった。各試行
の後にサンプルを採取し、そしてサンプルのアスタキサ
ンチン含量をHPLC上で分析した。ボールミルの温度は40
℃〜50℃に保持した。
同様に、75％の水中上記乾燥酵母細胞の懸濁液をボール
ミル中で処理した。この処理においてローターのスピー
ドを15m/秒とした。
ミル中で処理した。この処理においてローターのスピー
ドを15m/秒とした。
結果を第９表に示す。この表中、アスタキサンチン含量
を酵母乾物ｇ当りμｇとして示す。
を酵母乾物ｇ当りμｇとして示す。
第９表 60％大豆油 75％水 第一試行 221 179 第二試行 308 192第三試行 313 276 比較のため、乾燥酵母をホモゲナイゼーションを伴わな
いで大豆油又は水で処理した場合、酵母乾物ｇ当りわず
か23μｇのアスタキサンチンが見出された。
いで大豆油又は水で処理した場合、酵母乾物ｇ当りわず
か23μｇのアスタキサンチンが見出された。
酵母細胞の実質的全破砕を得るためにボールミル中での
約３回の処理で十分であることが実験により示された。
約３回の処理で十分であることが実験により示された。
例11. 魚の飼育 異るアスタキサンチン含量の魚餌を調製した。魚粉、大
豆粉、魚油、押小麦、レシチン及び混合物の形のビタミ
ンの混合物である、Dansk Orredfoder,Brande、デンマ
ーク、からの市販魚餌Ecoline 16から魚餌を調製した。
この飼料に種々の量のアスタキサンチンを添加した。例
３に記載したのと同じ方法で増殖せしめそして噴霧乾燥
したP.ロドチーマ酵母細胞からアスタキサンチンを得
た。50℃にて2.7kgの水に溶解したナトリウムカゼイン
0.475kgと混合されたホモジナイズされた酵母クリーム2
8kgから噴霧乾燥した酵母細胞を調製した。2gのアスコ
ルビルパルミテート及び大豆からのトコフェロール1gを
含有する0.068kgのGRINDTEK MOR50をナトリウムカゼイ
ン溶液中に乳化した。ナトリウムカゼイン溶液（酸化防
止剤を含有する）をホモジナイズされた酵母クリームと
混合し、そしてこの混合物を例８に記載したようにして
噴霧乾燥した。噴霧乾燥した生成物（92.6％乾物）は酵
母乾物ｇ当り約674μｇのアスタキサンチンを含有して
いた。この噴霧乾燥した生成物を前記の市販の魚餌に添
加して種々のアスタキサンチン濃度の魚餌（飼料Ａ〜
Ｄ）（下記第10表に示す）を得た。
豆粉、魚油、押小麦、レシチン及び混合物の形のビタミ
ンの混合物である、Dansk Orredfoder,Brande、デンマ
ーク、からの市販魚餌Ecoline 16から魚餌を調製した。
この飼料に種々の量のアスタキサンチンを添加した。例
３に記載したのと同じ方法で増殖せしめそして噴霧乾燥
したP.ロドチーマ酵母細胞からアスタキサンチンを得
た。50℃にて2.7kgの水に溶解したナトリウムカゼイン
0.475kgと混合されたホモジナイズされた酵母クリーム2
8kgから噴霧乾燥した酵母細胞を調製した。2gのアスコ
ルビルパルミテート及び大豆からのトコフェロール1gを
含有する0.068kgのGRINDTEK MOR50をナトリウムカゼイ
ン溶液中に乳化した。ナトリウムカゼイン溶液（酸化防
止剤を含有する）をホモジナイズされた酵母クリームと
混合し、そしてこの混合物を例８に記載したようにして
噴霧乾燥した。噴霧乾燥した生成物（92.6％乾物）は酵
母乾物ｇ当り約674μｇのアスタキサンチンを含有して
いた。この噴霧乾燥した生成物を前記の市販の魚餌に添
加して種々のアスタキサンチン濃度の魚餌（飼料Ａ〜
Ｄ）（下記第10表に示す）を得た。
対象として合成アスタキサンチンを含有する魚餌（飼料
Ｅ）を用いた。飼料Ｅは合成アスタキサンチンを40ppm
に相当する量で含有していた。
Ｅ）を用いた。飼料Ｅは合成アスタキサンチンを40ppm
に相当する量で含有していた。
飼料Ａ〜Ｅは次の組成を有した。
それぞれが約400gの体重を有する約60尾のニジマスを魚
餌Ａ〜Ｅのそれぞれの実験において用いた。魚をケージ
中に保持し、そして飼料を自由に取らせた。水は2.5〜
1.4℃の温度とし、魚飼育実験中の後の期間では低温と
した。
餌Ａ〜Ｅのそれぞれの実験において用いた。魚をケージ
中に保持し、そして飼料を自由に取らせた。水は2.5〜
1.4℃の温度とし、魚飼育実験中の後の期間では低温と
した。
魚からのアスタキサンチンの抽出 使用した装置は実験室実験において常用されている装置
である。
である。
皮膚を有しないニジマスを小片に切断し、そして15gの
肉を秤り取って遠心チューブ（100ml）に入れた。抽出
剤として15mlのテトラヒドロフランを加えた。肉をULTR
ATURAXミキサー中でさらに破砕し、そして次に遠心分離
した。テトラヒドロフラン抽出物を50mlのメスフラスコ
に移した。残渣を音波処理浴中で10mlのテトラヒドロフ
ランにより２〜３回洗浄し、そして遠心分離し、そして
テトラヒドロフラン相をメスフラスコに移し、これに追
加のテトラヒドロフランを加えて50mlにした。この50ml
の内10mlを窒素のもとで40℃の温度にて蒸発せしめた。
蒸発残渣を1mlの移動相に溶解し、そして0.45μｍのフ
ィルターを通して濾過し、その後に分析した。
肉を秤り取って遠心チューブ（100ml）に入れた。抽出
剤として15mlのテトラヒドロフランを加えた。肉をULTR
ATURAXミキサー中でさらに破砕し、そして次に遠心分離
した。テトラヒドロフラン抽出物を50mlのメスフラスコ
に移した。残渣を音波処理浴中で10mlのテトラヒドロフ
ランにより２〜３回洗浄し、そして遠心分離し、そして
テトラヒドロフラン相をメスフラスコに移し、これに追
加のテトラヒドロフランを加えて50mlにした。この50ml
の内10mlを窒素のもとで40℃の温度にて蒸発せしめた。
蒸発残渣を1mlの移動相に溶解し、そして0.45μｍのフ
ィルターを通して濾過し、その後に分析した。
HPLC分析 カラム:LiChrosorb RP-18,5μm,250×4.6mm 移動相: 40ml蟻酸 60ml水 384ml酢酸エチル 516mlアセトニトリル 流 速:10ml/分 注 入:20μループ、Rheodyne 7120 ポンプ:Waters 510 検出器:Waters 481,UV−分光光度形、471nm 積分器:Waters 740 魚の色の決定 魚肉の色を、ミノルタカメラ・メーターIIを用いるＬ＊
ａ＊ｂ＊−色決定法により決定した。Ｌ＊−値は明度成
分を示し、ａ＊−値（−60〜＋60）は緑／赤成分（負の
値は緑成分を示し、そして正の値は赤成分を示す）を示
し、そしてｂ＊−値（−60〜＋90）は青／黄成分を示
す。ａ＊−値のみを第11表に示す。
ａ＊ｂ＊−色決定法により決定した。Ｌ＊−値は明度成
分を示し、ａ＊−値（−60〜＋60）は緑／赤成分（負の
値は緑成分を示し、そして正の値は赤成分を示す）を示
し、そしてｂ＊−値（−60〜＋90）は青／黄成分を示
す。ａ＊−値のみを第11表に示す。
皮膚を有しないニジマスの肉をブレンダーでホモジナイ
ズして均一材料を得、これを小ペトリ皿（高さ1cm、直
径3.5cm）に入れたその全容を占めるようにした。ペト
リ皿中の材料の表面を平らにし、ガラス板を覆い、そし
て次に分析を待った。
ズして均一材料を得、これを小ペトリ皿（高さ1cm、直
径3.5cm）に入れたその全容を占めるようにした。ペト
リ皿中の材料の表面を平らにし、ガラス板を覆い、そし
て次に分析を待った。
次の表めに、魚飼育実験の結果を示す。
この結果が示すところによれば、魚餌Ａ〜Ｅのそれぞれ
のアスタキサンチンは魚に吸収され、そして魚肉は飼料
中のアスタキサンチンの量の増加（飼料Ａ−Ｄ）に従っ
て、そして飼育期間の増加に従って増加する赤色の着色
〔ａ＊−値（色の赤成分を示す）により観察されるよう
に〕を含有する。
のアスタキサンチンは魚に吸収され、そして魚肉は飼料
中のアスタキサンチンの量の増加（飼料Ａ−Ｄ）に従っ
て、そして飼育期間の増加に従って増加する赤色の着色
〔ａ＊−値（色の赤成分を示す）により観察されるよう
に〕を含有する。
さらに、上記の結果は、飼料中のアスタキサンチンの存
在が魚の成長に影響を与えないことを示している。
在が魚の成長に影響を与えないことを示している。
魚を視覚実験にかけ、そして魅力的な赤色を有すること
が見出された。飼育の43日後、飼料Ｄ及びＥ（それぞれ
本発明に従って製造されたアスタキサンチン40ppm及び
合成アスタキサンチン40ppmを含有する）を供与された
色の着色に実質的な差が観察されなかった。飼育の72時
間後、飼料C,D及びＥ（それぞれ、本発明に従って製造
されたアスタキサンチン約20ppm、本発明に従って製造
されたアスタキサンチン40ppm、及び合成アスタキサン
チン40ppmを含有する）により飼育された魚の着色に実
験的な差が観察されなかった。
が見出された。飼育の43日後、飼料Ｄ及びＥ（それぞれ
本発明に従って製造されたアスタキサンチン40ppm及び
合成アスタキサンチン40ppmを含有する）を供与された
色の着色に実質的な差が観察されなかった。飼育の72時
間後、飼料C,D及びＥ（それぞれ、本発明に従って製造
されたアスタキサンチン約20ppm、本発明に従って製造
されたアスタキサンチン40ppm、及び合成アスタキサン
チン40ppmを含有する）により飼育された魚の着色に実
験的な差が観察されなかった。
例12. フィッシュ・パテ（Fish pat′ｅ） タマの小片 71％ 油 ３％ ラスク（rusk） ４％ グリンドステッド・プロテイン177＊） １％ 澱 粉 １％ アスタキサンチン 0.001％ 水、防腐剤及びスパイス 100％まで ＊）グリンドステッド・プロテインは75％のグリンドス
テッド・プロテイン100と25％のアルギン酸ナトリウム
とのブレンドである。
テッド・プロテイン100と25％のアルギン酸ナトリウム
とのブレンドである。
アスタキサンチンを油相に分散せしめた。グリンドステ
ッド・プロテイン177、澱粉及び他の乾燥成分を混合
し、そして魚をコロイドミルに加えた。次に、油相、乾
燥成分、及び水を加え、そしてコロイドミル中で10分間
処理を続ける。パテを錫容器に満たし、そして熱処理を
かけた。
ッド・プロテイン177、澱粉及び他の乾燥成分を混合
し、そして魚をコロイドミルに加えた。次に、油相、乾
燥成分、及び水を加え、そしてコロイドミル中で10分間
処理を続ける。パテを錫容器に満たし、そして熱処理を
かけた。
レッド・ドレッシング 魅力的な赤色を有するレッド・ドレッシングを次の成分
から常法に従って製造することができる。
から常法に従って製造することができる。
油 30.0％ タラゴン酢 12.3％ トメトペースト 8.0％ マヨダン（Mayodan）DC＊） 0.3％ 糖 8.0％ 食 塩 0.8％ アスタキサンチン 0.01〜0.5％ 水、防腐剤及びスパイス 100％まで ＊）マヨダン（Mayodan）DC（商標）はグリンドステッ
ド・プロダクスA/Sからの安定剤である。
ド・プロダクスA/Sからの安定剤である。
フロントページの続き (51)Int.Cl.6 識別記号 庁内整理番号 ＦＩ 技術表示箇所 (Ｃ１２Ｎ 1/16 Ｃ１２Ｒ 1:645） (Ｃ１２Ｐ 23/00 Ｃ１２Ｒ 1:645）
Claims (23)
- 【請求項１】接触物として100μｌの４日間YM培養物を
用い、50mlの培地を含み２個のバッフルを有し150rpmの
回転振とうに付された500mlの振とうフラスコ中で20〜2
2℃にて５日間ディフコYM培地で、30mmol/1/時の酸素移
動速度を用いる条件下で培養せしめ、20mlのメタノール
中0.2gの酵母乾物の懸濁液を、氷水で冷却されるジャケ
ットを有し直径0.4mmのガラスボール15gを収容するガラ
スボールミル中で20℃以下の温度において、0.5分間の
間隔をおいて５×１分間の破砕にかけることによって調
製した酵母のメタノール抽出物について、標準として純
粋なアスタキサンチンを用いてHPLCにより測定した場合
に、酵母乾物ｇ当り600μｇ以上の量でアスタキサンチ
ンを生産する、ファフィア・ロドチーマ（Phaffia rho
dozyma）種に属する、酵母細胞。 - 【請求項２】寄託番号No.224-87 CBSのもとに寄託され
ている酵母株、寄託番号No.225-87 CBSのもとに寄託さ
れている酵母株又は寄託番号No.215-88 CBSのもとに寄
託されている酵母株に属するか、あるいはそのアスタキ
サンチン生産能を有しているその変異株である、請求項
１に記載の酵母株。 - 【請求項３】請求項１に記載された条件下で増殖しそし
て請求項１に記載した方法により測定した場合に、酵母
乾物ｇ当り700μｇ以上、好ましくは酵母乾物ｇ当り100
0μｇ以上、特に酵母乾物ｇ当り1500μｇ以上、そして
最も好ましくは酵母乾物ｇ当り2000μｇ以上の量でアス
タキサンチンを生産する、請求項１又は２に記載の酵母
細胞。 - 【請求項４】請求項１〜３のいずれか１項に記載の酵母
細胞の製造方法であって、酵母細胞を変異系で処理し、
そして請求項１に記載の条件下で増殖せしめそして請求
項１に記載の方法により測定した場合に酵母乾物ｇ当り
600μｇ以上の量でアスタキサンチンを生産することが
できる生じた変異株を選択することを含んで成る方法。 - 【請求項５】酵母細胞を引き続いての２回以上の変異誘
発処理にかける、請求項４に記載の方法。 - 【請求項６】変異誘発にかけられる酵母細胞が、請求項
１に記載の条件下で増殖せしめそして請求項１に記載の
方法で測定した場合に酵母乾物ｇ当り600μｇ以上の量
でアスタキサンチンを生産する酵母細胞である、請求項
４又は５に記載の方法。 - 【請求項７】前記変異原がエチルメタンスルホネート、
UV照射及びＮ−メチル−Ｎ′−ニトロ−Ｎ−ニトロソグ
アニジンから選択される、請求項４〜６のいずれか１項
に記載の方法。 - 【請求項８】ファフィア・ロドチーマ種に属する酵母の
アスタキサンチン含有細胞又はその細胞破砕物の製造方
法であって、炭水化物源、資化性窒素源及びリン源、微
少栄養素及びビオチン又はデスチオビオチンを含有する
培地中でアスタキサンチン生産性酵母細胞を15〜26℃の
温度において培養することによって請求項１に記載の酵
母細胞を得、そして所望により前記細胞を破壊すること
を含んで成る方法。 - 【請求項９】培養をフェドーバッチ発酵により行い、ア
ルコールが実質的に生成されずそして場合によってはグ
ルコース及びサッカロースの合計濃度が8g/l以下、好ま
しくは5g/l、そして最も好ましくは1g/lであり温度が20
〜22℃である条件下で発酵を行い、発酵又はその部分
を、糖蜜及び／又はサッカロース並びに窒素源、例えば
硫酸アンモニウム、リン酸アンモニウム、水酸化アンモ
ニウム又は尿素、リン源、例えばリン酸アンモニウム及
びリン酸、並びに添加された微量栄養素又は鉱物塩、例
えば硫酸マグネシウム、硫酸亜鉛及びビオチン又はデス
チオビオチンを含有する培地中で行い、糖蜜を他の成分
とは別に培地に供給する、請求項８に記載の方法。 - 【請求項１０】培養が、実質的にすべての培養条件につ
いて実質的に十分である条件下での増殖期、及びこれに
続く、連続する通気のもとで増殖培地が少なくとも１種
類の増殖因子を消耗しこれによってこれに続く期間での
アスタキサンチンの生産を増強する増殖制限期を含んで
成る、請求項８又は９に記載の方法。 - 【請求項１１】前記増殖制限期を約16時間以上、例えば
16〜24時間続け、増殖制限期を、この期間を用いないで
得られる生産の1.2倍以上、好ましくはこの期間を用い
ないで得られる生産の1.3倍以上、例えば1.4倍以上、そ
してさらに好ましくは1.5倍以上のアスタキサンチン生
産を増強するように適合せしめ、増殖制限期を好ましく
は培地になんらの栄養又は微量栄養も実質上添加するこ
となく行う、請求項８〜10のいずれか１項に記載の方
法。 - 【請求項１２】培養される酵母細胞が野性型アスタキサ
ンチン生産性ファフィア・ロドチーマ種酵母細胞である
請求項８〜11のいずれか１項に記載の方法。 - 【請求項１３】得られる生物体中のアスタキサンチンの
濃度が酵母乾物ｇ当り700μｇ以上である、請求項８〜1
2のいずれか１項に記載の方法。 - 【請求項１４】培養される酵母細胞が請求項２又は３に
記載の酵母細胞である、請求項８〜13のいずれか１項に
記載の方法。 - 【請求項１５】得られる生物体中のアスタキサンチンの
濃度が、酵母乾物ｇ当り700μｇ以上、好ましくは800μ
ｇ以上、さらに好ましくは1000μｇ以上、特に酵母乾物
ｇ当り1500μｇ以上、例えば酵母乾物ｇ当り2000μｇ以
上、そして最も好ましくは酵母乾物ｇ当り3000μｇ以上
である、請求項８〜14のいずれか１項に記載の方法。 - 【請求項１６】前記培養及びそれに続く任意的増殖制限
期に続き、酵母細胞を次の処理： ◎ 細胞を上昇した圧力にかけそして次に圧力を開放す
ることにより細胞を破砕し、そして次に破砕された細胞
を限外濾過又は蒸発にかけて該破砕された酵母細胞を濃
縮する； ◎ 細胞を上昇した圧力にかけそして次に圧力を開放す
ることにより細胞を破砕し、そして次に該破砕された細
胞を噴霧乾燥又はドラム乾燥する； ◎ 濾過してフィルターケーキを得、これを次に押出
し、次に、押出したものを例えば流動床中で又はトレイ
乾燥により乾燥する； ◎ 流動床中で又はトレイ乾燥により乾燥された全体細
胞乾燥材料を油相、例えば可食性油脂と混合し、この混
合物をミル、例えばボール攪拌ミル中で粉砕して細胞を
破砕しそしてアスタキサンチンを前記油相に放出せしめ
る； の１つ又は複数にかける、請求項８〜15のいずれか１項
に記載の方法。 - 【請求項１７】前記処理を、酸素制限条件下で、例えば
不活性雰囲気、例えば水蒸気より及び／又は窒素により
及び／又は二酸化炭素により達成される不活性雰囲気中
で行う、請求項16に記載の方法。 - 【請求項１８】氷酢酸含有溶剤による全体酵母細胞の抽
出を溶剤の氷点より高い温度、例えば20〜100℃の範
囲、好ましくは20〜80℃の範囲、そしてさらに好ましく
は20〜60℃の範囲の温度において行う、請求項16又は17
に記載の方法。 - 【請求項１９】請求項１に記載の酵母細胞又はその細胞
破砕物を他の飼料成分、好ましくは動物飼料と組み合わ
せて含んで成る動物飼料であって、前記アスタキサンチ
ン含有酵母細胞又はその細胞破砕物が全動物飼料組成物
乾物の10重量％以下、好ましくは５％以下、そしてさら
に好ましくは３％以下であり、他の成分が好ましくは蛋
白質及び炭水化物、例えば魚粉、小麦、血粉、穀粉、脂
肪、例えば魚油及び植物油、ビタミン及びミネラルから
選択される、動物飼料。 - 【請求項２０】前記アスタキサンチン含有酵母細胞又は
その細胞破砕物が、請求項２又は３に記載の酵母細胞も
しくはその破砕物、又は請求項８〜18のいずれか１項に
記載の方法により製造された酵母又はその破砕物であ
る、請求項19に記載の動物飼料。 - 【請求項２１】動物の肉及び／又は動物により生産され
る生成物の赤色の着色を得るために動物を飼育する方法
であって、該動物に、請求項１に記載の酵母細胞又はそ
の細胞破砕物を含有する飼料を供与することを含んで成
り、該動物が好ましくは魚、特にサケもしくはマス、バ
ターに着色するためにウシ、あるいは卵黄を着色するた
めに家禽である、前記方法。 - 【請求項２２】アスタキサンチンの製造方法であって、
請求項１〜３のいずれか１項に記載の酵母細胞又は請求
項８〜18項のいずれか１項に記載の方法により得られた
細胞もしくはその破砕物を、任意の順序で下記の工程に
かけることを含んで成る方法： ◎ 培養物から細胞を収得して酵母クリームを得る； ◎ 細胞を開く、例えば機械的、化学的及び／又は酵素
処理の手段により、そして／又は細胞を音波処理、自己
消化、浸透圧分解及び／又は原形質分離にかけることに
より、場合によっては適当な薬剤、例えば洗剤、酸、塩
基、酵素、自己消化増強物質、浸透圧分解剤例えば塩、
及び／又は原形質分解剤の添加に伴って、細胞壁を破壊
する； ◎ 細胞をホモジナイズしてホモジネートを得る； ◎ 細胞、細胞断片又はホモジネートを、好ましくは12
重量％以下の水分含量に、好ましくは10重量％以下の水
分含量に乾燥する； ◎ 細胞、細胞断片又はホモジネートからアスタキサン
チンを抽出する。 - 【請求項２３】下記の工程の少なくとも１つの任意の順
序で行うことを含んで成る請求項22に記載の方法： ◎ 好ましくはホモジナイズされた破砕された細胞を有
機溶剤、例えば石油エーテル、アセトン、又はアルコー
ル、例えばメタノール、エタノール又はイソプロパノー
ルで抽出することにより有機溶剤に溶解したアスタキサ
ンチンを得、そして次に場合によっては溶剤を例えば蒸
発により除去する； ◎ 全体細胞を氷酢酸を含んで成る溶剤により抽出する
ことによって氷酢酸含有溶剤中に含まれたアスタキサン
チンを得る； ◎ 破砕された又は全体に湿った又は乾燥した細胞を、
場合によっては例えば前記の有機溶剤の存在下で二酸化
炭素により超臨界抽出する。
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