JPS63501122A - 反復配列の少なくとも一部が欠失している弱毒化偽狂犬病ウイルス及びそれを含むワクチン - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 反復配列の少なくとも一部が欠失している弱毒化偽狂犬病ウィルス及びそれを含 むワクチン ＬＪＬ立ＪＬＪｆｆ１ 本明細書においていくつかの刊行物がカッコ付アラビア数字によって参照されて いる。これらの参照文献の完全な引用は本明細書末尾に記載されている。これら の刊行物の開示全体はここに引用によって本明細書に合体され、本発明に係わる 技術水準を更に充分に記述するものとなる。

ウィルスＤＮＡを分離し、このＤＮＡを細菌のプラスミド内へクローン化するこ とが可能となったことによりウィルスワクチンの作成に使用できるアプローチが 大きく拡張せしめられた。

本明細書におけるアプローチは、プラスミド内でクローン化状態にあるウィルス のＤＮＡ配列を変更せしめることによるが、これらの変更は挿入、削除又は単一 の若しくは重複した塩基変化を含みかつこれらに限られない。変更せしめられた ＤＮＡはついでウィルスのゲノムへ当該ウィルスを非病原性にする目的で戻され 挿入される。このようにして得られる生ウイルス製品は、免疫６谷を引き出し、 ワクチンとして保護的であるように又は動物の非病原性ウィルス感染の要求され る他のいかなる状況においても使用され得る。

動物ウィルスの−・群、ヘルペスウィルス又はｈｅｒｐｅｔｏｕｔｒ＋ｄａｅ。

は本発明のアプローチを容れ得るウィルスの種類の例である。

これらのウィルスはｉｏｏ、ｏｏｏから１５０，０００のＤＮＡの塩基対をその 遺伝子物質として含有し、そしてイン・ビトロ細胞培養でウィルスの複製に必ず しも必要でないゲノムのいくつかの領域が確認された。ＤＮＡのこれらの領域の 変更は動物種に対するウィルスの病原性を低下する（弱毒化する）ものであるこ とが知られている。例えば、チミジンキナーゼ遺伝子の不活性化によりヒト単純 ヘルペスウィルスは非病原性たらしめられ（１）、豚偽狂犬病ウィルスは非病原 性たらしめられる■及び（３）。

反復領域の一部除去によりヒト単純ヘルペスウィルスが非病原性たらしめられる （４）及び■。ウィルス性ｉ！瘍原性と関連するマレック病ウィルスにおいて反 復領域が確認され、この領域における変化が腫瘍原性の欠如と相関関係を有する ■。反復領域におけるこれらの変更によっては、反復配列に欠失を持つ弱毒化偽 狂犬病ウィルスの構築は教示されない。ヘルペスウィルス・サイミリにおける別 の領域が同様に腫瘍原性と相関関係があるものとされたくわ。偽狂犬病ウィルス におけるある領域が天然に存在するワクチン株においては欠失していることが示 された（■。この欠失は部分的に病原性欠如の原因となっているが、それは反復 配列においては生じておらず、反復配列における欠失に起因する弱毒化を示唆し ない。

文献から得られる一般的結論は、ヘルペスウィルスはゲノムの種々の部位にＤＮ Ａの非必須領域を含んでいるということ及びこれらの領域の変更はウィルスの弱 毒化をもたらし得てワクチン又は非病原性株誘導への道をひらき得るものである ということである。ウィルスの弱毒化の程度はウィルスをワクチンとして使用す る際は重要である。ウィルスの過度の弱毒化を惹き起す欠失は充分な免疫応答を 引き出さないワクチンを結果するであろう。

ヘルペスウィルスはヒト及びその他のを椎動物において種々の潜在的な回帰性感 染を惹き起すことが知られておりまたファンガス及びカキに感染することが知ら れていさえする。ヘルペスウィルスの感染と関連した状況には、単ｌｌ１ｍ疹タ イプ１が原因である単純庖疹、単純庖疹タイプ２が原因である性器庖疹並びに帯 状庖疹感染が原因である小児水痘及び成人帯状庖疹がある。狂犬病ウィルス（Ｐ ＲＶ）として知られるクラスＤヘルペスウィルスは飼育及び野生動物におけるＡ ｕｊｃｓｚｋｙ病、急性のしばしば致死的である神経状態、を誘発する。

偽狂犬病ウィルスの天然宿主は豚である。豚においては感染は普通不顕性である が、発熱、痙撃及び麻痺によって特徴付けられ得る。偽狂犬病ウィルスはまたウ シ、ヒツジ、イヌ、ネコ、キツネ及びミンクに感染し、この場合は通常宿主の死 を結果する。偽狂犬病ウィルス感染の眼に見える支配的な特徴は一般に関連地域 の宿主の工具を結果する激しい痒疹である。激しい興奮、発作及び麻痺が、これ らは全て脳を髄炎の症状であるが、発症後数日内に通常生じる死に先行して生ず る。

偽狂犬病ウィルスゲノムの遺伝子地図が作成された（第１図参照）。該ゲノムは 、順次、ユニークな長領域、内部逆方向反復塩基配列、ユニークな短領域及び末 端逆方向反復塩基配列を含むことが知られている。

豚の偽狂犬病ウィルス病は世界的に政府期間の重大な関心事となっている。米国 においては、感染豚は屠殺場以外へは売却できない。いくつかの州が別個に偽狂 犬病に対する撲滅抑制方法に関する立法を行なった。伝統的なワクチン製造者間 の研究開発動向は生ウィルスの使用よりはサブユニットワクチンによるアプロー チに基づく製品をもたらす研究を強調するものであった。生ウイルスワクチンか らの逸脱は主としてサブユニットワクチンについて認められた安全性の側面及び サブユニットワクチンが伝染性の生ウィルスを含有する可能性の低いことに基ず く。伝統的な生ウイルスワクチンは撲滅プログラムの期間中に防蝕を保持してい るように思われるピルレンスに復帰できることは周知のことである。反復塩基配 列の少くとも一部分に欠失をもつ弱毒化偽狂犬病ウィルスは最も一般的な生ウイ ルスワクチンからの逸脱物であり、ワクチン産業が全体として動いている方向か らの逸脱である。これらのウィルスは反復領域及びその他の領域において修復不 可能な欠失をこうむっている、すなわち、該ウィルスはビルレンスに復帰できず 、安全である。

これらのウィルスから成るワクチンによりサブユニットワクチン６安全性の側面 と生ウイルスワクチンの商業的及び有効性の利点とが結合せしめられる。

偽狂犬病ウィルスのワクチンは入手可能である。これらのワクチンは一般に細胞 培養弱毒化（ｃｅｌｌ　ｃｕｌｔｕｒｅ　ａｔｔｅｎｕａｔｉｏｎ）の手法で製 造される。この方法で製造される生ウィルスワクチンの中には、ウィルスゲノム の特異的短領域（ｕｎｉｑｕｅ　Ｓｈｏｒｔｒａｎｇｅ）に欠失が認められるも のがある（０が、しかしながら、これらのウィルスはリピートシーケンスに欠失 を有していない。

１９８５年５月１５日にヨーロッパ特許公報ＮＱＯ１４１４５８が公示された。

このヨーロッパ特許公報は、１９８４年１０月１２日に出願されたヨーロッパ特 許出願Ｎα８４２０１４７４．８に基づいており、「ヘルペスウィルスの欠失変 異株及びこれを含むワクチン」という表題がつけられている。

この刊行物は、該ゲノムからの欠失したＤＮＡ配列を有する、弱毒化偽狂犬病ウ ィルスの構築を開示している。欠失のタイプとしては、単独短領域での欠失及び リピートシーケンスでの欠失である。しかしながらこの出願は、リピートシーケ ンス中の弱毒化欠失について十分に詳細に開示しておらず、またリピートシーケ ンス中での欠失の予測し得ない弱毒化性について何等教示していない。特にこれ 等の発明者等は、旧ｎｄＩ［［部位の位置でのリピート単位中の小さな欠失はブ タにおける毒性について重要性をもたないと述べており、弱毒化におけるリピー ト領域の重要性に気がついていなかったことを直接示している。いずれにしても 、この出願は本出願の出願日の前−年以内に外国で刊行されたものである。

ゲノム中の唯一の長い領域に位置する、偽狂犬病ウィルスのチミジンキナーゼ（ ＴＫ）ｍ伝子中の欠失によって、ウィルスが非病原性になるが、宿主動物中に於 ける免疫応答も同様に低下することも知られている。米国特許第４，５１４，４ ９７号明細書（発明の名称：修飾化偽狂犬病ウィルス）は、唯−ＴＫｍ伝子中に 於いてのみ欠失のある温度抵抗性偽狂犬病・ウィルスを開示してはいるが、リピ ート配列の欠失によって弱毒化された偽狂犬病ウィルスについては何ら教唆ない し示唆していない。更に、我々の弱毒化偽狂犬病ウィルスは如何なる温度抵抗性 に対しても選択されたものではない。

理想的なウィルス生ワクチンとは、非病原性であり、強い免疫応答を生起させる ものである。従って、非病原性であって、宿主動物中で強い免疫応答を生起し得 る偽狂犬病生ワクチンが望ましい。

本発明は、弱毒化偽狂犬病ウィルス、即ち、病原性の弱められた偽狂犬病ウィル スに係り、強い免疫応答を誘発するワクチンとして、又は動物に対する非病原性 ウィルス感染が必要とされる他の情況下で有用なウィルスである。該ウィルスは 少なくともリピート配列の一部に欠失を為する。偽狂犬病ウィルス病に対してブ タを免疫するのに用いた際、該ウィルスは他の感染し易いを殺さずに、又は仲間 の動物にうつることがないという利点を有する。更に加えて、該ウィルスは安定 、即ち、病原性株に復帰せず、良好な免疫応答を提供するものである。

弱毒偽狂犬病ウィルスの複製に必須の配列を含み、反復配列の少なくとも一部が 欠失しているＤＮＡからなる弱毒ウィルスが提供される。前記弱毒ウィルスの複 製に必須の配列の少な（とも一部は、天然の偽狂犬病ウィルスの複製に必須の配 列中に存在する。本発明の有効免疫量のウィルスと適切な担体とからなるワクチ ンは偽狂犬病ウィルス病に対して動物を免疫するのに有用である。

また本発明は弱毒偽狂犬病ウィルスの製造方法およびこれらのウィルスから偽狂 犬病ウィルスワクチンの製造方法も提供する。

図面の簡単な説明 第１図は、ｐｓｔ（＄７断片の位置を示すＢａｍＨＩ制限酵素地図を含む擬狂犬 病ウィルスゲノム地図である。ＵＬは特異的長シークエンス、ＵＳは特異的類シ ークエンス、ＩＲは内部リピートシーフェンス、ＴＲは末端リピートシーフェン スを示す。

第２図は、５−ＰＲｖ−ｏｏｌにおけるリピート欠失の位置を示す擬狂犬病つィ ルスＢａｍＨＩＩ５制限８Ｉ素地図である。

第３図Ａは、Ｓ　−Ｐ　ＲＶ　−００２におけるリピート欠失の位置を示す擬狂 犬病ウィルスＢａＩＩＨＩ　＃５制限酵素地図である。同Ｂは、チミジンキナー ゼ遺伝子領域における欠失の位置を示す擬狂犬病ウィルスＰＳｔｌ　＄７制限酵 素地図である。

ｌ豆皮ｌ亙左１１ 本発明は、弱毒化擬狂犬病ウィルスに関する。これらのウィルスは、リピートシ ーフェンスの少なくとも一部分が欠失している弱毒ウィルスの複製に必要なシー フェンスを含むＤＮＡからなる。このシーフェンスの少なくとも一部分は、天然 の擬狂犬病ウィルスの複製に必要なシーフェンス中にある。ウィルスは耐熱性で はない。すなわち、野生タイプのものに許容される温度よりも高い温度での複製 のために、ウィルスを選択しなかった。耐熱性でないウィルスとは、本明細書中 、野生タイプのものに許容される温度でのみ複製し得るウィルスであると定義さ れる。更に、弱毒ウィルスの複製に必須のＤＮＡシークエンスｉ、天然の擬狂犬 病ウィルスから誘導することができる。

欠失は全体として、リピートシーフェンスの一部分又はりリピートシーフェンス の一部分と隣接する特異的領域の一部分とからなる。すなわち、欠失は連結領域 （ｊｕｎｃｔｉｏｎ　ｒｅｇｉｏｎ）で生じ得る。更に、該複製に必須でないシ ーフェンスは前記リピート又は両方のリピートから除外してもよい。更に、１つ のリピート又は１つの完全なリピートの必須シーフェンスの少なくとも一部分を 除外してもよい。

本発明はまた、リピートシーフェンスの少なくとも一部分及びリピート内に位置 しないシーフェンスが除外された擬狂犬病ウィルスＤＮＡからなる弱毒擬狂犬病 ウィルスにも関する。本発明の一態様においては、両リピートに存在する非必須 のシーフェンス及びリピート内に位置しないシーフェンスを除いた。

本発明の好ましい態様においては、リピート内に位置しない除外したシーフェン スは遺伝子の少なくとも一部分である。本発明の特別の態様においては、リピー ト内に位置しない除外したシーフェンスは、遺伝子の少なくとも一部分である。

本発明の特別の態様においては、リピート内に位置しない除外したシーフェンス は、擬狂犬病チミジンキナーゼをコードする遺伝子の少なくとも一部分である。

両リピートに欠失を有し且つ擬狂犬病チミジンキナーゼをコードする遺伝子に欠 失を有する弱毒擬狂犬ウィルスを製造した。このウィルスを５−ＰＲＶ−００２ の記号で表わし、ＡＴＣＣ寄託番号ＮＱ　Ｖ　Ｒ２１０７で寄託されている。

本発明はまた、連結領域以外のリピートシーフェンスの少な（とも一部分又は極 （初期遺伝子（ｉｍｍｅｄｉａｔｅ　ｅａｒｌｙ　ｇｅｎｅｓ）が除外された擬 狂犬病ウィルスＤＮＡからなる弱毒擬狂犬病ウィルスにも関する。極く初期遺伝 子に対するプロモーターの両すピートシークエンス上流に欠失を有する弱毒偽狂 犬病ウィルスを製造した。このウィルスを５−ＰＲＶ−００１の記号で表わし、 ＡＴＣＣ寄託番号ＮＱ　Ｖ　Ｒ２１０６で寄託されている。

本発明は更に、擬狂犬病ウィルス症のワクチンにも係る。このワクチンは、有効 な免疫量の、欠失リピートシーフェンスの少なくとも一部分を有する弱毒擬狂犬 病ウィルスと、適当なキャリアとからなる。適当なキャリアとは典型的には、糖 、塩及び蛋白質などの安定化剤を含む生理学的にバランスさせた培養培地である 。本発明の一態様において、豚用ワクチンは一投与ｌあたり約１０３〜１０９１ ０３ル１０９（ｐｆｕ）に等しい有効免疫吊の弱毒擬狂犬病ウィルスを含有して いる。犬、猫、羊又は牛すなわち畜午に対する有効な免病量は、−投与量あたり 約１０４〜１０６ｐｆｕである。

本発明は更に、動物に本発明の適当量のワクチンを投与することからなる、擬狂 犬病ウィルス病に対し動物を免病化する方法にも係る。ワクチンは筋肉注射、皮 下注射、腹腔注射又は静脈注射で投与され得る。更に、ワクチンは、鼻腔注射又 は経口的に投与され得る。

本発明は更に、弱毒擬狂犬病ウィルスの製造方法にも係る。

この方法は、野生タイプの擬狂犬病ウィルスＤＮＡを単離し、制限酵素消化を利 用してＤ　Ｎ　Ａ　ＩＩＪ限酵素断片を形成することを含む。この制限酵素断片 をアガロースゲルエレクトロホレシスで精製すると、特異的なりＮＡ断片が得ら れる。これらのＤＮＡ断片を、当業者に知られている適当なＨ素で処理すると、 変形ウィルスＤＮＡ断片（ｍｏｄｉｆｉｅｄ　ｖｉｒａｌ　ＤＮＡ　ｆｒａｇ＋ ａｅｎｔｓ）が得られる。これらの変形ウィルスＤＮＡ断片は、細菌のプラスミ ドＤＮＡシーフェンスに結合可能である。適当な細菌プラスミドは当業者に公知 の適当な制限酵素により別個に処理されて、変形ウィルスＤＮＡ断片に結合可能 な細菌プラスミドＤＮＡシーフェンスとなる。次いで、これらの細菌プラスミド ＤＮＡ断片と変形ウィルスＤＮＡ断片とを、ウィルスＤＮＡが細菌ＤＮＡに結合 してウィルス−細菌性プラスミドが形成される条件下に、結合させる。

ウィルス−細菌性ＤＮＡプラスミドを次いで制限酵素により地図化し、ウィルス ＤＮＡインサートの制限酵素地図を明らかにする。次いでウィルス−細菌性ＤＮ Ａプラスミドを当業界で公知の制限酵素を用いて処理し、ウィルス−細菌性ＤＮ ＡプラスミドのウィルスＤＮＡシーフェンスに少なくとも１つの欠失を生起させ る。ウィルスＯＮ△シークエンスに少なくとも１つの欠失を含有するこのプラス ミドを、野生タイプのままの擬狂犬病ウィルスを用いて動物細胞の中へトランス フェクト（ｔｒａｎｓｆｅｃｔ　）する。動物細胞を適当な条件下に維持して、 野生タイプの擬狂犬病ウィルスＤＮＡが、野生タイプのウィルスと、プラスミド のウィルスＤＮＡシーフェンスで組み換えられた少ａのウィルスとを再生するよ うにする。これらの組み換えウィルスのあるものは、プラスミドのウィルスＤＮ Ａインサートにおける欠失の結果として、そのゲノムに欠失を有している。これ らのウィルスを同定し、次いで野生タイプのウィルスからプラーク精製した。

本発明の好適具体例に於いては、細菌プラスミド内に挿入されたウィルスＤＮＡ 制限酵素断片は、少なくともリピート配列の一部を含むものである。本発明の一 特定具体例では、ウィルス−細菌ＤＮＡプラスミドのウィルスＤＮＡ配列中に於 ける欠失によって、組換ウィルスの両リピート配列中に欠失が生ずる。

本発明のもう一つの好適具体例に於いては、細菌プラスミド内に挿入されたウィ ルスＤＮＡ制限酵素断片は擬狂犬病ウィルスのチミジンキナーゼをコードする遺 伝子を含む。本発明の一特定具体例では、ウィルス−細菌ＤＮＡプラスミドのウ ィルスＤＮＡ配列中に欠失があり、それは組換ウィルスの両リピート配列及び擬 狂犬病ウィルスのチミジンキナーゼをコードする遺伝子に於ける欠失をもたらす ものである。

本発明は、擬狂犬病ウィルスワクチンの調製方法にも係わるものである。該方法 は、ローラーボトル又はマイクロキ１？リアビーズ、例えばセファデックスビー ズの懸濁液内でウィルスを培養することを含む。該ウィルスはバッチ式培養器に よって培養することもできる。

本発明に於いて用いられる方法は全て、分子生物学の研究室に於いて標準的に使 用されるものか又は、それらに多少の変更を加えたものである。

本発明に於ける全ての方法で用いられる出発野生型擬狂犬病ウィルスは誘発試験 によく用いられる毒性ウィルスである、ＬＩＳＤＡから得られたショーブ株であ る。該ウィルスは誘発ストック用に、ベロ細胞内で４回以内増殖させ、ワクチン 株の操作及び精製用には１０回以内増殖させた。

本発明で用いた酵素は、全て容易に入手し得る市販のものであり、製造者の指示 に従って使用した。例えば、制限酵素は、主にニュー・イングランド・バイオラ プス（　Ｂｉｏｌａｂｓ　）　、ベセスダ・リサーチ・ラボラトリーズ（ＢＲＬ ）及びＩＢＩコーポレーション並びにその他から入手した。Ｂａｌ　３１ヌクレ アーゼはＢＲＬより、ＤＮＡＴ４リガーゼはＢｉｏｌａｂｓより、子牛−腸ホス ファターゼはベーリンガー・マンハイム社から、そして大腸菌ＤＮＡポリメラー ゼＩのクレノー断片はＢｉｏｌａｂｓより夫々入手した。

プラスミドＤＮＡは主に文献６のに記載の方法によって調製した。ウィルスＤＮ ＡのｖＡ製に関しては文献＋１１）に記載がある。プラスミドにより形質転換し たｍ胞の小試料からのＤＮＡ調製物（ミニ、プレブ）は文献６ｆ）に記載の方法 で作成した。

文献（ＩＩに記載の方法に従って、電気泳動により分離し、その後アガロースゲ ルからＤＮＡ断片を精製した。フェノール抽出物を低融点アガロースゲル及び標 準アガロースゲルに対する電気溶出用に用いた。文献Ｏ０の方法に従って大腸菌 ８８１０１株内にＤＮＡを形質転換させた。文献Ｏ及び０３に記載の方法に主に 従って、ＤＮＡを動物細胞にトランスフェクションした。

制限酵素による消化、アガロースゲル電気泳動による断片の分離、該断片の所定 の放射性標識ＤＮＡ又はＲＮＡプローブへのハイブリダイゼーション及び該ゲル からフィルターへのプロット操作による制限酵素断片の移動（サザンプロット分 析）（文献１０）により、ＤＮＡ中の制限酵素断片の順列と構造を分析した。擬 狂犬病組換ウィルスで感染させた単層組織培養物から得たウィルスはＨＡＴ培地 中でチミジンキナーゼの存在によって、又はＢｕｄｒ培地中での該遺伝子の非存 在によって選択した。

（文献１４に記載の操作を用いた。）チミジンキナーゼの存在は、文献１５に記 載の方法によって１４ｃチミジンラベリング法を用いてアッセイした。

ＤＮＡの制限酵素断片は大腸菌ＤＮＡポリメラーゼのクレノー断片を用いて平滑 末端にした（文献１０参照）。子牛腸ホスファターゼの消化による末端リン酸残 塁の除去も同様に文献１０に記載の方法で実施した。

５−ＰＲＶ−００１の構築 リピート領域内に欠失を有する擬狂犬病ウィルスは以下の操作によって得た。擬 狂犬病つィルスショーブ株のチミジンキナーゼ領域はＰｓｔ　Ｉ＄７断片（４， ３００塩基対、　ｐｓＹ３４４）としてクローン化した。Ｂａｌ１＄１１と呼ば れる約３，２００塩基対のＢａｒａＨ１断片が前記領域内に含有されていた。Ｂ ａｍ　１１１断片が擬狂犬病ウィルスのチミジンキナーゼ遺伝子を含有している ことが、遺伝標識救済実験及び配列データにより判明した（文献１６参照）。

遺伝標識救済実験によって、チミジンキ太−ゼ擬狂犬病ウィルス変異体もＢａ１ ｌ　＄１１クローンによって見出すことができ、従ってこれはチミジンキナーゼ 遺伝子を含有するものである。

Ｈｌｕ　１部位はチミジンキナーゼ構造遺伝子内にある。（文献１６参照）。こ の挿入物を含有するプラスミドを切断し、消化し、再結合してＨｌｕ　１部位に 欠失を生じさせる。該欠失のサイズについてプラスミドを分析し、約３００塩基 対の欠失を有するプラスミド（ｐＳＹ　５１３　）を野生型全狂犬病ウィルスＤ ＮＡの存在下で動物細胞にトランスフェクトした。薬剤であるブロモデオキシウ リジンの存在下でウィルスを選択した。組換ウィルスの候補をプラーク精製によ って野生型全狂犬病ウィルスから分離し、そのＤＮＡ調製物を作成し、制限酸素 による消化及びサザンブロッティング（文献１０）によって該ＤＮＡを分析して ウィルスゲノム内に欠失が存在することを証明した。

以上の結果から、［３ａｎ＋ＨＩＩ５断片内の欠失位置をめ、これを第２図に示 した。上記方法によって、擬狂犬病ウィルス（Ｓ−ＰＲＶ−００１）を単離し、 これは３ａｍ）ｌ）＄５の両断ハ（コピー）に欠失を有し、Ｐｓｔ　１７断片に は欠失がないものであった。

該ウィルスは完全無傷で活性なチミジンキナーゼ遺伝子を保持していた（１４Ｃ −チミジン取込みアッセイにより測定）。

Ｓ　−ＰＲＶ−００２（７）ＩＩ 完全な（１ｎｔａｃｔ）野生型偽狂犬病ＤＮＡと狂犬病ＤＮＡのクローン化断片 との相同組換えの結果としてゲノム中に多重欠失を含む弱毒化偽狂犬病ウィルス が構築された。方法は、Ｓ−Ｐ　ＲＶ　−００１の構築の場合と同様であった。

組換えに使用したプラスミドクローンは、偽狂犬病ウィルスノＰｓｔ　Ｉ　１７ クロ一ン化断片由来のちのであった。クローン化ｐｓｔＪ　害７断片は長い非反 復領域に認められるがＢａｍＨＩＩ５反復断片にも若干相似していることに注目 されたい。Ｐｓｔｌ１１断片はウィルスＤＮＡのＰｓｔ　Ｉ消化物から７ガロー スゲル電気泳動に従って精製され、ｐｓＹ　３４４を形成すべく　ｐｓｔサイト にクーロン化された。

プラスミドＤＮＡを旧ｕｉ制限酵素を用いて切断後Ｂａｔ　３１ヌクレアーゼで 消化することにより、Ｈｌｕ　ｌサイトの周囲のプラスミド中で欠失を生じさせ た。ＤＮＡを各種時間（１０〜６０秒）に亘り消化させ、おおよその消化度を調 べるためにアガロースゲル電気泳動によりサンプルを分析した。１００〜２００ ０塩基対の消化サンプルを、ＤＮＡを循環させるべく再結紮し、Ｅ、　ｃｏｌｉ 中に形質転換させた。約３００個の塩基対が欠失したプラスミドｐｓＹ５１３を ウィルスＤＮＡとの組替えのために用いた。プラスミドＤＮＡを完全な偽狂犬病 ウィルスＤＮＡと氾合し、混合物を家兎の皮膚細胞にトランスフェクトさせた。

予想される欠失位置はプラスミドＤＮＡに相似のＤＮＡ領域内、即ちＰｓｔｌ　 ＄７（或いはこれらを含むＢａｍＨＩ　雲１１）及び成る程ＵＰｓｔｌ＄７断片 とハイブリダイズする３ａ１１）（＋１５内であろう。トランスフェクションか ら回収されたウィルスを、チミジンキナーゼ活性を欠く組換え体を選択する薬剤 ブロモデオキシウリジンを用いて選択した。チミジンキナーゼ遺伝子は断片ｐｓ ｔｒ　１７に残存し、そのサイドでの相同組換えの結果遺伝子中の欠失が生じた 。ウィルスは２回精製されたプラークであり、制限酵素地図によりＤＮＡ中の変 化を調べた。

Ｓ　−Ｐ　ＲＶ　−００２と呼称される偽狂犬病ウィルス組換え体は、サザンハ イプリダイゼーションによってＢａｍＨＩ　＄１１断片及び３ａｍ）（１１５断 片中に欠失があることが判明した（第３図参照）。このウィルスは、（１５）に 記載されている１４Ｃ−チミジン挿入アッセーが示す如く、チミジンキナーゼ活 性を欠いている。

Ｓ−ＰＲＶ−００１及ヒｓ　−ＰＲＶ−００２ヲ用いて行った動物実験第１組の 研究の目的は、Ｓ　−Ｐ　ＲＶ　−００１及び５−ＰＲＶ−００２と野生型偽狂 犬病ウィルス（ＰＲＶ）の安全性（ごルレンス）及び抗原性（抗体応答の誘導） について比較することにあった。

以前ＰＲＶを受けていない幼い（４−６連合）豚に、上記３種のウィルスを各種 濃度で接種した。動物を１４日間毎日観察してＰＲＶの臨床的兆候を調べ、体温 も毎日記録した。所定時間に豚から血液サンプルを採取し、ラジオイムノ拡散酵 素結合イムノソルベント法（ＲＩＤＥＡ）を用いてＰＲＶに対する抗体を調べた 。接種後の所定時間に豚を層殺し、組織を取り出し、ウィルスの存在を調べた。

これらの３種のウィルスのビルレンスも、若いマウスに注側後致死邑を測定する ごとにより調べた。

これらの研究結果を表１−４に示す。

表　１ マウスにおける野生型、５−ＰＲＶ−００１或いは５−ＰＲＶ−００１偽狂犬病 ウイルスのビルレンスａ）組織培養感染用１５ｏ（ＴｉＳＳＬｌｅ　ｃｕｌｔｕ ｒｅ　１ｎｆｅｃｔｉｖｅ　ｄＯｓｅｓｏ）：ＴＣＩＤ５０ 表　２ 豚における野生型、５−ＰＲＶ−００１或し１は５−ＰＲＶ−００２偽狂犬病ウ イルスのビルレンス表　２　（つづき） ａ）　’ｒｃｌＤ５゜ ｂ）上昇した直腸混 ÷・・・・・・１０５−１０６゜ ＋＋・・・・・・１０６−１０７″″ ＋＋÷・・・・・・１０７−１０８　”Ｃ）ＣＮＳ兆候 ＋・・・・・・後肢に軽度の運動失調及び硬直十＋・・・・・・後肢に重度の運 動失調及び軽度の平衡異常＋＋＋・・・・・・全肢に重度の運動失調、兵制運動 不能。

横臥及び連続する頭の運動 表　３ 野生型、Ｓ　−ＰＲＶ−００１或いは５−ＰＲＶ−００２偽狂犬病ウイルスを接 種した豚の面清学的反応表　３　（つづき） ａ）　ＴＣＩＤ５０ ｂ）ＲＩＤＥＡテスト； 全て豚とも０８目はく２であった。

ＮＴ＝テストせず 表　４ 野生型、５−ＰＲＶ−００１或いは５−ＰＲＶ−００２偽狂犬病ウイルスを接種 した豚からのウィルス単離Ｃ）セル培養中を２回通過後サンプルを−と判定した 。全ての十のサンプルは第１回のセル培養通過時に認められた。

３．２ ワイルドタイプＰＲＶは、１０　ＴＣｒＤ５ｏのマウスＬＤ１ｏｏを示した。マ ウスは致死の前に昏睡し、毛がまばらになり、掻痒（むずむずした）を示した。

ワイルドタイプＰＲＶを接種したブタは全て体温が上昇し、ＰＲＶ感染に典型的 な中枢神経系症状を示した。接種後１０日のブタ及び１２日後の別のブタを屠殺 し、組織からウィルスを回収した。接種後１４日後までに全てのブタはＰＲＶ抗 体を有し、２８日のサンプリング期間を通して高いレベルを示した。

３．８ Ｓ−ＰＲＶ−００１のマウスＬＤ　は１０　ＴＣＩＤ５ｏであす、全てのマウス を致死させるためには、ワイルドタイプで必要であったものの４倍のウィルスが 必要であった。マウスの平均死亡時間は１〜２日遅れ、このウィルスがマウスに 対する毒性をいくらか喪失していることを示す。Ｓ　−Ｐ　ＲＶ　−００１を接 種した９等のブタは全て体温の上昇を示したが、ＣＮＳ症状の進行を示したもの は９頭中２頭だ【プであり、これらはワイルドタイプウィルスを接種されたもの で見られたものほど重大なものではなかった。接種後５日で屠殺した２頭のブタ の１頭からウィルスを単離した。これ等のブタは全てワイルドタイプを接種ブタ に等しいレベルのＰＲＶ抗体を有していた。

５−ＰＲＶ−００２はマウスに対して毒性ではなく、ブタにおいて何等臨床症状 あるいは発熱反応を示さなかった。接種後２８日で屠殺したブタからはウィルス は回収できなかった。（それより前に屠殺したブタはない。）ワイルドタイプ及 び５−ＰＲｖ　−ｏｏｉを接種したブタで測定されたものよりもわずかに低いだ けの抗体レベルで示されるように、ウィルスはブタにおいて充分復製されていた 。

これ等の研究から得られる結論は、５−ＰＲＶ−００１は非常に良好な抗原であ るが、生起された欠失はブタに使用される安Ｓ　−Ｐ　ＲＶ　−００２はブタ及 びマウスにおいて無毒性であり、なおかつブタにおいて強い抗体反応を生起する 能力を保持しているものである。

５−ＰＲＶ−００２のワクチンウィルスとしτの有用性をさらに試験するために 、５〜６週令連合ＲＢ抗体非保持のブタで、ワクチン接種／誘発試験を行なった 。１群のブタを誘発コントロールとした。ワクチン接種ブタは上述のようにして ワクチン接種後の逆反応を観察した。ワクチン接種の２７日後に、ワクチン接種 及びコントロールのブタに毒性ウィルスの１０’＝７ＴＣＩＤを鼻腔的投与する ことにより誘発した。さらに１４日間ブタのＰＲＶ感染症状を観察した。

この試験の結果を表５に示す。

表　５ Ｓ−ＰＲＶ−００２によるワクチン接種とワイルドタイプＰＲＶによる誘発後の 血清学的及び臨床的反応ａ、高温　÷−１０５〜１０６′″、　＋＋＝　１０６ 〜１０７°、　＋÷＋＝１０７〜１０８゜ｂ、ＣＮＳ症状　＋＝軽度の運動失調 と後肢のこわばり、十十−重大な後肢の運動失調及び軽度の平衡喪失、◆＋（＝ 全肢における重大な運動失調、兵制不能、側面横臥及び連続的な頭部の動きｃ、 ＲＩＤＥＡ試験 ｄ、ＰＲＶ以外の原因によりブタが死亡ｅ、７日以前にブタが死亡 体温の上昇あるいは典型的なＰＲＶ症状の呈示により丞されるワクチン接種後の 逆反応は、ワクチン接種動物において見られなかった。ワクチン接種体は全てＰ ＲＶ抗体を産生じ、非ワクチン接種コントロールは血清陰性のままであった。毒 性ウィルスによる誘発の後、５頭のコントロールブタのうち３頭は発熱し、重大 なＣＮＳ症状を進行させて死亡した。コントロールの１頭は、発熱し一時的なＣ ＮＳ症状を〒したが回復した。５番目のコントロールは発熱したが、ＰＲＶ感染 による臨床症状は見せなかった。それに対して、４頭のワクチン接種ブタのうち ３頭は臨床的に正常めままで、強い第２の抗体反応を示した。

−担はワクチン接種したブタ誘発後４日でＰＲＶの臨床症状を示さずに死亡した 。組織試験したところＰＲＶ感染部位は発見されず、ウィルスもまったく単離さ れなかった。死因は不明のままである。

４．０ この試験の結論は、Ｓ　−Ｐ　ＲＶ　−００２をｉｏ　ＴＣＩＤ５ｏの投与量で 与えた場合、ワクチ接種動物中に強力な保護反応を引き起すということである。

この反応は、非ワクヂン接種ブタの６０％を死亡させる感染に対して保護するの に充分である。

別の偽狂犬病ウィルス構築物 リピートシーケンスを欠失した別の偽狂犬病ウィルス構築物を本明細書に記載の 方法で製造した。一つの構築物は、内部リピートからのＤＮＡの２０００ｂｐ配 列と隣接する単独長鎖域からの１ｏｏｏｂｐ配列とからなる欠失を有するもので ある。マウスとブタにおけるこのウィルスの予備試験の結果、これは弱毒化され た。

このウィルスは、結合領域における欠失を有する弱毒化偽狂犬病ウィルスの例で あり、偽狂犬病ウィルス疾患に対するワクチンとして有用であると考えられる。

また、別の例として、特に第２図に示したＢＡＨＩｌｌ　＄５フラグメントのＸ ｂａＩ部位とＨｐａＩ部位の間であるリピート領域の欠失を有する偽狂犬病ウィ ルスを構築した。このウィルスに関してはまだ毒性については試験していない。

これ等の例は、リピート中のその他の欠失を構築し得、リピートシーケンス中の 欠失がこのウィルスを弱毒化することを示１　、　Ｒ，Ｈ，Ｐｒ１ｃｅ　ａｎｄ 　Ａ、　Ｋａｈｎ、　Ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ　ａｎｄ　Ｉｍｍｕｎｉｔｙ　３４゜ ５７１−５８０．１９８１゜ ２　、　Ｐ、Ｂ、　Ｔｅｎ５ｅｒ、　ｅｔ　ａｌ、、　Ｊｏｕｒｎａｌ　ｏｆ　 Ｇｅｎｅｒａｌ　Ｖｉｒｏｌｏｇｙ　６４゜１３６９−１３７３．１９８３゜ ３、Ｓ、にｉｔ、ｅｔ　ａｌ、、Ｎ１ｎｔｈ　Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ　１ ｌｅｒｐｅｓｖｉｒｕｓＷｏｒｋｓｈｏｐ、５ｅａｔｔｌｅ、Ａｕｇｕｓｔ　２ ４−２９．　１９８４゜４　、Ｒｏｉｚｍａｎ、ｅｔ　ａｔ、、Ｃｏｌｄｓｐｒ ｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｒ　Ｃｏｎｆｅｒｅｎｃｅ　ｏｎ　ＮｅｗＡｐｐｒｏａｃｈ ｅｓ　ｔｏ　Ｖｉｒａｌ　Ｖａｃｃｉｎｅｓ、５ｅｐｔｅｎ＋ｂｅｒ、１９８３ ゜５　、Ｒ，Ｌ、Ｔｈｏｍｐｓｏｎ、ｅｔ　ａｌ、、ＶｉｒｏｌｏｇＶ　１３１ 　、　１８０−１９２．１９８３゜６　、Ａ、Ｔａｎａｋａ、ａｔ　ａｔ、、Ｈ ｅｒｐｅｓｖｉｒｕｓ　Ｍｅｅｔｉｎｇ、Ｋｅｙｓｔｏｎｅ、Ｃｏ、。

１９８４゜ ７　、Ｊ、Ｈ，Ｋｏｏｍｅｙ、ｅｔ　ａｌ、、Ｊｏｕｒｎａｌ　ｏｆ　Ｖｉｒｏ ｌｏｇｙ　５０．　６６２−６６！Ｌ１９８４゜ ８　、Ｂ、Ｌｏｍｎｉｃｚｉ、ｅｔ　ａｌ、、Ｊｏｕｒｎａｌ　ｏｆ　Ｖｉｒｏ ｌｏｇｙ　４９．　９７０−９７９゜１９８４． ９　、Ｂｅｎ−ＰＯｒａｔ、ｅｔ　ａｌ、、Ｎ１ｎｔｈ　Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏ ｎａｌ　ＨｅｒｐｅｓｖｉｒｕｓＷｏｒｋｓｈｏｐ、５ｅａｔｔｌｅ、Ａｕｇｕ ｓｔ　２４−１９．１９８４゜１０、Ｈａｎｉａｔｉｓ、ｅｔ　ａｌ、、Ｍｏ１ ｅｃｕｌａｒ　Ｃｌｏｎｉｎｇ：　Ａ　ＬａｂｏｒａｔｏｒｙＭａｎｕａｌ、Ｃ ｏ１ｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　１ｌａｒｂｏｒ　１．ａｂｏｒａｔｏｒｙ　Ｐｒｅｓｓ 、１９８２゜１１、Ｌ、Ｅ、Ｐｏ５ｔ、ｅｔ　ａｔ、、ＰＮＡＳ　７７、　４２ ０１−４２０５．　１９８０゜１２、Ｐ、Ｄｉｅｒｋｓ、ｅｔ　ａｌ、、Ｄｅｖ ｅｌｏｐｍｅｎｔａｌ　Ｂｉｏｌｏｇｙ　ＵｓｉｎｇＰｕｒｉｆｉｅｄ　Ｇｅｎ ｅｓ。

１３、Ｄ、Ｄ、　Ｂｒｏｗｎ　ａｎｄ　Ｃ，Ｆ、　Ｆｏｘ　（Ｅｄｓ、）　ＩＣ Ｎ−１ｌｃＬＡ　Ｓｙｍｐｏｓｉｕｍｏｎ　Ｍｏ１ｅｃｕｌａｒ　ａｎｄ　Ｃｅ １ｌｕｌａｒ　Ｂｉｏｌｏｇｙ、Ａｃａｄ、Ｐｒｅｓｓ　Ｎ、Ｙ、。

１）Ｉ）、３４７−３６６．１９８１゜１４、Ｌ、Ｅ、Ｐｏ５ｔ、Ｈａｃｋｅｎ 、ａｎｄ　Ｂ、Ｒｏｉｚｍａｎ、Ｃｅ１ｌ　２４．　５５５−５６５゜１９８１ ゜ １５、Ｔｅｎ５ｅｒ、　ｅｔ　ａｌ、、　Ｊ、Ｃ１１ｎｉｃａｌ　Ｈｉｃｒｏｂ ｉｏｌｙｇｙ　１７．　１２２−１２７゜１９８３゜ １６、Ｓ、にｆｔ、ｅｔ　ａｌ、、Ｈｅｒｐｅｓｖｉｒｕｓ　Ｈｅｅｔｉｎｏ、 ＩＣＭ−ＵＣＬＡ　Ｓｙｍｐｏｓｉｕｍ。

Ａｐｒｉｌ　８−１３．　１９８４．　＾ｂｓｔｒａｃｔ　Ｎ２８８゜Ｆｉｇｕ ｒｅ　Ｌ Ｆｉｇｕｒｅ　２ ０＝：：：：：：コ 欠失 Ｆｉｇｕｒｅ　３ ズ先 ８　−二１−Ｊ− Ｐ３ＩＩ　Ｐｖｕｆｆ　ＰｖｕａＢａｒｎＨ＋　’−■手続ネ市正書（方式） ％式％ ２、発明の名称　反復配列の少なくとも一部が欠失している弱毒化偽狂犬病ウィ ルス及びそれを含むワクチン３、補正をする者 事件との関係　特許出願人 名　称　プルｆチク・リサーチ・アンド・ディベロップメント・パートナ−シッ プ４、代　理　人　東京都新宿区新宿１丁目１番１４号　山田ビル５、補正命令 の日付　昭和６３年１月１４日６、補正により増加する発明の数 ７、補正の対象　特許法第１８４条の５第１項の規定による書面中、発明の名称 の欄、出願人の住所、名称及び代表者８、補正の内容 （１、発明の名称を正確に記載した特許法第１８４条の５第１項の規定による書 面を別紙の通り補充する。

（２）出願人の代表者を記載した特許法第１８４条の５第１項の規定による書面 を別紙の通り補充する。

（３）特許法第１８４条の５第１項の規定による書面中、出願人の、住所及び名 称に誤りがあったので別紙の通り補正する。

（４）発明の名称を訂正し、滲出した明細書の翻訳文を別紙の通り補充する。（ 内容に変更なし） （５）浄書した請求の範囲の翻訳文を別紙の通り補充する。

（内容に変更なし） （６）委任状・法人格証明書および翻訳文を別紙の通り補充する。

（７）証明書および翻訳文を別紙の通り補充する。

９、添附摺類の目録 （１）訂正特許法第１８４条の５第１項の規定による書面　１通（２）明細書の 翻訳文及び請求の範囲の翻訳文　１通（３）委任状・法人格証明書および翻訳文 　各１通（４）証明書および翻訳文　各１通 （５）理由書　１通 商、同日付にて本願に関する住所変更届を提出致しました。

国際調査報告

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 （１）弱毒化した偏狂犬病ウィルスの複製に必須の配列を含むＤＮＡからなる弱 毒化偽狂犬病ウィルスであって、前記配列の少なくとも一部が天然の偽狂犬病ウ ィルスの複製に必須の配列中に存在し、反復配列の少なくとも一部が欠失してい る、前記弱毒化偽狂犬病ウィルス。 （２）ウィルスが温度感受性でない、請求の範囲第１項の弱毒化偽狂犬病ウィル ス。 （３）弱毒化ウィルスの複製に必須のＤＮＡ配列が天然の偽狂犬病ウィルスに由 来する、請求の範囲第１項の弱毒化偽狂犬病ウィルス。 （４）反復配列の欠失部分が接合領域以外の反復配列の一部を含む、請求の範囲 第１項の弱毒化偽狂犬病ウィルス。 （５）反復配列の欠失部分が接合領域を含む、請求の範囲第１項の弱毒化偽狂犬 病ウィルス。 （６）反復配列の欠失部分が非必須の配列からなる、請求の範囲第１項の弱毒化 偽狂犬病ウィルス。 （７）両方の反復配列の欠失部分が非必須の配列からなる、請求の範囲第６項の 弱毒化偽狂犬病ウイルス。 （８）ひとつの反復の必須の配列の少なくとも一部が欠失している、請求の包囲 第１項の弱毒化偽狂犬病ウィルス。 （９）ひとつの反復が全部欠失している、請求の範囲第８項の弱毒化偽狂犬病ウ ィルス。 （１０）さらに、反復内に位置していない配列が欠失している、請求の範囲第１ 項の弱毒化偽狂犬病ウィルス。 （１１）反復内に位置していない欠失配列が遺伝子の少なくとも一部である、請 求の範囲第１０項の弱毒化偽狂犬病ウィルス。 （１２）反復内に位置していない欠失配列が偽狂犬病チミジンキナーゼをコード している遺伝子の少なくとも一部である、請求の範囲第１１項の弱毒化偽狂犬病 ウィルス。 （１３）Ｓ−ＰＲＶ−００２と命名され、ＡＴＣＣ受付番号第ＶＲ２１０７号と して寄託されている、請求の範囲第１２項の弱毒化偽狂犬病ウィルス。 （１４）欠失が両方の反復中の前初期遺伝子のプロモーターの上流である、請求 の範囲第１項の弱毒化偽狂犬病ウィルス。 （１５）Ｓ−ＰＲＶ−００１と命名され、ＡＴＣＣ受付番号第ＶＲ２１０６号と して寄託されている、請求の範囲第１４項の弱毒化偽狂犬病ウィルス。 （１６）請求の範囲第１項の弱毒化偽狂犬病ウィルスの有効免疫量と適切な担体 とからなる偽狂犬病ウィルス疾病用ワクチン。 （１７）適切な担体が安定剤を含有する生理学的に平衝化した倍地である、請求 の範囲第１６項のワクチン。 （１８）有効免疫量が約１０３〜約１０９ｐｆｕ／用量である、請求の範囲第１ ６項のワクチン。 ６ （１９）有効免疫量が約１０４〜約１０６ｐｆｕ／用量である、請求の範囲第１ ６項のワクチン。 （２０）請求の範囲第７項の弱毒化偽狂犬病ウィルスの有効免疫量と適切な担体 とからなる偽狂犬病ウィルス疾病用ワクチン。 （２１）請求の範囲第９項の弱毒化偽狂犬病ウィルスの有効免疫量と適切な担体 とからなる偽狂犬病ウィルス疾病用ワクチン。 （２２）請求の範囲第１１項の弱毒化偽狂犬病ウィルスの有効免疫量と適切な担 体とからなる偽狂犬病ウィルス疾病用ワクチン。 （２３）請求の範囲第１２項の弱毒化偽狂犬病ウィルスの有効免疫量と適切な担 体とからなる偽狂犬病ウィルス疾病用ワクチン。 （２４）請求の範囲第１３項の弱毒化偽狂犬病ウィルスの有効免疫量と適切な担 体とからなる偽狂犬病ウィルス疾病用ワクチン。 （２５）請求の範囲第１５項の弱毒化偽狂犬病ウィルスの有効免疫量と適切な担 体とからなる偽狂犬病ウィルス疾病用ワクチン。 （２６）請求の範囲第１６項のワクチンの適切な用量を動物に投与することから なる偽狂犬病ウィルス疾病に対して動物を免疫する方法。 （２７）請求の範囲第１８項のワクチンの適切な用量を動物に投与することから なる偽狂犬病ウィルス疾病に対して動物を免疫する方法。 （２８）請求の範囲第１９項のワクチンの適切な用量を動物に投与することから なる偽狂犬病ウィルス疾病に対して動物を免疫する方法。 （２９）請求の範囲第２０項のワクチンの適切な用量を動物に投与することから なる偽狂犬病ウィルス疾病に対して動物を免疫する方法。 （３０）請求の範囲第２１項のワクチンの適切な用量を動物に投与することから なる偽狂犬病ウィルス疾病に対して動物を免疫する方法。 （３１）請求の範囲第２２項のワクチンの適切な用量を動物に投与することから なる偽狂犬病ウィルス疾病に対して動物を免疫する方法。 （３２）請求の範囲第２３項のワクチンの適切な用量を動物に投与することから なる偽狂犬病ウィルス疾病に対して動物を免疫する方法。 （３３）請求の範囲第２４項のワクチンの適切な用量を動物に投与することから なる偽狂犬病ウィルス疾病に対して動物を免疫する方法。 （３４）請求の範囲第２５項のワクチンの適切な用量を動物に投与することから なる偽狂犬病ウィルス疾病に対して動物を免疫する方法。 （３５）動物がブタである、請求の範囲第２７項の方法。 （３６）動物がブタ、イヌ、ネコ、ヒツジまたはウシ動物である、請求の範囲第 ２８項の方法。 （３７）筋肉内、皮下、腹膜間または静脈内注射によってワクチンを投与する、 請求の範囲第２６項の方法。 （３８）ワクチンを鼻内に投与する、請求の範囲第２６項の方法。 （３９）ワクチンを経口投与する、請求の範囲第２６項の方法。 （４０）弱毒化された偽狂犬病ウィルスの調製方法であって、ａ．野生型偽狂犬 病ウイルスのＤＮＡを単離し、ｂ．単離した野生型偽狂犬病ウィルスＤＮＡを適 当な制限酵素で消化してウィルスＤＮＡ制限断片を生成させ、ｃ．このウィルス ＤＮＡ制限断片を分離し、ｄ．適切なウィルスＤＮＡ制限断片を適当な酵素で処 理して、細菌性プラスミドＤＮＡ配列と連結することができる改変ウィルスＤＮ Ａ断片を生成させ、 ｅ．別に、適切な細菌性プラスミドを適当な制限酵素で処理して、改変されたウ ィルスＤＮＡ断片と連結することができる細菌性プラスミドＤＮＡ配列を生成さ せ、ｆ．改変されたウィルスＤＮＡ断片を適切な条件下で細菌性ブラスミドＤＮ Ａ配列と合せてウィルスー細菌性プラスミドを形成せしめ、 ９．このウィルスー細菌性ＤＮＡプラスミドを適当な制限酵素またはその他のヌ クレアーゼで処理してウィルスー細菌性ＤＮＡプラスミドのウィルスＤＮＡ配列 中に少なくともひとつの欠失を生ぜしめ、 ｈ．ウィルスＤＮＡ配列の一部が欠失しているウィルスー細菌性ＤＮＡプラスミ ドと、野生型の完全な偽狂犬病ウィルスとで動物細胞をトランスフェクトし、 ｉ．この動物細胞を適切な条件下に維持して、野生型の偽狂犬病ウィルスＤＮＡ に、野生型のウィルスと、ウィルスー細菌性プラスミドのウィルスＤＮＡ配列と 組換えられているウィルスの小パーセントとを再生せしめ、 ｊ．ウィルスー細菌性ＤＮＡプラスミドのウィルスＤＮＡ配列と組換えられてお り、かつこのウィルスー細菌性ＤＮＡプラスミドのウィルスＤＮＡ配列中に生じ た欠失に対応する欠失をゲノム中にもっているウィルスを同定し、ｋ．この組換 えウィルスを野生型のウィルスからプラーク精製する ことからなる方法。 （４１）ウィルスＤＮＡ制限断片が反復配列を含んでいる、請求の範囲第４０項 の方法。 （４２）ウィルスー細菌性ＤＮＡプラスミドのウィルスＤＮＡ配列中の欠失が組 換えウィルスの両者の反復配列中の欠失に帰着する、請求の範囲第４１項の方法 。 （４３）ウィルスＤＮＡ制限断片が偽狂犬病チミジンキナーゼをコードしている 遺伝子を含んでいる、請求の範囲第４０項の方法。 （４４）ウィルスー細菌性ＤＮＡプラスミドのウィルスＤＮＡ配列中の欠失が、 組換えウィルスの両者の反復配列および偽狂犬病チミジンキナーゼをコードして いる遺伝子中の欠失に帰着する、請求の範囲第４３項の方法。 （４５）請求の範囲第（１６）項の偽狂犬病ウィルスワクチンの製造方法であっ て、このウィルスを回転瓶中で培養することからなる方法。 （４６）請求の範囲第１６項の偽狂犬病ウィルスワクチンの製造方法であって、 このウィルスを微粒子担体ビーズの懸濁液中で培養することからなる方法。 （４７）請求の範囲第１６項の偽狂犬病ウィルスワクチンの製造方法であって、 このウィルスをバッチ酸酵によって培養することからなる方法。