JPH07163347A - 組換えｄ−ヒダントイナーゼ、その生産方法および使用 - Google Patents
組換えｄ−ヒダントイナーゼ、その生産方法および使用Info
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- JPH07163347A JPH07163347A JP6202004A JP20200494A JPH07163347A JP H07163347 A JPH07163347 A JP H07163347A JP 6202004 A JP6202004 A JP 6202004A JP 20200494 A JP20200494 A JP 20200494A JP H07163347 A JPH07163347 A JP H07163347A
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Abstract
(57)【要約】
【目的】 改良された温度安定性を有する組換えＤ−ヒ
ダントイナーゼを多量に提供することにある。 【構成】 配列番号１のアミノ酸配列で特徴付けられる
Ｄ−ヒダントイナーゼ活性を有する組換えタンパク質。
ダントイナーゼを多量に提供することにある。 【構成】 配列番号１のアミノ酸配列で特徴付けられる
Ｄ−ヒダントイナーゼ活性を有する組換えタンパク質。
Description
【０００１】
【産業上の利用分野】本発明は新規な組換えＤ−ヒダン
トイナーゼ、その生産方法およびその使用に関する。
トイナーゼ、その生産方法およびその使用に関する。
【０００２】
【従来の技術】Ｄ−ヒダントイナーゼ（ジヒドロピリミ
ジナーゼ、EC 3.5.2.2) はＮ−カルバモイル−Ｄ−アミ
ノ酸を生産するのに使用される。これらの化合物はＤ−
アミノ酸の生産に重要な中間体生成物である（Morin
ら, Appl.Microbiol. 35, 536-540 (1991)、欧州特許第
0219034 号明細書）。Ｄ−アミノ酸は、順に、ペニシリ
ンおよび半合成セファロスポリンの側鎖の合成に重要な
出発物質である。Ｎ−カルバモイル−Ｄ−アミノ酸の生
産は高温で行われることが好ましい。何となれば、ヒダ
ントインはより可溶性であり、そのラセミ化がより迅速
に起こり、その反応がまた加速されるからである。この
理由のために、熱安定性のＤ−ヒダントイナーゼに対す
る要望がある。
ジナーゼ、EC 3.5.2.2) はＮ−カルバモイル−Ｄ−アミ
ノ酸を生産するのに使用される。これらの化合物はＤ−
アミノ酸の生産に重要な中間体生成物である（Morin
ら, Appl.Microbiol. 35, 536-540 (1991)、欧州特許第
0219034 号明細書）。Ｄ−アミノ酸は、順に、ペニシリ
ンおよび半合成セファロスポリンの側鎖の合成に重要な
出発物質である。Ｎ−カルバモイル−Ｄ−アミノ酸の生
産は高温で行われることが好ましい。何となれば、ヒダ
ントインはより可溶性であり、そのラセミ化がより迅速
に起こり、その反応がまた加速されるからである。この
理由のために、熱安定性のＤ−ヒダントイナーゼに対す
る要望がある。
【０００３】高温（40〜90℃）で活性であるＤ−ヒダン
トイナーゼが好熱性微生物（ドイツ特許出願第3031151
号明細書）から得ることができる。しかしながら、これ
らの好熱性微生物は培養し難く、しかも増殖が不十分で
ある。加えて、Ｄ−ヒダントイナーゼはこれらの微生物
により非常に少量でしか生産されない。組換えＤ−ヒダ
ントイナーゼが欧州特許第0219034 号明細書に記載され
ている。しかしながら、Ｄ−ヒダントイナーゼ活性は、
欧州特許第0219034 号明細書に記載されたDNA 配列の発
現中に少量で得られるにすぎない。
トイナーゼが好熱性微生物（ドイツ特許出願第3031151
号明細書）から得ることができる。しかしながら、これ
らの好熱性微生物は培養し難く、しかも増殖が不十分で
ある。加えて、Ｄ−ヒダントイナーゼはこれらの微生物
により非常に少量でしか生産されない。組換えＤ−ヒダ
ントイナーゼが欧州特許第0219034 号明細書に記載され
ている。しかしながら、Ｄ−ヒダントイナーゼ活性は、
欧州特許第0219034 号明細書に記載されたDNA 配列の発
現中に少量で得られるにすぎない。
【０００４】
【発明が解決しようとする課題】本発明の目的は、更に
改良された温度安定性を有する組換えＤ−ヒダントイナ
ーゼを多量に提供することであった。
改良された温度安定性を有する組換えＤ−ヒダントイナ
ーゼを多量に提供することであった。
【０００５】
【課題を解決するための手段】この目的は、配列番号１
のアミノ酸配列で特徴付けられるＤ−ヒダントイナーゼ
活性を有するタンパク質により達成される。そのタンパ
ク質は、 a)約8.2 のpH最適値、約6.5 〜9.0 のpH安定性に関する
最適値を有し、 b)更に、50ミリモル／リットルのトリス緩衝液、pH7.8
中で15mg/ml の濃度で60℃で20分後に初期活性の約100
％を有し、更に65℃で20分後に初期活性の約80％を有
し、 c)天然で産出しないポリペプチドであり、 d)外来性DNA の原核生物発現の生産物である。
のアミノ酸配列で特徴付けられるＤ−ヒダントイナーゼ
活性を有するタンパク質により達成される。そのタンパ
ク質は、 a)約8.2 のpH最適値、約6.5 〜9.0 のpH安定性に関する
最適値を有し、 b)更に、50ミリモル／リットルのトリス緩衝液、pH7.8
中で15mg/ml の濃度で60℃で20分後に初期活性の約100
％を有し、更に65℃で20分後に初期活性の約80％を有
し、 c)天然で産出しないポリペプチドであり、 d)外来性DNA の原核生物発現の生産物である。
【０００６】驚くべきことに、本発明の酵素は原核生物
中で組換えにより多量に生産でき、易可溶性であり、そ
して高活性および良好な温度安定性を有することがわか
った。本発明の組換えＤ−ヒダントイナーゼは、Ｃ末端
のアミノ酸配列に関して、天然酵素（野生型酵素）、例
えば、好熱性バチルス（DE-OS 3031151)および欧州特許
第0219034 号明細書に記載された酵素とは異なる。
中で組換えにより多量に生産でき、易可溶性であり、そ
して高活性および良好な温度安定性を有することがわか
った。本発明の組換えＤ−ヒダントイナーゼは、Ｃ末端
のアミノ酸配列に関して、天然酵素（野生型酵素）、例
えば、好熱性バチルス（DE-OS 3031151)および欧州特許
第0219034 号明細書に記載された酵素とは異なる。
【０００７】本発明の酵素は野生型酵素より12のアミノ
酸だけ短く、そして最後の６のアミノ酸の配列を異にす
る。欧州特許第0219034 号明細書に記載された酵素と比
較して、本発明の酵素は８のアミノ酸だけ長く、最後の
30のアミノ酸の配列を異にする。また、本発明のＤ−ヒ
ダントイナーゼは、そのアミノ酸配列が配列番号１とは
わずかに異なるタンパク質と理解される。この場合、ア
ミノ酸は置換、欠失、誘導体化または付加し得る。
酸だけ短く、そして最後の６のアミノ酸の配列を異にす
る。欧州特許第0219034 号明細書に記載された酵素と比
較して、本発明の酵素は８のアミノ酸だけ長く、最後の
30のアミノ酸の配列を異にする。また、本発明のＤ−ヒ
ダントイナーゼは、そのアミノ酸配列が配列番号１とは
わずかに異なるタンパク質と理解される。この場合、ア
ミノ酸は置換、欠失、誘導体化または付加し得る。
【０００８】Ｄ−ヒダントイナーゼ活性を有するタンパ
ク質をコードし、そして a)配列番号２に示されたDNA 配列またはその相補的DNA
配列、 b)遺伝暗号の縮重のために、a)で特定された配列の一つ
によりまたコードされるタンパク質をコードするDNA 配
列 からなる群から選ばれるDNA が本発明のＤ−ヒダントイ
ナーゼの組換え生産に使用される。
ク質をコードし、そして a)配列番号２に示されたDNA 配列またはその相補的DNA
配列、 b)遺伝暗号の縮重のために、a)で特定された配列の一つ
によりまたコードされるタンパク質をコードするDNA 配
列 からなる群から選ばれるDNA が本発明のＤ−ヒダントイ
ナーゼの組換え生産に使用される。
【０００９】配列番号２のDNA 配列が使用されることが
好ましい。DNA 配列は、当業者に良く知られている方法
でわずかに改変し得る。例えば、縮重したコドンが、同
じアミノ酸をコードするその他のコドンにより置換し得
る。更に、付加的なコドンが5'末端および3'末端で、ま
たは配列内に挿入でき、または個々のコドンもしくはコ
ドンの群が欠失でき、但し、この方法で得られたDNA 変
異体が本発明の配列とごくわずかに異なり、通常の条件
（Sambrookら, Molecular cloning, A Laboratory Manu
al, Cold Spring Harbor Laboratory Press,ニューヨー
ク1989) 下でこれらの配列とハイブリダイズし、かつコ
ードされたタンパク質がＤ−ヒダントイナーゼ活性を有
することを条件とする。
好ましい。DNA 配列は、当業者に良く知られている方法
でわずかに改変し得る。例えば、縮重したコドンが、同
じアミノ酸をコードするその他のコドンにより置換し得
る。更に、付加的なコドンが5'末端および3'末端で、ま
たは配列内に挿入でき、または個々のコドンもしくはコ
ドンの群が欠失でき、但し、この方法で得られたDNA 変
異体が本発明の配列とごくわずかに異なり、通常の条件
（Sambrookら, Molecular cloning, A Laboratory Manu
al, Cold Spring Harbor Laboratory Press,ニューヨー
ク1989) 下でこれらの配列とハイブリダイズし、かつコ
ードされたタンパク質がＤ−ヒダントイナーゼ活性を有
することを条件とする。
【００１０】加えて、本発明は、好適な原核宿主細胞
（例えば、E.coli、サッカロミセス・セレビジアエ(Sac
charomyces cerevisiae)) を好適な発現系中に存在する
本発明のDNA で形質転換し、形質転換宿主細胞を培養
し、そして生成したＤ−ヒダントイナーゼを細胞または
細胞上澄みから単離することによる組換えＤ−ヒダント
イナーゼの生産方法に関する。
（例えば、E.coli、サッカロミセス・セレビジアエ(Sac
charomyces cerevisiae)) を好適な発現系中に存在する
本発明のDNA で形質転換し、形質転換宿主細胞を培養
し、そして生成したＤ−ヒダントイナーゼを細胞または
細胞上澄みから単離することによる組換えＤ−ヒダント
イナーゼの生産方法に関する。
【００１１】組換え生産に使用される宿主細胞の形質転
換は既知の方法(Sambrook ら,1989)に従って行われる。
形質転換宿主細胞は、Ｄ−ヒダントイナーゼ遺伝子の発
現を可能にする条件下で培養される。使用される発現ベ
クターに応じて、既知の方法で誘導物質（例えば、ラク
トースまたはイソプロピル−β−Ｄ−チオガラクトピラ
ノシド(IPTG)) を培地に添加することが必要なことがあ
る。細胞上澄みまたは細胞からの組換えＤ−ヒダントイ
ナーゼの単離は既知の方法で行われる。 この方法を使
用して、106 U/1.5kg のバイオマスまでの収量で活性な
組換えＤ−ヒダントイナーゼを得ることが可能である。
換は既知の方法(Sambrook ら,1989)に従って行われる。
形質転換宿主細胞は、Ｄ−ヒダントイナーゼ遺伝子の発
現を可能にする条件下で培養される。使用される発現ベ
クターに応じて、既知の方法で誘導物質（例えば、ラク
トースまたはイソプロピル−β−Ｄ−チオガラクトピラ
ノシド(IPTG)) を培地に添加することが必要なことがあ
る。細胞上澄みまたは細胞からの組換えＤ−ヒダントイ
ナーゼの単離は既知の方法で行われる。 この方法を使
用して、106 U/1.5kg のバイオマスまでの収量で活性な
組換えＤ−ヒダントイナーゼを得ることが可能である。
【００１２】組換えにより生産されたＤ−ヒダントイナ
ーゼの溶解および精製は、当業者に良く知られている方
法に従って行い得る。醗酵後に得られたバイオマスは高
圧ホモジナイザー中で分断される(disrupt) ことが好ま
しく、粗抽出物が硫酸アンモニウムで分別され、約60℃
でインキュベートされる（加熱工程）。加えて、本発明
は、ラセミヒダントインを50〜80℃の温度で本発明のＤ
−ヒダントイナーゼとともにインキュベートし、続いて
生成されるＮ−カルバモイル−Ｄ−アミノ酸を単離し、
所望により、当業者に良く知られている方法に従って反
応混合物から精製することを特徴とする相当するＮ−カ
ルバモイル−Ｄ−アミノ酸へのラセミヒダントインの開
裂方法に関する。
ーゼの溶解および精製は、当業者に良く知られている方
法に従って行い得る。醗酵後に得られたバイオマスは高
圧ホモジナイザー中で分断される(disrupt) ことが好ま
しく、粗抽出物が硫酸アンモニウムで分別され、約60℃
でインキュベートされる（加熱工程）。加えて、本発明
は、ラセミヒダントインを50〜80℃の温度で本発明のＤ
−ヒダントイナーゼとともにインキュベートし、続いて
生成されるＮ−カルバモイル−Ｄ−アミノ酸を単離し、
所望により、当業者に良く知られている方法に従って反
応混合物から精製することを特徴とする相当するＮ−カ
ルバモイル−Ｄ−アミノ酸へのラセミヒダントインの開
裂方法に関する。
【００１３】全ての遺伝子操作方法、例えば、発現、DN
A 改変、クローニングおよび組換えタンパク質の単離
が、当業者に良く知られている方法、例えば、Ausubel,
F.M.ら, Current Protocols in Molecular Biology, Wi
ley,ニューヨーク1992; Sambrookら (1989) またはDavi
s,L.G., Methods in Molecular Biology, Elsevier, ア
ムステルダム, NL, 1986に記載された方法に従って行い
得る。本発明が下記の実施例、配列表および図面により
更に詳しく説明される。
A 改変、クローニングおよび組換えタンパク質の単離
が、当業者に良く知られている方法、例えば、Ausubel,
F.M.ら, Current Protocols in Molecular Biology, Wi
ley,ニューヨーク1992; Sambrookら (1989) またはDavi
s,L.G., Methods in Molecular Biology, Elsevier, ア
ムステルダム, NL, 1986に記載された方法に従って行い
得る。本発明が下記の実施例、配列表および図面により
更に詳しく説明される。
【００１４】
【実施例】実施例１ プラスミド構築 ２種のプライマー(Hyd1 およびHyd2) を使用してＤ−ヒ
ダントイナーゼ遺伝子をバチルス・サーモグルコシダシ
ウス(Bacillus thermoglucosidasius)（野生型）から単
離し、そして制限酵素EcoRI およびHindIII による制限
後にE.coli (pKK177-3, DSM 3062) 中の発現に適した発
現ベクターに挿入した。 Hyd1: GGAATTCTATGACAAAAATAATAAAAAATGG （配列番号３） Hyd2: GCGGATCCAAGCTTTTAAATATTGGCCGTACCC （配列番号４） 塩基がHindIII 切断部位から欠失される場合(AAGCTT →
AAGCT)、配列番号１を有するタンパク質に翻訳し得る読
み取り枠が形成された（図１）。
ダントイナーゼ遺伝子をバチルス・サーモグルコシダシ
ウス(Bacillus thermoglucosidasius)（野生型）から単
離し、そして制限酵素EcoRI およびHindIII による制限
後にE.coli (pKK177-3, DSM 3062) 中の発現に適した発
現ベクターに挿入した。 Hyd1: GGAATTCTATGACAAAAATAATAAAAAATGG （配列番号３） Hyd2: GCGGATCCAAGCTTTTAAATATTGGCCGTACCC （配列番号４） 塩基がHindIII 切断部位から欠失される場合(AAGCTT →
AAGCT)、配列番号１を有するタンパク質に翻訳し得る読
み取り枠が形成された（図１）。
【００１５】得られるプラスミドpD8 はIPTG誘導プロモ
ーターの制御下でタンパク質コード配列として配列番号
２を含む。このプラスミド中で、そのプロモーターがそ
の他のプロモーター、例えば、lac プロモーター、mgl
プロモーター（欧州特許出願第0316370 号）または欧州
特許出願第0186069 号および同第0303925 号明細書に記
載されたプロモーターにより置換し得る。
ーターの制御下でタンパク質コード配列として配列番号
２を含む。このプラスミド中で、そのプロモーターがそ
の他のプロモーター、例えば、lac プロモーター、mgl
プロモーター（欧州特許出願第0316370 号）または欧州
特許出願第0186069 号および同第0303925 号明細書に記
載されたプロモーターにより置換し得る。
【００１６】実施例２ E.coliからの組換えヒダントイナーゼの醗酵方法の説明 E.coli HB 101 (DSM 1607)を宿主生物として使用し、こ
れはpD8 だけでなく適合性プラスミドのlacI遺伝子を含
んでいた。予備培養物を、液体窒素中に貯蔵したパイレ
ッツ(paillettes)から開始する二重選択圧（カナマイシ
ンおよびアンピシリン）でLB培地中で培養した。
れはpD8 だけでなく適合性プラスミドのlacI遺伝子を含
んでいた。予備培養物を、液体窒素中に貯蔵したパイレ
ッツ(paillettes)から開始する二重選択圧（カナマイシ
ンおよびアンピシリン）でLB培地中で培養した。
【００１７】主培養に関する接種容積は１〜10容量％で
あった。HK培地の主成分は酵母エキスおよびグルコース
であった。培地を接種前にK2HPO4でpH7.6-7.8 に調節し
た。培地の更に別の必須成分はMn塩およびMg塩である。
それらはヒダントイナーゼの活性および安定性に必要で
ある。これらの塩を別々に滅菌し、培地に別々に添加し
た。少量（約20％）のみを最初に添加し、酸性度の調節
剤として使用されるグルコース用量を介してその主たる
量を添加した。
あった。HK培地の主成分は酵母エキスおよびグルコース
であった。培地を接種前にK2HPO4でpH7.6-7.8 に調節し
た。培地の更に別の必須成分はMn塩およびMg塩である。
それらはヒダントイナーゼの活性および安定性に必要で
ある。これらの塩を別々に滅菌し、培地に別々に添加し
た。少量（約20％）のみを最初に添加し、酸性度の調節
剤として使用されるグルコース用量を介してその主たる
量を添加した。
【００１８】封入体(IB)の生成を避けるために、少量の
IPTG（<1ミリモル）による誘導を10のOD578 まで行わな
かった。醗酵温度は32℃であった。加えて、OD578=30よ
り上で、制限用量の酵母エキスを添加して増殖速度を制
限した。用量比率により比増殖速度を調節し、制限する
ことにより、IB生成を殆ど完全に抑制し、そして高収量
のバイオマスを得ることができる。pH値を7.0-7.2 に調
節した。望ましくない酸生成を抑制するために、溶解酸
素値pO2 を攪拌速度、入口の空気制御、用量比率および
／または圧力により>10 ％に保った。
IPTG（<1ミリモル）による誘導を10のOD578 まで行わな
かった。醗酵温度は32℃であった。加えて、OD578=30よ
り上で、制限用量の酵母エキスを添加して増殖速度を制
限した。用量比率により比増殖速度を調節し、制限する
ことにより、IB生成を殆ど完全に抑制し、そして高収量
のバイオマスを得ることができる。pH値を7.0-7.2 に調
節した。望ましくない酸生成を抑制するために、溶解酸
素値pO2 を攪拌速度、入口の空気制御、用量比率および
／または圧力により>10 ％に保った。
【００１９】120-140 のOD578 を約40時間の醗酵期間後
に得た。これは45-50g乾燥重量／リットルのバイオマス
収量に相当する。ヒダントイナーゼ活性は、この場合に
は>1MU／リットルであり、これは約100U/mg の比活性で
活性な可溶性ヒダントイナーゼの>10g／リットルの発現
率に相当する。
に得た。これは45-50g乾燥重量／リットルのバイオマス
収量に相当する。ヒダントイナーゼ活性は、この場合に
は>1MU／リットルであり、これは約100U/mg の比活性で
活性な可溶性ヒダントイナーゼの>10g／リットルの発現
率に相当する。
【００２０】実施例３ 3.1 分断 湿潤バイオマス1.5kg を６リットルの低温の50ミリモル
／リットルのトリス／HCl 緩衝液pH8.5 中に懸濁させ、
そして1200バールでAPV ガウリンGmbH社からの高圧ホモ
ジナイザーで分断した。続いてその懸濁液を+4℃に冷却
し、そしてソーバル遠心分離機中で約25,000 x gで高速
で遠心分離した。
／リットルのトリス／HCl 緩衝液pH8.5 中に懸濁させ、
そして1200バールでAPV ガウリンGmbH社からの高圧ホモ
ジナイザーで分断した。続いてその懸濁液を+4℃に冷却
し、そしてソーバル遠心分離機中で約25,000 x gで高速
で遠心分離した。
【００２１】3.2 硫酸アンモニウム分別 固体硫酸アンモニウムを1.3 モル／リットルの濃度まで
粗エキスに添加し、沈殿を高速で遠心分離により廃棄し
た。上澄みを2.5 モル／リットルの濃度まで硫酸アンモ
ニウムで更に沈殿させ、そして沈殿を再度高速で遠心分
離した。
粗エキスに添加し、沈殿を高速で遠心分離により廃棄し
た。上澄みを2.5 モル／リットルの濃度まで硫酸アンモ
ニウムで更に沈殿させ、そして沈殿を再度高速で遠心分
離した。
【００２２】3.3 加熱工程 硫酸アンモニウム沈殿の沈殿を50ミリモル／リットルの
トリス／HCl 緩衝液pH8.5 で溶解し、そして10 mg/mlの
タンパク質濃度に調節した。その酵素溶液を56℃に加熱
し、この温度に30分間保った。続いてそれを+4℃に冷却
し、そして沈殿を遠心分離した。収量は35U/mgタンパク
質の比活性で約1 x 106 単位であった。
トリス／HCl 緩衝液pH8.5 で溶解し、そして10 mg/mlの
タンパク質濃度に調節した。その酵素溶液を56℃に加熱
し、この温度に30分間保った。続いてそれを+4℃に冷却
し、そして沈殿を遠心分離した。収量は35U/mgタンパク
質の比活性で約1 x 106 単位であった。
【００２３】3.4 従来技術との比較 表１は、既知のヒダントイナーゼにつきリットル当たり
で表される活性と本発明の酵素につきリットル当たりで
表される活性の比較を示す。
で表される活性と本発明の酵素につきリットル当たりで
表される活性の比較を示す。
【００２４】
【表１】Ｄ−ヒダントイナーゼ 活性（kU／リットル） ドイツ特許出願第3031151 号 0.10 （野生型） 欧州特許第0219034 号 0.56 本発明 1000
【００２５】
配列番号１の情報 (i) 配列の特徴： (A) 長さ：460 のアミノ酸 (B) 型：アミノ酸 (C) 鎖の数：一本鎖 (D) トポロジー：直鎖状 (xi)配列の記載：配列番号１：
【００２６】
【化１】
【００２７】配列番号２の情報 (i) 配列の特徴： (A) 長さ：1383の塩基対 (B) 型：核酸 (C) 鎖の数：一本鎖 (D) トポロジー：直鎖状 (xi)配列の記載：配列番号２：
【００２８】
【化２】
【００２９】配列番号３の情報 (i) 配列の特徴： (A) 長さ：31の塩基対 (B) 型：核酸 (C) 鎖の数：一本鎖 (D) トポロジー：直鎖状 (xi)配列の記載：配列番号３：
【００３０】
【化３】
【００３１】配列番号４の情報 (i) 配列の特徴： (A) 長さ：33の塩基対 (B) 型：核酸 (C) 鎖の数：一本鎖 (D) トポロジー：直鎖状 (xi)配列の記載：配列番号４：
【００３２】
【化４】
─────────────────────────────────────────────────────
【手続補正書】
【提出日】平成６年８月２６日
【手続補正２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】特許請求の範囲
【補正方法】変更
【補正内容】
【特許請求の範囲】
【請求項４】 ラセミヒダントインを50〜80℃の温度で
請求項１に記載のＤ−ヒダントイナーゼとともにインキ
ュベートし、そして生成するＤ−Ｎ−カルバモイル−α
−アミノ酸を反応混合物から単離し、所望により精製す
るＤ−Ｎ−カルバモイル−α−アミノ酸およびＬ−Ｎ−
カルバモイル−α−アミノ酸へのラセミヒダントインの
開裂方法。 ─────────────────────────────────────────────────────
請求項１に記載のＤ−ヒダントイナーゼとともにインキ
ュベートし、そして生成するＤ−Ｎ−カルバモイル−α
−アミノ酸を反応混合物から単離し、所望により精製す
るＤ−Ｎ−カルバモイル−α−アミノ酸およびＬ−Ｎ−
カルバモイル−α−アミノ酸へのラセミヒダントインの
開裂方法。 ─────────────────────────────────────────────────────
【手続補正書】
【提出日】平成７年１月１２日
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】図面の簡単な説明
【補正方法】追加
【補正内容】
【図面の簡単な説明】
【図１】Ｄ−ヒダントイナーゼ遺伝子を含むプラスミド
ｐＤ８の構築図を示す。
ｐＤ８の構築図を示す。
フロントページの続き (51)Int.Cl.6 識別記号 庁内整理番号 ＦＩ 技術表示箇所 //(Ｃ１２Ｎ 9/78 Ｃ１２Ｒ 1:19） (Ｃ１２Ｎ 9/78 Ｃ１２Ｒ 1:865） (Ｃ１２Ｎ 1/19 Ｃ１２Ｒ 1:865） (Ｃ１２Ｎ 1/21 Ｃ１２Ｒ 1:19） (72)発明者 フリードリッヒ ポップ ドイツ連邦共和国 82404 シンデルスド ルフ イルムフリードヴェーク ２
Claims (8)
- 【請求項１】 配列番号１のアミノ酸配列で特徴付けら
れるＤ−ヒダントイナーゼ活性を有する組換えタンパク
質。 - 【請求項２】a)配列番号２に示されたDNA 配列またはそ
の相補的DNA 配列、 b)遺伝暗号の縮重のために、配列番号１に記載のタンパ
ク質（これはまたa)で特定された配列の一つによりコー
ドされる）をコードするDNA 配列からなる群から選ばれ
たＤ−ヒダントイナーゼ活性を有するタンパク質をコー
ドするDNA 。 - 【請求項３】 配列番号２のDNA 配列。
- 【請求項４】 宿主細胞が請求項２または３に記載のDN
A 配列によりコードされたタンパク質を発現するように
請求項２または３に記載のDNA 配列で形質転換されてい
る原核宿主細胞または真核宿主細胞。 - 【請求項５】 大腸菌細胞またはサッカロミセス細胞で
ある請求項４に記載の宿主細胞。 - 【請求項６】 請求項２または３に記載の配列を含むDN
A ベクター。 - 【請求項７】 好適な宿主細胞を好適な発現系中で請求
項２または３に記載のDNA で形質転換し、形質転換宿主
細胞を培養し、そして生成するＤ−ヒダントイナーゼを
細胞または細胞上澄みから単離することによる組換えＤ
−ヒダントイナーゼの生産方法。 - 【請求項８】 ラセミヒダントインを50〜80℃の温度で
請求項１に記載のＤ−ヒダントイナーゼとともにインキ
ュベートし、そして生成するＤ−Ｎ−カルバモイル−α
−アミノ酸を反応混合物から単離し、所望により精製す
るＤ−Ｎ−カルバモイル−α−アミノ酸およびＬ−Ｎ−
カルバモイル−α−アミノ酸へのラセミヒダントインの
開裂方法。
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| DE4328829A DE4328829A1 (de) | 1993-08-27 | 1993-08-27 | Rekombinante D-Hydantoinase, Verfahren zur Herstellung und Verwendung |
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| JP2546979B2 JP2546979B2 (ja) | 1996-10-23 |
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1996
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