JPH07155180A - 新規phb分解酵素、その製造法及び該酵素を産生する微生物 - Google Patents

新規phb分解酵素、その製造法及び該酵素を産生する微生物

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JPH07155180A
JPH07155180A JP5339196A JP33919693A JPH07155180A JP H07155180 A JPH07155180 A JP H07155180A JP 5339196 A JP5339196 A JP 5339196A JP 33919693 A JP33919693 A JP 33919693A JP H07155180 A JPH07155180 A JP H07155180A
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JP
Japan
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phb
enzyme
degrading enzyme
pseudomonas
degrading
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JP5339196A
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English (en)
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Shuji Toyoda
修次 豊田
Yoshihito Akai
義仁 赤井
Kimimasa Kazuno
公正 数野
Mitsugi Iida
貢 飯田
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Snow Brand Milk Products Co Ltd
Original Assignee
Snow Brand Milk Products Co Ltd
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Abstract

(57)【要約】 【構成】 シュードモナス(Pseudomonas) 属に属する微
生物の産生するポリヒドロキシブチレート分解酵素。そ
の製造法及びこの酵素を産生するシュードモナス属 sp.
328 株(FERM P-13954)。上記微生物は、東京都新宿区の
土壌中より分離された。 【効果】 生分解性プラスチックのポリヒドロキシブチ
レートを短時間のうちに効率よく生分解することがで
き、環境保護に有用である。

Description

【発明の詳細な説明】
【0001】
【産業上の利用分野】本発明は、新規なポリヒドロキシ
ブチレート分解酵素(ポリヒドロキシブチレートデポリ
メラーゼ)に関する。また、本発明は、シュードモナス
属に属する微生物から新規なポリヒドロキシブチレート
分解酵素を製造する方法に関する。さらに、本発明は、
新規なポリヒドロキシブチレート分解酵素を産生するシ
ュードモナス属に属する微生物に関する。本発明では、
このポリヒドロキシブチレート分解酵素、あるいは、こ
のポリヒドロキシブチレート分解酵素を産生するシュー
ドモナス属に属する微生物を用いることにより、ポリヒ
ドロキシブチレートを成分とする生分解性プラスティッ
クを効率的に分解することが可能である。
【0002】
【従来の技術】近年、生分解性プラスティック製品は、
土中に投棄した後に埋め立てまたは海中投棄などの処理
方法によって自然界の微生物に分解され得る素材とし
て、他のプラスティック素材製品よりも高価であるにも
かかわらず、これらの素材に代わる物として使用が増加
してきている。しかし、現在のプラスティックごみの発
生量を考慮すると、仮に全てのプラスティック製品が生
分解性プラスティックになったとしても、これを処理す
るのに自然界の微生物の働きによる分解を待っているだ
けでは処理しきれなくなることが予想される。そこで、
微生物による分解を促進するために生分解性プラスティ
ック素材に微生物培地成分を配合する方法(特開平4-16
8150号公報)、生分解性プラスティック素材にリパー
ゼ、アミラーゼ、セルラーゼ、乳酸脱水素酵素などの加
水分解酵素を添加する方法(特開平4-168149号公報)、
生分解性プラスティック素材成形品を製造する際に配合
する無機及び/または有機フィラーの配合量と平均体積
を特定範囲に調節し、成形品使用中の生分解及び崩壊を
抑制する方法(特開平4−146953号公報)などが提案さ
れている。しかしながら、ポリヒドロキシブチレート
(以下、PHBと略記する)を主な素材とする生分解性
プラスティックを特異的に分解するPHB分解酵素、あ
るいはそのPHB分解酵素を菌体外に産生する微生物に
ついては、実用化されていない現状にある。
【0003】
【発明が解決しようとする課題】本発明者らは、このよ
うな状況を鑑み鋭意研究を行った結果、東京都新宿区の
土壌より分離したシュードモナス(Pseudomonas)属に属
する微生物が、PHBを特異的に分解するPHB分解酵
素を産生することを見出した。さらに、こうして得られ
た菌株からこのPHB分解酵素を分離、精製して本発明
を完成するに至った。したがって、本発明は、生分解性
プラスティックのPHBを分解するPHB分解酵素を提
供することを課題とする。また、本発明は、シュードモ
ナス(Peudomonas)属に属する微生物を培養してPHB分
解酵素を採取する方法を提供することを課題とする。さ
らに、本発明は、PHB分解酵素を産生するシュードモ
ナス(Pseudomonas) 属に属する微生物を提供することを
課題とする。
【0004】
【課題を解決する手段】本発明は、上記課題を解決する
ためになされたものである。本発明のPHBを特異的に
分解する酵素を産生する微生物は、前記のように東京都
新宿区の土壌から分離された。この微生物の分離方法に
ついては後に記述する。ここで本発明のPHB分解酵素
を産生する微生物の分類学的性状及び生理学的性状を以
下に示す。 (1)菌形 桿菌 (2)サイズ 1.0 ×1.5 μm (3)連鎖 − (4)運動性 + (5)グラム染色性 + (6)好気性 + (7)オキシダーゼテスト + (8)カタラーゼテスト + (9)DNase − (10)DNA中のGC含量 63.9 % +はありを、−はなしを示す。この結果、Bergey's Man
ual of Systematic Bacteriology(1986)に基づいて、こ
の微生物菌体をシュードモナス・スピーシーズと同定し
た。そして、この菌体、シュードモナス(Pseudomonas)
sp.328 株はSBT-3444株として工業技術院生命工学工業
技術研究所に寄託されている(受託番号 FERM P-1395
4)。
【0005】次に、本発明のPHB分解酵素を製造する
方法について説明する。シュードモナス・スピーシーズ
をPHB添加培地、例えば、Succinate 培地[J.Bacteri
ol.119, 152-161(1974)]のクエン酸の代わりにPHBを
1%添加した培地に添加し、30℃前後で15−20時間培養
した後、菌体を遠心分離で回収する。次に、その菌体を
PHB分解酵素生産培地に添加し、30℃前後で菌数が 5
×109 cells/ml程度になるまで培養してPHB分解酵素
を産生させる。そして、その培養上清を回収して70%硫
安分画を行った後、この沈殿画分にPHBを添加して、
PHBと本酵素の親和性を利用してPHB−酵素複合体
を形成させ、遠心分離によってPHB分解酵素蛋白を回
収する。さらに、このPHB分解酵素蛋白を種々のクロ
マトグラフィーにより精製し、SDS-PAGEで単一なPHB
分解酵素を得ることができる。
【0006】このようにして得られるPHB分解酵素の
性質は、以下の通りである。 (1)至適pH pH 約 4.3 (2)等電点 pI 約 8.4 (3)最適温度 約 40℃ (4)分子量 約 513,000 ダルトン(ゲル
濾過) 約 42,700ダルトン(SDS-PAGE)
【0007】次に実施例を挙げて、本発明をさらに詳し
く説明する。
【実施例1】PHB分解酵素の土壌からの分離方法につ
いて説明する。すなわち、東京都新宿区から採取した土
壌を生理食塩水で希釈し、この希釈液を遠心分離した上
清を段階的に希釈して、表2に示したPHB分解酵素生
産培地に寒天を 1.5%添加して作成したプレートに塗抹
する。PHB分解酵素を生産する菌株は白濁したプレー
ト上に透明なハローを形成することにより分離すること
ができる。さらに、こうして得られた菌株をPHB分解
酵素生産培地より培養し、PHB分解酵素を生産するこ
とを確認した。得られた菌株は、PHB添加培地に寒天
を 1.5%加えて作成したスラントで植え継ぎを行った。
このようにして得られた菌株はPHB分解活性が著しく
強力で、この菌株を同定したところ、前述のような菌学
的性質を示し、シュードモナス(Pseudomonas)sp.328 株
と命名し、生命工学工業技術研究所に寄託した(受託番
号 FERM P-13954)。
【0008】
【実施例2】実施例1で得られたシュードモナス(Pseu
domonas)sp. 328 株(FERM P-13954)を表1に示すPHB
添加培地に添加し、30℃で17時間培養した後、遠心分離
で回収した菌体を表2に示すPHB分解酵素生産培地に
添加し、30℃で菌数が5×109cells/ml となるまで培養
した。次に、遠心分離で培養上清を回収した後、70%硫
安分画を行って、PHB分解酵素活性のある沈殿画分を
回収した。そして、このPHB分解酵素画分にPHBを
添加してPHB−酵素複合体を形成させ、10,000rpm 15
分間の遠心分離により沈澱したPHB−酵素複合体を回
収した。この操作を3回繰り返した。さらに、このPH
B分解酵素蛋白をDEAE-TOYOPEARL (商品名) 650Mに10mM
トリス+5% グリセロール(pH8.8)緩衝液を用いて
吸着させ、0.08M NaClで洗浄後、0.18M NaClで溶出させ
た。以上の操作により、SDS-PAGEで単一なPHB分解酵
素を得た。
【0009】以上の操作における精製度、および回収率
を以下に示した。 ────────────────────────────────── 操 作 活 性 蛋白量 比活性 回収率 ────────────────────────────────── 培養上清 84.8 17.2 4.9 100 硫安分画 72.6 5.8 12.4 85.6 アフィニティ─* 50.3 0.99 50.8 59.3 イオン交換クロマト 15.5 0.18 87.6 18.3 ────────────────────────────────── *PHB−酵素複合体を作成させ、これを遠心分離によ
り回収する方法を示した。単位はそれぞれ以下に示し
た。 活性 U/ml(1Uは、1分間に吸収波長650nm の吸光度
が0.001 減少する量) 蛋白量 mg/ml 比活性 U/mg 回収率 %
【0010】
【表1】 PHB添加培地 ──────────────────────── 成 分 濃 度 ──────────────────────── PHB 1 % KH2PO4-Na2HPO4(pH=6.8) 33 mM 塩化アンモニウム 18 mM 硫酸マグネシウム・7水塩 2 mM 塩化鉄(III)・6水塩 0.037mM 塩化カルシウム 0.045mM ────────────────────────
【0011】
【表2】 PHB分解酵素生産培地 ─────────────────────── 成 分 濃 度 ─────────────────────── PHB 1 % KH2PO4-Na2HPO4(pH=6.8) 33 mM 塩化アンモニウム 18 mM 硫酸マグネシウム・7水塩 1 mM ───────────────────────
【0012】
【試験例1】実施例2で得られたPHB分解酵素につい
て、PHB分解活性の有無を試験した。精製水 0.8ml、
0.1M 酢酸緩衝液 1ml、10mg/ml濃度のPHB溶液40μl
から成る反応液1.84mlに、実施例2で得られたPHB分
解酵素液 200μl を添加し、30℃で20分間保持したとこ
ろ、PHBに特異的な吸収波長 650nmの吸光度が1.0 か
ら0.283 に減少した。
【0013】
【発明の効果】本発明のPHB分解酵素、あるいは、本
発明のPHB分解酵素を産生するシュードモナス属に属
する微生物を用いることにより、有害な副産物を伴うこ
と無く生分解性プラスティックのPHBを短時間で効率
的に処理することができ、環境保護に有用である。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.6 識別記号 庁内整理番号 FI 技術表示箇所 C12R 1:38)

Claims (6)

    【特許請求の範囲】
  1. 【請求項1】 次の性質を示すポリヒドロキシブチレー
    ト分解酵素。 (1)作用:ポリヒドロキシブチレートを分解する。 (2)至適 pH :約 4.3 (3)等電点:約 8.4 (4)最適温度:約 40 ℃ (5)分子量:約513,000 ダルトン(ゲル濾過) 約42,700ダルトン(SDS-PAGE)
  2. 【請求項2】 シュードモナス(Pseudomonas) 属に属す
    る微生物に由来する請求項1記載の酵素。
  3. 【請求項3】 微生物がシュードモナス(Pseudomonas)s
    p. 328株(FERM P-13954)である請求項2記載の酵素。
  4. 【請求項4】 シュードモナス(Pseudomonas) 属に属
    し、請求項1記載のポリヒドロキシブチレート分解酵素
    産生能を有する微生物を培養し、培地または菌体に該酵
    素を産生せしめ、これを採取することを特徴とするポリ
    ヒドロキシブチレート分解酵素の製造法。
  5. 【請求項5】 微生物がシュードモナス(Pseudomonas)s
    p.328 株(FERM P-13954)である請求項4記載の製造法。
  6. 【請求項6】 シュードモナス(Pseudomonas)sp.328 株
    (FERM P-13954)。
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Cited By (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2005045017A1 (ja) * 2003-11-05 2005-05-19 National Institute Of Advanced Industrial Science And Technology ポリヒドロキシアルカノエート系樹脂の分解方法
CN115942963A (zh) * 2020-07-31 2023-04-07 金伯利-克拉克环球有限公司 可自动生物降解的吸收制品

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JPWO2005045017A1 (ja) * 2003-11-05 2007-05-24 独立行政法人産業技術総合研究所 ポリヒドロキシアルカノエート系樹脂の分解方法
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