JPH07163395A - α‐アミラーゼアイソザイム活性の分別定量法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 【構成】 インヒビター法によりα‐アミラーゼアイソ
ザイム活性を分別定量する方法において、阻害剤として
式 【化１】 で表わされる６³‐デオキシマルトトリオース（ＤＯＧ
３）を用いる分別定量法である。 【効果】 該ＤＯＧ３は２種のα‐アミラーゼアイソザ
イムに対する阻害定数の差がきわめて大であるので、効
率よく、簡単な操作で、しかも精度よくα‐アミラーゼ
アイソザイム活性を分別定量することができる。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【産業上の利用分野】本発明は、α‐アミラーゼアイソ
ザイム活性の新規な分別定量法、さらに詳しくいえば、
新規な阻害剤を用いるインヒビター法により、試料中の
α‐アミラーゼアイソザイム活性を簡単な操作で、精度
よく分別定量する方法に関するものである。

【０００２】

【従来の技術】ヒトα‐アミラーゼには膵臓由来のもの
（以下Ｐ型α‐アミラーゼという）と唾液腺由来のもの
（以下Ｓ型α‐アミラーゼという）の少なくとも２種の
アイソザイムが存在することが知られている。

【０００３】ところで、血清中の総α‐アミラーゼ活性
が高値になると、急性膵炎の初期あるいは慢性膵炎の急
性化の疑いを生じるが、この場合はＰ型α‐アミラーゼ
活性の上昇が総α‐アミラーゼ活性の上昇の主因となっ
ている。しかし、唾液腺や耳下腺の疾病、外科手術後、
ある種の肝疾患などではＳ型α‐アミラーゼ活性の上昇
が主因となって顕著な総α‐アミラーゼ活性の上昇がみ
られるため、しばしば鑑別診断を誤らせる原因となって
いる。したがって、近年両アイソザイムの簡便、正確な
分別定量法が強く要望されている。

【０００４】従来、ヒトα‐アミラーゼアイソザイム活
性の分別定量法としては、例えば（１）電気泳動法、
（２）ゲルろ過法、（３）エンザイム・イムノ・アッセ
イ法（ＥＩＡ法）、（４）小麦インヒビターなどの阻害
剤を用いるインヒビター法などが知られている。しかし
ながら、これらの方法のうち、（１）〜（３）の方法に
ついてはいずれも測定操作が煩雑で、しかも測定に長時
間を要するという欠点がある。

【０００５】一方（４）の阻害剤として小麦インヒビタ
ーを用いるインヒビター法は、該小麦インヒビターがＰ
型α‐アミラーゼよりもＳ型α‐アミラーゼをより強く
阻害すること、すなわち阻害定数が異なることを利用し
て両者の活性を測定するものであるが、操作が比較的簡
便なため、最近多く使用されるようになってきている。

【０００６】しかしながら、この小麦インヒビターはタ
ンパク質であるため安定性が悪く、α‐アミラーゼアイ
ソザイム活性測定用試薬のキットとして組込んだ場合の
長期保存が困難であるし、また小麦インヒビターの精製
度合いによりα‐アミラーゼアイソザイムに対する阻害
定数が異なるため、その都度阻害定数を測定する必要が
あるなどの欠点を有している。

【０００７】

【発明が解決しようとする課題】本発明は、このような
従来のインヒビター法が有する欠点を克服し、α‐アミ
ラーゼアイソザイム活性を効率よく、簡単な操作で、し
かも高い精度で測定しうる方法を提供することを目的と
してなされたものである。

【０００８】

【課題を解決するための手段】本発明者らは前記目的を
達成するために種々研究を重ねた結果、６³-デオキシマ
ルトトリオースのＰ型α‐アミラーゼとＳ型α‐アミラ
ーゼに対する各阻害定数の間に極めて大きな差があるこ
と、そしてα‐アミラーゼアイソザイムをインヒビター
法で分別定量する際に、阻害剤として該物質を用いるこ
とにより、その目的を達成しうることを見出し、この知
見に基づいて本発明を完成するに至った。

【０００９】すなわち、本発明は、α‐アミラーゼ活性
測定用基質と試料とを反応させて得られるα‐アミラー
ゼ活性の測定値と、前記と同一の基質と試料とを２種の
α‐アミラーゼアイソザイムに対する阻害定数が異なる
阻害剤の存在下で反応させて得られるα‐アミラーゼ活
性の測定値とからα‐アミラーゼアイソザイム活性を分
別定量する方法、いわゆるインヒビター法において、阻
害剤として、式

【化２】 で表わされる６³‐デオキシマルトトリオース［Ｏ‐６
‐デオキシ‐α‐Ｄ‐グルコピラノシル‐（１→４）‐
Ｏ‐α‐Ｄ‐グルコピラノシル‐（１→４）‐Ｄ‐グル
コース］を用いることを特徴とするα‐アミラーゼアイ
ソザイム活性の分別定量法を提供するものである。

【００１０】以下、本発明について詳細に説明する。ま
ず、本発明方法において用いられるα‐アミラーゼ活性
測定用基質としては、α‐アミラーゼ活性を測定しうる
基質であればどのようなものでもよいが、例えば、一般
式

【化３】 （式中のＲは水素原子、芳香族発色性基又はグルコース
以外の糖残基、Ｒ¹とＲ²はそれぞれ水酸基、アジド基、
ハロゲン原子、アシルオキシ基、アルキル若しくはアリ
ールオキシ基、アルキル若しくはアリールスルホニル
基、アルキル若しくはアリールメルカプト基、Ｎ‐アル
キル若しくはＮ‐アリールカルバモイルオキシ基、アル
キルオキシ若しくはアリールオキシメトキシ基であり、
それらは同一であってもたがいに異なっていてもよい
し、Ｒ¹とＲ²とで置換又は非置換のメチレンジオキシ基
を形成してもよく、ｎは１〜６の整数である）で表わさ
れるマルトオリゴ糖誘導体などを挙げることができる。

【００１１】これらの物質の中で、基質に対するＰ型α
‐アミラーゼとＳ型α‐アミラーゼとの反応速度比が
０．６以上、特に約１のものが、簡便性、正確性の点で
有利である。

【００１２】また、本発明方法において、阻害剤として
用いられる前記式（Ｉ）で表わされる６³‐デオキシマ
ルトトリオースは、α‐アミラーゼにより実質的に加水
分解されず、かつα‐アミラーゼ活性測定時に必要によ
り存在させる共役酵素によっても加水分解されることな
く、後述のように、特にＰ型α‐アミラーゼを特異的に
阻害し、Ｐ型α‐アミラーゼとＳ型α‐アミラーゼとの
阻害定数の差は極めて大きい。さらに、該物質は、小麦
インヒビターなどのタンパク質とは異なって、極めて安
定であり、α‐アミラーゼアイソザイム活性測定用試薬
のキットとして組込んだ場合、長期間保存することがで
き、有効に用いることができる。

【００１３】次に、試料中のα‐アミラーゼアイソザイ
ム活性を分別定量する方法を具体的に説明する。まず、
活性既知のＰ型α‐アミラーゼ標品及びＳ型α‐アミラ
ーゼ標品を用い、使用するα‐アミラーゼ活性測定用基
質に対するそれぞれの反応速度定数（ｋ _P、ｋ_S）を常法
により求める（後記実施例参照）。また、ここで使用し
たものと同一のα‐アミラーゼ活性測定用基質に、阻害
剤として用いる６³-デオキシマルトトリオースを種々の
濃度で加え、前記標品Ｐ型α‐アミラーゼとＳ型α‐ア
ミラーゼに対する阻害定数の差が最大となる６³-デオキ
シマルトトリオースの濃度を決定し、この濃度でのＰ型
α‐アミラーゼ及びＳ型α‐アミラーゼに対するそれぞ
れの阻害定数（ａ、ｂ）を常法により求める（後記実施
例参照）。

【００１４】次に、α‐アミラーゼ活性を測定する試料
に、前記α‐アミラーゼ活性測定用基質を加え、常法に
より、共役酵素を加えるか又は加えないで反応させ、吸
光度変化量（Ｔ）を測定する。

【００１５】続いて、先に決定した濃度で６³‐デオキ
シマルトトリオースを加える以外は前記と同様にして吸
光度変化量（Ｗ）を測定する。

【００１６】ここで、試料中のＰ型α‐アミラーゼ活性
値をＰ、Ｓ型α‐アミラーゼ活性値をＳとすると、次の
関係が成り立つ。 ｋ_PＰ＋ｋ_SＳ＝Ｔ （１） （１−ａ）ｋ_PＰ＋（１−ｂ）ｋ_SＳ＝Ｗ （２） そして、これらの式から、次の式が得られる。 Ｐ＝［（１−ｂ）Ｔ−Ｗ］／［ｋ_P（ａ−ｂ）］ （３） Ｓ＝（Ｔ−ｋ_PＰ）／ｋ_S （４）

【００１７】すなわち、ｋ_P、ｋ_S、ａ及びｂをあらかじ
め測定しておけば、α‐アミラーゼ活性測定用基質及び
同一の基質と６³-デオキシマルトトリオースとを用い、
試料と酵素反応を行わせて測定した吸光度変化量（Ｔ、
Ｗ）を前記式（３）及び（４）に代入するだけで、試料
中の２種のアイソザイム活性の分別定量を簡単に行うこ
とができる。

【００１８】本発明方法で用いる前記式（Ｉ）で表わさ
れる６³-デオキシマルトトリオースはα‐アノマー、β
‐アノマーのいずれでもよい。

【００１９】また、α‐アミラーゼ活性測定用基質とし
て用いられる前記一般式（ＩＩ）で表わされるマルトオ
リゴ糖誘導体も、α‐アノマー、β‐アノマーのいずれ
でもよい。そして、このマルトオリゴ糖部については、
例えばＤ−マルトトリオースから、マルトオクタオース
までのものすべてが使用できるが、特にマルトペンタオ
ース、マルトへキサオース、マルトへプタオースが好ま
しい。

【００２０】前記一般式（ＩＩ）で表わされるＲは、水
素原子、芳香族発色性基又はグルコースを除く単糖類の
残基であるが、特に芳香族発色性基が好ましい。

【００２１】この芳香族発色性基としては分光学的に検
出できればどのようなものを用いてもよいが、例えば次
のものが挙げられる。

【化４】 （式中のＲ³〜Ｒ⁷はそれぞれ水素原子、ハロゲン原子、
ニトロ基、アルキル基、アリール基、アリル基、アミノ
基、スルホン酸基又はカルボキシル基であり、それらは
たがいに同一であってもよいし、異なっていてもよく、
またＲ³とＲ⁴又はＲ⁴とＲ⁵が結合して、縮合芳香環を形
成してもよい）

【化５】 （式中のＲ⁸は水素原子又はアルキル基である）

【化６】 （式中のＲ⁹は水素原子又はアルキル基である）

【化７】 （式中のＲ¹⁰〜Ｒ¹⁷はそれぞれ水素原子、ハロゲン原
子、ニトロ基、アルキル基、アリール基、アリル基、ア
ミノ基、スルホン酸基又はカルボキシル基であり、それ
らはたがいに同一であってもよいし、異なっていてもよ
く、またＲ¹⁰とＲ¹¹又はＲ¹²とＲ¹³が結合して、縮合芳
香環を形成してもよく、さらにＲ¹¹とＲ¹²及び／又はＲ
¹⁵とＲ¹⁶が共通の酸素原子となって縮合エーテル環を形
成してもよく、Ｚは窒素原子又はＮ→Ｏである）

【００２２】また、グルコースを除く単糖類としては広
義の単糖類あるいはその誘導体でもよく、例えばフルク
トース、イノシトール、グルシトール、ソルビトール、
グルコース‐６‐リン酸などが挙げられる。

【００２３】このような前記一般式（ＩＩ）で表わされ
る化合物の代表例としては、マルトペンタオース、マル
トヘプタオース、２‐クロロ‐４‐ニトロフェニル＝β
‐Ｄ‐マルトペンタオシド、２‐クロロ‐４‐ニトロフ
ェニル＝４⁵，６⁵‐ジ‐Ｏ‐（Ｎ‐エチル）カルバモイ
ル‐β‐Ｄ‐マルトペンタオシド、２‐クロロ‐４‐ニ
トロフェニル＝４⁵，６⁵‐ジ‐Ｏ‐メトキシメチル‐β
‐Ｄ‐マルトペンタオシド、２‐クロロ‐４‐ニトロフ
ェニル＝６⁵‐アジド‐６⁵‐デオキシ‐β‐Ｄ‐マルト
ペンタオシド、２‐クロロ‐４‐ニトロフェニル＝６⁷
‐クロロ‐β‐デオキシ‐Ｄ‐マルトヘプタオシド、２
‐クロロ‐４‐ニトロフェニル＝α‐Ｄ‐マルトトリオ
シド、４‐ニトロフェニル＝６⁵‐Ｏ‐ベンジル‐α‐
Ｄ‐マルトペンタオシド、２‐クロロ‐４‐ニトロフェ
ニル＝４⁵，６⁵‐Ｏ‐ベンジリデン‐β‐Ｄ‐マルトペ
ンタオシド、フェノールインド‐３′‐クロロフェニル
＝６⁵‐Ｏ‐トルエンスルホニル‐β‐Ｄ‐マルトペン
タオシド、６⁵‐クロロ‐６ ⁵‐デオキシ‐Ｄ‐マルトペ
ンタオース、１‐（４⁶‐Ｏ‐，６⁶‐Ｏ‐ジメタンスル
ホニル‐α‐マルトヘキサオシル）‐α‐Ｄ‐グルシト
ールなどが挙げられる。

【００２４】なお、前記及び後記において、記号６⁵、
６⁷、６^m、４⁵などは、それぞれマルトオリゴ糖誘導体
を構成するグルコース単位の還元末端から５番目、７番
目、ｍ番目のグルコースの６位、４位の水酸基が置換さ
れていることを示す。

【００２５】次に、前記式（Ｉ）で表わされる６³‐デ
オキシマルトトリオースは既知の物質であり［カルボハ
イドレート・リサーチ（Ｃａｒｂｏｈｙｄｒａｔｅ Ｒ
ｅｓｅａｒｃｈ）、第５１巻、第７３〜８４ページ（１
９７６年）］、どのような方法を用いて製造してもよい
が、例えば「カルボハイドレート・リサーチ（Ｃａｒｂ
ｏｈｙｄｒ．Ｒｅｓ．）」、第２３８巻、第１９３〜２
１３ページ（１９９３年）などの方法を用いて、β‐シ
クロデキストリンをモノトシル化したのち、水素化ホウ
素ナトリウムで、モノ‐６‐デオキシ‐β‐シクロデキ
ストリンとし、これにシクロデキストリナーゼ（特開平
３−１５３８４号公報参照）を作用させると同時に、又
は作用させたのちに、エキソ型糖化酵素例えばグルコア
ミラーゼ、α‐グルコシダーゼなどを作用させ、さらに
通常用いられる方法で精製することにより、目的の６³
‐デオキシマルトトリオースを製造することができる。
さらに、前記一般式（ＩＩ）で表わされるマルトオリゴ
糖誘導体は市販品をそのまま用いてもよいし、一般的な
製造方法を組み合わせて得られるものを用いてもよい。

【００２６】本発明方法においては、試料中のα‐アミ
ラーゼアイソザイム活性を定量するに際し、前記一般式
（ＩＩ）で表わされるマルトオリゴ糖誘導体をα‐アミ
ラーゼ活性測定用基質とし、α‐アミラーゼ阻害剤とし
て前記式（Ｉ）で表わされる６³‐デオキシマルトトリ
オースを加えないときと、加えたときとのそれぞれのα
‐アミラーゼ活性を測定するが、この場合、通常共役酵
素の存在下でα‐アミラーゼと基質とを作用させる。こ
の際の基質と共役酵素との関係については特に制限はな
く、常法に従えばよい。しかしながら、用いる基質によ
っては下記に示すように共役酵素を用いる必要はない。

【００２７】例えば、基質としての前記一般式（ＩＩ）
で表わされるマルトオリゴ糖誘導体と共役酵素との組合
せなどについていえば、次のとおりである。 （１）ｎが１であり、かつ、ＯＲがα‐アノマーの場合 共役酵素は不必要である。 （２）ｎが２以上で、かつ、Ｒが水素原子である化合物
（α‐アノマー及び／又はβ‐アノマー）の場合 α‐グルコシダーゼ及び／又はグルコアミラーゼを用い
る。 （３）Ｒが芳香族発色性基又はグルコース以外の単糖類
の残基である化合物の場合 α‐アノマーのみの場合 α‐グルコシダーゼ及び／又はグルコアミラーゼを用い
る。 β‐アノマーのみあるいはα‐アノマーとβ‐アノマ
ーの混合物の場合 α‐グルコシダーゼ及び／又はグルコアミラーゼに加え
てさらにβ‐グルコシダーゼを用いる。

【００２８】なお、前記一般式（ＩＩ）で表わされるマ
ルトオリゴ糖誘導体の内、非還元末端が非修飾のＲ¹及
びＲ²が水酸基である化合物を基質として用いる場合
は、共役酵素としてグルコアミラーゼを用いないことな
ども通常どおりである。

【００２９】ここで使用するα‐グルコシダーゼは動
物、植物、微生物などいずれの由来のものを用いてもよ
いが、例えば酵母由来のものを用いるのが好ましい。ま
た、グルコアミラーゼもいかなる起源のものを用いても
よいが、例えばリゾプス属（Ｒｈｉｚｏｐｕｓ ｓ
ｐ．）などに由来するものが好ましい。さらにまた、β
‐グルコシダーゼもいかなる起源のものを用いてもよ
く、例えばアーモンドの種子から得られたものが用いら
れる。

【００３０】次に、α‐アミラーゼアイソザイム活性の
分別定量のための有利な系としては、前記一般式（Ｉ
Ｉ）で表わされるマルトオリゴ糖誘導体を基質として含
む系において、該基質０．１〜１０ｍＭ及び緩衝液２〜
３００ｍＭを含有し、かつ、共役酵素が必要な場合に
は、前記の基質と共役酵素との組合せを考慮し、α‐グ
ルコシダーゼ及び／又はグルコアミラーゼを用いるとき
はそれぞれ５〜１０００ｕ（単位）／ｍｌ、さらにβ‐
グルコシダーゼを用いるときは０．５〜３０ｕ／ｍｌを
含有するｐＨ４〜１０の系が挙げられる。

【００３１】また、阻害剤として添加される前記式
（Ｉ）で表わされる６³‐デオキシマルトトリオースの
系における濃度は、Ｐ型α‐アミラーゼとＳ型α‐アミ
ラーゼに対する阻害定数の差が最大となる濃度を採用す
るが、通常０．０１〜１０ｍＭ、好ましくは０．０５〜
５ｍＭ濃度である。

【００３２】用いられる緩衝剤としては、例えばリン酸
塩、酢酸塩、炭酸塩、グッズ（Ｇｏｏｄ’ｓ）の緩衝
液、ホウ酸塩、クエン酸塩、ジメチルグルタル酸塩など
が挙げられる。

【００３３】このような系に前記成分以外に本発明の目
的をそこなわない範囲で、さらに必要に応じて慣用の種
々の添加成分を加えることができる。例えば、溶解補助
剤、安定化剤として、グリセリン、牛血清アルブミン、
α‐又はβ‐シクロデキストリン、トリトンＸ‐１００
などを加えることができるし、ヒトα‐アミラーゼ活性
化剤として、ＮａＣｌ、ＭｇＣｌ₂、ＭｇＳＯ₄、ＣａＣ
ｌ₂、ＣａＣｌ₂・Ｈ₂Ｏなどの形でＣｌ^-イオン、Ｃａ²⁺
イオン、Ｍｇ²⁺イオンなどを加えることもできる。これ
らの添加成分は１種用いてもよいし、２種以上組み合わ
せて用いてもよい。これらは前記系調製の適当な段階で
加えることができる。

【００３４】また前記一般式（ＩＩ）で表わされるマル
トオリゴ糖誘導体において、Ｒが水素原子若しくは単糖
類の残基である基質を用いる場合、酵素反応によって生
成するグルコース、マルトース、あるいはその他の単糖
類を吸光度法によって定量するときは、ＮＡＤ（Ｐ）→
ＮＡＤ（Ｐ）Ｈ又はＮＡＤ（Ｐ）Ｈ→ＮＡＤ（Ｐ）の酸
化−還元反応に伴う吸光度変化測定系に通常用いられる
酵素類、すなわち、グルコース‐６‐リン酸デヒドロゲ
ナーゼ（例えばＬｅｕｃｏｎｏｓｔｏｃ ｍｅｓｅｎｔ
ｅｒｏｉｄｅｓなどに由来するもの）、マルトースホス
ホリラーゼ（例えばＬａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｂｒ
ｅｖｉｓなどに由来するもの）、ヘキソキナーゼ（例え
ば酵母などに由来するもの）、β‐ホスホムターゼ［例
えば兎筋肉（ｒａｂｂｉｔ ｍｕｓｃｌｅ）などに由来
するもの］、ソルビトールデヒドロゲナーゼ［例えば羊
肝（ｓｈｅｅｐ ｌｉｖｅｒ）に由来するもの］及びＮ
ＡＤ（Ｐ）［又はＮＡＤ（Ｐ）Ｈ］、ＡＴＰなどを加え
ればよい。

【００３５】なお、Ｒが芳香族発色性基である基質を用
いる場合には、α‐アミラーゼ反応に係わる共役酵素系
以外に、前記のように吸光系に係わる酵素などを必要と
しないで吸光度法を適用できるため、より好ましい。

【００３６】次に、本発明方法の好適な実施態様につい
て説明する。まず、前記一般式（ＩＩ）で表わされるマ
ルトオリゴ糖誘導体を基質とし、活性既知のＰ型α‐ア
ミラーゼ標品及びＳ型α‐アミラーゼ標品を用いて、常
法によりこれらに対する反応速度定数（ｋ_P、ｋ_S）を求
める。

【００３７】また、活性既知のＰ型α‐アミラーゼ標品
及びＳ型α‐アミラーゼ標品を用い、常法により、前記
と同一の基質に阻害剤の前記式（Ｉ）で表わされる６³
‐デオキシマルトトリオースを種々の濃度で加え、Ｐ型
α‐アミラーゼ及びＳ型α‐アミラーゼに対する阻害定
数の差が最大となる濃度を決定し、該濃度でのＰ型α‐
アミラーゼ及びＳ型α‐アミラーゼに対するそれぞれの
阻害定数（ａ、ｂ）を求める。

【００３８】次に、分別定量法としては、２チャンネル
法（２回測定法）及びダブルカイネティック法（１回
法、同時２項目分析法）とがあるが、まず、前者につい
て述べる。

【００３９】α‐アミラーゼ活性を有する試料に、必要
により共役酵素としてのα‐グルコシダーゼ又はグルコ
アミラーゼあるいはその両方をそれぞれ５〜１０００ｕ
／ｍｌ、好ましくは１０〜５００ｕ／ｍｌ加え、基質が
β‐アノマーを含むときは、さらにβ‐グルコシダーゼ
を０．５〜３０ｕ／ｍｌ、好ましくは１〜１５ｕ／ｍｌ
加え、これと同時又はこれらのあとに前記基質を０．１
〜１０ｍＭ、好ましくは０．３〜５ｍＭの濃度となるよ
うに緩衝剤と共に添加したのち、温度２５〜４５℃、好
ましくは３５〜４０℃、ｐＨ４〜１０、好ましくは６．
５〜７．５の条件下で少なくとも１分間、好ましくは２
〜１０分間反応させ、生成した発色性芳香族化合物を、
常法に従い、そのままあるいは、必要に応じｐＨを調整
したのち、適当な吸収波長で連続的に又は断続的に吸光
度変化量（Ｔ）を測定する。また、前記阻害剤を、測定
系におけるＰ型α‐アミラーゼ及びＳ型α‐アミラーゼ
に対する阻害定数の差が最大となる濃度で、前記と同一
の基質に加える以外は、前記と同様にして吸光度変化量
（Ｗ）を測定する。

【００４０】次に、後者について述べると、まず、前記
と同様にして吸光度変化量（Ｔ′）を測定し、次いで、
この測定系に、さらに前記阻害剤を前記と同様に阻害定
数の差が最大となる濃度で加えて吸光度変化量（Ｗ）を
測定する。このときのＴは Ｔ＝Ｔ′×（Ｔ′測定時の総液量／Ｗ測定時の総液量） で求められる。なお、前記阻害剤は、前記のように基質
に加えて用いたり、測定系に直接加えて用いる他、必要
により使用する共役酵素に加えて用いることもできる。

【００４１】また、前記一般式（ＩＩ）で表わされる化
合物のＲが水素原子又は単糖類の残基である場合は、吸
光系に係わる酵素及びその他必要な成分を適宜添加し、
Ｒが芳香族発色性基である場合と同様にして行うことが
できる。

【００４２】このようにして得たｋ_P、ｋ_S、ａ、ｂ、Ｔ
及びＷの値を前記式（３）及び（４）に代入することに
より、試料中のＰ型α‐アミラーゼ活性（Ｐ）及びＳ型
α‐アミラーゼ活性（Ｓ）を求めることができる。

【００４３】

【発明の効果】本発明方法において用いる阻害剤として
の前記式（Ｉ）で表わされる６³‐デオキシマルトトリ
オースは２種のα‐アミラーゼアイソザイムに対する阻
害定数の差が極めて大きいので、効率よく、簡単な操作
で、しかも従来法に比べ精度よくヒトα‐アミラーゼ中
のアイソザイム活性の分別定量を行いうるという利点が
ある。したがって、本発明方法は、Ｐ型α‐アミラーゼ
及びＳ型α‐アミラーゼ活性を別々に定量することが要
求される疾患の診断用定量法として好適である。

【００４４】

【実施例】次に、実施例により本発明をさらに詳細に説
明する。なお、各例において、Ｎ３Ｇ５‐ＣＮＰは２‐
クロロ‐４‐ニトロフェニル＝６⁵‐アジド‐６⁵‐デオ
キシ‐β‐Ｄ‐マルトペンタオシドを、ＤＯＧ３は６³
‐デオキシマルトトリオースを、Ｇ５‐ＣＮＰは２‐ク
ロロ‐４‐ニトロフェニル＝β‐Ｄ‐マルトペンタオシ
ドを意味する。また、吸収極大波長は特に示されていな
い限り、メタノール中で測定した値であり、比旋光度は
２５℃においてＤ線で測定した値である。

【００４５】参考例１ Ｎ３Ｇ５‐ＣＮＰの製造 （１）６‐Ｏ‐トシル‐β‐シクロデキストリンの製造 市販のβ‐シクロデキストリン［和光純薬工業（株）
製］５０．０ｇ（４４．１ｍｍｏｌ）をピリジン５００
ｍｌに溶解し、トシルクロリド３３．３ｇ（１７５ｍｍ
ｏｌ）を加え、室温下で４時間、かきまぜながら反応さ
せた。次いで、この反応液に水２５０ｍｌ及びｎ‐ブタ
ノール１リットルを加え、混合液を減圧下で１／２量ま
で濃縮し、濃縮液をアセトン５００ｍｌ中へかきまぜな
がら投入して固形物を析出させた。次に、この析出物を
グラスフィルタでろ別し、アセトン２００ｍｌで２回洗
浄したのち、ろ取物をＯＤＳカラムクロマトグラフィに
より精製し、エタノール‐水混液（容量比１：９）で溶
出した目的画分を濃縮し、水から再結晶すると、６‐Ｏ
‐トシル‐β‐シクロデキストリンが２５．３ｇ（１
９．６ｍｍｏｌ，収率４４．４％）得られた。

【００４６】融点（℃）：１７２．０〜１７４．０（分
解） 赤外吸収スペクトル（ｃｍ^-1）：３４００，２９３０，
１６４２，１６３２，１６００，１４２４，１３６０，
１３００，１１７８，１１５６，１０７８，１０２８ 核磁気共鳴スペクトル（２００ＭＨｚ）ｐｐｍ（ＤＭＳ
Ｏ‐ｄ₆）：２．４４（３Ｈ，ｓ），３．１５〜４．４
５（ｍ）．４．７６（２Ｈ，ｂｒ．ｓ），４．８５（５
Ｈ，ｂｒ．ｓ），７．４４（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝８．８Ｈ
ｚ），７．７５（１Ｈ．ｄ，Ｊ＝８．８Ｈｚ）

【００４７】（２）６‐アジド‐６‐デオキシ‐β‐シ
クロデキストリンの製造 前記（１）で得た６‐Ｏ‐トシル‐β‐シクロデキスト
リン１６．９ｇ（１３．１ｍｍｏｌ）を水５００ｍｌ及
び１，４‐ジオキサン２５０ｍｌの混液に溶解し、アジ
化ナトリウム３４．１ｇ（５２５ｍｍｏｌ）を加え、８
５℃で４時間反応させた。次いで、反応液を減圧下で１
／２量まで濃縮し、得られた濃縮液をＯＤＳカラムクロ
マトグラフィにより精製し、エタノール‐水混液（容量
比１：９）で溶出した目的画分を濃縮し、水から再結晶
すると、６‐アジド‐６‐デオキシ‐β‐シクロデキス
トリンが１４．３ｇ（１２．３ｍｍｏｌ，収率９３．９
％）得られた。

【００４８】融点（℃）：２１５．０〜２１８．０（分
解） 赤外吸収スペクトル（ｃｍ^-1）：３３９０，２９２０，
２１２０，１６４２，１４１４，１３７０，１３４０，
１３０４，１１５６，１０８０，１０３０ 高速液体クロマトグラフィ［東ソー（株）製ＴＳＫｇｅ
ｌ Ａｍｉｄｅ‐８０カラム（４．６ｍｍＩＤ×２５０
ｍｍ），ＲＩ検出，溶離液：アセトニトリル／水＝３：
２（ｖ／ｖ），流速：１．０ｍｌ／ｍｉｎ］：ｔ_R ＝
６．６ｍｉｎ 比旋光度［α］：（ｃ ０．５１０，１，４‐ジオキサ
ン／Ｈ₂Ｏ＝１：１（ｖ／ｖ）；＋１４５° 元素分析値：Ｃ₄₂Ｈ₆₉Ｎ₃Ｏ₃₄として Ｃ Ｈ Ｎ 理論値（％） ４３．４９ ６．００ ３．６２ 実測値（％） ４３．２８ ６．１１ ３．５３

【００４９】（３）６⁵‐アジド‐６⁵‐デオキシ‐Ｄ‐
マルトペンタオースの製造 前記（２）と同様にして得た６‐アジド‐６‐デオキシ
‐β‐シクロデキストリン２５ｇ（２１．６ｍｍｏｌ）
を、あらかじめ４０℃に加温しておいた１０ｍＭリン酸
緩衝液（ｐＨ７．８）１．０リットル中にかきまぜなが
ら投入し、完全に溶解した。後記の方法で得られたシク
ロデキストリナーゼ４９０単位を加え、４０℃で２時間
かきまぜながら反応を行った。反応終了後、反応液を８
０℃で１０分間かきまぜながら加熱した。続いて、反応
液を室温まで冷却し、ラジオライト（＃１００）、さら
にメンブランフィルタ（０．４５μｍ）でろ過を行った
のち、１１５ｍｌまで減圧下で濃縮した。得られた濃縮
液をＯＤＳカラムクロマトグラフィにより精製し、エタ
ノール‐水混液［０％（ｖ／ｖ）→３５％（ｖ／ｖ）グ
ラジェント］で溶出したのち、濃縮乾固して６^m‐アジ
ド化マルトヘプタオース（ｍ＝１〜７）を１１．６ｇ
（９．８６ｍｍｏｌ，収率４５．６％）得た。

【００５０】次いで、これを２０ｍＭ酢酸緩衝液（ｐＨ
４．５）２５０ｍｌ中にかきまぜながら溶解し、そこへ
グルコアミラーゼ８ｍｇ［２５０ｕ、生化学工業（株）
製］を加え、４０℃で４時間かきまぜながら反応を行っ
た。反応終了後、反応液を９０℃で２０分間かきまぜな
がら加熱した。続いて、反応液を室温まで冷却し、メン
ブランフィルタ（０．４５μｍ）でろ過を行ったのち、
５５ｍｌまで減圧下で濃縮した。得られた濃縮液を活性
炭カラムクロマトグラフィにより精製し、さらにエタノ
ール‐水混液（５％→４５％グラジェント）で溶出し、
約３０％エタノールの溶出画分を凍結乾燥して６⁵‐ア
ジド‐６⁵‐デオキシ‐Ｄ‐マルトペンタオース１．７
９ｇ（２．１０ｍｍｏｌ，収率２１．３％）を得た。

【００５１】融点（℃）：１７６．０〜１７９．０ 赤外吸収スペクトル（ｃｍ^-1）：３４００，２９２０，
２１１０，１６２８，１４０６，１３６０，１２７８，
１２４０，１１４４，１０７６，１０２２ 核磁気共鳴スペクトル（２００ＭＨｚ）ｐｐｍ（Ｄ
₂Ｏ）：２．８０〜４．００（ｍ），４．６４（０．５
Ｈ，ｄ，Ｊ＝８．０Ｈｚ），５．２３（０．５Ｈ，ｄ，
Ｊ＝３．５Ｈｚ），５．３５（４Ｈ，ｄ，Ｊ＝３．５Ｈ
ｚ） 高速液体クロマトグラフィ［東ソー（株）製ＴＳＫｇｅ
ｌ Ａｍｉｄｅ‐８０カラム（４．６ｍｍＩＤ×２５０
ｍｍ），ＲＩ検出，溶離液：アセトニトリル／水＝３：
２（ｖ／ｖ），流速：１．０ｍｌ／ｍｉｎ］：ｔ_R ＝
６．９ｍｉｎ 比旋光度［α］：（ｃ ０．５４４，Ｈ₂Ｏ）；＋１６
９° 元素分析値：Ｃ₃₀Ｈ₅₁Ｎ₃Ｏ₂₅として Ｃ Ｈ Ｎ 理論値（％） ４２．２１ ６．０２ ４．９２ 実測値（％） ４２．０３ ６．１３ ４．６９

【００５２】（４）Ｎ３Ｇ５‐ＣＮＰの製造 前記（３）と同様にして得た６⁵‐アジド‐６⁵‐デオキ
シマルトペンタオース５．０ｇ（５．８６ｍｍｏｌ）を
ピリジン１００ｍｌに溶解し、無水酢酸５０ｍｌ（５２
９ｍｍｏｌ）を加え、室温で２日間反応させた。次いで
反応液のピリジン、無水酢酸、酢酸を留去したのち、精
製することなく、この残さをジクロロメタン３０ｍｌに
溶解し、三臭化リン５５６μｌ（５．８６ｍｍｏｌ）及
び水２１１μｌ（１１．７ｍｍｏｌ）を加え、室温で２
０時間かきまぜながら反応させた。続いて、反応液に無
水炭酸カリウム１８．６ｇ（１３５ｍｍｏｌ）を加え、
室温で１５分間かきまぜながら反応させた。不溶物をグ
ラスフィルタでろ別し、これをジクロロメタン２００ｍ
ｌで３回洗った。ろ液と洗液を合わせ、これに含まれる
ジクロロメタンを留去した。精製することなく、この残
さをアセトニトリル１００ｍｌに溶解し、２‐クロロ‐
４‐ニトロフェノール５．０９ｇ（２９．３ｍｍｏｌ）
を加えたのち、さらに酸化銀（Ａｇ₂Ｏ）６．８０ｇ
（２９．３ｍｍｏｌ）を加え、３５℃で１７時間かきま
ぜながら反応させた。次いで、反応液をグラスフィルタ
でろ別し、これをジクロロメタン５０ｍｌで３回洗っ
た。ろ液と洗液を合わせて減圧下で濃縮し、このろ液に
含まれるアセトニトリルとジクロロメタンを留去した。
その残さにジクロロメタン３００ｍｌを加え、綿栓ろ過
したのち、０．５Ｎ水酸化ナトリウム水溶液２００ｍｌ
で１回、飽和食塩水それぞれ２００ｍｌで３回洗浄し、
さらに、無水硫酸ナトリウム１０ｇを加えて乾燥し、綿
栓ろ過したのち、減圧下で濃縮し、これに含まれるジク
ロロメタンを留去した。精製することなく、その残さを
メタノール６０ｍｌ、２８ｗｔ％アンモニア水３０ｍ
ｌ、水１５ｍｌの混液に懸濁し、３５℃で２０時間かき
まぜながら反応させた。次いで、反応液を減圧下で濃縮
し、これに含まれる水及びメタノールを留去した。得ら
れた残さをＯＤＳゲルカラムクロマトグラフィにより精
製し、エタノール‐水混液（容量比１：４）で溶出した
目的画分を濃縮し、水から再結晶して目的のＮ３Ｇ５‐
ＣＮＰを２．４７ｇ（２．４５ｍｍｏｌ，収率４１．８
％）得た。

【００５３】融点（℃）：１３０．０〜１３５．０
（分解） 紫外部・可視部吸収スペクトル：吸収極大波長［λｍａ
ｘ］（ｎｍ）＝２９０（ｌｏｇε＝３．９８），２２７
（ｌｏｇε＝３．９９），２０９（ｌｏｇε＝４．２
０） 赤外吸収スペクトル（ｃｍ^-1）：３４１０，２９３０，
２１１０，１５８４，１５２０，１４８４，１２７４，
１１５０，１０７８，１０２４ 核磁気共鳴スペクトル（２００ＭＨｚ）ｐｐｍ（ＤＭＳ
Ｏ‐ｄ₆）：３．０５〜３．９０（ｍ），４．２０〜
４．５５（ｍ），４．７４（１Ｈ，ｂｒ ｄ，Ｊ＝４．
８Ｈｚ），４．９６（１Ｈ，ｂｒ ｄ，Ｊ＝５．４Ｈ
ｚ），５．０５（２Ｈ，ｄ，Ｊ＝３．７Ｈｚ），５．１
０（２Ｈ，ｄ，Ｊ＝３．７Ｈｚ），５．２５（１Ｈ，
ｄ，Ｊ＝７．６Ｈｚ），５．２５〜５．６０（ｍ），
７．４７（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝９．３Ｈｚ），８．１９（１
Ｈ，ｄｄ，Ｊ＝９．３Ｈｚ，２．７Ｈｚ），８．２９
（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝２．７Ｈｚ） 高速液体クロマトグラフィ［東ソー（株）製ＴＳＫｇｅ
ｌ Ａｍｉｄｅ‐８０カラム（４．６ｍｍＩＤ×２５０
ｍｍ），ＲＩ検出，溶離液：アセトニトリル／水＝３：
１（ｖ／ｖ），流速：１．０ｍｌ／ｍｉｎ］：ｔ_R＝
６．７ｍｉｎ 比旋光度［α］：（ｃ ０．５１６，Ｈ₂Ｏ）；＋９
２．４° 元素分析：Ｃ₃₆Ｈ₅₃ＣｌＮ₄Ｏ₂₇として Ｃ Ｈ Ｎ 理論値（％） ４２．８４ ５．２９ ５．５５ 実測値（％） ４２．８８ ５．３１ ５．５９

【００５４】参考例２ ＤＯＧ３の製造 （１） ６‐デオキシ‐β‐シクロデキストリンの製造 前記参考例１の（１）で得た６‐Ｏ‐トシル‐β‐シク
ロデキストリン１．２７ｇ（０．９８５ｍｍｏｌ）をジ
メチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）２０ｍｌに溶解したの
ち、これに水素化ホウ素ナトリウム（ＮａＢＨ₄）３８
４ｍｇ（１０．２ｍｍｏｌ）を加え、５０℃で１２時間
反応させた。次いで、この反応液に水１０００ｍｌを加
え、ＯＤＳカラムクロマトグラフィ処理してＤＭＳＯを
除去したのち、エタノール‐水混液（容量比１：９）で
溶出した目的画分を濃縮して、メタノール再結晶するこ
とにより、６‐デオキシ‐β‐シクロデキストリン８３
９．６ｍｇ（０．７５０ｍｍｏｌ、収率７６．１％）が
得られた。 融点（℃）：２８０．０〜２８１．０（分解） 赤外吸収スペクトル（ｃｍ^-1）：３３７０，２９２０，
１１５２，１０８０，１０２０ 核磁気共鳴スペクトル（２００ＭＨｚ）ｐｐｍ（ＤＭＳ
Ｏ‐ｄ₆ ）：１．２０（３Ｈ，ｄ，Ｊ＝６．１Ｈｚ），
２．８０〜４．０５（ｍ），４．８４（７Ｈ，ｂｒ．
ｓ） 元素分析値：Ｃ₄₂Ｈ₇₀Ｏ₃₄として

【００５５】（２）ＤＯＧ３の製造 前記（１）と同様にして得た６‐デオキシ‐β‐シクロ
デキストリン１５ｇを１００ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ
７．０）１．０リットル中にかきまぜながら投入し、完
全に溶解した。これに、シクロデキストリナーゼ２４単
位を加え、４０℃で４８時間かきまぜながら反応を行っ
た。反応終了後、反応液に塩酸を加えてｐＨを約２．０
にすることにより反応を停止させたのち、水酸化ナトリ
ウム溶液を加えて中和し、次いで、これをＯＤＳカラム
に通液して、未反応の６‐デオキシ‐β‐シクロデキス
トリンを吸着させ、通液画分を得た。この操作を繰り返
して、合計６３ｇの６‐デオキシ‐β‐シクロデキスト
リンを処理した。この通液画分を１／１０の液量の１０
０ｍＭ酢酸緩衝液（ｐＨ４．５）と混合したのち、さら
に１００ｍＭ酢酸によりｐＨを４．５に調整した。続い
て、これにグルコアミラーゼ２５００ｕを添加して４０
℃で８時間酵素反応を行わせたのち、この反応液に塩酸
を添加してｐＨを約２．０にすることにより反応を停止
させ、次いで、水酸化ナトリウム溶液を加えて中和し
た。次に、この液を活性炭カラムに通液したのち、０〜
３５％のエタノールグラジエントにより６‐デオキシマ
ルトオリゴ糖を溶出させ、この内約２１％のエタノール
溶出画分を凍結乾燥して、純度約９８％の６³‐デオキ
シ‐Ｄ‐マルトトリオース約１．１ｇを得た。

【００５６】赤外吸収スペクトル（ｃｍ^-1）：３４０
０，２９５０，１６９０，１１４６，１０４２ 核磁気共鳴スペクトル（２００ＭＨｚ）ｐｐｍ（Ｄ
₂Ｏ）：１．２８（３Ｈ，ｄ，Ｊ＝６．１Ｈｚ），３．
１７（１Ｈ，ｔ，Ｊ＝８．９Ｈｚ），３．２９（１Ｈ，
ｔ，Ｊ＝８．９Ｈｚ），３．５０〜４．０５（ｍ），
４．６５（ｃａ．０．５Ｈ，ｄ，Ｊ＝７．８Ｈｚ），
５．２５（ｃａ．０．５Ｈ，ｄ，Ｊ＝３．７Ｈｚ），
５．２７（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝３．０Ｈｚ），５．３６（１
Ｈ，ｄ，Ｊ＝３．９Ｈｚ） 高速液体クロマトグラフィ［東ソー（株）製ＴＳＫｇｅ
ｌ Ａｍｉｄｅ‐８０カラム（４．６ｍｍＩＤ×２５０
ｍｍ），ＲＩ検出，溶離液：アセトニトリル／水＝３：
２（ｖ／ｖ），流速：１．０ｍｌ／ｍｉｎ］：ｔ_R ＝
５．９ｍｉｎ 元素分析値：Ｃ₁₈Ｈ₃₂Ｏ₁₅として

【００５７】参考例３ シクロデキストリナーゼの調製 １％（Ｗ／Ｖ）β‐シクロデキストリン、１％（Ｗ／
Ｖ）ペプトン、０．５％（Ｗ／Ｖ）ＮａＣｌ及び０．１
％（Ｗ／Ｖ）イーストエキスから成る液体倍地（水道水
使用、ｐＨ７．０）１００ｍｌを５００ｍｌ容坂口フラ
スコに入れ、１２０℃で２０分間、殺菌処理を行った。
これに、バチルス・スフェリカスＥ‐２４４（ＦＥＲＭ
ＢＰ‐２４５８）の保存スラントより１白金耳接種
し、３０℃で１日間振とう培養した。この培養液５０ｍ
ｌを、前記と同様の培地組成と殺菌条件により調整した
２０００ｍｌの培地を含有する３０００ｍｌ容ミニジャ
ーに接種して３０℃、１ｖｖｍ、３５０ｒｐｍの条件で
２日間通気かくはん培養を行い、培養終了後、この培養
液から８０００ｒｐｍ、２０分間の遠心分離処理により
菌体を分離し、２％（Ｗ／Ｖ）トリトンＸ‐１００を含
有する１０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７．０）５００ｍｌ
に菌体を懸濁して２５℃で１日間かきまぜた。該懸濁液
から１２０００ｒｐｍで２０分間の遠心分離処理により
菌体残留分を除去したのち、上澄液を１０ｍＭリン酸緩
衝液（ｐＨ７．０）に対して１６時間透析した。得られ
た透析物を１２０００ｒｐｍで２０分間遠心分離処理し
て不溶物を除去し、上澄を粗酵素液（１）とした。

【００５８】次いで、この粗酵素液（１）約５００ｍｌ
（総活性２００単位、タンパク量２０８３ｍｇ、非活性
０．１、ｐＨ７．０）を１０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ
７．０）で平衡化したＤＥＡＥセフアロース充填カラム
（φ３４×１７０ｍｍ）に供し、酵素を吸着させたの
ち、０〜１．５ＭＮａＣｌのグラジエント勾配により溶
出を行った。このようにして得られた活性フラクション
を集めて粗酵素液（２）１０５ｍｌ（総活性１４５単
位、比活性０．５８、収率７２．５％）を得た。続い
て、この粗酵素液（２）２０ｍｌ（総活性３１単位、タ
ンパク量２９ｍｇ）を１Ｍ硫酸ナトリウム含有１００ｍ
Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ７．０）で平衡化したエーテル５
ＰＷ充填カラム（φ２１．５×１５０ｍｍ）に供し、酵
素を吸着させたのち、１Ｍ〜０Ｍ硫酸ナトリウムのグラ
ジェント勾配により溶出を行った。このようにして得ら
れた活性フラクションを集めて粗酵素液（３）５０ｍｌ
（総活性７２単位、比活性２．９３、収率３６％）を得
た。

【００５９】実施例１ （１）α‐アミラーゼ活性測定用基質Ｎ３Ｇ５‐ＣＮＰ
のＫｍ値の測定 （イ）Ｎ３Ｇ５‐ＣＮＰ液の調製 ４０ｍＭ‐ＮａＣｌ及び２ｍＭ‐ＭｇＣｌ₂を含有する
濃度５０ｍＭのリン酸緩衝液（ｐＨ７．０）に、前記参
考例１で得たＮ３Ｇ５‐ＣＮＰを溶解し、濃度０．１
６，０．３２，０．４８，０．６４，０．８０，０．９
６ｍＭのα‐アミラーゼ活性測定用基質溶液を調製し
た。

【００６０】（ロ）共役酵素液の調製 リゾプス属（Ｒｈｉｚｏｐｕｓ ｓｐ．）由来の市販グ
ルコアミラーゼ及びアーモンド由来のβ‐グルコシダー
ゼを、それぞれ１６３ｕ／ｍｌ、１６．３ｕ／ｍｌの濃
度になるように４０ｍＭ‐ＮａＣｌ及び２ｍＭ‐ＭｇＣ
ｌ₂を含有する５０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７．０）に
混合して溶解した。なお、これら市販のグルコアミラー
ゼ及びβ‐グルコシダーゼは東洋紡績（株）製を使用し
た。

【００６１】（ハ）α‐アミラーゼ液の調製 市販のヒトＰ型α‐アミラーゼ及びヒトＳ型α‐アミラ
ーゼを、それぞれ約１５０ＩＵ／リットルの濃度になる
ように、蒸留水に溶解した。なお、この市販のヒト両α
‐アミラーゼは国際試薬（株）製キャリブザイム・ＡＭ
Ｙを使用した。また、２‐クロロ‐４‐ニトロフェノー
ルの分子吸光係数εを１６１００とし、α‐アミラーゼ
活性を３７℃、１分間に１μｍｏｌのＧ５‐ＣＮＰを分
解する酵素量を１国際単位（ＩＵ）と定義する（以下同
じ）。

【００６２】（ニ）Ｋｍの測定 ヒトＰ型α‐アミラーゼ液及びヒトＳ型α‐アミラーゼ
液それぞれについて、α‐アミラーゼ液２５０μｌに共
役酵素液１．０ｍｌを加えてかきまぜ、３７℃で１分間
加温したのち、各濃度のＮ３Ｇ５‐ＣＮＰ液２．０ｍｌ
を加えてかきまぜ、３７℃で２．５分間加温したのち２
分間、４００ｎｍにおける吸光度の変化量を測定した。
また、α‐アミラーゼ液の代わりに蒸留水２５０μｌを
用いてブランク試験を行った。得られた測定値をライン
ウエーバー・バーク（Ｌｉｎｅｗｅａｖｅｒ‐Ｂｕｒ
ｋ）プロットし、最小二乗法を用いてＫｍ値を算出し
た。この結果、Ｎ３Ｇ５‐ＣＮＰのヒトＰ型及びヒトＳ
型α‐アミラーゼに対するＫｍ値は、それぞれ０．１７
ｍＭ、０．２７ｍＭとなった。

【００６３】（２）α‐アミラーゼ活性測定用基質Ｎ３
Ｇ５‐ＣＮＰの反応速度定数ｋ_p，ｋ_sの測定及び直線性
の確認試験 （イ）α‐アミラーゼ液の調製 前記市販のヒトＰ型α‐アミラーゼ及びヒトＳ型α‐ア
ミラーゼを蒸留水に溶解し、それぞれ５４１ＩＵ／リッ
トル及び５１０ＩＵ／リットルのα‐アミラーゼ液を調
製した。これらを原液とし、蒸留水を用いてそれぞれ希
釈し、原液１００％，８０％，５０％，３０％，２０％
及び１０％（Ｖ／Ｖ）を含有する６種のα‐アミラーゼ
液を調製した。

【００６４】（ロ）共役酵素液の調製 前記（１）の（ロ）と同様にして調製した。 （ハ）Ｎ３Ｇ５‐ＣＮＰ液の調製 前記Ｎ３Ｇ５‐ＣＮＰを３．２５ｍＭ［最終濃度（測定
系における濃度、以下同じ）２．０ｍＭ］の濃度になる
ように、４０ｍＭ‐ＮａＣｌ及び２ｍＭ‐ＭｇＣｌ₂を
含有する５０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７．０）に溶解し
た。この濃度は、ヒトＰ型α‐アミラーゼ及びヒトＳ型
α‐アミラーゼに対して、それぞれＫｍ値の１１．８、
７．４倍に相当するため、最大反応速度を得るに十分な
基質量である。 （ニ）直線性の確認、ｋ_P及びｋ_Sの値の測定 前記ヒトＰ型α‐アミラーゼ及びヒトＳ型α‐アミラー
ゼ液各６種について、α‐アミラーゼ液２５０μｌに共
役酵素液１．０ｍｌを加えてかきまぜ、３７℃で１分間
加温したのち、Ｎ３Ｇ５‐ＣＮＰ液２．０ｍｌを加えて
かきまぜ、３７℃で２．５分間加温したのち２分間、４
００ｎｍにおける吸光度変化量を測定した。また、α‐
アミラーゼ液の代わりに蒸留水２５０μｌを用いてブラ
ンク試験を行った。この結果、ヒトＰ型α‐アミラーゼ
に関しては５４１ＩＵ／リットルまで（ｒ＝０．９９
９）、ヒトＳ型α‐アミラーゼに関しては５１０ＩＵ／
リットルまで（ｒ＝０．９９８）まで直線性が確認され
た。また、最小二乗法により得た直線の傾きから ｋ_P＝１．１×１０^-3 ｋ_S＝１．１×１０^-3 を得た。

【００６５】（３）ＤＯＧ３のＰ型α‐アミラーゼ及び
Ｓ型α‐アミラーゼに対する阻害定数の測定試験 （イ）基質（Ｎ３Ｇ５‐ＣＮＰ）と阻害剤ＤＯＧ３との
混液の調製 Ｎ３Ｇ５‐ＣＮＰを３．２５ｍＭ（最終濃度２．０ｍ
Ｍ）及び前記参考例２で得たＤＯＧ３を０．０５、０．
１１、０．５４、１．０９、２．１６、３．２５、５．
４１ｍＭ（最終濃度はそれぞれ０．０３、０．０７、
０．３３、０．６７、１．３３、２．００、３．３３ｍ
Ｍ）の７種類の濃度になるように、４０ｍＭ‐ＮａＣｌ
及び２ｍＭ‐ＭｇＣｌ₂を含有する５０ｍＭ‐リン酸緩
衝液（ｐＨ７．０）に溶解した。

【００６６】（ロ）α‐アミラーゼ液の調製 前記市販のヒトＰ型α‐アミラーゼ及びヒトＳ型α‐ア
ミラーゼをそれぞれ約１５０ＩＵ／リットルの濃度にな
るように、蒸留水に溶解した。 （ハ）共役酵素液の調製 前記（１）の（ロ）と同様にして調製した。 （ニ）阻害定数の測定 α‐アミラーゼ液２５０μｌに共役酵素液１．０ｍｌを
加えてかきまぜ、３７℃で１分間加温したのち、前記基
質（Ｎ３Ｇ５‐ＣＮＰ）と阻害剤ＤＯＧ３との混液（７
種類）２．０ｍｌを加えてかきまぜ、３７℃で２．５分
間加温したのち２分間、４００ｎｍにおけるそれぞれの
吸光度変化量を測定した。なお、ＤＯＧ３の濃度０ｍＭ
（無添加）のときのヒトＰ型及びＳ型α‐アミラーゼの
活性値を１００％とし、前記各測定値からＤＯＧ３の各
種濃度におけるヒトＰ型及びＳ型α‐アミラーゼの相対
活性値を求めた。この結果を図１に示す。なお、図１に
おいて、白丸はＰ型α‐アミラーゼ、黒丸はＳ型α‐ア
ミラーゼを意味する。

【００６７】次に、該相対活性値の差が最大である
（０．５４８）ＤＯＧ３の濃度（０．３３ｍＭ）に対す
るヒトＰ型及びＳ型α‐アミラーゼの相対活性値を求め
（それぞれ１３．１％、６７．９％）、さらに、これよ
りそれぞれの阻害定数（ａ、ｂ）を求めた。 ａ＝１−０．１３１＝０．８６９ ｂ＝１−０．６７９＝０．３２１ このようにして、ｋ_P、ｋ_S、ａ及びｂが求められ、次い
で測定される吸光度変化量（Ｔ、Ｗ）を前記式（３）及
び（４）に代入することにより、Ｐ型α‐アミラーゼ活
性値（Ｐ）及びＳ型α‐アミラーゼ活性値（Ｓ）が得ら
れる。

【００６８】（４）分別定量試験 活性既知のヒトＰ型α‐アミラーゼとヒトＳ型α‐アミ
ラーゼとを種々の割合で混合し、基質として前記Ｎ３Ｇ
５‐ＣＮＰを、阻害剤として前記ＤＯＧ３を用いた場合
について、混合割合に基づいて得た理論値と式（３）及
び（４）から算出される計算値との適合性を調べた。

【００６９】（イ）基質（Ｎ３Ｇ５‐ＣＮＰ）液の調製 前記Ｎ３Ｇ５‐ＣＮＰを３．２５ｍＭ（最終濃度２．０
ｍＭ）の濃度となるように、４０ｍＭ‐ＮａＣｌ及び２
ｍＭ‐ＭｇＣｌ₂を含有する５０ｍＭ‐リン酸緩衝液
（ｐＨ７．０）に溶解した。

【００７０】（ロ）基質（Ｎ３Ｇ５‐ＣＮＰ）と阻害剤
ＤＯＧ３との混液の調製 前記Ｎ３Ｇ５‐ＣＮＰとＤＯＧ３を、それぞれ３．２５
ｍＭ（最終濃度２．０ｍＭ）、０．５４ｍＭ（最終濃度
０．３３ｍＭ）の濃度となるように、４０ｍＭ‐ＮａＣ
ｌ及び２ｍＭ‐ＭｇＣｌ₂を含有する５０ｍＭ‐リン酸
緩衝液（ｐＨ７．０）に溶解した。

【００７１】（ハ）共役酵素液の調製 前記（１）の（ロ）と同様にして調製した。 （ニ）α‐アミラーゼアイソザイム試験液の調製 前記市販のヒトＰ型α‐アミラーゼ及びＳ型α‐アミラ
ーゼを蒸留水で溶解し、（Ｐ：Ｓ）＝（１０：０）及び
（０：１０）に対応する理論値の各α‐アミラーゼ液を
得た。この活性は前記（２）で試験した直線性が保持さ
れている範囲内である。これらの溶液を原液とし、Ｐ型
α‐アミラーゼ及びＳ型α‐アミラーゼの混合液を混合
容量比（Ｐ：Ｓ）＝（１０：０）、（Ｐ：Ｓ）＝（９：
１）、（Ｐ：Ｓ）＝（８：２）、（Ｐ：Ｓ）＝（７：
３）、（Ｐ：Ｓ）＝（６：４）、（Ｐ：Ｓ）＝（５：
５）、（Ｐ：Ｓ）＝（４：６）、（Ｐ：Ｓ）＝（７：
３）、（Ｐ：Ｓ）＝（８：２）、（Ｐ：Ｓ）＝（９：
１）、（Ｐ：Ｓ）＝（０：１０）で混合し（計１１
種）、α‐アミラーゼアイソザイム試験液とした。

【００７２】（ホ）分別定量試験 各α‐アミラーゼアイソザイム試験液２５０μｌに共役
酵素液１．０ｍｌを加えてかきまぜ、３７℃で１分間加
温したのち、Ｎ３Ｇ５‐ＣＮＰ液又はＮ３Ｇ５‐ＣＮＰ
とＤＯＧ３との混液２．０ｍｌを加えてかきまぜ、３７
℃で２．５分間加温したのち２分間、４００ｎｍにおけ
る吸光度変化量（ΔＯＤ）を測定した。また、α‐アミ
ラーゼアイソザイム試験液の代わりに蒸留水２５０μｌ
を用いてブランク試験を行い、Ｔ及びＷを求めた。混合
前の活性値と混合比から求められるものを理論活性値と
し、前記式（３）及び（４）に前記ｋ_P、ｋ_S、ａ、ｂ、
Ｔ及びＷを代入して算出されるものを計算活性値（測定
値）とした試験結果を表１に示す。なお、活性値の単位
はＩＵ／リットルである。

【００７３】

【表１】

【００７４】表１から、計算活性値（測定値）と理論活
性値は極めて高い相関を示していることが分かる。

【００７５】実施例２ α‐アミラーゼ活性を有するヒト血清について分別定量
を行った。 （１）本発明方法による分別定量（２チャンネル法） （イ）基質（Ｎ３Ｇ５‐ＣＮＰ）液の調製、（ロ）基質
（Ｎ３Ｇ５‐ＣＮＰ）と阻害剤ＤＯＧ３との混液の調
製、（ハ）共役酵素液の調製は、それぞれ実施例１の
（４）の（イ）〜（ハ）と同様にして調製した。 （ニ）α‐アミラーゼ試験液 α‐アミラーゼ活性を有するヒト血清（５０個の試料） （ホ）分別定量 α‐アミラーゼアイソザイム試験液の代わりにヒト血清
２５０μｌとする以外は、実施例１の（４）の（ホ）と
同様の操作を行い、前記ｋ_P、ｋ_S、ａ及びｂ、ここで求
めたＴ及びＷを前記式（３）及び（４）に代入し、Ｐ値
（ＩＵ／リットル）及びＳ値（ＩＵ／リットル）を求め
た。

【００７６】（２）小麦インヒビターを用いた方法 （イ）基質（Ｎ３Ｇ５‐ＣＮＰ）液の調製、（ロ）α‐
アミラーゼ試験液は、それぞれ前記（１）の（イ）、
（ニ）と同様である。 （ハ）共役酵素と小麦インヒビターとの混液の調製 実施例１の（１）の（ロ）と同様にして調製した共役酵
素液の５０ｍｌに小麦インヒビター１バイアル［生化学
工業（株）製、８ＡＩＵ（１ＡＩＵはヒトＳ型アミラー
ゼ２ｕ／リットル（ブルースターチ法）を５０％阻害す
る量］を溶解した。 （ニ）分別定量 各ヒト血清２５０μｌに前記（ハ）の混液１．０ｍｌを
加えてかきまぜ、３７℃で１分間加温したのち、Ｎ３Ｇ
５‐ＣＮＰ液２．０ｍｌを加えてかきまぜ、３７℃で
２．５分間加温したのち２分間、４００ｎｍにおける吸
光度変化量（ΔＯＤ）を測定した。また、α‐アミラー
ゼ試験液の代わりに蒸留水２５０μｌを用いてブランク
試験を行い、この方法でのＷを求めた。一方、（ハ）の
混液の代わりに、共役酵素液のみを１．０ｍｌとする以
外は、上記と同様の操作を行い、この方法でのＴを求め
た。また、この小麦インヒビター法のｋ_P、ｋ_S、ａ及び
ｂは、測定の結果、それぞれ１．１×１０^-3、１．１×
１０^-3、０．２６２、０．７２６であった。これらの数
値及びここで求めたＴ及びＷを前記式（３）及び（４）
に代入してＰ値（ＩＵ／リットル）及びＳ値（ＩＵ／リ
ットル）を求めた。

【００７７】（３）このようにして得た本発明の分別定
量法によるＰ値と小麦インヒビター法によるＰ値をプロ
ットしたグラフを図２に示す。この結果、両者の相関性
はｒ＝０．９８９、Ｙ＝０．９６２Ｘ−１．４６９で、
よく整合していることが分かる。

【００７８】（４）別のα‐アミラーゼ試験液を用いた
本発明の分別定量法と小麦インヒビター法との測定誤差
の比較 α‐アミラーゼ試験液として、ヒト血清の代わりに酵素
リファレンス［和光純薬工業（株）製商品名］を用いた
以外は、前記（１）及び（２）の分別定量法と同様にし
てＰ型α‐アミラーゼ活性を測定し、このときの両者の
測定誤差の比較をした。その結果を表２に示す。

【００７９】

【表２】

【００８０】表２における、変動係数（％）値から、本
発明方法は小麦インヒビター法に比較し、α‐アミラー
ゼアイソザイム活性を測定誤差が少なくて精度よく、分
別定量できることが分かる。 実施例３ （１）Ｇ５‐ＣＮＰのＫｍ値、反応速度定数ｋ_P、ｋ_S及
びＤＯＧ３の阻害定数ａ、ｂの測定 α‐アミラーゼ測定用基質としてのＮ３Ｇ５‐ＣＮＰの
代わりに市販のＧ５‐ＣＮＰを、共役酵素液としてのグ
ルコアミラーゼの代わりにα‐グルコシダーゼ４０６ｕ
／ｍｌ［東洋紡績（株）製］を用いる以外は、実施例１
と同様にしてＧ５‐ＣＮＰのＫｍ値、反応速度定数（ｋ
_P、ｋ_S）及び阻害定数（ａ、ｂ）を測定した。その結
果、Ｇ５‐ＣＮＰのＫｍ値、ｋ_P、ｋ_Sは、それぞれ０．
４５ｍＭ、１．２×１０^-3、１．２×１０^-3であり、Ｄ
ＯＧ３のａ、ｂは、その濃度が０．５０ｍＭのとき、そ
れぞれ０．６１７、０．１４１であった。

【００８１】（２）分別定量 （イ）基質Ｇ５‐ＣＮＰ液の調製 Ｎ３Ｇ５‐ＣＮＰの代わりに前記Ｇ５‐ＣＮＰ３．２５
ｍＭ（最終濃度２．０ｍＭ）を用いる以外は、実施例１
の（４）の（イ）と同様にして調製した。 （ロ）基質（Ｇ５‐ＣＮＰ）と阻害剤ＤＯＧ３との混液
の調製 Ｎ３Ｇ５‐ＣＮＰの代わりに前記Ｇ５‐ＣＮＰを３．２
５ｍＭ（最終濃度２．０ｍＭ）とし、ＤＯＧ３の濃度を
０．８１ｍＭ（最終濃度０．５０ｍＭ）とする以外は、
実施例１の（４）の（ロ）と同様にして調製した。 （ハ）共役酵素液の調製 グルコアミラーゼの代わりにα‐グルコシダーゼ４０６
ｕ／ｍｌ［東洋紡績（株）製］を用いる以外は、実施例
１の（４）の（ハ）と同様にして調製した。 （ニ）α‐アミラーゼ試験液 α‐アミラーゼ活性を有するヒト血清（５０個の試料） （ホ）分別定量試験 実施例１の（４）の（イ）〜（ニ）の代わりに、前記
（イ）〜（ニ）の溶液を用いる以外は、実施例１の
（４）と同様にして分別定量した。

【００８２】 （３）基質液としてＮ３Ｇ５‐ＣＮＰを用いる分別定量 実施例１の（４）の（ニ）のα‐アミラーゼアイソザイ
ム試験液の代わりに、前記（ニ）のα‐アミラーゼ試験
液を用いる以外は、実施例１の（４）と同様にして分別
定量した。 （４）前記（２）及び（３）の分別定量法で測定して得
た各Ｐ値をプロットしたグラフを図３に示す。この結
果、両者のＰ値の相関性はｒ＝０．９８６、Ｙ＝０．９
７４Ｘ＋１．１５５であり、よく整合していることが分
かる。なお、図３において、Ｇ５‐ＣＮＰ法、Ｎ３Ｇ５
‐ＣＮＰ法は、それぞれ前記（２）、（３）による分別
定量法を意味する。

【００８３】実施例４ （１）Ｔ及びＷをダブルカイネティック法で測定する方
法（１回測定法） （イ）α‐アミラーゼ試験液 α‐アミラーゼ活性を有するヒト血清（７０個の試料） （ロ）基質（Ｎ３Ｇ５‐ＣＮＰ）液の調製 前記Ｎ３Ｇ５‐ＣＮＰを３．２５ｍＭ（最終濃度２．０
ｍＭ）溶液になるように、４０ｍＭ‐ＮａＣｌ及び２ｍ
Ｍ‐ＭｇＣｌ₂を含有する５０ｍＭ‐リン酸緩衝液（ｐ
Ｈ７．０）に溶解した。 （ハ）共役酵素液の調製 グルコアミラーゼ、β‐グルコシダーゼをそれぞれ１８
１ｕ／ｍｌ、１８．１ｕ／ｍｌの濃度になるようにした
以外は、実施例１の（１）の（ロ）と同様にして調製し
た。 （ニ）ＤＯＧ３液の調製 前記ＤＯＧ３を１０．７３ｍＭ（最終濃度０．３３ｍ
Ｍ）の濃度になるように、４０ｍＭ‐ＮａＣｌ及び２ｍ
Ｍ‐ＭｇＣｌ₂を含有する５０ｍＭ‐リン酸緩衝液（ｐ
Ｈ７．０）に溶解した。 （ホ）分別定量法 共役酵素液０．９ｍｌに各ヒト血清２５０μｌを加えて
かきまぜ、３７℃で１．０分間加温したのち、Ｎ３Ｇ５
‐ＣＮＰ液２．０ｍｌを加えてかきまぜ、３７℃で１．
０分間加温したのち２分間、４００ｎｍにおける吸光度
変化量（ΔＯＤ）を測定した。３０秒後、同測定系液に
さらに、ＤＯＧ３液０．１０ｍｌを加え、１．５分間加
温したのち２．０分間、４００ｎｍにおける吸光度変化
量（ΔＯＤ）を測定した。ブランク試験はα‐アミラー
ゼ試験液の代わりに蒸留水２５０μｌを用い、Ｔ′及び
Ｗを測定した。このときのＴは Ｔ＝Ｔ′×３．１５／３．２５ である。

【００８４】次に、実施例１で求めたｋ_P、ｋ_S、ａ及び
ｂ、ここで求めたＴ及びＷを前記式（３）及び（４）に
代入してＰ値（ＩＵ／リットル）及びＳ値（ＩＵ／リッ
トル）を求めた。 （ヘ）ここで求めたＰ値と実施例２の（１）（２チャン
ネル法）と同様にして求めたＰ値をプロットしたグラフ
を図４に示す。この結果、両者の相関性はｒ＝０．９９
９５、Ｙ＝０．９９４Ｘ−０．４１５であり、よく整合
していることが分かる。

【００８５】すなわち、本発明方法は、１回の測定でα
‐アミラーゼアイソザイムの分別定量を精度よく行うこ
とができ、基質及び共役酵素が２チャンネル法の１／２
の量で測定でき、経済的にも優れた方法である。

【図面の簡単な説明】

【図１】 本発明方法の実施例における阻害剤ＤＯＧ３
の濃度とＰ型及びＳ型α‐アミラーゼの相対活性値との
関係を示すグラフ。

【図２】 Ｐ型α‐アミラーゼ活性の本発明方法による
測定値と小麦インヒビター法によるそれとの相関を示す
グラフ。

【図３】 本発明方法におけるＰ型α‐アミラーゼ活性
のＮ３Ｇ５‐ＣＮＰ法による測定値とＧ５‐ＣＮＰ法に
よるそれとの相関を示すグラフ。

【図４】 本発明方法におけるＰ型α‐アミラーゼ活性
の２チャンネル法による測定値とダブルカイネティック
法のそれとの相関を示すグラフ。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (72)発明者 山次 信幸 千葉県野田市野田339番地 キッコーマン 株式会社内 (72)発明者 本山 義則 東京都墨田区業平５丁目５番12号 第一化 学薬品株式会社東京研究所内 (72)発明者 細井 健二 東京都墨田区業平５丁目５番12号 第一化 学薬品株式会社東京研究所内

Claims (1)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 α‐アミラーゼ活性測定用基質と試料と
   を反応させて得られるα‐アミラーゼ活性の測定値と、
   前記と同一の基質と試料とを２種のα‐アミラーゼアイ
   ソザイムに対する阻害定数が異なる阻害剤の存在下で反
   応させて得られるα‐アミラーゼ活性の測定値とからα
   ‐アミラーゼアイソザイム活性を分別定量する方法にお
   いて、阻害剤として式 【化１】 で表わされる６³‐デオキシマルトトリオースを用いる
   ことを特徴とするα‐アミラーゼアイソザイム活性の分
   別定量法。