JPH0716436B2 - ヘテロ二重特異性モノクローナル抗体の製造法 - Google Patents

ヘテロ二重特異性モノクローナル抗体の製造法

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JPH0716436B2
JPH0716436B2 JP2069910A JP6991090A JPH0716436B2 JP H0716436 B2 JPH0716436 B2 JP H0716436B2 JP 2069910 A JP2069910 A JP 2069910A JP 6991090 A JP6991090 A JP 6991090A JP H0716436 B2 JPH0716436 B2 JP H0716436B2
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Description

【発明の詳細な説明】 産業上の利用分野 本発明はヘテロ二重特異性抗体の製造法に関する。
従来の技術 ヘテロ二重特異性抗体またはヘテロ二官能性抗体は、２
つの異なる抗原結合部位を有する、すなわち２つの異な
るエピトープとは反対方向に向いている抗体である。ヘ
テロ二官能性抗体は、疾病の治療に使用することができ
る。従って、二重特異性抗体は、例えば癌腫細胞の細胞
表面の抗原に対する１つの抗原結合部位および特定の医
薬に対する１つの抗原結合部位を有することができる。
更に、この方法で、癌腫細胞に対する治療剤が特異的に
惹起される。もう１つの別の変種は、１つの抗原結合部
位がＴ−細胞−表面−抗原とは反対方向に向いおりかつ
別の抗原結合部位がビールスの抗原決定因子とは反対方
向に向いている二重特異性抗体である。この種の抗体
は、意図的に血液中のビールスを破壊することができる
ものとされている。
二重特異性抗体の製造法は、既に公知である。すなわ
ち、Proc.Natl.Acad.Sci.,USA,83（1986）、4479〜4483
およびEur.J.Immunol.,17（1987）、571〜574には、ス
ペーサーの使用下で２つの異なる抗体を化学的に互いに
結合させる方法が記載されている。しかし、この方法
は、費用がかかりかつ抗体の新規のトポロジカルな形勢
を生じる。
更に、Proc.Natl.Acad.Sci.,USA,83（1986）、1453〜14
57の記載から、それぞれ異なる抗体を分泌する２つの細
胞系を互いに融合させる方法は、公知である。この場合
には、二重の染色体の組みを含有するハイブリードマ細
胞が生じ、望ましいヘテロ二官能性抗体が生産される。
この方法の欠点は、得られた細胞系列がしばしば不安定
であり、したがって工業的規模でのヘテロ二官能性抗体
の生産には不適当であることにある。
発明が解決しようとする課題 従って、本発明の課題は、二重特異性抗体を良好な収量
で得ることができかつ工業的規模で実施することができ
る１つの方法を提供することであった。
課題を解決するための手段 この課題は、望ましい特異性を有する抗体を分泌するハ
イブリドーマ細胞系から少なくとも遺伝子を、軽鎖およ
び重鎖の可変部分に対して単離し、真核プラスミドベク
ター中に挿入し、この発現ベクターを第２の望ましい特
異性を有する抗体を分泌するハイブリドーマ細胞系中に
導入し、この細胞系を培養し、抗体を取得し、二重特異
性抗体を分離することを特徴とする、二重特異性モノク
ローナル抗体を製造する方法によって解決される。
意外なことに、本発明方法によれば、二重特異性抗体を
高い収量で得ることに成功する。本発明により使用され
る導入されたハイブリドーマ細胞系は、ハイブリドーマ
細胞系のゲノムならびに発現ベクターによってコード化
されているホモ二官能性抗体を発現させ、ならびにハイ
ブリドーマ宿主細胞の抗原結合部位および導入されたベ
クターの抗原結合部位を有する、２つの抗体の遺伝子か
ら形成されたヘテロ二官能性抗体を発現させる。意外な
ことに、このヘテロ二官能性抗体の収量は極めて高い。
ヘテロ二官能性抗体は、２つのホモ官能性抗体とともに
簡単な方法で、例えば固体の担体に固定されている抗原
の１つに結合させ、かつ標識化されかつ可溶性で使用さ
れる別の抗原に結合させることによって測定される。
二重特異性抗体を本発明により製造するために、真核発
現ベクターは、ハイブリドーマ細胞系中に導入される。
真核発現ベクターは、本質的な要素として選択可能なマ
ーカー、強力なプロモーターおよび完全または不完全な
抗体を発現させるための遺伝子を含有する。免疫グロブ
リン遺伝子を挿入するために、当業者に知られている多
数の種々の真核プラスミドベクターが適当である。適当
なのは、例えば次のベクターである。
ａ）ホスホトランスフェラーゼを新たに発現させるベク
ター、この場合形質転換細胞の選択は、抗生物質G418を
用いて行なわれる。このベクターは、P.Southernおよび
P.Berg,J.Mol.Appl.Genet.1（1982）、327〜341に記載
されている。
ｂ）エシェリキア・コア（E.coli）キサンチン−グアニ
ン−ホスホリボシル−転移酵素を発現させるベクター、
この場合形質転換細胞の選択は、マイコフェノール酸耐
性に対して行なわれる。このベクターは、R.Mulliganお
よびP.Berg,Proc.Natl.Acad.Sci.,USA、78（1981）、20
72〜2076に記載されている。
ｃ）“多薬耐性（multi−drug resistance）”遺伝子を
発現させるベクター。この場合、選択は、例えばコルキ
シン、ビンブラスチン、アドリアマイシンまたはアクチ
ノマイシンＤのような薬剤を用いて行なわれる。このベ
クターは、S.E.Kane,B.R.Troen,S.Gal,K.Kida,I.Pastan
及びM.M.Gottesman,Mol.and Cell.Biol.8（1988）,3316
〜3321ならびにD.W.Shou,A.Fojo,I.B.Roninson,J.E.Chi
n,R.Soffir,I.PastanおよびM.Gottesman,Mol.and Cell
Biol.6（1986）、4039〜4044に記載されている。
ｄ）ジヒドロ葉酸還元酵素またはメトトレキセートに対
して減少された親和力を有する突然変異体を発現させる
ベクター。形質転換細胞の選択は、メトトレキセート含
有媒体中での成長によって行なわれる。ベクターは、R.
KaufmanおよびP.A.Sharp,J.Mol.Biol.159（1982）,601
〜621およびC.C.Simonson他、Proc.Natl.Acad.Sci.,USA
80（1983）、2495〜2499に記載されている。
これらのベクターは、全部が既に選択可能なマーカーを
有する。出発ベクターとしては、例えばプラスミドpMT0
10/A+を使用することができる。ベクター中には、少な
くとも望ましい特異性の抗体の可変部分およびcH1領域
または完全な抗体をコード化する免疫グロブリン遺伝子
が自体公知の方法で挿入される。この場合には、望まし
い特異性の抗体を生産するハイブリドーマから相応する
DNAを取得しかつベクター中に結合することができる
か、或いは望ましい免疫グロブリン遺伝子のゲノムDNA
を使用することができる（Buckel他、Gene 51（1980）1
3〜19参照）。
免疫グロブリン遺伝子としては、少なくとも軽鎖に対す
る遺伝子、重鎖の可変部分に対する遺伝子および望まし
い抗体のcH1領域に対する遺伝子が使用される。
軽鎖のための遺伝子は、κ鎖またはλ鎖のための遺伝子
であることができる。それぞれ完全な遺伝子が使用され
る。所望の抗体の種類に依存して、重鎖のための遺伝子
は選択される。抗体の種類に応じて、遺伝子は、μ、γ
１、γ２、γ３、γ４、α１、α２、δまたはε鎖から
選択される。この場合には、全ての情報を重鎖に対して
使用することができるか、または重鎖に対してコード化
されているDNAの一部のみを使用することができる。必
要に応じて、cH2領域、cH3領域ならびに場合によっては
cH4領域は、得るべき抗体の望ましい種類に依存してな
らびに使用されるハイブリドーマ細胞系に依存して選択
される。本発明により製造された二重特異性抗体が人体
での治療的処置に定められている場合には、ヒトの免疫
グロブリンのcH1領域、cH2領域、cH3領域および場合に
よってはcH4領域を使用することは、有利である。
本発明による方法の１つの実地態様の場合には、軽鎖に
対するκ遺伝子およびマウス抗体またはヒト抗体のγｌ
遺伝子を含有する発現ベクターが使用されている。
真核発現ベクターの１つの好ましい成分は、１つの強い
プロモーターである。高い生産率を生じるプロモーター
は、当業者に知られている。例えば、SV40の早期または
遅早プロモーター、軽鎖および重鎖に対する免疫グロブ
リンプロモーター、サイトメガリエ（Cytomegalie）−
ビールス−プロモーターならびにメタロチオナイン（Me
tallothionein）−プロモーターが適当である。全く同
様に、別の構成ビールス性または細胞性プロモーターは
適当である。
こうして構成された真核発現ベクターは、抗原結合部位
Ａを有する抗体を分泌するハイブリドーマ細胞系中に導
入される。このためには、望ましい結合部位を有する抗
体を生産するハイブリドーマ細胞系が適当である。有利
には、製造すべき抗体に由来する種類の抗体を生じるハ
イブリドーマ細胞系が使用される。殊に、マウスハイブ
リドーマ細胞系またはヒトハイブリドーマ細胞系が適当
である。
発現ベクターのトランスフェクションは、自体公知の方
法で行なわれる。有利にトランスフェクションは、電気
泳動によって実施される（Nucleic Acids Res.15（198
7）1311〜1326;Bio Techniques6（1988）742〜751）。
こうして得られた導入された細胞系は、相応するマーカ
ー上に向かって選択され、培養され、次に抗体は、自体
公知の方法で得られる（例えば、A.Y.Liu他、Proc.Nat
l.Acad.Sci.USA、84（1987）3439;S.L.Morrison他、Pro
c.Natl.Acad.USA、81（1984）6851）。
導入された細胞系は、宿主−ハイブリドーマ細胞系を分
泌するホモ二官能性抗体ならびに真核発現ベクターによ
りコード化されるホモ二官能性抗体、ならびに２つの異
なる抗原結合部位を有するヘテロ二官能性抗体を生産す
る。導入された発現ベクターが、抗原結合部位Ｂを有す
る抗体の可変領域に対する情報のみを含有する場合に
は、特異性Ｂを有する半抗体として、一定の部分が宿主
細胞によってコード化された抗体に相当するものが形成
され、したがって２つの半抗体を組み合わせた場合に
は、抗原−結合部位ＡおよびＢならびに宿主ハイブリド
ーマ細胞系によって形成された抗体の一定部分を有する
二重特異性抗体が生じる。
しかし、ヘテロ二官能性抗体の形成の前記解釈は、別の
予想される結合方法を排除するものではなく、説明のた
めの試験のみを表わすものである。
ヘテロ二官能性抗体は、意外にも高い収量で分泌され
る。望ましい抗体の形成は、それ自体免疫グロブリンを
全く生産し得ないハイブリドーマ宿主細胞に比して10倍
だけ高いことが見い出された。このことは、本発明によ
り得られた細胞系が10倍だけ高められた抗体生産率を示
すことを意味する。
10個の異なる抗体種の混合物（２つの抗体の軽鎖および
重鎖の全ての可能な組合せ物）を含有する培養上澄み液
から被検抗体は、公知方法で分離することができる。有
利には、望ましい抗体は、免疫吸着によって分離され
る。特に有利な実施態様の場合、二官能性抗体の分離
は、２段階で行なわれる。まず、全部の抗体種を含有す
る溶液を抗原結合部位Ａと結合可能な抗原と結合させ、
この場合抗体ＡおよびABは吸着される。結合した抗体の
溶離後、第２段階で一官能性抗体および二官能性抗体を
含有する溶液から、抗原結合部位Ｂと結合可能な抗原の
吸着によってヘテロ二官能性抗体は、選択的にホモ二官
能性抗体Ａと分離される。ヘテロ二官能性抗体は、溶離
によって高い純度で得ることができる。
本発明によれば、顕著は収率でヘテロ二官能性抗体を得
ることができる方法が提供される。この抗体は、なかん
ずく癌腫またはビールスによって惹起される疾病の治療
への使用に適当である。使用目的に応じて、望ましい抗
原決定因子を選択することができる。従って、当該医師
には第２の抗原決定因子のそれぞれ有利な組合せ物を見
い出すために幅広い領域が残されている。更に、なお種
々の生理学的方法に役立つ抗体のFc部分を変える可能性
が存在する。
プラスミドpBMS1（DSM5229）およびpBMS2（DSM5230）な
らびに微生物エシェリキア・コリHB101（DSM1607）は、
ドイチェン・ザムルング・フォン・ミクロオルガニスメ
ン（Deutschen Sammlung von Mikroorganisme）に寄託
されており、これらのプラスミドのDSMへの寄託は、ブ
ダペスト条約に基づく国際寄託である。また、ハイブリ
ドーマ細胞系MAK（monoklonaler Antikoerper Klon（モ
ノクロナール抗体のクローン）33は、番号ECACC8809140
4でヨーロッピアン・コレクション・オブ・アニマル・
セル・カルチャーズ（European Collection of Animal
Cell Cultures）に寄託されており、このクローンのECA
CCへの寄託は、ブダペスト条約に基づく国際寄託であ
る。
実施例 例１ 免疫グロブリン遺伝子の単離 サブリツキー（F.Sablitzky）、ヴィルトナー（G.Wilde
ner）およびライェフスキー（K.Rajewski）、EMBO J.4
（1985）345〜350ならびにコックス（Chr.Kocks）およ
びライェフスキー（K.Rajewski）、Proc.Natl.Acad.Sc
i.USA（1988）85、8206〜8210に記載の方法により、マ
ウス−ハイブリドーマ系A20/44から、モノクロナールマ
ウスλ，γ2a抗ニトロフェノール抗体とは反対方向に向
いている抗イディオタイプ抗体（抗体Ｂ）を分泌させ、
モノクロナール抗体のκ遺伝子およびγ１遺伝子を単離
した。
活性遺伝子にSalI−リンカー（CGTCGACG）を備えさせ、
かつpUC18またはpBR322にサブクローン化した。軽鎖に
対する遺伝子を5.5kb断片によってコード化し、重鎖に
対する遺伝子を9.25kb断片によってコード化した。
例２ 免疫グロブリン遺伝子の発現ベクターの構築 出発プラスミドとして、pMTO10/A+を使用した（DNA5（1
986）529〜537）。このプラスミドは、後接したポリア
デニル化部位（An）を有するヒツジ金属チオネインプロ
モーター（pMT）、SV40の早期プロモーターの制御下で
のマウス−ジヒドロ葉酸還元酵素遺伝子のための発現カ
セット、SV40の早期プロモーターの制御下での新しいホ
スホ転移酵素のための発現カセット、細菌複製源および
アンピシリン耐性をコード化する１つの遺伝子を含有す
る。属するポリアデニル化部位を有するヒツジ金属チオ
ネインプロモーターをEcoRIおよびSalIのプラズミドの
分解によって切断し、断片をヌクレアーゼS1で処理し、
第１図に点線で示された断片を低溶融性のアガロースゲ
ルから単離した。引続き、SalIリンカーをリゲートし、
SalIで後切断し、リンカーを有する断片を低溶融性のア
ガロースゲル上で単離し、再リゲートし（T4−リガー
ゼ）、エシェリキア・コリHB101（DSM1607）中に導入
し、かつアンピシリン耐性コロニーを単離した。プラズ
ミドpMTを制限分析によって特徴付けた（Hind IIIを用
いる分解により、２つの断片2.8kbおよび4.65kbが得ら
れた）。末端にSalI切断部位を備えた、ハイブリドーマ
系A20/44からのκ遺伝子をプラズミドpMTのSalI中にリ
ゲートした。生じたプラズミドを部分的にSalIで分解
し、ハイブリドーマ細胞系pA20/44からのγ１遺伝子を
9.25kbSal断片としてリゲートした。
この場合、プラズミドpBMS1およびpBMS2は、κ遺伝子に
関連してγ１遺伝子の異なる配向に相応して生成された
（第２図）。プラズミドpBMS1をHind IIIで分解するこ
とにより、8.6kb;6.6kb;4.2kbおよび2.8kbの断片が生
じ、プラズミドpBMS2をHind IIIで分解することによ
り、11.5kb;6.6kb;2.8kbおよび1.3kbの断片が生じた。
例３ 免疫グロブリン遺伝子のための発現構造を有するハイブ
リドーマ生産細胞系のトランスフェクション プラズミドpBMS1およびpBMS2を電気泳動法（Elektropor
ation）（Bio−Radの遺伝子パルサー）によって、Nucle
icAcids Res.15（1987）1311〜1326ないしはBio Techni
ques6（1988）742〜751に記載の方法により、クレアチ
ンキナーゼの下単位Ｍとは反対方向に向いた抗体（抗体
Ａ）を分泌するバッケル（Buckel）他、Gene51（1987）
13〜19に記載のハイブリマード系MAK33（ECACC8809140
4）中に導入した。１回のパルスあたりプラズミド−DNA
10μｇおよび細胞１×106を使用した。
遠心分離後、細胞を冷たいHeBS緩衝液で洗浄し（HEPES2
0ミリモル、pH7.5、NaCl137ミリモル、KCl5ミリモル、N
a2HPO40.7ミリモル、デキストロース６ミリモル）、HeB
S緩衝液と一緒に再懸濁させ、細胞106/mの濃度に調節
し、かつ氷上においた。プラズミド添加の後、パルス処
理した（条件：容量500μＦおよび電圧範囲240〜350Vま
たは160μＦおよび200〜260V）。細胞をパルス処理の後
に約10分間氷上に保持し、引続き媒体Ｉ（RPMI 1640、
ウシ胎児血清10％、グルタミン２ミリモル/l、ピルビン
酸ナトリウム１ミリモル/l、非必須アミノ酸0.1モル/
l）中で37℃でインキュベートした。
安定な形質転換細胞の選択は、媒体1mlあたりG418 800
μｇの濃度の際にG418含有媒体上にインキュベートする
ことによって行なわれた。
安定な形質転換細胞を約14日後に確認し、“限定希釈”
によって単離し、かつ媒体Ｉ中での大量培養で増殖させ
る。
例４ 上澄み液中での免疫反応性蛋白質の測定 測定をGene56（1987）205〜216の記載と同様にELISA試
験を用いて実施した。κ鎖の測定のために、マイクロ滴
定板をヒツジからの抗マウス−Ig Gene56（1987）205
〜216抗体で被覆し、かつ導入された細胞からの上澄み
液と一緒にインキュベートした。洗浄後、標識化のため
にペルオキシダーゼと、マウス−Fab断片（IgG）とは反
対方向を向いたヒツジ抗体（IgG）のFab断片との接合体
を添加した。引続き、ペルオキシダーゼの基質としてAB
TS（2,2−アジノ−ジ−［３−エチルベンズチアゾリン
−スルホネート（６）］）を添加し、呈色を405nmで溶
液中に存在するκ鎖の量に対する尺度して測定した。
γ鎖を同様にして測定したが、この場合には、標識化し
た受容体としてペルオキシダーゼと、マウスFc−γ（Ig
G）とは反対方向に向いているヒツジからの抗体のFab断
片（IgG）を使用した。
例５ 抗体の分離 特異性を有する抗体Ａ、ＢおよびABを含有する培養上澄
み液を、抗体Ａとの結合能力を有する抗原が結合してい
るアフィニティーカラムでクロマトグラフィー処理し
た。抗体Ｂは、こうして分離することができた。抗体Ａ
およびハイブリッド抗体ABを固定化抗原に結合させた。
引続き、抗体Ａおよびハイブリッド抗体ABをグリシン0.
2モル/lの溶液、pH2.8、を用いて溶離し、この溶出液
を、抗体Ｂとの結合能力を有する抗原が固定されている
アフィニティーカラムでクロマトグラフィー処理した。
抗体Ａは、カラムから流出する液体中に存在し、抗体AB
は、選択的に結合され、かつグリシン0.2モル/lの溶
液、pH2.8、を用いて溶離することによって純粋に得る
ことができる。
抗体の定義 抗体A: ハイブリドーマ系MAK33のCK−MM−特異的抗体 抗体B: 例１による細胞系A20/44からの抗イディオタイプ抗体 抗体AB: 抗体ＡおよびＢからのハイブリッド抗体 例６ ビオチニル化CK−MMの製造 CK−MM（クレアチンキナーゼ、EC2.7.3.2）をコイテル
（Keutel）他、Arch.Biochem.Biophys.150（1972）648
の記載によりヒト骨格筋から単離した。燐酸カリウム緩
衝液30ミリモル中のCK−MM 10mg（0.12マイクロモル）
の溶液、pH7.1、にジメチルスルホキシド50μｌ中のビ
オニル−ε−アミノカプロン酸−Ｎ−ヒドロキシスクシ
ンイミドエステル0.43マイクロモルをピペットを用いて
注入し、かつ氷浴中で60分間インキュベートした。引続
き、試薬の過剰量をカーボネート緩衝液２ミリモル、pH
8.7、に対する透析によって除去し、かつビオチニル化
されたいCKMMを凍結乾燥した。
例７ 培養上澄み液中でのハイブリッド抗体の特異的測定 マイクロ滴定板の凹所を熱いRNA−ストレプトアビジン
（燐酸カリウム40ミリモル/l中の10μg/ml、pH7.4（欧
州特許出願公開第0269092号明細書の記載により製
造））で被覆した。緩衝液Ｉ（HEPES50ミリモル/l、NaC
l0.15モル/l、クロテインC1％、pH7.0）を用いての後被
覆の後、ビオチニル化ヒトCK−MM（例６により製造）
（緩衝液Ｉ中で１μg/ml）を負荷した。引続き、ハイブ
リッド−MAKABを含有する細胞培養上澄み液と一緒に室
温で１時間インキュベートし、引続き２回インキュベー
ション緩衝液（組成:HEPES50ミリモル、pH7.0、NaCl0.1
5モル/l、クロテインC1％、酒石酸ジナトリウム0.2モル
/1、PEG40.000 0.75％、プルロニックF68 0.5％、フ
ェノール0.01％）で洗浄した。その後に、抗体Ｂとは反
対方向に向いた抗体（抗体Ｃ）のPOD標識したFab断片
（POD活性127mU/ml）と一緒にインキュベートした。接
合体基をHEPES50ミリモル/l、pH7.0、NaCl0.15ミリモル
/l、プルロニックF680.1％を用いる３回の洗浄によって
除去した。次に、標識化の測定のために、PODのための
基質としてABTS［2,2′−アジノ−ジ−３−エチルベン
ズチアゾリン−スルホネート］を添加し、１時間インキ
ュベートし、次いで405nmでの吸光度を光度計（ELISA−
読取り装置）を用いて測定した。較正曲線を、抗体Ａの
Fab断片で抗体Ｂを横方向に架橋することによって得ら
れた。モデルのハイブリッド抗体を用いて調節した。標
準の使用した濃度は、０〜11.5ng/mlであった。
例８ 抗体Ｂの測定 マイクロ滴定板を抗体Ｃ（ニトロフェノールとは反対方
向を向いた）で被覆した。被覆緩衝液は、カーボネート
／ビカーボネート0.2ミリモル/l、pH9.4から成り立って
いた。２時間後、この板を後被覆緩衝液（HEPES50ミリ
モル/l、NaCl0.15モル/l、クロテインC1％、pH7.0）と
一緒に30分間インキュベートした。全ての反応を室温で
振盪させながら実施した。較正曲線を抗体Ｂを有する標
準溶液を用いて調節した。較正試料および細胞上澄み液
を媒体Ｉで希釈し、かつ室温で２時間インキュベートし
た。凹所の吸引濾過およびインキュベーション緩衝液
（HEPES50ミリモル/l、NaCl0.15ミリモル/l、酒石酸ジ
ナトリウム0.2モル/l、クロテインC1％、PEG40000 0.7
5％、プルロニックF68 0.5％、フェノール0.01％、pH
7.0）での２回の洗浄の後、１時間の接合体インキュベ
ーションを行なった。そのために、抗体ＣのFab断片とP
ODとの接合体を使用し、この接合体をインキュベーショ
ン緩衝液中でPOD活性159mU/mlに希釈した。吸引濾過お
よび洗浄緩衝液（HEPES50ミリモル/l、NaCl0.15ミリモ
ル/l、プルロリックF68 0.1％、pH7.0）での凹所の３
回の洗浄の後、60分間基質としてのABTSと反応させた。
吸光度を光度計（ELISA−読取り装置）で405nmの際に49
0nmに対して測定した。試料の濃度を標準構成曲線によ
り測定した。
例９ 抗体ＡおよびABの測定 熱いRSAストレプトアビジン（10μg/ml）を固体相（96
個の凹所を有するマイクロ滴定板、Nunc）で被覆緩衝液
（燐酸カリウム緩衝液pH7.4）中に吸着させた。結合し
ていないストレプトアビジンを注意深く除去し、非特異
性結合部位を後被覆溶液（燐酸カリウム緩衝液50ミリモ
ル/l、NaCl0.15モル/l、RSA1％、7.5）で緩和させた。
較正試料（抗体Ａ＝CK−MM特異性）および培養上澄み液
を塗布前に例６での得られたビオチニル化CK−MM（500n
m/ml）で1:10で希釈した。試料の１時間のインキュベー
ションの後、２回のインキュベーション緩衝液で洗浄し
た。次いで、ヤギの場合に得られた（POD活性130mU/m
l）、マウスIgGのFc部分とは反対方向を向いたPOD標識
化ポリクロナール抗体と一緒に１時間インキュベートし
た。基質ABTSを用いるインキュベーションの後、405nm
での吸光度を光度計（ELISA−読取り装置）で測定し
た。
抗体Ａの含量を抗体（Ａ＋Ｂ）の濃度から抗体（AB）の
濃度を差し引くことによって測定した。
例10 抗体ＡおよびABの測定 マイクロ滴定板をマウスIgGのFcγ部分とは反対方向に
向いたヒツジIgGを用いて重炭酸0.2モル/l/炭酸塩緩衝
液（pH9.5）中で10μg/ml被覆した。結合していない抗
体を除去し、非特異性結合部位を後被覆溶液（燐酸カリ
ウム50ミリモル/l、NaCl0.15モル/l、RSA（牛血清アル
ブミン）１％、pH7.5％）によって飽和した。全ての反
応は、室温で振盪させながら行なった。培養上澄み液を
燐酸カリウム50ミリモル/l、pH7.5、酒石酸ナトリウム
0.2モル、RAS1％を用いて希釈し、かつ１時間インキュ
ベートした。インキュベーション緩衝液を用いて２回の
洗浄の後、インキュベーションをPODと抗体ＣのFab断片
との接合体を用いて行なった（POD活性130mU/ml）。洗
浄の後、ABTSと一緒にインキュベートし、かつ60分間の
後に吸光度を光度計（ELISA−読取り装置）で405nmで測
定した。較正曲線を精製した抗体Ｂを用いて記載した。
抗体Ｂの含量は、抗体Ｂ＋ABの濃度から抗体ABの濃度を
差し引くことによって計算した。
例11 抗体Ａ、ＢおよびABの収量の比較 プラスミドpBMS1CK−MMに対して特異性の抗体Ａを生産
する細胞系MAK33中に導入し、G418耐性コロニーを単離
し、かつ24時間上澄み液中に細胞106個を播種した後、
次のパラメーターを記載したように測定した。
ａ）抗体AB ｂ）抗体Ｂ ｃ）抗体Ａ 結果は、第１表に示してある。
同様の結果は、プラスミドpBMS2を使用した場合にも得
られた。前記バッケル（Buckel）他、Gene51（1987）13
〜19の記載によるハイブリドーマ系MAK33の菌学的性
質： 阻害検定によるクレアチンキナーゼイソ酵素の測定は、
心筋梗塞の診断および監視にとって有用な手段である。
上掲書の著者等は、クレアチンキナーゼＭ−サブユニッ
トの阻害能力を有するモノクロナール抗体を分泌する幾
つかのマウスハイブリドーマ系列を確立した。モノクロ
ナール抗体の１つ（MAK33）は、クレアチンキナーゼーM
Bの活性に影響を及ぼすことなしにクレアチンキナーゼ
ーMMを80％阻害する。２つのモノクロナール抗体の組合
せ物は、クレアチンキナーゼーMMの阻害を99.4％にまで
増大させた。MAK33を分泌するハイブリドーマ細胞のポ
リ（Ａ）+RNAは、単離され、かつこの抗体の重鎖及び軽
鎖の双方のcDNAをクローン化するために使用された。完
全な長さのcDNAクローンは、γ１およびκ定常部を用い
てcDNA試料をハイブリッド化することによって得られ
た。単ペプチドを含む可変領域および５′−非翻訳領域
の一部からの完全なヌクレオチド配列が測定された。
（上掲書、第13頁の「概要」、参照） このことは、サブユニットＭ上での抗体結合部位がイソ
酵素CK−MM上に存在しているけれども、CK−MB上には存
在していないことを示す。この抗体の存在は、CK−MMと
CK−MBとの間にＭの立体配座の相違があることを意味し
ている。サブユニットＭ上のMAK33結合部位は、二量体
のイソ酵素の場合にＢによって覆うことができたけれど
も、Ｍでは覆うことができなかった。（上掲書、第15頁
右欄第７〜16行、参照）
【図面の簡単な説明】
第１図は、発現プラスミドを構築する際の初期構造を示
す遺伝子地図であり、この場合第１図中でＸは、上から
順にEcoxSal、ヌクレアーゼS1、分離指示断片、SalIリ
ンカー、SalI、レリゲートを表わし、 第２図は、発現ベクターを示す遺伝子地図である。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.6 識別記号 庁内整理番号 ＦＩ 技術表示箇所 (Ｃ１２Ｐ 21/08 Ｃ１２Ｒ 1:91） (56)参考文献 Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ ａｎｄ Ｂｉ ｏｐｈｙｓｉｃａｌ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｃｏｍｍｉｎｉｃａｔｉｏｎｓ 164［１ ］（1989）Ｐ．271−276

Claims (1)

    【特許請求の範囲】
  1. 【請求項１】抗原結合部位Ａおよび抗原結合部位Ｂを有
    するヘテロ二重特異性モノクローナル抗体を製造する方
    法において、抗原結合部位Ａを有する抗体を分泌するハ
    イブリドーマ細胞系から少なくとも遺伝子を、軽鎖およ
    び重鎖の可変部分ならびにcH1領域に対して単離し、真
    核プラスミドベクター中に挿入し、この発現ベクターを
    抗原結合部位Ｂを有する抗体を分泌するハイブリドーマ
    細胞系中に導入し、この細胞系を培養し、抗体を取得
    し、二重特異性抗体を分離することを特徴とする、ヘテ
    ロ二重特異性モノクローナル抗体の製造法。
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