JPH11225758A - 組換えｄｎａタンパクの製造方法 - Google Patents
組換えｄｎａタンパクの製造方法Info
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- JPH11225758A JPH11225758A JP10322472A JP32247298A JPH11225758A JP H11225758 A JPH11225758 A JP H11225758A JP 10322472 A JP10322472 A JP 10322472A JP 32247298 A JP32247298 A JP 32247298A JP H11225758 A JPH11225758 A JP H11225758A
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- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
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- C07K16/40—Immunoglobulins [IG], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against enzymes
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Abstract
(57)【要約】
【課題】 Ｆｖ構造体の提供
【解決手段】 組換えＤＮＡ技術を使って、ドメインの
一方または両方が、Ｎ末端に可変ドメインを、Ｃ末端に
酵素、リガンドまたはトキシンを有する融合蛋白質から
なるＦｖ構造体の創製。
一方または両方が、Ｎ末端に可変ドメインを、Ｃ末端に
酵素、リガンドまたはトキシンを有する融合蛋白質から
なるＦｖ構造体の創製。
Description
【０００１】
【発明の属する技術分野】本発明は組換えＤＮＡタン白
の製造法、特に組換えＤＮＡ技術により抗体Ｆｖ断片を
製造する方法に関する。以下の記述では、多くの文献に
言及する。これらは名前と番号を〔 〕にて示す。文献
の完全な情報は末尾に番号順に示す。
の製造法、特に組換えＤＮＡ技術により抗体Ｆｖ断片を
製造する方法に関する。以下の記述では、多くの文献に
言及する。これらは名前と番号を〔 〕にて示す。文献
の完全な情報は末尾に番号順に示す。
【０００２】天然の抗体分子の構造は周知である。即
ち、４個の鎖、２個の重鎖および２個の軽鎖から成り、
そのＮ−末端は整列している。抗体の各鎖は比較的フレ
キシブルなアミノ酸配列により他のドメインに結合した
多くのドメインを形成する。軽鎖はＣ−末端不変ドメイ
ンに結合したＮ−末端可変ドメインから成る。重鎖はＮ
−末端可変ドメインと３個以上の不変ドメインから成
る。各対の軽鎖と重鎖可変ドメインは共同して、抗原結
合領域を形成する。
ち、４個の鎖、２個の重鎖および２個の軽鎖から成り、
そのＮ−末端は整列している。抗体の各鎖は比較的フレ
キシブルなアミノ酸配列により他のドメインに結合した
多くのドメインを形成する。軽鎖はＣ−末端不変ドメイ
ンに結合したＮ−末端可変ドメインから成る。重鎖はＮ
−末端可変ドメインと３個以上の不変ドメインから成
る。各対の軽鎖と重鎖可変ドメインは共同して、抗原結
合領域を形成する。
【０００３】抗体の抗原結合（又は可変）領域（各々は
軽鎖と重鎖可変ドメインから成る）を注意深くタン白分
解的消化により、残りから分離できることは２・３の単
離例にて報告された。この分離領域は一般にＦｖ領域と
して知られている。単離された重鎖又は軽鎖可変ドメイ
ンはダイマー化して擬−Ｆｖ領域を得ることが出来るこ
とも公知である。
軽鎖と重鎖可変ドメインから成る）を注意深くタン白分
解的消化により、残りから分離できることは２・３の単
離例にて報告された。この分離領域は一般にＦｖ領域と
して知られている。単離された重鎖又は軽鎖可変ドメイ
ンはダイマー化して擬−Ｆｖ領域を得ることが出来るこ
とも公知である。
【０００４】Ｆｖ領域又は擬−Ｆｖ領域（以下Ｆｖ断片
とまとめて呼ぶ）は診断薬又は治療剤として使用できる
ことも示唆された。例えば、放射能標識したＦｖ断片は
身体中の腫瘍を探すのに使われた。Ｆｖ構造に結合され
ている細胞毒剤は化学治療剤として使用できる。Ｆｖ断
片は全抗体分子即ちＦａｂ又はＦ（ａｂ′）2 断片と比
べて比較的小さいから、この断片はそのターゲットに容
易に達することができ、ターゲットに多量結合でき、か
つ患者から速かに除くことができることも推測された。
とまとめて呼ぶ）は診断薬又は治療剤として使用できる
ことも示唆された。例えば、放射能標識したＦｖ断片は
身体中の腫瘍を探すのに使われた。Ｆｖ構造に結合され
ている細胞毒剤は化学治療剤として使用できる。Ｆｖ断
片は全抗体分子即ちＦａｂ又はＦ（ａｂ′）2 断片と比
べて比較的小さいから、この断片はそのターゲットに容
易に達することができ、ターゲットに多量結合でき、か
つ患者から速かに除くことができることも推測された。
【０００５】タン白分解的切断によりＦｖ領域をつくる
のは実験室条件下でも難しく、実際上工業的見地から実
施不能である。組換えＤＮＡ技術を使ってＦｖ断片を微
生物につくらせることはムーアとザファロニ〔１〕によ
り提案された。しかし、Ｆｖ断片を生産するのに必要な
遺伝情報を含むように形質転換された微生物は必要なタ
ン白を合成しうるが、活性Ｆｖ断片を得るのは非常に難
しいことが分かった。合成されたタン白は微生物中の不
溶性封入体に通常見られる。Ｆｖ断片を得るために、フ
ィールド等〔２〕に記載されるように、微生物構造を破
壊し、タン白を分離しついでタン白を再変性する必要が
ある。しかし、このような方法により得たＦｖ断片の収
量は低い。
のは実験室条件下でも難しく、実際上工業的見地から実
施不能である。組換えＤＮＡ技術を使ってＦｖ断片を微
生物につくらせることはムーアとザファロニ〔１〕によ
り提案された。しかし、Ｆｖ断片を生産するのに必要な
遺伝情報を含むように形質転換された微生物は必要なタ
ン白を合成しうるが、活性Ｆｖ断片を得るのは非常に難
しいことが分かった。合成されたタン白は微生物中の不
溶性封入体に通常見られる。Ｆｖ断片を得るために、フ
ィールド等〔２〕に記載されるように、微生物構造を破
壊し、タン白を分離しついでタン白を再変性する必要が
ある。しかし、このような方法により得たＦｖ断片の収
量は低い。
【０００６】スケラとプラックサン〔３〕が確認してい
ることは、バクテリア宿主細胞を使って組換えＤＮＡ技
術により機能的Ｆｖ断片を生産することは不可能である
と信じられていた。しかし、彼等は、Ｅ．ｃｏｌｉ中に
機能的抗−ホスホリルコリンＦｖ断片を生産できる特定
の発現系を開発した。ほんの少量のタン白（０．２ｍｇ
／ｌ培養物）がこの発現系により得られた。即ち、この
開発された系が工業的生産を可能とするかどうかの問題
は残っている。特定の発現系が別のバクテリア系の他の
抗体から誘導されたＦｖ断片を得るのに使用できるかど
うかも未解決である。
ることは、バクテリア宿主細胞を使って組換えＤＮＡ技
術により機能的Ｆｖ断片を生産することは不可能である
と信じられていた。しかし、彼等は、Ｅ．ｃｏｌｉ中に
機能的抗−ホスホリルコリンＦｖ断片を生産できる特定
の発現系を開発した。ほんの少量のタン白（０．２ｍｇ
／ｌ培養物）がこの発現系により得られた。即ち、この
開発された系が工業的生産を可能とするかどうかの問題
は残っている。特定の発現系が別のバクテリア系の他の
抗体から誘導されたＦｖ断片を得るのに使用できるかど
うかも未解決である。
【０００７】したがって、組換えＤＮＡ技術によりＦｖ
断片を好収率で生産可能なことが望ましい。本発明によ
れば、以下の工程から成るＦｖ断片を製造する方法が提
供される。即ち、抗体軽鎖又は重鎖の可変ドメインのみ
をコードするＤＮＡ配列を有するオペロンを含む真核発
現ベクターで真核宿主細胞を形質転換し、
断片を好収率で生産可能なことが望ましい。本発明によ
れば、以下の工程から成るＦｖ断片を製造する方法が提
供される。即ち、抗体軽鎖又は重鎖の可変ドメインのみ
をコードするＤＮＡ配列を有するオペロンを含む真核発
現ベクターで真核宿主細胞を形質転換し、
【０００８】この形質転換した宿主細胞を、ＤＮＡ配列
によりコードされたタン白を合成させる条件下で培養
し、ついで合成されたタン白を集取する工程である。Ｆ
ｖ断片の鎖を引き出しそして十分機能的なＦｖ断片を培
養上澄液に生産されるように、宿主細胞により正しく組
立てることが望ましい。
によりコードされたタン白を合成させる条件下で培養
し、ついで合成されたタン白を集取する工程である。Ｆ
ｖ断片の鎖を引き出しそして十分機能的なＦｖ断片を培
養上澄液に生産されるように、宿主細胞により正しく組
立てることが望ましい。
【０００９】望ましい別法として、宿主細胞をそれぞれ
相補的重鎖又は軽鎖可変ドメインをコードするＤＮＡ配
列をもつオペロンを含む第２の真核発現ベクターで形質
転換するものである。第２の望ましい別法では、第１の
発現ベクターはそれぞれ相補的重鎖又は軽鎖可変ドメイ
ンをコードするＤＮＡ配列を含む第２のオペロンを有す
る。どちらの場合でも、翻訳産物は軽鎖と重鎖可変ドメ
インのダイマーから成るＦｖ断片である。
相補的重鎖又は軽鎖可変ドメインをコードするＤＮＡ配
列をもつオペロンを含む第２の真核発現ベクターで形質
転換するものである。第２の望ましい別法では、第１の
発現ベクターはそれぞれ相補的重鎖又は軽鎖可変ドメイ
ンをコードするＤＮＡ配列を含む第２のオペロンを有す
る。どちらの場合でも、翻訳産物は軽鎖と重鎖可変ドメ
インのダイマーから成るＦｖ断片である。
【００１０】必要なら、各可変ドメインはＣ−末端に融
合した酵素、リガンド又はトキシンの如きエフェクター
タン白を有する融合タン白として発現させることができ
る。このエフェクタータン白は、イメージ用の放射活性
又はフルオレッセン分子を結合し、又は治療用細胞毒剤
を結合するのに使用することができる。この場合、各オ
ペロンは読み枠中、可変ドメインコード配列に連結した
エフェクタータン白をコードするＤＮＡ配列を含む。
合した酵素、リガンド又はトキシンの如きエフェクター
タン白を有する融合タン白として発現させることができ
る。このエフェクタータン白は、イメージ用の放射活性
又はフルオレッセン分子を結合し、又は治療用細胞毒剤
を結合するのに使用することができる。この場合、各オ
ペロンは読み枠中、可変ドメインコード配列に連結した
エフェクタータン白をコードするＤＮＡ配列を含む。
【００１１】この各可変ドメインが別個に翻訳される場
合、生産されたＦｖ断片は非共有結合によってのみ一緒
に保持される。したがって、Ｆｖ断片は例えばｐＨを下
げることにより解離し易い。Ｆｖ断片の安定性を改善す
るために、各ＤＮＡをコードする配列をその３′末端で
変えることができ、１つ以上のシステイン残基は各可変
ドメインのＣ−末端で生産される。このような改変を行
なうと、ダイマー中の可変ドメインはＳ−Ｓ結合により
連結するようになり得る。このことはＦｖ断片の組立て
も促進しうる。
合、生産されたＦｖ断片は非共有結合によってのみ一緒
に保持される。したがって、Ｆｖ断片は例えばｐＨを下
げることにより解離し易い。Ｆｖ断片の安定性を改善す
るために、各ＤＮＡをコードする配列をその３′末端で
変えることができ、１つ以上のシステイン残基は各可変
ドメインのＣ−末端で生産される。このような改変を行
なうと、ダイマー中の可変ドメインはＳ−Ｓ結合により
連結するようになり得る。このことはＦｖ断片の組立て
も促進しうる。
【００１２】別法として、Ｆｖフラグメントは第一可変
ドメインをコードする第一ＤＮＡ配列および第二可変ド
メインをコードする第二ＤＮＡ配列をオペロン中に有す
るベクターの使用により安定化させることができる。こ
の第一配列および第二配列は結合ペプチド配列をコード
する第三ＤＮＡ配列により連結されている。この方法に
類似する提案はＬａｎｄｅｒおよびＢｉｒｄにより記載
されている〔４〕。これらのドメインをコードする配列
は、翻訳産物において、第一可変ドメインが、第二可変
ドメインの正常Ｎ−末端に、結合ペプチド配列により連
結された、そのＣ−末端を有するように配列させること
ができる。この場合に、結合ペプチド配列は、妥当な長
さと柔軟性とを有する必要がある。
ドメインをコードする第一ＤＮＡ配列および第二可変ド
メインをコードする第二ＤＮＡ配列をオペロン中に有す
るベクターの使用により安定化させることができる。こ
の第一配列および第二配列は結合ペプチド配列をコード
する第三ＤＮＡ配列により連結されている。この方法に
類似する提案はＬａｎｄｅｒおよびＢｉｒｄにより記載
されている〔４〕。これらのドメインをコードする配列
は、翻訳産物において、第一可変ドメインが、第二可変
ドメインの正常Ｎ−末端に、結合ペプチド配列により連
結された、そのＣ−末端を有するように配列させること
ができる。この場合に、結合ペプチド配列は、妥当な長
さと柔軟性とを有する必要がある。
【００１３】第一および第二のドメインをコードする配
列は、同一ドメインをコードすることができるが、好ま
しくは相補的軽鎖ドメインと重鎖ドメインとをコードす
る。この場合に、所望により、１個だけのエフェクター
タンパク質をＦｖフラグメントに融合させることができ
る。
列は、同一ドメインをコードすることができるが、好ま
しくは相補的軽鎖ドメインと重鎖ドメインとをコードす
る。この場合に、所望により、１個だけのエフェクター
タンパク質をＦｖフラグメントに融合させることができ
る。
【００１４】ＤＮＡをコードする配列（１つまたはそれ
以上）はｃＤＮＡ、ゲノムＤＮＡまたはその混合物を含
有することができる。好ましくは、これらのコード配列
は、モノクローナル抗体、有利には、マウスモノクロー
ナル抗体に由来するものである。これらのコード配列は
「天然」配列であることができ、あるいは「ヒューマナ
イズ化」配列であることができる。このヒューマナイズ
化配列は一つの種からのモノクローナル抗体からの相補
性決定領域（ＣＤＲｓ）が別の種からのフレームワーク
領域（ＦＲｓ）上にグラフトされたもである。「ヒュー
マナイズ化」抗体に使用することができる技術はＲｅｉ
ｃｈｍａｎｎ等により記載されている〔５〕。
以上）はｃＤＮＡ、ゲノムＤＮＡまたはその混合物を含
有することができる。好ましくは、これらのコード配列
は、モノクローナル抗体、有利には、マウスモノクロー
ナル抗体に由来するものである。これらのコード配列は
「天然」配列であることができ、あるいは「ヒューマナ
イズ化」配列であることができる。このヒューマナイズ
化配列は一つの種からのモノクローナル抗体からの相補
性決定領域（ＣＤＲｓ）が別の種からのフレームワーク
領域（ＦＲｓ）上にグラフトされたもである。「ヒュー
マナイズ化」抗体に使用することができる技術はＲｅｉ
ｃｈｍａｎｎ等により記載されている〔５〕。
【００１５】本発明の第二の態様に従い、ドメインの一
方または両方がそのＮ−末端部位に可変ドメインを有
し、かつまた、そのＣ−末端部位に、酵素、リガンドま
たはトキシンを有する融合タンパク質よりなる、Ｆｖ構
造が提供される。
方または両方がそのＮ−末端部位に可変ドメインを有
し、かつまた、そのＣ−末端部位に、酵素、リガンドま
たはトキシンを有する融合タンパク質よりなる、Ｆｖ構
造が提供される。
【００１６】これらのドメインをコードする配列は、オ
ペロンでプロモーターの制御の下にある。好ましくは、
このプロモーターはヒトサイトメガロウイルス（ＨＣＭ
Ｖ）メジャーイメディエートアーリィ（ＭＩＥ）遺伝子
からのプロモーターのような強力なプロモーターであ
る。
ペロンでプロモーターの制御の下にある。好ましくは、
このプロモーターはヒトサイトメガロウイルス（ＨＣＭ
Ｖ）メジャーイメディエートアーリィ（ＭＩＥ）遺伝子
からのプロモーターのような強力なプロモーターであ
る。
【００１７】形質転換させる、真核宿主細胞は、好まし
くは、哺乳動物細胞であり、たとえばＣＨＯ細胞を使用
することができる。しかしながら、宿主細胞はミエロイ
ド細胞、特に、形質転換される前には、完全抗体または
軽鎖を分泌しないミエローマ細胞は最も好ましい。この
ような細胞系は充分に知られており、広く入手すること
ができる。
くは、哺乳動物細胞であり、たとえばＣＨＯ細胞を使用
することができる。しかしながら、宿主細胞はミエロイ
ド細胞、特に、形質転換される前には、完全抗体または
軽鎖を分泌しないミエローマ細胞は最も好ましい。この
ような細胞系は充分に知られており、広く入手すること
ができる。
【００１８】本発明で使用するのに適する発現ベクター
を製造することができ、そして宿主細胞中にトランスフ
ォームすることができる技術は、当技術でよく知られて
おり、たとえばＭａｎｉａｔｉｓにより開示されている
〔６〕。
を製造することができ、そして宿主細胞中にトランスフ
ォームすることができる技術は、当技術でよく知られて
おり、たとえばＭａｎｉａｔｉｓにより開示されている
〔６〕。
【００１９】形質転換された宿主細胞によって製造され
たＦｖフラグメントは、現在利用できる、方法のいずれ
によっても採取することができる。一例として、抗原は
クロマトグラフィメジウム上に不動化させることがで
き、培養上澄液をこのメジウム上に通す。これにより、
Ｆｖフラグメントは上澄液中の残りの成分から分離され
る。
たＦｖフラグメントは、現在利用できる、方法のいずれ
によっても採取することができる。一例として、抗原は
クロマトグラフィメジウム上に不動化させることがで
き、培養上澄液をこのメジウム上に通す。これにより、
Ｆｖフラグメントは上澄液中の残りの成分から分離され
る。
【００２０】本発明はまた、本発明の方法で使用するた
めの真核細胞発現ベクター、このベクターで形質転換さ
れた真核宿主細胞、および本発明の方法により製造され
るＦｖフラグメントを包含する。
めの真核細胞発現ベクター、このベクターで形質転換さ
れた真核宿主細胞、および本発明の方法により製造され
るＦｖフラグメントを包含する。
【００２１】微生物における組換えＤＮＡ技術を使用し
て容易に採取できる量の官能性Ｆｖ構造体を製造するこ
とには失敗していたことから（ＳｋｅｒｒａおよびＰｌ
ｕｃｋｔｈｕｍの特別の発現系〔３〕を使用する場合を
除く）、Ｆｖを真核細胞内で、培養培地中に分泌される
安定な産物として、良好な収率で製造できることは驚く
べきことである。約１０ｍｇ／培養物１リットルのＦｖ
の収率が得られ、この改良された収率はこの真核細胞発
現系がさらに発展することを予想させる。従って、本発
明は、組換えＤＮＡ技術によって、Ｆｖ構造体を商業的
に有用な量で製造することを可能にするという、予想外
の利益を提供する。さらに、真核宿主細胞を使用する利
点には、分泌されたＦｖ構造体が代表的に、細菌発熱物
質の不存在の下に製造されることにある。
て容易に採取できる量の官能性Ｆｖ構造体を製造するこ
とには失敗していたことから（ＳｋｅｒｒａおよびＰｌ
ｕｃｋｔｈｕｍの特別の発現系〔３〕を使用する場合を
除く）、Ｆｖを真核細胞内で、培養培地中に分泌される
安定な産物として、良好な収率で製造できることは驚く
べきことである。約１０ｍｇ／培養物１リットルのＦｖ
の収率が得られ、この改良された収率はこの真核細胞発
現系がさらに発展することを予想させる。従って、本発
明は、組換えＤＮＡ技術によって、Ｆｖ構造体を商業的
に有用な量で製造することを可能にするという、予想外
の利益を提供する。さらに、真核宿主細胞を使用する利
点には、分泌されたＦｖ構造体が代表的に、細菌発熱物
質の不存在の下に製造されることにある。
【００２２】もう一つの驚くべき特徴は、Ｆｖフラグメ
ントを、ＢＩＰ（重鎖結合タンパク質）のための結合部
位がＦｖフラグメント中に存在しなくても、適当に組立
てることができることにある。ＢＩＰの結合が抗体の正
しい組立てを確実にするために必須であるものと推測さ
れていた。
ントを、ＢＩＰ（重鎖結合タンパク質）のための結合部
位がＦｖフラグメント中に存在しなくても、適当に組立
てることができることにある。ＢＩＰの結合が抗体の正
しい組立てを確実にするために必須であるものと推測さ
れていた。
【００２３】本発明の方法は、いずれのＦｖフラグメン
トにも一般的に適用することができ、従って、所望の特
異性を有するＦｖフラグメントを容易な方法で製造する
ことを可能にするものと信じられる。さらにまた、Ｆｖ
フラグメントを哺乳動物で製造することができるので、
インビボにおいてそれらを使用するための調節を容易に
うることができる。
トにも一般的に適用することができ、従って、所望の特
異性を有するＦｖフラグメントを容易な方法で製造する
ことを可能にするものと信じられる。さらにまた、Ｆｖ
フラグメントを哺乳動物で製造することができるので、
インビボにおいてそれらを使用するための調節を容易に
うることができる。
【００２４】ここに、本発明の若干の態様を、図面を引
用して例示だけの目的で示す。これらの図面において、
図１は、ヒューマナイズ化抗−リゾチームＦｖフラグメ
ントの産生に使用するためのベクターの構築を示すもの
である；図２は、図１のベクターに使用されたリシェイ
プ化ＨｕＶＬＬＹＳ遺伝子のヌクレオチド配列および相
当するアミノ酸配列を示すものである；図３は、抗−Ｔ
ＡＧ７２Ｆｖフラグメントの製造に使用するためのベク
ターの構築を示すものである；そして図４は、Ｂ７２．
３ＦｖのＳＤＳポリアクリルアミドゲルのフルオログラ
フを示すものである。
用して例示だけの目的で示す。これらの図面において、
図１は、ヒューマナイズ化抗−リゾチームＦｖフラグメ
ントの産生に使用するためのベクターの構築を示すもの
である；図２は、図１のベクターに使用されたリシェイ
プ化ＨｕＶＬＬＹＳ遺伝子のヌクレオチド配列および相
当するアミノ酸配列を示すものである；図３は、抗−Ｔ
ＡＧ７２Ｆｖフラグメントの製造に使用するためのベク
ターの構築を示すものである；そして図４は、Ｂ７２．
３ＦｖのＳＤＳポリアクリルアミドゲルのフルオログラ
フを示すものである。
【００２５】例 １ 抗体Ｄ１．３（リゾチームに特異的なマウスモノクロー
ナル抗体（Ｖｅｒｈｏｅｙｅｎ ｅｔ ａｌ．〔７〕）
の重鎖可変領域を、ヒトミエローマＮＥＷ（Ｓａｕｌ
ｅｔ ａｌ．〔８〕）によって産生されるモノクローナ
ル抗体をＦＲをコードするＤＮＡ配列にそのＣＤＲをコ
ードするＤＮＡ配列をグラフトすることによってヒュー
マナイズした。Ｂｅｎｃｅ Ｊｏｎｅｓ蛋白ＲＥＩ配列
（Ｅｐｐｅｔ ａｌ．〔１０〕）に似たヒトカッパ鎖コ
ンセンサス配列のＦＲ（Ｋａｂａｔ ｅｔ ａｌ．
ナル抗体（Ｖｅｒｈｏｅｙｅｎ ｅｔ ａｌ．〔７〕）
の重鎖可変領域を、ヒトミエローマＮＥＷ（Ｓａｕｌ
ｅｔ ａｌ．〔８〕）によって産生されるモノクローナ
ル抗体をＦＲをコードするＤＮＡ配列にそのＣＤＲをコ
ードするＤＮＡ配列をグラフトすることによってヒュー
マナイズした。Ｂｅｎｃｅ Ｊｏｎｅｓ蛋白ＲＥＩ配列
（Ｅｐｐｅｔ ａｌ．〔１０〕）に似たヒトカッパ鎖コ
ンセンサス配列のＦＲ（Ｋａｂａｔ ｅｔ ａｌ．
〔９〕）をコードするＤＮＡ配列にそのＣＤＲをコード
するＤＮＡ配列をグラフトすることによってＤ１．３の
軽鎖可変領域もヒューマナイズした。Ｒｅｉｃｈｍａｎ
ｎ ｅｔ ａｌ．〔４〕の方法に従って、長いオリゴヌ
クレオチドについての部位特異的突然変異を用いてグラ
フトを実施した。
するＤＮＡ配列をグラフトすることによってＤ１．３の
軽鎖可変領域もヒューマナイズした。Ｒｅｉｃｈｍａｎ
ｎ ｅｔ ａｌ．〔４〕の方法に従って、長いオリゴヌ
クレオチドについての部位特異的突然変異を用いてグラ
フトを実施した。
【００２６】Ｆｖ構造の発現については、ヒューマナイ
ズ化軽鎖及び重鎖可変領域のコード配列の３′未満にス
トップコドンを導入した。
ズ化軽鎖及び重鎖可変領域のコード配列の３′未満にス
トップコドンを導入した。
【００２７】最初の構築では、イムノグロブリン重鎖プ
ロモーター／エンハンサー配列（Ｖｅｒｈｏｅｙｅｎ
ｅｔ ａｌ．〔７〕）のコントロール下とは独立に、シ
ングルベクター中にコード配列を挿入した。第２の構築
では、ＨＣＭＶ−ＭＩＥ遺伝子プロモーター／エンハン
サー配列（Ｓｔｅｎｂｅｒｇ ｅｔ ａｌ．〔１１〕と
Ｂｏｓｈａｒｔ ｅｔ ａｌ．〔１２〕）のコントロー
ル下にそれぞれのコード配列を挿入した。ＨＣＭＶ配列
のＲＮＡスタート部位を利用して、可変領域コード配列
の５′未満でシグナル配列の５′フランキング配列にＨ
ＣＭＶ−ＭＩＥ遺伝子プロモーター／エンハンサー配列
を融合させた。第２の構築体ｐＬＲ1 は図１に示した。
ロモーター／エンハンサー配列（Ｖｅｒｈｏｅｙｅｎ
ｅｔ ａｌ．〔７〕）のコントロール下とは独立に、シ
ングルベクター中にコード配列を挿入した。第２の構築
では、ＨＣＭＶ−ＭＩＥ遺伝子プロモーター／エンハン
サー配列（Ｓｔｅｎｂｅｒｇ ｅｔ ａｌ．〔１１〕と
Ｂｏｓｈａｒｔ ｅｔ ａｌ．〔１２〕）のコントロー
ル下にそれぞれのコード配列を挿入した。ＨＣＭＶ配列
のＲＮＡスタート部位を利用して、可変領域コード配列
の５′未満でシグナル配列の５′フランキング配列にＨ
ＣＭＶ−ＭＩＥ遺伝子プロモーター／エンハンサー配列
を融合させた。第２の構築体ｐＬＲ1 は図１に示した。
【００２８】リシェイプ化軽鎖可変領域ＨｕＶＬＬＹＳ
及びリシェイプ化重鎖可変領域ＨｕＶＨＬＹＳ（Ｖｅｒ
ｈｏｅｙｅｎ ｅｔ ａｌ．〔７〕）をそれぞれＭ１３
中にＨｉｎｄ ＩＩＩ−ＢａｍＨ Ｉフラグメントとし
てクローン化した。リシェイプ化ＨｕＶＬＬＹＳ遺伝子
のヌクレオチド配列及び対応するアミノ酸配列を図２に
示した。それぞれのコード配列の３′未満に、２つのス
トップコドン次いでＳａｃ Ｉ部位を部位特異的突然変
異により導入した。
及びリシェイプ化重鎖可変領域ＨｕＶＨＬＹＳ（Ｖｅｒ
ｈｏｅｙｅｎ ｅｔ ａｌ．〔７〕）をそれぞれＭ１３
中にＨｉｎｄ ＩＩＩ−ＢａｍＨ Ｉフラグメントとし
てクローン化した。リシェイプ化ＨｕＶＬＬＹＳ遺伝子
のヌクレオチド配列及び対応するアミノ酸配列を図２に
示した。それぞれのコード配列の３′未満に、２つのス
トップコドン次いでＳａｃ Ｉ部位を部位特異的突然変
異により導入した。
【００２９】それぞれの遺伝子のリーダー配列の翻訳ス
タート部位とＲＮＡスタート部位との間に、図２に示し
たようにＨｉｎｄ ＩＩＩ部位を導入した。得られる可
変領域遺伝子をｐＳＶｇｐｔベクター（Ｍｕｌｌｉｇａ
ｎとＢｅｒｇ〔１４〕）にＨｉｎｄ ＩＩＩ−ＢａｍＨ
Ｉフラグメントとしてクローン化した。このベクター
は、リンカー（Ｎｅｕｂｅｒｇｅｒ ｅｔ ａｌ．〔１
５〕）としてＩｇ−重鎖エンハンサー（Ｉｇ Ｈｅｎ
ｈ）のＥｃｏＲ Ｉ−Ｈｉｎｄ ＩＩＩフラグメントを
有していた。それぞれの遺伝子の３′Ｓａｃ Ｉ−Ｂａ
ｍＨ Ｉフラグメントを次いで、ヒトカッパ定常領域
（３′未満Ｃｋ）（Ｈｉｅｔｅｒ ｅｔ ａｌ．〔１
３〕）のＳａｃ Ｉ−ＢａｍＨ Ｉフラグメントと交換
し、ポリアデニレーションシグナルを得た。それぞれの
ベクターのＨｉｎｄ ＩＩＩ部位に、エンハンサー、プ
ロモーター及び第１非翻訳化エクソン（ＨＣＭＶ ｅｎ
ｈ−ｐｒｏ）を含有するＨＣＭ−ＭＩＥ遺伝子のＨｉｎ
ｄ ＩＩＩフラグメント（Ｓｔｅｎｂｅｒｇ ｅｔ ａ
ｌ．〔１１〕とＢｏｓｈａｒｔ ｅｔ ａｌ．〔１
２〕）をクローン化した。次いで、完全ＶＬ−遺伝子
（Ｉｇ−エンハンサー、ＨＣＭＶ−プロモーター、ＶＬ
−コード領域及びポリアデニル化シグナルを含有する）
をｐＢＧＳ １８（Ｓｐｒａｔｔ ｅｔ ａｌ．〔１
６〕）にＥｃｏＲ Ｉフラグメントとしてサブクローン
化し、得られるベクターｐＢＧＳ−ＨｖＶＬＬＹＳ図１
に示すようにＢａｍＨ Ｉ−フラグメントとしてｐＳＶ
ｇｐｔ−ＨｖＶＨＬＹＳベクターにクローン化した。最
終プラスミドｐＬＲ Ｉは、更に、薬剤アンピシリン
（ａｍｐR ）、カナマイシン（ＫａｎR ）及びマイコフ
ェノール酸（Ｅｃｏ ｇｐｔ）の耐性遺伝子、２つのｃ
ｏｌＥ Ｉ複製オリジン（ｃｏｌＥ ｏｒｉ）及びＳＶ
４０エンハンサー（ＳＶ４０ ｅｎｈ−ｐｒｏ）を含ん
でいた。クローニングに用いたＢａｍＨ Ｉ（Ｂ）、Ｈ
ｉｎｄ ＩＩＩ（Ｈ）、ＥｃｏＲＩ（Ｅ）及びＳａｃ
Ｉ（Ｓ）を示した。
タート部位とＲＮＡスタート部位との間に、図２に示し
たようにＨｉｎｄ ＩＩＩ部位を導入した。得られる可
変領域遺伝子をｐＳＶｇｐｔベクター（Ｍｕｌｌｉｇａ
ｎとＢｅｒｇ〔１４〕）にＨｉｎｄ ＩＩＩ−ＢａｍＨ
Ｉフラグメントとしてクローン化した。このベクター
は、リンカー（Ｎｅｕｂｅｒｇｅｒ ｅｔ ａｌ．〔１
５〕）としてＩｇ−重鎖エンハンサー（Ｉｇ Ｈｅｎ
ｈ）のＥｃｏＲ Ｉ−Ｈｉｎｄ ＩＩＩフラグメントを
有していた。それぞれの遺伝子の３′Ｓａｃ Ｉ−Ｂａ
ｍＨ Ｉフラグメントを次いで、ヒトカッパ定常領域
（３′未満Ｃｋ）（Ｈｉｅｔｅｒ ｅｔ ａｌ．〔１
３〕）のＳａｃ Ｉ−ＢａｍＨ Ｉフラグメントと交換
し、ポリアデニレーションシグナルを得た。それぞれの
ベクターのＨｉｎｄ ＩＩＩ部位に、エンハンサー、プ
ロモーター及び第１非翻訳化エクソン（ＨＣＭＶ ｅｎ
ｈ−ｐｒｏ）を含有するＨＣＭ−ＭＩＥ遺伝子のＨｉｎ
ｄ ＩＩＩフラグメント（Ｓｔｅｎｂｅｒｇ ｅｔ ａ
ｌ．〔１１〕とＢｏｓｈａｒｔ ｅｔ ａｌ．〔１
２〕）をクローン化した。次いで、完全ＶＬ−遺伝子
（Ｉｇ−エンハンサー、ＨＣＭＶ−プロモーター、ＶＬ
−コード領域及びポリアデニル化シグナルを含有する）
をｐＢＧＳ １８（Ｓｐｒａｔｔ ｅｔ ａｌ．〔１
６〕）にＥｃｏＲ Ｉフラグメントとしてサブクローン
化し、得られるベクターｐＢＧＳ−ＨｖＶＬＬＹＳ図１
に示すようにＢａｍＨ Ｉ−フラグメントとしてｐＳＶ
ｇｐｔ−ＨｖＶＨＬＹＳベクターにクローン化した。最
終プラスミドｐＬＲ Ｉは、更に、薬剤アンピシリン
（ａｍｐR ）、カナマイシン（ＫａｎR ）及びマイコフ
ェノール酸（Ｅｃｏ ｇｐｔ）の耐性遺伝子、２つのｃ
ｏｌＥ Ｉ複製オリジン（ｃｏｌＥ ｏｒｉ）及びＳＶ
４０エンハンサー（ＳＶ４０ ｅｎｈ−ｐｒｏ）を含ん
でいた。クローニングに用いたＢａｍＨ Ｉ（Ｂ）、Ｈ
ｉｎｄ ＩＩＩ（Ｈ）、ＥｃｏＲＩ（Ｅ）及びＳａｃ
Ｉ（Ｓ）を示した。
【００３０】エレクトロポレーション（ｐｏｔｔｅｒ
ｅｔ ａｌ．〔１７〕）によって、プラスミドを非産生
ミエローマセルライン（ＮＳＯ Ｇａｌｆｒｅ ｅｔ
ａｌ．〔１８〕）にトランスフェクトした。得られるト
ランスフェクト体をマイコフェノール酸（Ｍｕｌｌｉｇ
ａｎとＢｅｒｇ〔１４〕）で選択した。トランスフェク
ト細胞クローンを、35Ｓ−メチオニン取り込み、リゾチ
ームセファロースを用いた培養上清のアフィニティー精
製及びＳＤＳ−アクリルアミドゲル分析によりスクリー
ニングした。
ｅｔ ａｌ．〔１７〕）によって、プラスミドを非産生
ミエローマセルライン（ＮＳＯ Ｇａｌｆｒｅ ｅｔ
ａｌ．〔１８〕）にトランスフェクトした。得られるト
ランスフェクト体をマイコフェノール酸（Ｍｕｌｌｉｇ
ａｎとＢｅｒｇ〔１４〕）で選択した。トランスフェク
ト細胞クローンを、35Ｓ−メチオニン取り込み、リゾチ
ームセファロースを用いた培養上清のアフィニティー精
製及びＳＤＳ−アクリルアミドゲル分析によりスクリー
ニングした。
【００３１】ＨＣＭＶプロモーターを用いた場合には、
Ｉｇプローモーターを用いた構築体に比べて分泌Ｆｖフ
ラグメントは約１００−１０００倍多かった。Ｆｖフラ
グメントの調製に用いたクローン化セルラインは、ロー
ラーボトル中で生育させた時は約８ｍｇ／ｌを分泌し
た。かくして、インタクト抗体の組換え体と同様の収率
で、ミエローマ細胞中にてＦｖフラグメントを産生する
ことが可能となる。
Ｉｇプローモーターを用いた構築体に比べて分泌Ｆｖフ
ラグメントは約１００−１０００倍多かった。Ｆｖフラ
グメントの調製に用いたクローン化セルラインは、ロー
ラーボトル中で生育させた時は約８ｍｇ／ｌを分泌し
た。かくして、インタクト抗体の組換え体と同様の収率
で、ミエローマ細胞中にてＦｖフラグメントを産生する
ことが可能となる。
【００３２】ＳＤＳゲル分析により、Ｆｖフラグメント
は約１２ｋＤ（計算値：ＶＨ＝１２，７４９、ＶＬ＝１
１，８７５）の２つのチェインを有していた。それはリ
ゾチームセファロースにより培養上清から容易に精製さ
れたので、機能的形態で分泌されている。精製Ｆｖフラ
グメントを、リン酸緩衝化生理食塩水（ＰＢＳ）中のＨ
ＰＬＣサイズカラム（Ｂｉｏｚｏｒｂａｘ Ｇ Ｂ２５
０）で調べた所、シングルピークが観察され、その保持
時間は濃度７０及び０．３ｍｇ／ｌでは変化はなかっ
た。
は約１２ｋＤ（計算値：ＶＨ＝１２，７４９、ＶＬ＝１
１，８７５）の２つのチェインを有していた。それはリ
ゾチームセファロースにより培養上清から容易に精製さ
れたので、機能的形態で分泌されている。精製Ｆｖフラ
グメントを、リン酸緩衝化生理食塩水（ＰＢＳ）中のＨ
ＰＬＣサイズカラム（Ｂｉｏｚｏｒｂａｘ Ｇ Ｂ２５
０）で調べた所、シングルピークが観察され、その保持
時間は濃度７０及び０．３ｍｇ／ｌでは変化はなかっ
た。
【００３３】ＦｖフラグメントをｐＨ７．５でネイティ
ブアクリルアミドゲルで分析した。Ｆｖフラグメントは
単一バンドを示し、そこにはＳＤＳゲルで分析した所、
ＶＨ領域とＶＬ領域とが含まれていた。このバンドは、
リゾチーム存在下ではネイティブゲル上でシフトした。
シフトバンドにはリゾチームとＶＨ及びＶＬ領域が含ま
れていた。更に、単離したＶＬ領域は、Ｆｖフラグメン
トとは相違する移動性を示した。単離ＶＨはゲルでは移
動しなかった。これらの結果から、ｐＨ７．５でのＦｖ
フラグメントのプレドミナント体は関連ＶＨ−ＶＬヘテ
ロダイマーであることが強く示唆される。
ブアクリルアミドゲルで分析した。Ｆｖフラグメントは
単一バンドを示し、そこにはＳＤＳゲルで分析した所、
ＶＨ領域とＶＬ領域とが含まれていた。このバンドは、
リゾチーム存在下ではネイティブゲル上でシフトした。
シフトバンドにはリゾチームとＶＨ及びＶＬ領域が含ま
れていた。更に、単離したＶＬ領域は、Ｆｖフラグメン
トとは相違する移動性を示した。単離ＶＨはゲルでは移
動しなかった。これらの結果から、ｐＨ７．５でのＦｖ
フラグメントのプレドミナント体は関連ＶＨ−ＶＬヘテ
ロダイマーであることが強く示唆される。
【００３４】また、超遠心沈降分析による見かけの分子
量は約２３．０５±０．３５ｋＤ（０．７３の部分特異
的容量）であった。
量は約２３．０５±０．３５ｋＤ（０．７３の部分特異
的容量）であった。
【００３５】ＶＨ−ＶＬヘテロダイマーの形成は、蛋白
濃度０．５ｍｇ／ｌでの３．７％ホルムアルデヒド／Ｐ
ＢＳでの架橋により確立された。約２５ｋＤの架橋化Ｖ
Ｈ−ＶＬヘテロダイマーが形成された。このようなヘテ
ロダイマーはリゾチームセファロースに結合する。架橋
化物質をＳＤＳゲルに過剰に負荷した所、わずかに低分
子量の小分画（５％以下）が現われた。ＶＨホモダイマ
ーと考えられる高分子量バンドは観察されなかった。
濃度０．５ｍｇ／ｌでの３．７％ホルムアルデヒド／Ｐ
ＢＳでの架橋により確立された。約２５ｋＤの架橋化Ｖ
Ｈ−ＶＬヘテロダイマーが形成された。このようなヘテ
ロダイマーはリゾチームセファロースに結合する。架橋
化物質をＳＤＳゲルに過剰に負荷した所、わずかに低分
子量の小分画（５％以下）が現われた。ＶＨホモダイマ
ーと考えられる高分子量バンドは観察されなかった。
【００３６】それにもかかわらず、Ｆｖフラグメントは
ｐＨ４．５でネイティブアクリルアミドゲル上で溶解し
た。ＶＨとＶＬとはそれぞれ単一バンドを示した。その
蛋白分解消化を促進するために、歴史的には低ｐＨでの
抗体のインキュベーションが行なわれている。
ｐＨ４．５でネイティブアクリルアミドゲル上で溶解し
た。ＶＨとＶＬとはそれぞれ単一バンドを示した。その
蛋白分解消化を促進するために、歴史的には低ｐＨでの
抗体のインキュベーションが行なわれている。
【００３７】中性ｐＨは、Ｆｖフラグメントが主に関連
している場合は、動的平衡である。精製生合成ラベル化
ＶＨ領域は、非ラベル化ＶＨ−ＶＬヘテロダイマーとイ
ンベートした時にはこの非ラベル化ＶＨ領域と交換し
た。ラベル化ＶＨ−ＶＬヘテロダイマーはホルムアルヒ
ドによる架橋によりトラップできた。試薬の非存在下で
のプレインキュベーションなしに架橋化法により１晩で
平衡に到達するに十分にこの交換は早い。
している場合は、動的平衡である。精製生合成ラベル化
ＶＨ領域は、非ラベル化ＶＨ−ＶＬヘテロダイマーとイ
ンベートした時にはこの非ラベル化ＶＨ領域と交換し
た。ラベル化ＶＨ−ＶＬヘテロダイマーはホルムアルヒ
ドによる架橋によりトラップできた。試薬の非存在下で
のプレインキュベーションなしに架橋化法により１晩で
平衡に到達するに十分にこの交換は早い。
【００３８】本発明方法により得られるタイプの蛋白
は、構造研究及び臨床研究に極めて有用である。異なる
抗原結合部位について同じβ−シートフレームワークを
用いることができるので、ＦｖフラグメントはＮＭＲス
ペクトルシグナルのアサインメントを簡単化する。臨床
応用については、元のＦｖ−フラグメントのフレームワ
ークに応答するプライマリー抗イムノグロブリンを克服
するために新たなフレームワークでのハイパー可変領域
の再使用（それによりその特異性）が役に立つ。架橋は
ある場合には有利であるが、Ｆｖフラグメントの溶解は
診断及び治療用において問題とはならない。ＶＨとＶＬ
領域の架橋は、遺伝子レベルでペプチドリンカーを導入
することにより、この場合にはインタードメインのジス
ルフィド結合を形成するための例えばシステインを含
み、あるいは本明細書で示す化学的方法により可能であ
る。
は、構造研究及び臨床研究に極めて有用である。異なる
抗原結合部位について同じβ−シートフレームワークを
用いることができるので、ＦｖフラグメントはＮＭＲス
ペクトルシグナルのアサインメントを簡単化する。臨床
応用については、元のＦｖ−フラグメントのフレームワ
ークに応答するプライマリー抗イムノグロブリンを克服
するために新たなフレームワークでのハイパー可変領域
の再使用（それによりその特異性）が役に立つ。架橋は
ある場合には有利であるが、Ｆｖフラグメントの溶解は
診断及び治療用において問題とはならない。ＶＨとＶＬ
領域の架橋は、遺伝子レベルでペプチドリンカーを導入
することにより、この場合にはインタードメインのジス
ルフィド結合を形成するための例えばシステインを含
み、あるいは本明細書で示す化学的方法により可能であ
る。
【００３９】例 ２ 抗体Ｂ７２．３、抗腫瘍モノクローナル抗体のＬ鎖およ
びＨ鎖遺伝子（Ｃｏｌｃｈｅｒ他（１９）およびＷｈｉ
ｔｔｌｅ他（２０））を部位指向（ｓｉｔｅ−ｄｉｒｅ
ｃｔｅｄ）変異誘導に処して（Ｋｒａｍｅｒ他（２
１））、ＥｃｏＲＩ制限部位と可変ドメインの３′未満
に翻訳停止部位を導入した。加えて、可変遺伝子配列の
操作を促進するため、ＥｃｏＲ ＶおよびＨｉｎｄ Ｉ
ＩＩ部位をまたＶＬに導入し、ＶＨ中の天然のＰｖｕ
ＩＩおよびＢｇｌ Ｉ部位とマッチさせた。これらの遺
伝子を、別々にまたはタンデムで、ＳＶ−４０ ｐｏｌ
ｙＡ付加配列を有するＨＣＭＶプロモーターの制御下に
発現ベクター中にいれてクローン化した。タンデムに配
置した遺伝子での構築物を図２に示す。これらの構築部
をＣＯＳ Ｉ細胞中で一時的に発現させて試験した。可
変ドメインの合成および分泌は、トランスフェクション
した細胞を35Ｓ−メチオニン（１００ｕＣｉ／１０6 細
胞／ｍｌ、４８時間）で生合成的に標識して検定した。
細胞上清を、ＶＬまたはＶＨのフレームワークエピトー
プと反応させる抗血清でのイムノプレシピテーションに
処した。
びＨ鎖遺伝子（Ｃｏｌｃｈｅｒ他（１９）およびＷｈｉ
ｔｔｌｅ他（２０））を部位指向（ｓｉｔｅ−ｄｉｒｅ
ｃｔｅｄ）変異誘導に処して（Ｋｒａｍｅｒ他（２
１））、ＥｃｏＲＩ制限部位と可変ドメインの３′未満
に翻訳停止部位を導入した。加えて、可変遺伝子配列の
操作を促進するため、ＥｃｏＲ ＶおよびＨｉｎｄ Ｉ
ＩＩ部位をまたＶＬに導入し、ＶＨ中の天然のＰｖｕ
ＩＩおよびＢｇｌ Ｉ部位とマッチさせた。これらの遺
伝子を、別々にまたはタンデムで、ＳＶ−４０ ｐｏｌ
ｙＡ付加配列を有するＨＣＭＶプロモーターの制御下に
発現ベクター中にいれてクローン化した。タンデムに配
置した遺伝子での構築物を図２に示す。これらの構築部
をＣＯＳ Ｉ細胞中で一時的に発現させて試験した。可
変ドメインの合成および分泌は、トランスフェクション
した細胞を35Ｓ−メチオニン（１００ｕＣｉ／１０6 細
胞／ｍｌ、４８時間）で生合成的に標識して検定した。
細胞上清を、ＶＬまたはＶＨのフレームワークエピトー
プと反応させる抗血清でのイムノプレシピテーションに
処した。
【００４０】ＶＨ／ＶＬ構築物をエレクトロポレーショ
ン（ｅｌｅｃｔｒｏｐｏｒａｔｉｏｎ）によりチャイニ
ーズハムスター卵巣細胞（ＣＨＯ）中にトランスフェク
ションした。
ン（ｅｌｅｃｔｒｏｐｏｒａｔｉｏｎ）によりチャイニ
ーズハムスター卵巣細胞（ＣＨＯ）中にトランスフェク
ションした。
【００４１】ＶＨおよびＶＬドメインは、ＣＯＳ細胞上
清中で還元および非還元ＳＤＳポリアクリルアミドゲル
の両方で１４ＫＤ（参照、計算分子量１２．６ＫＤ）お
よび１２ＫＤ（参照、計算分子量１１．８ＫＤ）ポリペ
プチドとして検出された。両ドメインのより高レベルの
発現は明らかに単一ＶＨまたはＶＬプラスミドに比べデ
ュアルＶＨ／ＶＬプラスミドから得られた。ＶＨは両方
の標識ＣＯＳ細胞メジウムからドメインのある程度の会
合を含んでＶＬに特異的な抗血清によりＶＬと共沈殿さ
せた。しかし、抗原結合競合検定において推定のＦｖフ
ラグメントの作用を試験するにはいずれのＣＯＳ細胞に
よっても十分量の物質は得られなかった。
清中で還元および非還元ＳＤＳポリアクリルアミドゲル
の両方で１４ＫＤ（参照、計算分子量１２．６ＫＤ）お
よび１２ＫＤ（参照、計算分子量１１．８ＫＤ）ポリペ
プチドとして検出された。両ドメインのより高レベルの
発現は明らかに単一ＶＨまたはＶＬプラスミドに比べデ
ュアルＶＨ／ＶＬプラスミドから得られた。ＶＨは両方
の標識ＣＯＳ細胞メジウムからドメインのある程度の会
合を含んでＶＬに特異的な抗血清によりＶＬと共沈殿さ
せた。しかし、抗原結合競合検定において推定のＦｖフ
ラグメントの作用を試験するにはいずれのＣＯＳ細胞に
よっても十分量の物質は得られなかった。
【００４２】Ｂ７２．３可変ドメインがインビボで作動
しうるように組立てられているかどうかを調べるにはよ
り高レベルの発現が必要である。この為、ＶＨ／ＶＬ単
一およびデュアルプラスミドをＣＨＯ細胞に導入した。
これらのプラスミドの場合、ＣＯＳ細胞によりＣＨＯ細
胞の方が組換え抗体の収率がよさそうである。
しうるように組立てられているかどうかを調べるにはよ
り高レベルの発現が必要である。この為、ＶＨ／ＶＬ単
一およびデュアルプラスミドをＣＨＯ細胞に導入した。
これらのプラスミドの場合、ＣＯＳ細胞によりＣＨＯ細
胞の方が組換え抗体の収率がよさそうである。
【００４３】図４はＢ７２．３ＦｖｓのＳＤＳポリアク
リルアミドゲルのフルオログラフを示す。図１のベクタ
ーでトランフェクションを行なったＣＨＯ細胞を35Ｓメ
チオニン（１００ｕＣｉ／ｍｌ、４８ｈ．）で標識し、
細胞上清をＢ７２．３ＶＬドメインに特異的なラット抗
血清を用いてイムノプレシピテーションに処した。試料
を還元条件下に１５％ＳＤＳポリアクリルアミドゲルで
分析した。トラック１〜５は五つの独立ＣＨＯ細胞系の
結果を示す。左側の数字は大きさのマーカーである。
リルアミドゲルのフルオログラフを示す。図１のベクタ
ーでトランフェクションを行なったＣＨＯ細胞を35Ｓメ
チオニン（１００ｕＣｉ／ｍｌ、４８ｈ．）で標識し、
細胞上清をＢ７２．３ＶＬドメインに特異的なラット抗
血清を用いてイムノプレシピテーションに処した。試料
を還元条件下に１５％ＳＤＳポリアクリルアミドゲルで
分析した。トラック１〜５は五つの独立ＣＨＯ細胞系の
結果を示す。左側の数字は大きさのマーカーである。
【００４４】Ｂ７２．３Ｆｖポリペプチドはムチン−セ
ファロースマトリックスアフィニティークロマトグラフ
ィーによりこれらの細胞系の一つの培養上清（Ｆｖ３、
トラック３、図４）から単離した。ムチンはＢ７２．３
抗原によく似ていることが知られている（２２）。用い
たムチン−ムファロースは５ｍｇ／ｍｌのゲルで標準法
によりＣＮＢｒ活性化セファロースにウシ下顎ムチンを
結合されることにより製造した。
ファロースマトリックスアフィニティークロマトグラフ
ィーによりこれらの細胞系の一つの培養上清（Ｆｖ３、
トラック３、図４）から単離した。ムチンはＢ７２．３
抗原によく似ていることが知られている（２２）。用い
たムチン−ムファロースは５ｍｇ／ｍｌのゲルで標準法
によりＣＮＢｒ活性化セファロースにウシ下顎ムチンを
結合されることにより製造した。
【００４５】ＣＨＯ細胞系Ｆｖ３からの上清１００ｍｌ
を１ｍｌのムチン−セファロース５０％懸濁液と一夜４
℃でローラーミキサー中でインキュベートした（５ｍＭ
トリス、ｐＨ８．０）。次いで、ムチン−セファロース
を、インキュベーション混合物をカラムに注ぐことによ
って採取した。保持されたムチン−セファロースをカラ
ムからの溶出液中に２８０ｎｍでの吸収がみられなくな
るまで５０ｍＭトリスｐＨ８．０で洗浄した。次いで、
０．１Ｍクエン酸１ｍｌでＦｖを溶出した。次いで、こ
の酸溶出液のｐＨを５．５に調整し、ＥＬＩＳＡ法によ
り抗原結合活性を測定した。
を１ｍｌのムチン−セファロース５０％懸濁液と一夜４
℃でローラーミキサー中でインキュベートした（５ｍＭ
トリス、ｐＨ８．０）。次いで、ムチン−セファロース
を、インキュベーション混合物をカラムに注ぐことによ
って採取した。保持されたムチン−セファロースをカラ
ムからの溶出液中に２８０ｎｍでの吸収がみられなくな
るまで５０ｍＭトリスｐＨ８．０で洗浄した。次いで、
０．１Ｍクエン酸１ｍｌでＦｖを溶出した。次いで、こ
の酸溶出液のｐＨを５．５に調整し、ＥＬＩＳＡ法によ
り抗原結合活性を測定した。
【００４６】５μｇ ｍｌのウシ顎下腺ムチンを被覆し
たミクロタイタープレート中で試料を連続希釈し、４℃
で５０時間インキュベートした。０．２％トゥイーン２
０含有リン酸緩衝塩溶液、ｐＨ７．２で洗浄後、Ｂ７
２．３（Ｆａｂ′）2 まで高めたウサギポリクローナル
抗血清を各ウエルに２０００中１の希釈率で加えた。こ
の抗血清はＢ７２．３ＶＨおよびＶＬ両鎖を認識する抗
体を含んでいる。プレートを１時間室温でインキュベー
トし、再び洗浄し、そして１００μｌのヤギ抗ウサギＩ
ｇＧ Ｆｃ−セイヨウワサビペルオキシダーゼ結合物を
各ウエルに５０００中１の希釈率で加えた。
たミクロタイタープレート中で試料を連続希釈し、４℃
で５０時間インキュベートした。０．２％トゥイーン２
０含有リン酸緩衝塩溶液、ｐＨ７．２で洗浄後、Ｂ７
２．３（Ｆａｂ′）2 まで高めたウサギポリクローナル
抗血清を各ウエルに２０００中１の希釈率で加えた。こ
の抗血清はＢ７２．３ＶＨおよびＶＬ両鎖を認識する抗
体を含んでいる。プレートを１時間室温でインキュベー
トし、再び洗浄し、そして１００μｌのヤギ抗ウサギＩ
ｇＧ Ｆｃ−セイヨウワサビペルオキシダーゼ結合物を
各ウエルに５０００中１の希釈率で加えた。
【００４７】室温でさらに１時間インキュベーション
後、プレートを再び洗浄し、ＴＭＢ基質を加え、６０５
ｎｍで光学密度を測定して結合抗体を検出した。ＣＨＯ
Ｆｖ３上清試料はこの検定において固相ムチンと結合
しうることが示された。
後、プレートを再び洗浄し、ＴＭＢ基質を加え、６０５
ｎｍで光学密度を測定して結合抗体を検出した。ＣＨＯ
Ｆｖ３上清試料はこの検定において固相ムチンと結合
しうることが示された。
【００４８】ＶＨとＶＬとの会合に含まれる疎水性相互
作用が組立てられた状態にＦｖフラグメントを維持する
のに十分強力であるということは不確かなことである。
それ故、Ｆｖフラグメントを増やし、あるいは安定化さ
せるのにドメインをさらに修飾することが必要である。
たとえば、これは共有結合、たとえば、ジスルフィド結
合の導入により達成しうる。
作用が組立てられた状態にＦｖフラグメントを維持する
のに十分強力であるということは不確かなことである。
それ故、Ｆｖフラグメントを増やし、あるいは安定化さ
せるのにドメインをさらに修飾することが必要である。
たとえば、これは共有結合、たとえば、ジスルフィド結
合の導入により達成しうる。
【００４９】上記の態様は例示の為のみであり、本発明
の範囲を逸脱することなく種々の変更が可能であること
は当業者にとり自明であろう。
の範囲を逸脱することなく種々の変更が可能であること
は当業者にとり自明であろう。
【００５０】文 献 〔１〕 Ｍｏｏｒｅ ａｎｄ Ｚａｆｆａｒｏｎｉ，Ｕ
Ｓ−Ａ−４ ６４２ ３３４。 〔２〕 Ｆｉｅｌｄ ｅｔ ａｌ．，“Ｖａｃｃｉｎｅ
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Ｓｃｉｅｎｅ，２４０，１０３８−１０４１，１９８
８． 〔４〕 Ｌａｄｎｅｒ ａｎｄ Ｂｉｒｄ，ＷＯ ８８
／０１６４９． 〔５〕 Ｒｅｉｃｈｍａｎｎ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕ
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ｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ
Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏ
ｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，Ｃｏｌｄ ＳｐｒｉｎｇＨ
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Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏ
ｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，Ｃｏｌｄ ＳｐｒｉｎｇＨ
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ｅｒ Ｒｅｓ．，４８，２２１４，１９８８．
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ｉｎ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ，１，４９９，１９８
７． 〔２１〕 Ｋｒａｍｅｒ，ｅｔ ａｌ．，Ｎｕｃ．Ａｃ
ｉｄｓ Ｒｅｓ．，１２，９４４１，１９８４． 〔２２〕 Ｋｊｅｌｄｓｅｎ ｅｔ ａｌ．，Ｃａｎｃ
ｅｒ Ｒｅｓ．，４８，２２１４，１９８８．
【図１】図１は、ヒューマナイズ化抗−リゾチームＦｖ
フラグメントの産生に使用するためのベクターの構築を
示すものである；
フラグメントの産生に使用するためのベクターの構築を
示すものである；
【図２】図２は、図１のベクターに使用されたリシェィ
プ化ＨｕＶＬＬＹＳ遺伝子のヌクレオチド配列および相
当するアミノ酸配列を示すものである；
プ化ＨｕＶＬＬＹＳ遺伝子のヌクレオチド配列および相
当するアミノ酸配列を示すものである；
【図３】図３は、抗−ＴＡＧ７２Ｆｖフラグメントの製
造に使用するためのベクターの構築を示すものである；
そして
造に使用するためのベクターの構築を示すものである；
そして
【図４】図４は、Ｂ７２．３ＦｖのＳＤＳポリアクリル
アミドゲルのフルオログラフを示すものである。
アミドゲルのフルオログラフを示すものである。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.6 識別記号 ＦＩ Ｃ１２Ｐ 21/08 Ｇ０１Ｎ 33/531 Ａ Ｇ０１Ｎ 33/531 33/577 Ａ 33/577 Ａ６１Ｋ 49/02 Ａ (72)発明者 ヤーラントン，ジョフレイ トーマス イギリス国 アールジー11 ５エヌジェ イ，バークシャー，ニア リーディング, ウィナーシュ，シャーウッド ロード ８ (72)発明者 ボドマー，マーク ウィリアム イギリス国 アールジー19 １ディージェ イ オックスフォードシャー，ヘンリィ − オン − テムズ，リィーデイング ロード，131 (72)発明者 オーウェンズ，レイモンド ジョン イギリス国 アールジー９ １エスエッ チ，オックスフォードシャー，ヘンリィ − オン − テムズ，ハミルトン アベ ニュー 23
Claims (1)
- 【請求項１】 ドメインの一方または両方が、そのＮ末
端に可変ドメインを、そのＣ末端に酵素、リガンドまた
はトキシンを有する融合タンパク質からなるＦｖ構造
体。
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