JPH07159408A - オーエスキー病ウイルス感染抗体識別用抗原 - Google Patents
オーエスキー病ウイルス感染抗体識別用抗原Info
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- JPH07159408A JPH07159408A JP30914593A JP30914593A JPH07159408A JP H07159408 A JPH07159408 A JP H07159408A JP 30914593 A JP30914593 A JP 30914593A JP 30914593 A JP30914593 A JP 30914593A JP H07159408 A JPH07159408 A JP H07159408A
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Abstract
(57)【要約】
【目的】 オーエスキー病ウイルス感染抗体識別用抗原
を、ｇＸ抗体との反応の特異性が高くＥＬＩＳＡ法によ
って信頼性の充分に高い測定ができるものとし、しか
も、この識別用抗原は簡便な精製法で製造効率を高めて
低コストで提供できるようにする。 【構成】 オーエスキー病ウイルス感染抗体識別用抗原
を、ブタヘルペス１ウイルスの膜糖蛋白ｇＸとグルタチ
オンＳトランスフェラーゼとの融合蛋白から構成する。
このものは、ブタヘルペス１ウイルスの膜糖蛋白ｇＸと
グルタチオンＳトランスフェラーゼをコードする遺伝子
をプラスミドベクターに組み込んで融合蛋白を発現さ
せ、得られた融合蛋白をグルタチオンカラムクロマトグ
ラフィーにより精製して製造し、この精製された融合蛋
白を識別用抗原として、ＥＬＩＳＡ法に応用しオーエス
キー病ウイルス感染抗体を検出する。
を、ｇＸ抗体との反応の特異性が高くＥＬＩＳＡ法によ
って信頼性の充分に高い測定ができるものとし、しか
も、この識別用抗原は簡便な精製法で製造効率を高めて
低コストで提供できるようにする。 【構成】 オーエスキー病ウイルス感染抗体識別用抗原
を、ブタヘルペス１ウイルスの膜糖蛋白ｇＸとグルタチ
オンＳトランスフェラーゼとの融合蛋白から構成する。
このものは、ブタヘルペス１ウイルスの膜糖蛋白ｇＸと
グルタチオンＳトランスフェラーゼをコードする遺伝子
をプラスミドベクターに組み込んで融合蛋白を発現さ
せ、得られた融合蛋白をグルタチオンカラムクロマトグ
ラフィーにより精製して製造し、この精製された融合蛋
白を識別用抗原として、ＥＬＩＳＡ法に応用しオーエス
キー病ウイルス感染抗体を検出する。
Description
【０００１】
【産業上の利用分野】この発明は、ブタなどの家畜類が
感染するオーエスキー病のウイルス感染抗体識別用抗
原、その製造方法およびオーエスキー病ウイルス感染抗
体の検出方法に関する。
感染するオーエスキー病のウイルス感染抗体識別用抗
原、その製造方法およびオーエスキー病ウイルス感染抗
体の検出方法に関する。
【０００２】
【従来の技術】オーエスキー病は、ヘルペスウイルス科
のアルファヘルペスウイルス亜科に属するブタヘルペス
１ウイルス（以下、これをＡＤＶと略記する。）の感染
によって引き起こされる伝染病であり、ブタを初めとし
て、ウシ、ヒツジ、ネコ、イヌなどの哺乳動物が感染す
る疾病である。このようなＡＤＶに感染すると、幼若ブ
タでは重篤な症状を示し、死亡することもある。成ブタ
では一過性の呼吸器症状及び軽度の発熱症状が現れるこ
とが多い。また、ブタ体内にウイルスが潜伏感染し、新
しい感染源になったり妊娠ブタに感染すると高率に死・
流産を起こすこともあり、畜産界への被害は大きい。
のアルファヘルペスウイルス亜科に属するブタヘルペス
１ウイルス（以下、これをＡＤＶと略記する。）の感染
によって引き起こされる伝染病であり、ブタを初めとし
て、ウシ、ヒツジ、ネコ、イヌなどの哺乳動物が感染す
る疾病である。このようなＡＤＶに感染すると、幼若ブ
タでは重篤な症状を示し、死亡することもある。成ブタ
では一過性の呼吸器症状及び軽度の発熱症状が現れるこ
とが多い。また、ブタ体内にウイルスが潜伏感染し、新
しい感染源になったり妊娠ブタに感染すると高率に死・
流産を起こすこともあり、畜産界への被害は大きい。
【０００３】現在わが国では、この感染症に対する予防
を目的としたワクチンとして、ウイルスの増殖性または
感染性に関与しないとされるウイルス膜糖蛋白であるｇ
Ｉ抗原、ｇIII 抗原およびｇＸ抗原をコードする遺伝子
を欠損させたウイルスを生ワクチン製造用株として採用
している。オーエスキー病に感染したブタは、これを淘
汰して清浄化するというわが国の防疫方針に従い、自然
感染ブタとワクチン接種ブタとを区別して自然感染ブタ
のみを検出する必要があるからである。
を目的としたワクチンとして、ウイルスの増殖性または
感染性に関与しないとされるウイルス膜糖蛋白であるｇ
Ｉ抗原、ｇIII 抗原およびｇＸ抗原をコードする遺伝子
を欠損させたウイルスを生ワクチン製造用株として採用
している。オーエスキー病に感染したブタは、これを淘
汰して清浄化するというわが国の防疫方針に従い、自然
感染ブタとワクチン接種ブタとを区別して自然感染ブタ
のみを検出する必要があるからである。
【０００４】自然感染による抗体またはワクチン接種に
よる抗体を識別する方法としては、前記欠損させた抗原
に対する抗体をＥＬＩＳＡ法によって定量的に検出する
手法が一般的に行われている。
よる抗体を識別する方法としては、前記欠損させた抗原
に対する抗体をＥＬＩＳＡ法によって定量的に検出する
手法が一般的に行われている。
【０００５】そして、ｇＸ抗原をコードする遺伝子を欠
損させたウイルスをワクチン製造用株として採用した場
合に上記した検出方法に用いるｇＸ抗原は、ウイルス培
養上清液から遠心分離し、さらに塩析濃縮して抽出し、
ゲルろ過、イオン交換カラム、アフィニティーカラムク
ロマトグラフィー等で精製していた。
損させたウイルスをワクチン製造用株として採用した場
合に上記した検出方法に用いるｇＸ抗原は、ウイルス培
養上清液から遠心分離し、さらに塩析濃縮して抽出し、
ゲルろ過、イオン交換カラム、アフィニティーカラムク
ロマトグラフィー等で精製していた。
【０００６】ここで、ＥＬＩＳＡ法に必要なｇＸ抗原を
多量に製造する方法としては、以下のように遺伝子工学
的手法を採用することが考えられる。すなわち、オーエ
スキー病ウイルスの構造遺伝子のうち、ｇＸをコードす
る遺伝子をクローニングし、これをウイルス、プラスミ
ドまたはファージベクター遺伝子に挿入し、ｇＸを発現
させる方法である。
多量に製造する方法としては、以下のように遺伝子工学
的手法を採用することが考えられる。すなわち、オーエ
スキー病ウイルスの構造遺伝子のうち、ｇＸをコードす
る遺伝子をクローニングし、これをウイルス、プラスミ
ドまたはファージベクター遺伝子に挿入し、ｇＸを発現
させる方法である。
【０００７】
【発明が解決しようとする課題】しかし、上記のように
遺伝子工学的手法を採用して得られたｇＸは、細菌性プ
ラスミドでの発現における細菌成分の夾雑蛋白が混入
し、ウイルスベクターでの発現の場合は増殖させる細胞
の成分の夾雑蛋白が混入して非特異反応がみられ、この
ままではＥＬＩＳＡ法によって充分に信頼性の高い測定
ができず、前記した精製を行なう必要があるものであ
る。
遺伝子工学的手法を採用して得られたｇＸは、細菌性プ
ラスミドでの発現における細菌成分の夾雑蛋白が混入
し、ウイルスベクターでの発現の場合は増殖させる細胞
の成分の夾雑蛋白が混入して非特異反応がみられ、この
ままではＥＬＩＳＡ法によって充分に信頼性の高い測定
ができず、前記した精製を行なう必要があるものであ
る。
【０００８】また、従来のウイルス培養上清液から抽出
した識別用抗原ｇＸを用いる場合でも夾雑蛋白が混入
し、このままでは非特異反応がみられないのは勿論であ
り、煩雑な精製が必要である。
した識別用抗原ｇＸを用いる場合でも夾雑蛋白が混入
し、このままでは非特異反応がみられないのは勿論であ
り、煩雑な精製が必要である。
【０００９】このように従来の識別用抗原ｇＸのいずれ
のものでも煩雑な精製工程を必要として製造コストも高
額となり、効率良く製造できないという問題点がある。
のものでも煩雑な精製工程を必要として製造コストも高
額となり、効率良く製造できないという問題点がある。
【００１０】そこで、この発明は上記した問題点を解決
し、オーエスキー病ウイルス感染抗体識別用抗原を、煩
雑な精製を行わずともｇＸ抗体との反応の特異性が高
く、ＥＬＩＳＡ法によって信頼性の充分に高い測定がで
きるものとし、すなわちこの識別用抗原を簡便な精製法
で製造効率を高めて低コストで提供できるようにするこ
とを課題としている。
し、オーエスキー病ウイルス感染抗体識別用抗原を、煩
雑な精製を行わずともｇＸ抗体との反応の特異性が高
く、ＥＬＩＳＡ法によって信頼性の充分に高い測定がで
きるものとし、すなわちこの識別用抗原を簡便な精製法
で製造効率を高めて低コストで提供できるようにするこ
とを課題としている。
【００１１】
【課題を解決するための手段および作用】上記の課題を
解決するため、この発明においては、ブタヘルペス１ウ
イルスの膜糖蛋白ｇＸとグルタチオンＳトランスフェラ
ーゼとの融合蛋白質からオーエスキー病ウイルス感染抗
体識別用抗原を構成したのである。
解決するため、この発明においては、ブタヘルペス１ウ
イルスの膜糖蛋白ｇＸとグルタチオンＳトランスフェラ
ーゼとの融合蛋白質からオーエスキー病ウイルス感染抗
体識別用抗原を構成したのである。
【００１２】上記識別用抗原は、ブタヘルペス１ウイル
スの膜糖蛋白ｇＸとグルタチオンＳトランスフェラーゼ
をコードする遺伝子をプラスミドベクターに組み込んで
融合蛋白を発現させ、得られた融合蛋白をグルタチオン
カラムクロマトグラフィーにより精製することによって
製造できる。
スの膜糖蛋白ｇＸとグルタチオンＳトランスフェラーゼ
をコードする遺伝子をプラスミドベクターに組み込んで
融合蛋白を発現させ、得られた融合蛋白をグルタチオン
カラムクロマトグラフィーにより精製することによって
製造できる。
【００１３】また、ブタヘルペス１ウイルスの膜糖蛋白
ｇＸとグルタチオンＳトランスフェラーゼをコードする
遺伝子をプラスミドベクターに組み込んで融合蛋白を発
現させ、得られた融合蛋白をグルタチオンカラムクロマ
トグラフィーにより精製し、この精製された融合蛋白を
識別用抗原として、ＥＬＩＳＡ法によりオーエスキー病
ウイルス感染抗体を検出したのである。
ｇＸとグルタチオンＳトランスフェラーゼをコードする
遺伝子をプラスミドベクターに組み込んで融合蛋白を発
現させ、得られた融合蛋白をグルタチオンカラムクロマ
トグラフィーにより精製し、この精製された融合蛋白を
識別用抗原として、ＥＬＩＳＡ法によりオーエスキー病
ウイルス感染抗体を検出したのである。
【００１４】この発明の融合蛋白の原料となる膜糖蛋白
ｇＸ（以下、ｇＸと略記する。）を得るには、先ず、Ａ
ＤＶを感受性細胞に接種し、採取した感染細胞より抽出
精製したｍＲＮＡをもとに作成したｃＤＮＡライブラリ
ーからｇＸをコードする遺伝子を、ｇＸ免疫家兎血清を
用いたイムノスクリーニング法によってクローニングす
る。
ｇＸ（以下、ｇＸと略記する。）を得るには、先ず、Ａ
ＤＶを感受性細胞に接種し、採取した感染細胞より抽出
精製したｍＲＮＡをもとに作成したｃＤＮＡライブラリ
ーからｇＸをコードする遺伝子を、ｇＸ免疫家兎血清を
用いたイムノスクリーニング法によってクローニングす
る。
【００１５】この発明に用いるＡＤＶは、特に特定の株
から分離されたものを限定したものではなく、ブタなど
の感染哺乳類から単離された野性株の他、公知のＡＤＶ
岩手株を使用することもできる。
から分離されたものを限定したものではなく、ブタなど
の感染哺乳類から単離された野性株の他、公知のＡＤＶ
岩手株を使用することもできる。
【００１６】グルタチオンＳトランスフェラーゼとｇＸ
の融合蛋白は、例えば細菌性のプラスミドベクターにグ
ルタチオンＳトランスフェラーゼの産生をコードする遺
伝子を組み込み、その下流にｇＸの遺伝子を連結させた
組み替えプラスミドを構築し、さらにこれを大腸菌（エ
シェリヒア・コリ）などに感染させて発現させることが
できる。この場合、グルタチオンＳトランスフェラーゼ
のＣ末端にｇＸが融合する。
の融合蛋白は、例えば細菌性のプラスミドベクターにグ
ルタチオンＳトランスフェラーゼの産生をコードする遺
伝子を組み込み、その下流にｇＸの遺伝子を連結させた
組み替えプラスミドを構築し、さらにこれを大腸菌（エ
シェリヒア・コリ）などに感染させて発現させることが
できる。この場合、グルタチオンＳトランスフェラーゼ
のＣ末端にｇＸが融合する。
【００１７】このようにして発現された融合蛋白は、以
下のようにしてグルタチオンカラム（アフィニティー）
クロマトグラフィーにより精製される。すなわち、グル
タチオンＳトランスフェラーゼは、その基質であるグル
タチオンと特異性の高い反応をするため、基質であるグ
ルタチオンを付加したゲルろ過カラムに吸着する。次い
で、酵素に最適のｐＨまたはその近くの緩衝液でもって
カラムを洗い、非吸着成分を洗い流した後、グルタチオ
ンを添加した緩衝液を使用することによって、吸着して
いた融合蛋白を流出させて精製することができる。
下のようにしてグルタチオンカラム（アフィニティー）
クロマトグラフィーにより精製される。すなわち、グル
タチオンＳトランスフェラーゼは、その基質であるグル
タチオンと特異性の高い反応をするため、基質であるグ
ルタチオンを付加したゲルろ過カラムに吸着する。次い
で、酵素に最適のｐＨまたはその近くの緩衝液でもって
カラムを洗い、非吸着成分を洗い流した後、グルタチオ
ンを添加した緩衝液を使用することによって、吸着して
いた融合蛋白を流出させて精製することができる。
【００１８】このようにして得られた融合蛋白を識別用
抗原として用いて、ＥＬＩＳＡ法による血清中のｇＸに
対する抗体を検出すると、ワクチン感染個体の（膜糖蛋
白ｇＸによる抗体を含まない）血清と、自然感染個体の
（膜糖蛋白ｇＸによる抗体を含む）血清との識別を的確
に行なうことができる。
抗原として用いて、ＥＬＩＳＡ法による血清中のｇＸに
対する抗体を検出すると、ワクチン感染個体の（膜糖蛋
白ｇＸによる抗体を含まない）血清と、自然感染個体の
（膜糖蛋白ｇＸによる抗体を含む）血清との識別を的確
に行なうことができる。
【００１９】
（ｇＸ遺伝子のクローニング）ＡＤＶ岩手株感染ＲＫ−
１３細胞から常法に従って抽出精製したｍＲＮＡをもと
に、ＸｈｏＩリンカープライマーを用いてＭ−ＭｕＬＶ
ＲＴ ＲＮＡ依存ＤＮＡポリメラーゼ、ＤＮＡ−ポリメ
ラーゼ ＩによりｃＤＮＡを合成し、ファージベクター
λＺＡＰへ挿入した。これをファージミドベクター（ｐ
Ｂｌｕｅｓｃｒｉｐｔ）のライブラリーへと変換し、大
腸菌でのコロニースクリーニングを行なった。
１３細胞から常法に従って抽出精製したｍＲＮＡをもと
に、ＸｈｏＩリンカープライマーを用いてＭ−ＭｕＬＶ
ＲＴ ＲＮＡ依存ＤＮＡポリメラーゼ、ＤＮＡ−ポリメ
ラーゼ ＩによりｃＤＮＡを合成し、ファージベクター
λＺＡＰへ挿入した。これをファージミドベクター（ｐ
Ｂｌｕｅｓｃｒｉｐｔ）のライブラリーへと変換し、大
腸菌でのコロニースクリーニングを行なった。
【００２０】コロニースクリーニングについては、ＬＢ
／アンピシリンプレートの上に置いたニトロセルロース
フィルター上にコロニーを作らせ、一晩培養後、ＩＰＴ
Ｇにより蛋白の発現を誘導した。
／アンピシリンプレートの上に置いたニトロセルロース
フィルター上にコロニーを作らせ、一晩培養後、ＩＰＴ
Ｇにより蛋白の発現を誘導した。
【００２１】次いで、前記フィルターからレプリカフィ
ルターを作成し、クロロホルムとリゾチーム処理を行な
った後、抗ｇＸ抗体を反応させ、ＰＯＤとＤＡＢの系に
より発色させ、陽性クローンを得た。
ルターを作成し、クロロホルムとリゾチーム処理を行な
った後、抗ｇＸ抗体を反応させ、ＰＯＤとＤＡＢの系に
より発色させ、陽性クローンを得た。
【００２２】（ｇＸ遺伝子の大腸菌発現ベクターへの組
み込み）ｇＸ遺伝子の大腸菌発現ベクターへの組み込み
工程を、以下図１を参照して説明する。
み込み）ｇＸ遺伝子の大腸菌発現ベクターへの組み込み
工程を、以下図１を参照して説明する。
【００２３】図１中の右側の工程で模式的に示したよう
に、陽性クローン（ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ−ｇＸ）か
らプラスミドＤＮＡを抽出し、Ｅｃｏ ＲＩ、Ｋｐｎ
ＩでｃＤＮＡを切り出し、Ｔ４ ＤＮＡポリメラーゼで
末端を平滑化した。それをアガロースゲル電気泳動によ
り分離した後、ｐＢａｍＨＩリンカー（１２ｍｅｒ）を
連結（ｌｉｇａｔｉｏｎ）させ、大腸菌発現ベクター
（ＡＭＲＡＤ社製：ｐＧＥＸ−２Ｔ）のＢａｍＨＩサイ
トに挿入した。
に、陽性クローン（ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ−ｇＸ）か
らプラスミドＤＮＡを抽出し、Ｅｃｏ ＲＩ、Ｋｐｎ
ＩでｃＤＮＡを切り出し、Ｔ４ ＤＮＡポリメラーゼで
末端を平滑化した。それをアガロースゲル電気泳動によ
り分離した後、ｐＢａｍＨＩリンカー（１２ｍｅｒ）を
連結（ｌｉｇａｔｉｏｎ）させ、大腸菌発現ベクター
（ＡＭＲＡＤ社製：ｐＧＥＸ−２Ｔ）のＢａｍＨＩサイ
トに挿入した。
【００２４】ここで、同図中左側に示した市販の大腸菌
発現ベクター（ＡＭＲＡＤ社製：ｐＧＥＸ−２Ｔ）は、
特公表平１−５０３４４１号に記載の方法により製造
し、Ｓｃｈｉｓｔｏｓｏｍａ ｊａｐｏｎｉｃｕｍ 由
来のグルタチオンＳ−トランスフェラーゼを細菌性プラ
スミドに組み込んだものである。
発現ベクター（ＡＭＲＡＤ社製：ｐＧＥＸ−２Ｔ）は、
特公表平１−５０３４４１号に記載の方法により製造
し、Ｓｃｈｉｓｔｏｓｏｍａ ｊａｐｏｎｉｃｕｍ 由
来のグルタチオンＳ−トランスフェラーゼを細菌性プラ
スミドに組み込んだものである。
【００２５】（融合蛋白の発現、採取および精製）ｇＸ
遺伝子が組み込まれた大腸菌発現ベクターを大腸菌ＪＭ
１０９へとトランスフォームし、その大腸菌を３７℃で
ＯＤ600 が０．６〜１．０になるまで培養後、ＩＰＴＧ
を０．１ｍＭになるように添加し、さらに３７℃で３〜
５時間培養した。
遺伝子が組み込まれた大腸菌発現ベクターを大腸菌ＪＭ
１０９へとトランスフォームし、その大腸菌を３７℃で
ＯＤ600 が０．６〜１．０になるまで培養後、ＩＰＴＧ
を０．１ｍＭになるように添加し、さらに３７℃で３〜
５時間培養した。
【００２６】この培養液を３０００ｒｐｍ、１０分間の
条件で遠心分離し、得られた沈渣を１％のトリトン Ｘ
−１００を含んだリン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ）に浮遊さ
せた後、超音波処理を行ない、再度３０００ｒｐｍ、１
０分間の条件で遠心分離した。その遠心上清をグルタチ
オンセファロース４Ｂカラム（ファルマシア社製：グル
タチオンセファロース４Ｂ）にかけ、吸着されない成分
をＰＢＳで洗い流したのち、１５ｍＭグルタチオンを含
んだ０．１ＭＴｒｉｓＨＣｌ緩衝液（ｐＨ８．０）で吸
着している成分を溶出し、ｇＸとグルタチオンＳトラン
スフェラーゼとの融合蛋白（以下、ｇＸ−ＧＳＴと略記
する。）を得た。
条件で遠心分離し、得られた沈渣を１％のトリトン Ｘ
−１００を含んだリン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ）に浮遊さ
せた後、超音波処理を行ない、再度３０００ｒｐｍ、１
０分間の条件で遠心分離した。その遠心上清をグルタチ
オンセファロース４Ｂカラム（ファルマシア社製：グル
タチオンセファロース４Ｂ）にかけ、吸着されない成分
をＰＢＳで洗い流したのち、１５ｍＭグルタチオンを含
んだ０．１ＭＴｒｉｓＨＣｌ緩衝液（ｐＨ８．０）で吸
着している成分を溶出し、ｇＸとグルタチオンＳトラン
スフェラーゼとの融合蛋白（以下、ｇＸ−ＧＳＴと略記
する。）を得た。
【００２７】得られた精製融合蛋白の分画をＳＤＳ−ポ
リアクリルアミドゲル電気泳動およびイムノブロッティ
ングで解析し、この結果を図２に示した。
リアクリルアミドゲル電気泳動およびイムノブロッティ
ングで解析し、この結果を図２に示した。
【００２８】図２の結果からも明らかなように、ｇＸ融
合蛋白は主として８０Ｋｄの融合蛋白であって全４種類
が検出されたが、これらは全塩基配列の由来（ｏｒｉｇ
ｉｎ）が発現した蛋白であり、部分的に読み取られた蛋
白の分子量は小さかった。これら数種類の融合蛋白は、
ｇＸ抗体を検出し得る能力を有していた。
合蛋白は主として８０Ｋｄの融合蛋白であって全４種類
が検出されたが、これらは全塩基配列の由来（ｏｒｉｇ
ｉｎ）が発現した蛋白であり、部分的に読み取られた蛋
白の分子量は小さかった。これら数種類の融合蛋白は、
ｇＸ抗体を検出し得る能力を有していた。
【００２９】（ＥＬＩＳＡによる感染豚血清中の抗体の
検出）上記のように精製されたｇＸ−ＧＳＴを０．５μ
ｇ／５０μｌ／ｗｅｌｌになるように０．０５Ｍ炭酸緩
衝液で調製し、固相とした。１％牛血清アルブミンを含
むリン酸緩衝食塩液３００μｌ／ｗｅｌｌを加え、２５
℃、２時間インキュベートとした。次に、０．０５％Ｔ
ｗｅｅｎ２０を含んだリン酸緩衝食塩液（Ｔ−ＰＢＳ）
でプレートを洗浄した後、希釈した豚血清を１００μｌ
加え、２５℃、１時間インキュベートした。Ｔ−ＰＢＳ
で洗浄した後、同緩衝液で希釈したペルオキシダーゼ標
識抗ブタＩｇＧを１００μｌ加え、２５℃、１時間イン
キュベートした。反応後、Ｔ−ＰＢＳで洗浄し、基質
（ＡＢＴＳ）液を１００μｌ加え、２５℃、１時間イン
キュベートした。そして、この反応は同量の０．１Ｎ
ＮａＯＨを加えて停止させ、マイクロプレートオートリ
ーダーを用いて４９２ｎｍの吸光度（ＯＤ値）を測定し
た。なお、上記検出実験は、ＡＤＶ自然感染ブタ４６頭
とＡＤＶワクチン（マーカーとしてｇＸを除いたもの）
接種ブタ２９頭をサンプルとして行ない、結果を図３に
示した。
検出）上記のように精製されたｇＸ−ＧＳＴを０．５μ
ｇ／５０μｌ／ｗｅｌｌになるように０．０５Ｍ炭酸緩
衝液で調製し、固相とした。１％牛血清アルブミンを含
むリン酸緩衝食塩液３００μｌ／ｗｅｌｌを加え、２５
℃、２時間インキュベートとした。次に、０．０５％Ｔ
ｗｅｅｎ２０を含んだリン酸緩衝食塩液（Ｔ−ＰＢＳ）
でプレートを洗浄した後、希釈した豚血清を１００μｌ
加え、２５℃、１時間インキュベートした。Ｔ−ＰＢＳ
で洗浄した後、同緩衝液で希釈したペルオキシダーゼ標
識抗ブタＩｇＧを１００μｌ加え、２５℃、１時間イン
キュベートした。反応後、Ｔ−ＰＢＳで洗浄し、基質
（ＡＢＴＳ）液を１００μｌ加え、２５℃、１時間イン
キュベートした。そして、この反応は同量の０．１Ｎ
ＮａＯＨを加えて停止させ、マイクロプレートオートリ
ーダーを用いて４９２ｎｍの吸光度（ＯＤ値）を測定し
た。なお、上記検出実験は、ＡＤＶ自然感染ブタ４６頭
とＡＤＶワクチン（マーカーとしてｇＸを除いたもの）
接種ブタ２９頭をサンプルとして行ない、結果を図３に
示した。
【００３０】図３の結果から明らかなように、中和抗体
価とＥＬＩＳＡ Ｏ．Ｄ．値とは相関関係が認められ、
感染ブタ血清中の抗体を検出することが可能であり、こ
のｇＸとグルタチオンＳトランスフェラーゼとの融合蛋
白がオーエスキー病ウイルス感染抗体識別用抗原として
使用できることがわかる。
価とＥＬＩＳＡ Ｏ．Ｄ．値とは相関関係が認められ、
感染ブタ血清中の抗体を検出することが可能であり、こ
のｇＸとグルタチオンＳトランスフェラーゼとの融合蛋
白がオーエスキー病ウイルス感染抗体識別用抗原として
使用できることがわかる。
【００３１】（ワクチン接種ブタとＡＤＶ感染豚血清と
のＥＬＩＳＡによる抗体検出の精度の確認実験） ワクチン接種ブタについての確認実験：３週齢豚を３頭
用い、３週間間隔で２回ワクチンを耳根部筋肉内に接種
した。被検血清としては、ワクチン接種前、１回目接種
後３週後、２回目接種後、２、６、８、１１、１４、１
７週後の血清を用い、中和抗体価を測定すると共にＥＬ
ＩＳＡによる感染識別性を評価し、これらの結果を表１
に示した。
のＥＬＩＳＡによる抗体検出の精度の確認実験） ワクチン接種ブタについての確認実験：３週齢豚を３頭
用い、３週間間隔で２回ワクチンを耳根部筋肉内に接種
した。被検血清としては、ワクチン接種前、１回目接種
後３週後、２回目接種後、２、６、８、１１、１４、１
７週後の血清を用い、中和抗体価を測定すると共にＥＬ
ＩＳＡによる感染識別性を評価し、これらの結果を表１
に示した。
【００３２】ここで、ＥＬＩＳＡの評価については、被
検血清を１００倍に希釈し、ＰＯＤ標識抗ブタＩｇＧ抗
体とＡＢＴＳ（基質）との発色により、ＡＤＶ野外陰性
ブタ血清の反応性を基にして、陽性抗原と陰性抗原との
ＯＤ値の差が０．３未満の場合をマイナスとし、それ以
上の場合をプラスとした。
検血清を１００倍に希釈し、ＰＯＤ標識抗ブタＩｇＧ抗
体とＡＢＴＳ（基質）との発色により、ＡＤＶ野外陰性
ブタ血清の反応性を基にして、陽性抗原と陰性抗原との
ＯＤ値の差が０．３未満の場合をマイナスとし、それ以
上の場合をプラスとした。
【００３３】なお、上記実験において使用したワクチン
は、ＡＤＶ感染豚腎臓由来の株化細胞ＰＫ−１５をＴｒ
ｉｔｏｎ Ｘ−１００で可溶化し、１０００００×ｇで
超遠心分離した上清を陰イオン交換体およびヘパリント
ヨパールカラムにかけ、ＰＢＳで洗浄後、２ＭのＮａＣ
ｌを含むＰＢＳ（ｐＨ７．４）で溶出し、ＰＢＳに対し
て透析し、ホルマリンで不活化すると共にオイルアジュ
バント（セピック社製：ＩＳＡ７０）を混合して、ｇII
I を６０％以上含みｇＸを含まないワクチンを用いた。
は、ＡＤＶ感染豚腎臓由来の株化細胞ＰＫ−１５をＴｒ
ｉｔｏｎ Ｘ−１００で可溶化し、１０００００×ｇで
超遠心分離した上清を陰イオン交換体およびヘパリント
ヨパールカラムにかけ、ＰＢＳで洗浄後、２ＭのＮａＣ
ｌを含むＰＢＳ（ｐＨ７．４）で溶出し、ＰＢＳに対し
て透析し、ホルマリンで不活化すると共にオイルアジュ
バント（セピック社製：ＩＳＡ７０）を混合して、ｇII
I を６０％以上含みｇＸを含まないワクチンを用いた。
【００３４】
【表１】
【００３５】表１の結果から明らかなように、いずれの
ブタにおいても良好な中和抗体価の上昇が認められ、最
も高かったブタＮｏ．１の２回目接種１４週後の血清で
は、７００倍以上の値を示したが、ｇＸ抗原に対するＥ
ＬＩＳＡでは、どの時期においても抗体は検出されなか
った。
ブタにおいても良好な中和抗体価の上昇が認められ、最
も高かったブタＮｏ．１の２回目接種１４週後の血清で
は、７００倍以上の値を示したが、ｇＸ抗原に対するＥ
ＬＩＳＡでは、どの時期においても抗体は検出されなか
った。
【００３６】ＡＤＶ感染ブタについての確認実験：３頭
のブタを用い、それぞれ１０6.0 ＴＣＩＤ５０のＡＤＶ
山形Ｓ８１株を鼻腔内に投与した。被検血清としては、
感染前、感染後２週後、１、２、３、４、５および６ヶ
月後の血清を用い、中和抗体価を測定すると共にＥＬＩ
ＳＡによる感染識別性を前記した場合と全く同様に評価
し、これらの結果を表２に示した。
のブタを用い、それぞれ１０6.0 ＴＣＩＤ５０のＡＤＶ
山形Ｓ８１株を鼻腔内に投与した。被検血清としては、
感染前、感染後２週後、１、２、３、４、５および６ヶ
月後の血清を用い、中和抗体価を測定すると共にＥＬＩ
ＳＡによる感染識別性を前記した場合と全く同様に評価
し、これらの結果を表２に示した。
【００３７】
【表２】
【００３８】表２の結果から明らかなように、いずれの
ブタにおいても感染２週後より中和抗体価の上昇が認め
られ、６ヶ月後においてもその値はほぼ維持されてい
た。また、ｇＸ抗原に対するＥＬＩＳＡにおいても、感
染６ヶ月後までの全ての血清に抗体が検出された。
ブタにおいても感染２週後より中和抗体価の上昇が認め
られ、６ヶ月後においてもその値はほぼ維持されてい
た。また、ｇＸ抗原に対するＥＬＩＳＡにおいても、感
染６ヶ月後までの全ての血清に抗体が検出された。
【００３９】
【効果】この発明は、以上説明したように、オーエスキ
ー病ウイルス感染抗体識別用抗原を、膜糖蛋白ｇＸとグ
ルタチオンＳトランスフェラーゼとの融合蛋白から構成
したので、ｇＸ抗体との反応の特異性が高くＥＬＩＳＡ
法によって信頼性の充分に高い測定ができる識別用抗原
となり、このものを膜糖蛋白ｇＸと所定の酵素をプラス
ミドベクターに組み込んで融合蛋白を発現させ、得られ
た融合蛋白をグルタチオンカラムクロマトグラフィーに
より精製するという比較的簡便な方法で製造し、このも
のの製造効率を高めて低コストで提供できるという利点
がある。
ー病ウイルス感染抗体識別用抗原を、膜糖蛋白ｇＸとグ
ルタチオンＳトランスフェラーゼとの融合蛋白から構成
したので、ｇＸ抗体との反応の特異性が高くＥＬＩＳＡ
法によって信頼性の充分に高い測定ができる識別用抗原
となり、このものを膜糖蛋白ｇＸと所定の酵素をプラス
ミドベクターに組み込んで融合蛋白を発現させ、得られ
た融合蛋白をグルタチオンカラムクロマトグラフィーに
より精製するという比較的簡便な方法で製造し、このも
のの製造効率を高めて低コストで提供できるという利点
がある。
【図１】オーエスキー病ウイルス感染抗体識別用抗原の
製造方法を説明する模式図
製造方法を説明する模式図
【図２】精製した融合蛋白の分画の抗ｇＸ抗体に対する
イムノブロッティング像
イムノブロッティング像
【図３】ＥＬＩＳＡ Ｏ．Ｄ．値と中和抗体価の関係を
示す図表
示す図表
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.6 識別記号 庁内整理番号 ＦＩ 技術表示箇所 //(Ｃ１２Ｐ 21/02 Ｃ１２Ｒ 1:19）
Claims (3)
- 【請求項１】 ブタヘルペス１ウイルスの膜糖蛋白ｇＸ
とグルタチオンＳトランスフェラーゼとの融合蛋白から
なるオーエスキー病ウイルス感染抗体識別用抗原。 - 【請求項２】 ブタヘルペス１ウイルスの膜糖蛋白ｇＸ
とグルタチオンＳトランスフェラーゼをコードする遺伝
子をプラスミドベクターに組み込んで融合蛋白を発現さ
せ、得られた融合蛋白をグルタチオンカラムクロマトグ
ラフィーにより精製することからなるオーエスキー病ウ
イルス感染抗体識別用抗原の製造方法。 - 【請求項３】 ブタヘルペス１ウイルスの膜糖蛋白ｇＸ
とグルタチオンＳトランスフェラーゼをコードする遺伝
子をプラスミドベクターに組み込んで融合蛋白を発現さ
せ、得られた融合蛋白をグルタチオンカラムクロマトグ
ラフィーにより精製し、この精製された融合蛋白を識別
用抗原として、ＥＬＩＳＡ法によりオーエスキー病ウイ
ルス感染抗体を検出することからなるオーエスキー病ウ
イルス感染抗体の検出方法。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP30914593A JPH07159408A (ja) | 1993-12-09 | 1993-12-09 | オーエスキー病ウイルス感染抗体識別用抗原 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP30914593A JPH07159408A (ja) | 1993-12-09 | 1993-12-09 | オーエスキー病ウイルス感染抗体識別用抗原 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH07159408A true JPH07159408A (ja) | 1995-06-23 |
Family
ID=17989454
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP30914593A Pending JPH07159408A (ja) | 1993-12-09 | 1993-12-09 | オーエスキー病ウイルス感染抗体識別用抗原 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JPH07159408A (ja) |
Cited By (6)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JP2007505320A (ja) * | 2003-09-11 | 2007-03-08 | アイデックス ラボラトリーズ インコーポレイテッド | ネコ免疫不全ウイルスの検出のための方法と装置 |
| JP2007514753A (ja) * | 2003-12-18 | 2007-06-07 | アイデックス ラボラトリーズ インコーポレイテッド | ネコ免疫不全ウイルスの検出のための方法と装置 |
| JP2007523170A (ja) * | 2004-02-19 | 2007-08-16 | アイデックス ラボラトリーズ インコーポレイテッド | ネコ免疫不全ウイルスの検出のための方法および装置 |
| JP2008509091A (ja) * | 2004-06-30 | 2008-03-27 | アイデックス ラボラトリーズ インコーポレイテッド | ネコ免疫不全ウイルス（ｆｉｖ）のｅｎｖタンパク質のｖ３領域に由来するペプチドの使用を含むｆｉｖを検出するための方法および装置 |
| WO2009014207A1 (ja) * | 2007-07-25 | 2009-01-29 | The Kitasato Institute | 猫免疫不全ウイルスワクチン接種猫の検査方法、および該検査用抗原 |
| US8809004B2 (en) | 2010-04-02 | 2014-08-19 | Idexx Laboratories, Inc. | Detection of feline immunodeficiency virus |
-
1993
- 1993-12-09 JP JP30914593A patent/JPH07159408A/ja active Pending
Cited By (10)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JP2007505320A (ja) * | 2003-09-11 | 2007-03-08 | アイデックス ラボラトリーズ インコーポレイテッド | ネコ免疫不全ウイルスの検出のための方法と装置 |
| US7776546B2 (en) | 2003-09-11 | 2010-08-17 | Idexx Laboratories, Inc. | Method and device for detecting feline immunodeficiency virus |
| JP2007514753A (ja) * | 2003-12-18 | 2007-06-07 | アイデックス ラボラトリーズ インコーポレイテッド | ネコ免疫不全ウイルスの検出のための方法と装置 |
| JP2007523170A (ja) * | 2004-02-19 | 2007-08-16 | アイデックス ラボラトリーズ インコーポレイテッド | ネコ免疫不全ウイルスの検出のための方法および装置 |
| JP2008509091A (ja) * | 2004-06-30 | 2008-03-27 | アイデックス ラボラトリーズ インコーポレイテッド | ネコ免疫不全ウイルス（ｆｉｖ）のｅｎｖタンパク質のｖ３領域に由来するペプチドの使用を含むｆｉｖを検出するための方法および装置 |
| JP4866848B2 (ja) * | 2004-06-30 | 2012-02-01 | アイデックス ラボラトリーズ インコーポレイテッド | ネコ免疫不全ウイルス（ｆｉｖ）のｅｎｖタンパク質のｖ３領域に由来するペプチドの使用を含むｆｉｖを検出するための方法および装置 |
| WO2009014207A1 (ja) * | 2007-07-25 | 2009-01-29 | The Kitasato Institute | 猫免疫不全ウイルスワクチン接種猫の検査方法、および該検査用抗原 |
| US8394581B2 (en) | 2007-07-25 | 2013-03-12 | The Kitasato Institute | Test method on feline vaccinated with feline immunodeficiency virus vaccine, and antigen for use in the test |
| JP5409361B2 (ja) * | 2007-07-25 | 2014-02-05 | 北里第一三共ワクチン株式会社 | 猫免疫不全ウイルスワクチン接種猫の検査方法、および該検査用抗原 |
| US8809004B2 (en) | 2010-04-02 | 2014-08-19 | Idexx Laboratories, Inc. | Detection of feline immunodeficiency virus |
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