JPH07145192A - タンパク質純性化方法及びその純性化確認方法 - Google Patents
タンパク質純性化方法及びその純性化確認方法Info
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- JPH07145192A JPH07145192A JP5251960A JP25196093A JPH07145192A JP H07145192 A JPH07145192 A JP H07145192A JP 5251960 A JP5251960 A JP 5251960A JP 25196093 A JP25196093 A JP 25196093A JP H07145192 A JPH07145192 A JP H07145192A
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Abstract
(57)【要約】
【目的】 例えば発酵肉汁や牛乳のような複合溶液から
有用なタンパク質を取り出して回収する方法を提供す
る。 【構成】 有用なタンパク質を含む複合水溶液に、シリ
カハイドロゲル、キセロゲル、あるいはコゲルのような
シリカゲル収着体の安全で効果的な量を添加する。次
に、このシリカゲル収着体を有用なタンパク質がシリカ
ゲルに接触し収着されるように複合溶液中で十分に混合
する。続いてその有用なタンパク質が収着したシリカゲ
ルを溶液から取り出す。そして、他の収着成分の抽出を
最小限に抑える状態でシリカゲル収着体から有用なタン
パク質を抽出する。
有用なタンパク質を取り出して回収する方法を提供す
る。 【構成】 有用なタンパク質を含む複合水溶液に、シリ
カハイドロゲル、キセロゲル、あるいはコゲルのような
シリカゲル収着体の安全で効果的な量を添加する。次
に、このシリカゲル収着体を有用なタンパク質がシリカ
ゲルに接触し収着されるように複合溶液中で十分に混合
する。続いてその有用なタンパク質が収着したシリカゲ
ルを溶液から取り出す。そして、他の収着成分の抽出を
最小限に抑える状態でシリカゲル収着体から有用なタン
パク質を抽出する。
Description
【０００１】
【産業上の利用分野】本発明は、タンパク質純性化方法
及びその純性化確認方法に関し、特に発酵肉汁やミルク
のような複合溶液から有用なタンパク質を純性化された
形で抽出して回収することの可能な方法、及び前記タン
パク質が効果的に純性化されるかどうかを確認するため
の方法に関する。
及びその純性化確認方法に関し、特に発酵肉汁やミルク
のような複合溶液から有用なタンパク質を純性化された
形で抽出して回収することの可能な方法、及び前記タン
パク質が効果的に純性化されるかどうかを確認するため
の方法に関する。
【０００２】
【従来の技術】バイオテクノロジーの進歩により、ある
種の有機体において例えば人類に対するインシュリンの
ような有用なタンパク質を構成する因子配列が得られ、
さらに例えば発酵肉汁や牛乳のような有用なタンパク質
を発現する他の有機体からそれを生じさせることが可能
となってきている。
種の有機体において例えば人類に対するインシュリンの
ような有用なタンパク質を構成する因子配列が得られ、
さらに例えば発酵肉汁や牛乳のような有用なタンパク質
を発現する他の有機体からそれを生じさせることが可能
となってきている。
【０００３】
【発明が解決しようとする課題】従来は発現系統の他の
構成成分から有用なタンパク質を分離するのは、極めて
困難でかつコストがかかる。分離及び純性化は、生成物
のコストへの主要な誘因である。
構成成分から有用なタンパク質を分離するのは、極めて
困難でかつコストがかかる。分離及び純性化は、生成物
のコストへの主要な誘因である。
【０００４】例えば発酵肉汁や牛乳のような複合溶液か
ら有用なタンパク質を抽出して回収する簡単な方法が求
められており、また、その方法によりそのような溶液か
ら有用なタンパク質が抽出されることを確認する方法も
求められている。
ら有用なタンパク質を抽出して回収する簡単な方法が求
められており、また、その方法によりそのような溶液か
ら有用なタンパク質が抽出されることを確認する方法も
求められている。
【０００５】したがって、本発明の目的は、例えば発酵
肉汁や牛乳のような複合溶液から有用なタンパク質を抽
出して回収する方法を提供することである。
肉汁や牛乳のような複合溶液から有用なタンパク質を抽
出して回収する方法を提供することである。
【０００６】また、本発明のさらなる目的は、本発明の
方法により複合溶液から有用なタンパク質が抽出され、
そして回収されるかどうかを確認する方法を提供するこ
とである。
方法により複合溶液から有用なタンパク質が抽出され、
そして回収されるかどうかを確認する方法を提供するこ
とである。
【０００７】
【課題を解決するための手段】請求項１に記載のタンパ
ク質純性化方法は、有用なタンパク質を含む複合溶液
に、シリカハイドロゲル、キセロゲル、あるいはコゲル
のような安全で効果的量のシリカゲル収着体を添加し、
このシリカゲルを有用なタンパク質がシリカゲルに接触
し収着されるように複合溶液中で十分に混合し、その有
用なタンパク質が収着したシリカゲルを溶液から取り出
し、それから、他の収着成分の脱着を最小限に抑える状
態でシリカゲル収着体から有用なタンパク質を抽出する
ことからなる。
ク質純性化方法は、有用なタンパク質を含む複合溶液
に、シリカハイドロゲル、キセロゲル、あるいはコゲル
のような安全で効果的量のシリカゲル収着体を添加し、
このシリカゲルを有用なタンパク質がシリカゲルに接触
し収着されるように複合溶液中で十分に混合し、その有
用なタンパク質が収着したシリカゲルを溶液から取り出
し、それから、他の収着成分の脱着を最小限に抑える状
態でシリカゲル収着体から有用なタンパク質を抽出する
ことからなる。
【０００８】請求項２に記載のタンパク質純性化方法
は、有用なタンパク質が不凍性タンパク質である。
は、有用なタンパク質が不凍性タンパク質である。
【０００９】請求項３に記載のタンパク質純性化方法
は、有用なタンパク質がキモシンである。
は、有用なタンパク質がキモシンである。
【００１０】請求項４に記載のタンパク質純性化方法
は、有用なタンパク質がインシュリンである。
は、有用なタンパク質がインシュリンである。
【００１１】請求項５に記載のタンパク質純性化方法
は、シリカゲル収着体がシリカハイドロゲルである。
は、シリカゲル収着体がシリカハイドロゲルである。
【００１２】請求項６に記載のタンパク質純性化方法
は、シリカゲル収着体がシリカキセロゲルである。
は、シリカゲル収着体がシリカキセロゲルである。
【００１３】請求項７に記載のタンパク質純性化方法
は、シリカゲル収着体がシリカコゲルである。
は、シリカゲル収着体がシリカコゲルである。
【００１４】請求項８に記載のタンパク質純性化方法
は、溶離剤が疎水性溶剤である。
は、溶離剤が疎水性溶剤である。
【００１５】請求項９に記載のタンパク質純性化方法
は、溶離剤が水素結合を分断する溶剤である。
は、溶離剤が水素結合を分断する溶剤である。
【００１６】請求項１０に記載のタンパク質純性化方法
は、溶離剤がイオン交換結合を分断する溶剤である。
は、溶離剤がイオン交換結合を分断する溶剤である。
【００１７】請求項１１に記載のタンパク質純性化確認
方法は、請求項１の方法により複合溶液から有用なタン
パク質が抽出されて、回収されるかどうかを決定するた
めの不適当な実験を避ける方法であり、有用なタンパク
質を含む複合溶液に、回収される目的となる有用なタン
パク質に近似する細孔径を有するシリカゲル収着体を添
加し、その溶液中でシリカゲル収着体を十分に混合し、
そのタンパク質がシリカゲル収着体に収着されるように
そのシリカゲル収着体を溶液中に浸漬した状態で保持
し、そしてそのシリカゲル収着体を取り出して、タンパ
ク質とシリカゲル収着体との間に存在する種々の結合を
分断しうる複数の溶離剤によりそのシリカゲル収着体の
試料を処理することからなる。その使用した複数の溶離
剤は集められて、それらが有用なタンパク質を含むかど
うかを確認するために分析される。もし、それらが有用
なタンパク質を含んでいるなら、その方法は、有用なタ
ンパク質を抽出して、回収するのに使用可能である。
方法は、請求項１の方法により複合溶液から有用なタン
パク質が抽出されて、回収されるかどうかを決定するた
めの不適当な実験を避ける方法であり、有用なタンパク
質を含む複合溶液に、回収される目的となる有用なタン
パク質に近似する細孔径を有するシリカゲル収着体を添
加し、その溶液中でシリカゲル収着体を十分に混合し、
そのタンパク質がシリカゲル収着体に収着されるように
そのシリカゲル収着体を溶液中に浸漬した状態で保持
し、そしてそのシリカゲル収着体を取り出して、タンパ
ク質とシリカゲル収着体との間に存在する種々の結合を
分断しうる複数の溶離剤によりそのシリカゲル収着体の
試料を処理することからなる。その使用した複数の溶離
剤は集められて、それらが有用なタンパク質を含むかど
うかを確認するために分析される。もし、それらが有用
なタンパク質を含んでいるなら、その方法は、有用なタ
ンパク質を抽出して、回収するのに使用可能である。
【００１８】請求項１２に記載のタンパク質純性化確認
方法は、溶離剤が、疎水性溶剤、水素結合を分断する溶
剤、及びイオン交換結合を分断する溶剤のうち少なくと
も１種である。
方法は、溶離剤が、疎水性溶剤、水素結合を分断する溶
剤、及びイオン交換結合を分断する溶剤のうち少なくと
も１種である。
【００１９】
【実施例】本発明の実施例を以下詳細に説明する。本発
明の好ましい実施例において、本発明の方法は、発酵肉
汁や牛乳のような複合溶液中に存在する有用なタンパク
質を収着するために、シリカゲル収着体を有用なタンパ
ク質を含む複合溶液に添加し、溶液中のシリカゲル収着
体を十分に混合し、その有用なタンパク質の回収する量
がシリカゲル収着体に収着されるまで、前記シリカゲル
収着体を約１０〜３０分間溶液中に浸漬した状態で保持
し、そして、このシリカゲル収着体を例えば濾過等の通
常の方法により溶液から分離することからなる。その
後、この有用なタンパク質が収着したシリカゲル収着体
は、有用なタンパク質がシリカゲル収着体から分離さ
れ、溶離剤から回収されるようにシリカゲル収着体と有
用なタンパク質との間に存在する結合を分断させる溶離
剤で処理される。
明の好ましい実施例において、本発明の方法は、発酵肉
汁や牛乳のような複合溶液中に存在する有用なタンパク
質を収着するために、シリカゲル収着体を有用なタンパ
ク質を含む複合溶液に添加し、溶液中のシリカゲル収着
体を十分に混合し、その有用なタンパク質の回収する量
がシリカゲル収着体に収着されるまで、前記シリカゲル
収着体を約１０〜３０分間溶液中に浸漬した状態で保持
し、そして、このシリカゲル収着体を例えば濾過等の通
常の方法により溶液から分離することからなる。その
後、この有用なタンパク質が収着したシリカゲル収着体
は、有用なタンパク質がシリカゲル収着体から分離さ
れ、溶離剤から回収されるようにシリカゲル収着体と有
用なタンパク質との間に存在する結合を分断させる溶離
剤で処理される。
【００２０】本発明の実施により、例えば発酵肉汁や牛
乳のような複合溶液から抽出される有用なタンパク質の
代表的なものは、次の通りである。
乳のような複合溶液から抽出される有用なタンパク質の
代表的なものは、次の通りである。
【００２１】(a) タンパク質、例えば不凍性タンパク質
（ＡＦＰ），人の血清アルブミン、及び組織タイプのプ
ラスミノゲン活性剤（ＴＰＡ） (b) ペプチドホルモン、例えばインシュリン (c) 酵素あるいは類似するタンパク質、例えばキモシ
ン、及びアルファ−１−アンチトリプシン (d) 発酵した肉汁、生物流体（例えばミルク）、あるい
は他の液体またはエキスから分離される他の有用なタン
パク質及びペプチド。例えば、成長ホルモン、及びその
他の有用な薬剤。
（ＡＦＰ），人の血清アルブミン、及び組織タイプのプ
ラスミノゲン活性剤（ＴＰＡ） (b) ペプチドホルモン、例えばインシュリン (c) 酵素あるいは類似するタンパク質、例えばキモシ
ン、及びアルファ−１−アンチトリプシン (d) 発酵した肉汁、生物流体（例えばミルク）、あるい
は他の液体またはエキスから分離される他の有用なタン
パク質及びペプチド。例えば、成長ホルモン、及びその
他の有用な薬剤。
【００２２】本発明の実施に使用されるシリカゲル収着
体の代表的なものは、次の通りである。
体の代表的なものは、次の通りである。
【００２３】(a) シリカハイドロゲル、好ましくは約１
００オングストロームの細孔径を有する製品、例えばピ
ー・キュー・コーポレーション（米国ペンシルバニア州
コンショホッケン市所在）製、商品名「ブライトソーブ
Ａ１００」（登録商標）。ブライトソーブＡ１００は、
より小さい細孔径（たとえば２５オングストローム）を
有するシリカゲル収着体を得るために乾燥させることが
できる。
００オングストロームの細孔径を有する製品、例えばピ
ー・キュー・コーポレーション（米国ペンシルバニア州
コンショホッケン市所在）製、商品名「ブライトソーブ
Ａ１００」（登録商標）。ブライトソーブＡ１００は、
より小さい細孔径（たとえば２５オングストローム）を
有するシリカゲル収着体を得るために乾燥させることが
できる。
【００２４】(b) シリカキセロゲル (c) シリカコゲル、好ましい製品としてピー・キュー・
コーポレーション製、商品名「ＤＰ４６６０」（登録商
標）が利用できる。
コーポレーション製、商品名「ＤＰ４６６０」（登録商
標）が利用できる。
【００２５】一般的に、シリカゲル収着体は、抽出され
るタンパク質の分子寸法に近似する細孔径を有するもの
が選択された。しかし、もしそのタンパク質が楕円形、
あるいは円柱状であるならば、シリカゲル収着体は、そ
の分子形状に応じたより小さい細孔径を有するものを選
択する。通常、添加されるシリカゲル収着体の量は、溶
液中の収着させるタンパク質及びその濃度に依存する。
好ましい使用量は、必要とされるタンパク質の全てを収
着するに必要とされる量より過剰量である。一般に、そ
の量は従来耐冷性ビールに使用される量よりもはるかに
多い、すなわち、ほとんどにおいて1000ppm より過剰と
する。
るタンパク質の分子寸法に近似する細孔径を有するもの
が選択された。しかし、もしそのタンパク質が楕円形、
あるいは円柱状であるならば、シリカゲル収着体は、そ
の分子形状に応じたより小さい細孔径を有するものを選
択する。通常、添加されるシリカゲル収着体の量は、溶
液中の収着させるタンパク質及びその濃度に依存する。
好ましい使用量は、必要とされるタンパク質の全てを収
着するに必要とされる量より過剰量である。一般に、そ
の量は従来耐冷性ビールに使用される量よりもはるかに
多い、すなわち、ほとんどにおいて1000ppm より過剰と
する。
【００２６】コーンらは、米国特許第 4,955,578号にお
いて、本発明の方法のシリカゲル収着体として有用な安
定化シリカゲルを製造する方法を開示している。
いて、本発明の方法のシリカゲル収着体として有用な安
定化シリカゲルを製造する方法を開示している。
【００２７】本発明の実施に使用される溶離剤の代表的
なものは、(a) 疎水的相互作用による結合を分断する溶
離剤、例えば、エタノール及び／又はイソプロパノール
などのアルコールを含む溶離剤、(b) イオン交換結合を
分断する溶離剤、例えば塩、緩衝剤及び／又はＥＤＴＡ
を含む溶離剤，(c) 水素結合を分断する溶離剤、例えば
尿素を含むものである。
なものは、(a) 疎水的相互作用による結合を分断する溶
離剤、例えば、エタノール及び／又はイソプロパノール
などのアルコールを含む溶離剤、(b) イオン交換結合を
分断する溶離剤、例えば塩、緩衝剤及び／又はＥＤＴＡ
を含む溶離剤，(c) 水素結合を分断する溶離剤、例えば
尿素を含むものである。
【００２８】耐冷性ビールに使用されたシリカハイドロ
ゲルに収着したタンパク質含有留分は、(1) エタノー
ル、塩及びｐＨ４．２のビールを含む溶離剤、(2) 0.05
Ｍのアンモニウム重炭酸塩及びＥＤＴＡのｐＨ８の溶離
剤、(3) ８Ｍの尿素とＥＤＴＡを含むｐＨ８の重炭酸塩
緩衝剤の溶離剤をもって順次シリカハイドロゲルから溶
出される。
ゲルに収着したタンパク質含有留分は、(1) エタノー
ル、塩及びｐＨ４．２のビールを含む溶離剤、(2) 0.05
Ｍのアンモニウム重炭酸塩及びＥＤＴＡのｐＨ８の溶離
剤、(3) ８Ｍの尿素とＥＤＴＡを含むｐＨ８の重炭酸塩
緩衝剤の溶離剤をもって順次シリカハイドロゲルから溶
出される。
【００２９】エタノール含有溶離剤はゲル濾過による溶
出のために用いられ、ハイドロゲルの細孔及びマトリッ
クスから徐々にそのタンパク質を流出させる。その溶出
した物質の分析結果は、その分析によるプロフィールと
ビールのプロフィールとが一致しないことから、タンパ
ク質が選択的に収着されていることを示した。
出のために用いられ、ハイドロゲルの細孔及びマトリッ
クスから徐々にそのタンパク質を流出させる。その溶出
した物質の分析結果は、その分析によるプロフィールと
ビールのプロフィールとが一致しないことから、タンパ
ク質が選択的に収着されていることを示した。
【００３０】さらにＥＤＴＡを含むｐＨ８の溶離剤によ
る溶出物は、イオン交換による分離についての証拠を提
供した。溶離剤中のＥＤＴＡは、またハイドロゲルへの
収着に直接あるいは間接的に関与する２価の陽イオンの
相互作用をも崩壊させると思われる。この溶離剤の使用
により溶出した物質の組成は、エタノール含有溶離剤に
よって脱着された物質の組成と異なるものであった。
る溶出物は、イオン交換による分離についての証拠を提
供した。溶離剤中のＥＤＴＡは、またハイドロゲルへの
収着に直接あるいは間接的に関与する２価の陽イオンの
相互作用をも崩壊させると思われる。この溶離剤の使用
により溶出した物質の組成は、エタノール含有溶離剤に
よって脱着された物質の組成と異なるものであった。
【００３１】８Ｍの尿素を含む最後の溶離剤は水素結合
を分断することが明らかなものである。その溶離剤の使
用により溶出された物質の組成は、前述した二つの溶離
剤により脱着された物質とは異なるものであった。
を分断することが明らかなものである。その溶離剤の使
用により溶出された物質の組成は、前述した二つの溶離
剤により脱着された物質とは異なるものであった。
【００３２】このハイドロゲルの一連の溶出物により得
られた結果は、収着メカニズムが複合的であり、ゲル濾
過、イオン交換もしかすると２価の陽イオンの相互作用
及び水素結合のコンビネーション、あるいはこれらのど
れか１つを含むものであること示した。
られた結果は、収着メカニズムが複合的であり、ゲル濾
過、イオン交換もしかすると２価の陽イオンの相互作用
及び水素結合のコンビネーション、あるいはこれらのど
れか１つを含むものであること示した。
【００３３】シリカハイドロゲルから溶出した物質は、
界面活性物質、褐色の生成物及びビールタンパク質を含
んでいた。このことは、タンパク質はハイドロゲルマト
リックスに直接的に収着されないことを示唆しており、
それよりむしろ界面活性留分がマトリックスに収着し、
そしてビールタンパク質がこの界面活性留分に収着す
る。
界面活性物質、褐色の生成物及びビールタンパク質を含
んでいた。このことは、タンパク質はハイドロゲルマト
リックスに直接的に収着されないことを示唆しており、
それよりむしろ界面活性留分がマトリックスに収着し、
そしてビールタンパク質がこの界面活性留分に収着す
る。
【００３４】そのうえポリフェノールがシリカハイドロ
ゲルに収着し、タンパク質がポリフェノールに収着する
ことも示唆している。このアイディアは、シリカゲルに
収着している界面活性構成要素のアイディアと類似して
いる。
ゲルに収着し、タンパク質がポリフェノールに収着する
ことも示唆している。このアイディアは、シリカゲルに
収着している界面活性構成要素のアイディアと類似して
いる。
【００３５】その他の起こりうるタンパク質とハイドロ
ゲルとの間の相互作用の態様は、水素結合、親水性及び
疎水性相互作用、ファンデル・ワールス力及びイオン的
相互作用を包含して伴われるものである。付言するなら
ば、アルミノシリケートやマグネシウムシリケートのよ
うな金属イオンを含むコゲルは、よりイオン的な特徴を
有する。
ゲルとの間の相互作用の態様は、水素結合、親水性及び
疎水性相互作用、ファンデル・ワールス力及びイオン的
相互作用を包含して伴われるものである。付言するなら
ば、アルミノシリケートやマグネシウムシリケートのよ
うな金属イオンを含むコゲルは、よりイオン的な特徴を
有する。
【００３６】緩衝剤に溶解した分子量の明らなタンパク
質を使用した実験において、シリカハイドロゲル、シリ
カコゲル、及びシリカキセロゲルへのタンパク質の収着
のメカニズムを明らかにしている。
質を使用した実験において、シリカハイドロゲル、シリ
カコゲル、及びシリカキセロゲルへのタンパク質の収着
のメカニズムを明らかにしている。
【００３７】大きな分子量を有するタンパク質のほう
が、小さい分子量を有するタンパク質よりも効果的に収
着する。小さい分子量を有するタンパク質は、ゲルの細
孔にしっかりと捕捉されないためである。調べられたタ
ンパク質は、アルドラーゼ（重量平均分子量：ＭＷ158,
000 ）、牛の血清アルブミン（ＭＷ67,000）、オバルブ
ミン（ＭＷ45,000）、キモトリプシノーゲンＡ（ＭＷ2
5,000）及びリボヌクレアーゼＡ（ＭＷ13,700）であ
る。
が、小さい分子量を有するタンパク質よりも効果的に収
着する。小さい分子量を有するタンパク質は、ゲルの細
孔にしっかりと捕捉されないためである。調べられたタ
ンパク質は、アルドラーゼ（重量平均分子量：ＭＷ158,
000 ）、牛の血清アルブミン（ＭＷ67,000）、オバルブ
ミン（ＭＷ45,000）、キモトリプシノーゲンＡ（ＭＷ2
5,000）及びリボヌクレアーゼＡ（ＭＷ13,700）であ
る。
【００３８】これらのタンパク質の全ては、ゲルの細孔
に入るに十分に小さい。大きな分子量を有するタンパク
質は、ゲルの細孔（シリカハイドロゲルは100 オングス
トローム）から締め出され、ゲルの表面に収着されも、
捕捉されもしない。
に入るに十分に小さい。大きな分子量を有するタンパク
質は、ゲルの細孔（シリカハイドロゲルは100 オングス
トローム）から締め出され、ゲルの表面に収着されも、
捕捉されもしない。
【００３９】捕捉の結論は、ただ直接的には数種のはっ
きりしたタンパク質を含有する単純な緩衝剤からの収着
に関係する。付加的な収着メカニズムは、発酵した肉汁
のような複合溶液から生じる。タンパク質の収着とタン
パク質の等電点あるいは界面活性のパラメーターとの間
に明確な関係はない。もし、これらの特性が収着に何等
か関係があるのであれば、さらに別の収着や相互作用が
存在するはずである。
きりしたタンパク質を含有する単純な緩衝剤からの収着
に関係する。付加的な収着メカニズムは、発酵した肉汁
のような複合溶液から生じる。タンパク質の収着とタン
パク質の等電点あるいは界面活性のパラメーターとの間
に明確な関係はない。もし、これらの特性が収着に何等
か関係があるのであれば、さらに別の収着や相互作用が
存在するはずである。
【００４０】一般に、タンパク質並びにペプチド、及び
本発明の方法により純性化されうる他の分子は、およそ
1,000 〜250,000 の分子量を有し、好ましいシリカゲル
収着体はそのタンパク質に近似する細孔径を有するもの
である。しかし、選択性は、そのタンパク質分子の形状
に影響される、例えば、楕円形状のタンパク質分子によ
っては、より小さい細孔径のものが用いられる。
本発明の方法により純性化されうる他の分子は、およそ
1,000 〜250,000 の分子量を有し、好ましいシリカゲル
収着体はそのタンパク質に近似する細孔径を有するもの
である。しかし、選択性は、そのタンパク質分子の形状
に影響される、例えば、楕円形状のタンパク質分子によ
っては、より小さい細孔径のものが用いられる。
【００４１】本発明の方法により純性化されうるタイプ
のペプチド及びタンパク質の一部の一覧と、その示され
たシリカゲル収着体の細孔径とを表１に示す。
のペプチド及びタンパク質の一部の一覧と、その示され
たシリカゲル収着体の細孔径とを表１に示す。
【００４２】
【表１】
【００４３】多くの有用なタンパク質は、シリカゲル収
着体を使用する比較的簡単な方法により複合溶液から抽
出され、純性化された形で回収される。
着体を使用する比較的簡単な方法により複合溶液から抽
出され、純性化された形で回収される。
【００４４】本発明者らは、北極の魚が凍結するの防ぐ
その体液中のタンパク質（すなわち不凍タンパク質；Ａ
ＦＰ）の組み替え型のものが、肉汁及び他の溶液からＤ
Ｐ４６６０（マグネシウムを含有するシリカコゲルの１
種）あるいはブライトソーブＡ１００（シリカハイドロ
ゲルの１種）上に収着され、純性化された形で選択的に
脱着されることを見出した。ＤＰ４６６０への収着物
は、限外濾過による濃縮物からでも、最初の発酵肉汁か
らでもどちらにもあった。背景となる物質は、シリカゲ
ルへの収着及びシリカゲルからの脱着に影響を与える肉
汁と限外濾過による濃縮物の両方に存在する。
その体液中のタンパク質（すなわち不凍タンパク質；Ａ
ＦＰ）の組み替え型のものが、肉汁及び他の溶液からＤ
Ｐ４６６０（マグネシウムを含有するシリカコゲルの１
種）あるいはブライトソーブＡ１００（シリカハイドロ
ゲルの１種）上に収着され、純性化された形で選択的に
脱着されることを見出した。ＤＰ４６６０への収着物
は、限外濾過による濃縮物からでも、最初の発酵肉汁か
らでもどちらにもあった。背景となる物質は、シリカゲ
ルへの収着及びシリカゲルからの脱着に影響を与える肉
汁と限外濾過による濃縮物の両方に存在する。
【００４５】コゲルＤＰ４６６０からのＡＦＰの脱着
は、５０容量％のエタノール溶離剤によりなされるが、
ハイドロゲルであるブライトソーブＡ１００からの脱着
はｐＨ８の３倍の緩衝剤によりなされる。このことは、
２つのシリカゲルの収着の方法が異なることを示すもの
である。エタノール含有溶離剤による溶出能力は、ＤＰ
４６６０へのＡＦＰの収着メカニズムが、おそらく疎水
的相互作用によるためであるということを示している。
これに対し、ｐＨの異なる溶離剤によるブライトソーブ
Ａ１００からのＡＦＰの溶出は、イオン交換相互作用の
１種であることをより示すものである。疎水的相互作用
がコゲルにより示され、イオン交換相互作用がハイドロ
ゲルにより示されるということは興味深いことである。
相互作用のおのおののタイプのいくつかは、おそらく両
方のゲルにおいてＡＦＰの収着の部分的な原因である。
は、５０容量％のエタノール溶離剤によりなされるが、
ハイドロゲルであるブライトソーブＡ１００からの脱着
はｐＨ８の３倍の緩衝剤によりなされる。このことは、
２つのシリカゲルの収着の方法が異なることを示すもの
である。エタノール含有溶離剤による溶出能力は、ＤＰ
４６６０へのＡＦＰの収着メカニズムが、おそらく疎水
的相互作用によるためであるということを示している。
これに対し、ｐＨの異なる溶離剤によるブライトソーブ
Ａ１００からのＡＦＰの溶出は、イオン交換相互作用の
１種であることをより示すものである。疎水的相互作用
がコゲルにより示され、イオン交換相互作用がハイドロ
ゲルにより示されるということは興味深いことである。
相互作用のおのおののタイプのいくつかは、おそらく両
方のゲルにおいてＡＦＰの収着の部分的な原因である。
【００４６】別の例である有用な酵素のキモシンは、シ
リカキセロゲルによりアセテート緩衝剤から収着され
る。キセロゲルからの脱着は２５％イソプロパノールを
含有するアセテート緩衝剤（ｐＨ５．６）の溶離剤によ
るものであり、キセロゲルへのキモシンの収着は疎水的
相互作用によるものであることが再び示された。シリカ
ゲルに収着しうる発酵した肉汁の中の原因となる物質の
影響により、発酵した肉汁からの収着及び脱着の条件は
異なる。
リカキセロゲルによりアセテート緩衝剤から収着され
る。キセロゲルからの脱着は２５％イソプロパノールを
含有するアセテート緩衝剤（ｐＨ５．６）の溶離剤によ
るものであり、キセロゲルへのキモシンの収着は疎水的
相互作用によるものであることが再び示された。シリカ
ゲルに収着しうる発酵した肉汁の中の原因となる物質の
影響により、発酵した肉汁からの収着及び脱着の条件は
異なる。
【００４７】さらに別の例であるインシュリンは０．２
５Ｍ酢酸中で、シリカコゲルＤＰ４６６０に収着され
る。脱着は、ｐＨ８の溶離剤によりなされ、その次に尿
素を含有する溶離剤（水素結合分断剤）によるさらなる
脱着が続く。この証拠はイオン交換、及び水素結合は両
方ともシリカコゲルＤＰ４６６０へのインシュリンの収
着に役割を果たしていることを示している。
５Ｍ酢酸中で、シリカコゲルＤＰ４６６０に収着され
る。脱着は、ｐＨ８の溶離剤によりなされ、その次に尿
素を含有する溶離剤（水素結合分断剤）によるさらなる
脱着が続く。この証拠はイオン交換、及び水素結合は両
方ともシリカコゲルＤＰ４６６０へのインシュリンの収
着に役割を果たしていることを示している。
【００４８】シリカゲルに収着しうる例えば発酵した肉
汁のような複合溶液中の原因となる物質の影響により、
複合溶液からの収着及び脱着の条件を異ならせることが
可能である。
汁のような複合溶液中の原因となる物質の影響により、
複合溶液からの収着及び脱着の条件を異ならせることが
可能である。
【００４９】ミルクから有用なタンパク質を抽出する本
発明の方法の有用性の証明が、さらに他の実験から導か
れる。この実験では、ＡＦＰは、ＡＦＰを生産するトラ
ンスジェニック牛のミルクに似た混合物とするために、
牛のミルクと混合される。このＡＦＰは、シリカコゲル
ＤＰ４６６０により、カゼイン、ホエーミルクタンパク
質及びクリームから分離される。カゼイン及びホエーの
ミセル構造は、コゲルの細孔から締め出される。ＡＦＰ
は、５０％エタノールによりＤＰ４６６０から脱着され
る。
発明の方法の有用性の証明が、さらに他の実験から導か
れる。この実験では、ＡＦＰは、ＡＦＰを生産するトラ
ンスジェニック牛のミルクに似た混合物とするために、
牛のミルクと混合される。このＡＦＰは、シリカコゲル
ＤＰ４６６０により、カゼイン、ホエーミルクタンパク
質及びクリームから分離される。カゼイン及びホエーの
ミセル構造は、コゲルの細孔から締め出される。ＡＦＰ
は、５０％エタノールによりＤＰ４６６０から脱着され
る。
【００５０】この例は、シリカハイドロゲル、キセロゲ
ル、及びコゲルへのタンパク質の収着の原因である複雑
なメカニズムをおおまかに示すものとして引用される。
水素結合、ゲル濾過、疎水的並びに親水的相互作用、及
びイオン並びにファンデル・ワールス相互作用の全てが
おそらく役割をになっている。そのうえ、その収着は媒
質中の他の構成要素により影響されると思われる。
ル、及びコゲルへのタンパク質の収着の原因である複雑
なメカニズムをおおまかに示すものとして引用される。
水素結合、ゲル濾過、疎水的並びに親水的相互作用、及
びイオン並びにファンデル・ワールス相互作用の全てが
おそらく役割をになっている。そのうえ、その収着は媒
質中の他の構成要素により影響されると思われる。
【００５１】明らかな緩衝剤のシステムにおける分子量
及び等電点の明らかな種々のタンパク質により追加実験
を行った。
及び等電点の明らかな種々のタンパク質により追加実験
を行った。
【００５２】表２は、分析に使用されたタンパク質の標
準値の一覧である。分子量は業者に提供されたものであ
る。等電点（ｐＩ）は発行された表から得られたもので
ある。
準値の一覧である。分子量は業者に提供されたものであ
る。等電点（ｐＩ）は発行された表から得られたもので
ある。
【００５３】
【表２】
【００５４】ゲル濾過の吸光度分析（ＨＰＬＣ）を行っ
た。溶離液は、0.9ml/分で汲み出された。溶離液は、0.
17Ｍの塩化ナトリウムを含有するｐＨ５のクエン酸塩−
リン酸塩緩衝剤であった。
た。溶離液は、0.9ml/分で汲み出された。溶離液は、0.
17Ｍの塩化ナトリウムを含有するｐＨ５のクエン酸塩−
リン酸塩緩衝剤であった。
【００５５】タンパク質の標準溶液は、溶離液緩衝剤の
１mlの分取に個々をおよそ１mg/mlの濃度の溶解したも
のである。実験においては、このタンパク質溶液の分取
を混合した。アルトラーゼ、オバルブミン及びリボヌク
レアーゼＡは、第一グループとして使用され、牛の血清
アルブミン及びキモトリプシノーゲンＡは第二グループ
として使用された。標準カーブは、およそ５〜15μｇの
範囲でグループとして注入されたタンパク質のそれぞれ
によって作成された。アルドラーゼは280nm の吸光率よ
り低いので、注入されるアルドラーゼの総量は、11〜33
μｇの範囲とした。標準混合物も、吸光度分析法（ＨＰ
ＬＣ）により応答要因を決定する収着の調査のそれぞれ
の日の開始時に分析された。シリカゲルの収着実験は、
1.5 mlのエペンドロフ遠心機の分析用遠沈管で行われ
た。シリカゲルは分析用遠沈管中において0.6 〜400mg
の範囲で重量を測定された。１mlより少ない量の緩衝剤
が添加され、シリカゲルを濡らして分散させるために渦
巻き式ミキサーで分析用遠沈管内のシリカゲルと緩衝剤
とを混合した。それからそれぞれおよそ150 μｇのタン
パク質溶液が徐々に１mlの量まで添加された。その分析
用遠沈管は振とう機に20分間設置された。その後、分析
用遠沈管は５分間14,000×ｇで遠心分離機にかけられ
た。その上澄み液100 μリットルを分離し、再び２分間
遠心分離機にかけ、吸光度分析法（ＨＰＬＣ）により分
析した。
１mlの分取に個々をおよそ１mg/mlの濃度の溶解したも
のである。実験においては、このタンパク質溶液の分取
を混合した。アルトラーゼ、オバルブミン及びリボヌク
レアーゼＡは、第一グループとして使用され、牛の血清
アルブミン及びキモトリプシノーゲンＡは第二グループ
として使用された。標準カーブは、およそ５〜15μｇの
範囲でグループとして注入されたタンパク質のそれぞれ
によって作成された。アルドラーゼは280nm の吸光率よ
り低いので、注入されるアルドラーゼの総量は、11〜33
μｇの範囲とした。標準混合物も、吸光度分析法（ＨＰ
ＬＣ）により応答要因を決定する収着の調査のそれぞれ
の日の開始時に分析された。シリカゲルの収着実験は、
1.5 mlのエペンドロフ遠心機の分析用遠沈管で行われ
た。シリカゲルは分析用遠沈管中において0.6 〜400mg
の範囲で重量を測定された。１mlより少ない量の緩衝剤
が添加され、シリカゲルを濡らして分散させるために渦
巻き式ミキサーで分析用遠沈管内のシリカゲルと緩衝剤
とを混合した。それからそれぞれおよそ150 μｇのタン
パク質溶液が徐々に１mlの量まで添加された。その分析
用遠沈管は振とう機に20分間設置された。その後、分析
用遠沈管は５分間14,000×ｇで遠心分離機にかけられ
た。その上澄み液100 μリットルを分離し、再び２分間
遠心分離機にかけ、吸光度分析法（ＨＰＬＣ）により分
析した。
【００５６】実験結果を表３、表４及び表５に示す。
【００５７】
【表３】
【００５８】
【表４】
【００５９】
【表５】
【００６０】表３〜５の結果は、検査されたタンパク質
が全面的に収着するにはシリカハイドロゲルは、コゲル
あるいはキセロゲルよりもより高いレベルが要求される
ことを示している。また、その結果はこれらのシリカゲ
ル収着体により大きな分子量のタンパク質の方が、小さ
な分子量のタンパク質よりもより強力に収着し、リボヌ
クレアーゼＡが最も収着しないことを示している。この
結果は、大きな分子量のタンパク質はゲルの細孔に入っ
て、捕捉されるが、小さい分子量のタンパク質は、細孔
に入ってその後出ていくことを示している。
が全面的に収着するにはシリカハイドロゲルは、コゲル
あるいはキセロゲルよりもより高いレベルが要求される
ことを示している。また、その結果はこれらのシリカゲ
ル収着体により大きな分子量のタンパク質の方が、小さ
な分子量のタンパク質よりもより強力に収着し、リボヌ
クレアーゼＡが最も収着しないことを示している。この
結果は、大きな分子量のタンパク質はゲルの細孔に入っ
て、捕捉されるが、小さい分子量のタンパク質は、細孔
に入ってその後出ていくことを示している。
【００６１】シリカハイドロゲル及びキセロゲルの細孔
径はそれぞれおよそ100 オングストロームである。およ
そ80オングストロームまでに近似の分子径のタンパク質
（ＭＷ150,000 ；球状構造）は、ゲルの商品名「セファ
デックスＧ100 」（７番及び８番）により分離される。
したがって、それに近似する分子量のタンパク質は、ハ
イドロゲルあるいはキセロゲルによっても捕捉されると
予想することができる。
径はそれぞれおよそ100 オングストロームである。およ
そ80オングストロームまでに近似の分子径のタンパク質
（ＭＷ150,000 ；球状構造）は、ゲルの商品名「セファ
デックスＧ100 」（７番及び８番）により分離される。
したがって、それに近似する分子量のタンパク質は、ハ
イドロゲルあるいはキセロゲルによっても捕捉されると
予想することができる。
【００６２】シリカコゲルに収着したオバルブミンの結
果は、他のタンパク質及びシリカハイドロゲルのタンパ
ク質の捕捉のパターンと適合しないが、コゲルもマグネ
シウムを明らかに含有している。
果は、他のタンパク質及びシリカハイドロゲルのタンパ
ク質の捕捉のパターンと適合しないが、コゲルもマグネ
シウムを明らかに含有している。
【００６３】タンパク質の収着と、分析された等電点あ
るいは界面活性のタンパク質の性質との間には関係はな
い。もし、これらの特性が収着に何等か関係があるので
あれば、さらに別の収着や相互作用が存在するはずであ
る。表３〜５に示された結果は、数種の明らかなタンパ
ク質を含有する単純な緩衝剤が収着に直接関係すること
を示している。
るいは界面活性のタンパク質の性質との間には関係はな
い。もし、これらの特性が収着に何等か関係があるので
あれば、さらに別の収着や相互作用が存在するはずであ
る。表３〜５に示された結果は、数種の明らかなタンパ
ク質を含有する単純な緩衝剤が収着に直接関係すること
を示している。
【００６４】実質上、耐冷性ビールに使用されるよりシ
リカコゲルＤＰ４６６０のより高い水準が、発酵した肉
汁から不凍性タンパク質を量的に分離するのに必要であ
る。肉汁中の不凍性タンパク質のレベルが増加すると、
それを抽出するために使用されるＤＰ４６６０の量も増
加する。タンパク質が低分子量（ＭＷ5,000 未満）であ
るので多量のＤＰ４６６０が必要である。数種の褐色の
生成物はタンパク質と一緒に溶出され、第二の分離手順
により分離される。
リカコゲルＤＰ４６６０のより高い水準が、発酵した肉
汁から不凍性タンパク質を量的に分離するのに必要であ
る。肉汁中の不凍性タンパク質のレベルが増加すると、
それを抽出するために使用されるＤＰ４６６０の量も増
加する。タンパク質が低分子量（ＭＷ5,000 未満）であ
るので多量のＤＰ４６６０が必要である。数種の褐色の
生成物はタンパク質と一緒に溶出され、第二の分離手順
により分離される。
【００６５】実験結果は、タンパク質の捕捉が、シリカ
ハイドロゲル。シリカコゲル及びシリカキセロゲルへの
タンパク質の収着の主要なメカニズムによることが明ら
かであることを示している。高い分子量のタンパク質は
低い分子量のタンパク質よりもより効果的に収着される
ことは明白である。
ハイドロゲル。シリカコゲル及びシリカキセロゲルへの
タンパク質の収着の主要なメカニズムによることが明ら
かであることを示している。高い分子量のタンパク質は
低い分子量のタンパク質よりもより効果的に収着される
ことは明白である。
【００６６】捕捉の結論は、数種の明らかなタンパク質
を含有する単純な緩衝剤からの収着にただ直接関係す
る。さらなる収着メカニズムは複合溶液から発生するの
であろう。
を含有する単純な緩衝剤からの収着にただ直接関係す
る。さらなる収着メカニズムは複合溶液から発生するの
であろう。
【００６７】収着メカニズムの複雑さは選択的溶出に機
会を与える、そのことはメカニズムを理解するのに挑戦
することと同じである。例えば発酵した肉汁やミルクの
ような複合溶液中の構成要素は、ほとんどではないが多
くが、シリカハイドロゲル、シリカコゲル及びシリカキ
セロゲルに収着しない。他の構成要素の収着は、複合溶
液の組成によって影響されるのであろう。それゆえに与
えられた有用なタンパク質を与えられた溶液から抽出
し、その後純性化された形で回収する見込みを迅速に決
定してあらかじめあらわす方法を得ることが重要であ
る。
会を与える、そのことはメカニズムを理解するのに挑戦
することと同じである。例えば発酵した肉汁やミルクの
ような複合溶液中の構成要素は、ほとんどではないが多
くが、シリカハイドロゲル、シリカコゲル及びシリカキ
セロゲルに収着しない。他の構成要素の収着は、複合溶
液の組成によって影響されるのであろう。それゆえに与
えられた有用なタンパク質を与えられた溶液から抽出
し、その後純性化された形で回収する見込みを迅速に決
定してあらかじめあらわす方法を得ることが重要であ
る。
【００６８】本発明の方法は、共に収着した構成要素を
脱着させない選択的な条件で収着された構成要素を回収
することを可能にしている。しかし、共に溶出するのは
避けられない。有用なタンパク質、あるいは他の興味あ
る構成要素は迅速に安価に濃縮され他の技術により成し
遂げるには困難な程度にまで純性化される。結果とし
て、本発明の方法の使用によりさらなる純性化が簡単に
行われる。
脱着させない選択的な条件で収着された構成要素を回収
することを可能にしている。しかし、共に溶出するのは
避けられない。有用なタンパク質、あるいは他の興味あ
る構成要素は迅速に安価に濃縮され他の技術により成し
遂げるには困難な程度にまで純性化される。結果とし
て、本発明の方法の使用によりさらなる純性化が簡単に
行われる。
【００６９】本発明の精神及び範囲を逸脱しない限り、
変更や改良のいくらかの技巧を施すことができる。本明
細書において用いた用語「収着する」及び「収着」は、
「吸収する」、「吸着する」、「吸収」及び「吸着」、
並びに「捕捉」さらにはシリカゲル収着体へのタンパク
質の結合するためのメカニズムを含むものである。さら
に、用語「タンパク質」はペプチド、糖タンパク、及び
本発明の方法により収着され、回収されうる他の分子を
含むものである。それゆえに、本発明は、クレームに限
定されるものではない。
変更や改良のいくらかの技巧を施すことができる。本明
細書において用いた用語「収着する」及び「収着」は、
「吸収する」、「吸着する」、「吸収」及び「吸着」、
並びに「捕捉」さらにはシリカゲル収着体へのタンパク
質の結合するためのメカニズムを含むものである。さら
に、用語「タンパク質」はペプチド、糖タンパク、及び
本発明の方法により収着され、回収されうる他の分子を
含むものである。それゆえに、本発明は、クレームに限
定されるものではない。
【００７０】
【発明の効果】本発明は、有用なタンパク質を含む複合
水溶液に、シリカハイドロゲル、キセロゲル、あるいは
コゲルのようなシリカゲル収着体の安全で効果的な量を
添加し、このシリカゲルを有用なタンパク質がシリカゲ
ル収着体に接触し収着されるように複合溶液中で十分に
混合し、そしてその有用なタンパク質が収着したシリカ
ゲルを溶液から取り出し、それから、他の収着成分の脱
着を最小限に抑える状態でシリカゲル収着体から有用な
タンパク質を脱着しているので、例えば発酵肉汁や牛乳
のような複合溶液から有用なタンパク質を純性化した形
で抽出することができる。
水溶液に、シリカハイドロゲル、キセロゲル、あるいは
コゲルのようなシリカゲル収着体の安全で効果的な量を
添加し、このシリカゲルを有用なタンパク質がシリカゲ
ル収着体に接触し収着されるように複合溶液中で十分に
混合し、そしてその有用なタンパク質が収着したシリカ
ゲルを溶液から取り出し、それから、他の収着成分の脱
着を最小限に抑える状態でシリカゲル収着体から有用な
タンパク質を脱着しているので、例えば発酵肉汁や牛乳
のような複合溶液から有用なタンパク質を純性化した形
で抽出することができる。
【００７１】また本発明においては、有用なタンパク質
を含む複合水溶液に、純性化される有用なタンパク質に
近似する細孔径を有するシリカゲル収着体を添加し、そ
の溶液中でシリカゲル収着体を十分に混合し、そのタン
パク質がシリカゲル収着体に収着されるようにそのシリ
カゲル収着体を溶液中に浸漬した状態で保持し、そして
そのシリカゲル収着体を取り出して、例えば疎水性溶
剤、水素結合を分断する溶剤、及びイオン交換結合を分
断する溶剤のような、タンパク質とシリカゲル収着体と
の間に存在する種々の結合を分断しうる複数の溶離剤に
よりそのシリカゲル収着体の試料を処理し、その使用し
た複数の溶離剤を集めて、それらが、有用なタンパク質
を含むかどうかを確認するために分析しているので、上
述した本発明のタンパク質純性化方法により複合溶液か
ら有用なタンパク質が抽出されて、純性化されるかどう
かを容易に確認することができる。
を含む複合水溶液に、純性化される有用なタンパク質に
近似する細孔径を有するシリカゲル収着体を添加し、そ
の溶液中でシリカゲル収着体を十分に混合し、そのタン
パク質がシリカゲル収着体に収着されるようにそのシリ
カゲル収着体を溶液中に浸漬した状態で保持し、そして
そのシリカゲル収着体を取り出して、例えば疎水性溶
剤、水素結合を分断する溶剤、及びイオン交換結合を分
断する溶剤のような、タンパク質とシリカゲル収着体と
の間に存在する種々の結合を分断しうる複数の溶離剤に
よりそのシリカゲル収着体の試料を処理し、その使用し
た複数の溶離剤を集めて、それらが、有用なタンパク質
を含むかどうかを確認するために分析しているので、上
述した本発明のタンパク質純性化方法により複合溶液か
ら有用なタンパク質が抽出されて、純性化されるかどう
かを容易に確認することができる。
Claims (12)
- 【請求項１】 有用なタンパク質を含む溶液からそのタ
ンパク質を抽出する方法において、前記方法は、少なく
とも幾らかの有用なタンパク質を収着する適量なシリカ
ゲル収着体を有用なタンパク質を含む溶液に添加し、こ
のシリカゲル収着体を溶液中に分散させて有用なタンパ
ク質が収着するまで溶液中に浸漬した状態で保持し、次
にその有用なタンパク質が収着したシリカゲル収着体を
溶液から取り出し、有用なタンパク質と前記シリカゲル
収着体との間の結合を分断する溶離剤で処理することに
より、有用なタンパク質を抽出し、純正化することを特
徴とするタンパク質純性化方法。 - 【請求項２】 請求項１に記載のタンパク質純性化方法
において、前記有用なタンパク質が、不凍性タンパク質
であることを特徴とするタンパク質純性化方法。 - 【請求項３】 請求項１に記載のタンパク質純性化方法
において、前記有用なタンパク質が、キモシンであるこ
とを特徴とするタンパク質純性化方法。 - 【請求項４】 請求項１に記載のタンパク質純性化方法
において、前記有用なタンパク質が、インシュリンであ
ることを特徴とするタンパク質純性化方法。 - 【請求項５】 請求項１に記載のタンパク質純性化方法
において、前記シリカゲル収着体が、シリカハイドロゲ
ルであることを特徴とするタンパク質純性化方法。 - 【請求項６】 請求項１に記載のタンパク質純性化方法
において、前記シリカゲル収着体が、シリカキセロゲル
であることを特徴とするタンパク質純性化方法。 - 【請求項７】 請求項１に記載のタンパク質純性化方法
において、前記シリカゲル収着体が、シリカコゲルであ
ることを特徴とするタンパク質純性化方法。 - 【請求項８】 請求項１に記載のタンパク質純性化方法
において、前記溶離剤が、疎水性溶剤であることを特徴
とするタンパク質純性化方法。 - 【請求項９】 請求項１に記載のタンパク質純性化方法
において、前記溶離剤が、水素結合を分断する溶剤であ
ることを特徴とするタンパク質純性化方法。 - 【請求項１０】 請求項１に記載のタンパク質純性化方
法において、前記溶離剤が、イオン交換結合を分断する
溶剤であることを特徴とするタンパク質純性化方法。 - 【請求項１１】 前記シリカゲル収着体により処理した
特定の有用なタンパク質を含む特定の溶液から前記有用
なタンパク質が効果的に抽出されたかどうかを確認する
ための方法であって、前記方法は、収着する有用なタン
パク質を含む溶液の試料に適量な前記シリカゲル収着体
を添加し、その溶液中で前記シリカゲル収着体を十分に
混合し、有用なタンパク質がシリカゲル収着体に収着さ
れるまでこのシリカゲル収着体を溶液中に浸漬した状態
で保持し、そのシリカゲル収着体を溶液から取り出し、
有用なタンパク質とシリカゲル収着体との間の結合をど
の溶離剤が分断するかを確認するためにそのシリカゲル
収着体を異なる溶離剤により処理することにより、有用
なタンパク質を抽出し、純性化することを特徴とするタ
ンパク質純性化確認方法。 - 【請求項１２】 請求項１１に記載のタンパク質純性化
確認方法において、前記溶離剤が、疎水性溶剤、水素結
合を分断する溶剤、及びイオン交換結合を分断する溶剤
のうち少なくとも１種であることを特徴とするタンパク
質純性化確認方法。
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| AU763349B2 (en) * | 1998-02-05 | 2003-07-17 | Henry M. Jackson Foundation For The Advancement Of Military Medicine | Simplified method for removing free protein during preparation of protein-polysaccharide conjugates and vaccines using restricted-access media |
| US6132625A (en) * | 1998-05-28 | 2000-10-17 | E. I. Du Pont De Nemours And Company | Method for treatment of aqueous streams comprising biosolids |
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| US20030026845A1 (en) * | 2001-06-18 | 2003-02-06 | Etzel Lisa R. | Process for preparing protein isolate from milk, whey, colostrum, and the like |
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| GB1215928A (en) * | 1967-04-28 | 1970-12-16 | Unilever Ltd | A process for reducing haze in beer |
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| GB1592702A (en) * | 1976-10-28 | 1981-07-08 | Asahi Chemical Ind | Method of adsorbing a protein on a protein adsorbent comprising a porous copolymer of a cyano-group-containing monomer |
| JPS5810056A (ja) * | 1981-07-10 | 1983-01-20 | 株式会社クラレ | 血液浄化装置 |
| DE3147842A1 (de) * | 1981-12-03 | 1983-06-23 | Hoechst Ag, 6230 Frankfurt | "verfahren zur trennung von gemischen aus insulin, insulinderivaten und gegebenenfalls verunreinigungen" |
| CA1178222A (en) * | 1982-02-04 | 1984-11-20 | Chang W. Chi | Composition and method for stabilizing beverages against haze formation |
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| US4528198A (en) * | 1983-09-27 | 1985-07-09 | Miller Brewing Company | Preparation of low calorie beer with malt extract free of yeast lethal factors |
| US4636394A (en) * | 1984-04-16 | 1987-01-13 | J. E. Siebel Sons' Company, Inc. | Method and compositions for chillproofing beverages |
| US4595578A (en) * | 1985-03-22 | 1986-06-17 | Scm Corporation | Stabilized silica gel and process for making same |
| US4684530A (en) * | 1985-10-04 | 1987-08-04 | W. R. Grace & Co. | Adsorption of proteins from fluids |
| JPS62207712A (ja) * | 1986-03-05 | 1987-09-12 | Fuji Debuison Kagaku Kk | ビ−ルの安定化処理用含水シリカゲル |
| DE3633797C2 (de) * | 1986-10-03 | 1995-08-10 | Forssmann Wolf Georg | Verfahren zur Gewinnung von biologisch aktiven Eiweissen (Peptiden) aus menschlichem und tierischem Blut (bzw. anderen Körperflüssigkeiten) |
| GB8707526D0 (en) * | 1987-03-30 | 1987-05-07 | Unilever Plc | Amorphous silicas |
| JP2732252B2 (ja) * | 1987-12-07 | 1998-03-25 | 株式会社ジェイ・エム・エス | ヘモグロビン選択吸着剤 |
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