JPH0716440B2 - グルコ−スの測定法 - Google Patents
グルコ−スの測定法Info
- Publication number
- JPH0716440B2 JPH0716440B2 JP60243849A JP24384985A JPH0716440B2 JP H0716440 B2 JPH0716440 B2 JP H0716440B2 JP 60243849 A JP60243849 A JP 60243849A JP 24384985 A JP24384985 A JP 24384985A JP H0716440 B2 JPH0716440 B2 JP H0716440B2
- Authority
- JP
- Japan
- Prior art keywords
- glucose
- measuring
- nicotinamide adenine
- adenine dinucleotide
- reduced nicotinamide
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Expired - Lifetime
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- Investigating Or Analysing Biological Materials (AREA)
- Investigating Or Analysing Materials By The Use Of Chemical Reactions (AREA)
- Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
Description
【発明の詳細な説明】 本発明はグルコースの測定法に関するものである。更に
詳細には、本発明はグルコースを含有する試料に還元型
ニコチンアミドアデニンジヌクレオタイド（NADH）又は
還元型ニコチンアミドアデニンジヌクレオタイドホスフ
ェート（NADPH）及びアルドースリダクターゼを作用さ
せ、グルコースの還元化反応と共役するNADHもしくはNA
DPHの酸化反応によって減少するNADHもしくはNADPHの量
を測定して、これから試料中のグルコース量を測定する
方法である。
詳細には、本発明はグルコースを含有する試料に還元型
ニコチンアミドアデニンジヌクレオタイド（NADH）又は
還元型ニコチンアミドアデニンジヌクレオタイドホスフ
ェート（NADPH）及びアルドースリダクターゼを作用さ
せ、グルコースの還元化反応と共役するNADHもしくはNA
DPHの酸化反応によって減少するNADHもしくはNADPHの量
を測定して、これから試料中のグルコース量を測定する
方法である。
血糖は、生体のエネルギー源としてもっとも重要なもの
であり、その濃度は腸管からの糖の吸収、肝臓における
糖新生とグルコーゲン合成、分解、末梢組織の糖利用、
腎臓からの排泄などの諸因子によって左右され、その調
節には自律神経と各種ホルモンが密接に関係している。
であり、その濃度は腸管からの糖の吸収、肝臓における
糖新生とグルコーゲン合成、分解、末梢組織の糖利用、
腎臓からの排泄などの諸因子によって左右され、その調
節には自律神経と各種ホルモンが密接に関係している。
血糖低下にはインスリン、上昇にはエピネフリン、グル
カゴン、成長ホルモン、副腎皮質ホルモン、甲状線ホル
モンなどが関係し、これらの拮抗、及び協調作用によっ
て血糖値が微妙に調節されている。
カゴン、成長ホルモン、副腎皮質ホルモン、甲状線ホル
モンなどが関係し、これらの拮抗、及び協調作用によっ
て血糖値が微妙に調節されている。
臨床的には、内分泌疾患、膵臓、肝臓、腎臓などの機能
障害時において、糖値が変動することが知られており、
血清及び尿中のグルコース量を測定することは、それら
の障害度並びに予後の診断に関して重要な意義をもつこ
とになる。
障害時において、糖値が変動することが知られており、
血清及び尿中のグルコース量を測定することは、それら
の障害度並びに予後の診断に関して重要な意義をもつこ
とになる。
従来の血糖測定には化学的方法として、アルカリ溶液中
でのグルコースの還元作用を利用した呈色反応である還
元法やグルコースが強酸性下で芳香族アミンと反応し縮
合呈色することを利用した縮合法などがある。還元法は
アスコルビン酸、尿酸、グルタチオン、グルクロン酸な
どの非糖性還元物質の影響を強く受け正確にグルコース
を測定できないという欠点があり、また縮合法は簡易で
あるが特異性が低いという欠点がある。
でのグルコースの還元作用を利用した呈色反応である還
元法やグルコースが強酸性下で芳香族アミンと反応し縮
合呈色することを利用した縮合法などがある。還元法は
アスコルビン酸、尿酸、グルタチオン、グルクロン酸な
どの非糖性還元物質の影響を強く受け正確にグルコース
を測定できないという欠点があり、また縮合法は簡易で
あるが特異性が低いという欠点がある。
また酵素法としては、グルコースオキシダーゼを利用し
た酵素電極法、パーオキシダーゼを共存させ酸化呈色を
測定する方法（GOD−POD法）とヘキソキナーゼを利用し
てグルコース−６−リン酸脱水素酵素を共役（HK−G6PD
法）させ、又はグルコース脱水素酵素のみを用いて、NA
DHもしくはNADPHの反応生成量を340nmの吸光度にて測定
する方法がある。しかし酵素電極法は迅速性には優れて
いるが共存物質の影響を受けるという欠点がある。ま
た、GOD−POD法は終点測定であるため、グルコース濃度
が高くなると酸素が不足して発生の反転現象が起こる。
HK−G6PD法は精度的には優れた方法であるが終点測定法
であるため測定時間が長くかかる。また、グルコース脱
水素酵素法は多くの点で満足できる方法であるが、ただ
測定間隔がせまいという欠点がある。そこで、近年臨床
検査領域における自動分析機の急速な普及に伴い、短時
間でしかも測定範囲の広い反応速度法によるグルコース
の定量法が望まれている。
た酵素電極法、パーオキシダーゼを共存させ酸化呈色を
測定する方法（GOD−POD法）とヘキソキナーゼを利用し
てグルコース−６−リン酸脱水素酵素を共役（HK−G6PD
法）させ、又はグルコース脱水素酵素のみを用いて、NA
DHもしくはNADPHの反応生成量を340nmの吸光度にて測定
する方法がある。しかし酵素電極法は迅速性には優れて
いるが共存物質の影響を受けるという欠点がある。ま
た、GOD−POD法は終点測定であるため、グルコース濃度
が高くなると酸素が不足して発生の反転現象が起こる。
HK−G6PD法は精度的には優れた方法であるが終点測定法
であるため測定時間が長くかかる。また、グルコース脱
水素酵素法は多くの点で満足できる方法であるが、ただ
測定間隔がせまいという欠点がある。そこで、近年臨床
検査領域における自動分析機の急速な普及に伴い、短時
間でしかも測定範囲の広い反応速度法によるグルコース
の定量法が望まれている。
一般に酵素の反応速度にて、その酵素の基質となる物質
を定量する場合には、酵素の基質に対するKm値が測定系
における基質濃度より充分大きいことが必須条件とな
る。
を定量する場合には、酵素の基質に対するKm値が測定系
における基質濃度より充分大きいことが必須条件とな
る。
本発明者らは、反応速度法によるグルコースの有効な定
量法を求めて鋭意研究した結果、アルドースリダクター
ゼがグルコースに対するKm値が数百mMと非常に高い事を
見出し、更に、グルコースの反応速度法での定量法とし
てアルドースリダクターゼを利用するのがきわめて有効
であることを知り、本発明を完成するに至った。
量法を求めて鋭意研究した結果、アルドースリダクター
ゼがグルコースに対するKm値が数百mMと非常に高い事を
見出し、更に、グルコースの反応速度法での定量法とし
てアルドースリダクターゼを利用するのがきわめて有効
であることを知り、本発明を完成するに至った。
本発明は、グルコースを含有する試料に還元型ニコチン
アミドアデニンジヌクレオタイド又は還元型ニコチンア
ミドアデニンジヌクレオタイドホスフェート、及びアル
ドースリダクターゼを作用させ、還元型ニコチンアミド
アデニンジヌクレオタイド又は還元型ニコチンアミドア
デニンジヌクレオタイドホスフェートの減少速度を測定
することを特徴とするグルコースの測定法である。
アミドアデニンジヌクレオタイド又は還元型ニコチンア
ミドアデニンジヌクレオタイドホスフェート、及びアル
ドースリダクターゼを作用させ、還元型ニコチンアミド
アデニンジヌクレオタイド又は還元型ニコチンアミドア
デニンジヌクレオタイドホスフェートの減少速度を測定
することを特徴とするグルコースの測定法である。
本発明を実施する場合、検体試料にNADHもしくはNADPH
の存在下中性から弱アルカリ性の緩衝液中でアルドース
リダクターゼを作用させ、アルドースリダクターゼ活性
によって進行するグルコースの還元反応に伴い同時進行
するNADHもしくはNADPHの酸化反応を紫外部吸収（340n
m）にて減少していく速度を測定することにより試料中
のグルコースを定量することができる。
の存在下中性から弱アルカリ性の緩衝液中でアルドース
リダクターゼを作用させ、アルドースリダクターゼ活性
によって進行するグルコースの還元反応に伴い同時進行
するNADHもしくはNADPHの酸化反応を紫外部吸収（340n
m）にて減少していく速度を測定することにより試料中
のグルコースを定量することができる。
本発明に使用するアルドースリダクターゼの給源として
は動物、微生物があるがいずれのアルドースリダクター
ゼを用いてもよい。緩衝液としてはトリエタノールアミ
ン、トリス、リン酸、グッドバッファなどが使用でき、
pHの６〜９が好ましい。本発明はアルドースリダクター
ゼの給源や使用緩衝液の種類とpHに制限されるものでは
ない。
は動物、微生物があるがいずれのアルドースリダクター
ゼを用いてもよい。緩衝液としてはトリエタノールアミ
ン、トリス、リン酸、グッドバッファなどが使用でき、
pHの６〜９が好ましい。本発明はアルドースリダクター
ゼの給源や使用緩衝液の種類とpHに制限されるものでは
ない。
本発明の方法は反応系が従来法に較べ単純であるので誤
差要因も少く検体試料中の物質の影響はほとんど無視で
き、しかもグルコース測定領域が０〜12g/dlと、非常に
広いため高濃度のグルコースを含む検体の測定において
も試料を希釈することなく、正確且つ高感度に、しかも
短時間での測定が可能であり、自分分析機での測定にお
いて極めて有用な方法である。
差要因も少く検体試料中の物質の影響はほとんど無視で
き、しかもグルコース測定領域が０〜12g/dlと、非常に
広いため高濃度のグルコースを含む検体の測定において
も試料を希釈することなく、正確且つ高感度に、しかも
短時間での測定が可能であり、自分分析機での測定にお
いて極めて有用な方法である。
以下に本発明の実施例を示す。
実施例１ 反応液として、0.35u/mlのアルドースリダクターゼ及び
0.25mMのNADPHを含む100mMリン酸カリ緩衝液（pH7.0）
を2mlキューベットに取り、37℃に温度調節された分光
光度計にセットした後、０から10g/dlのグルコースを含
む標準液をそれぞれ20μ添加し、340nmにおける１分
間あたりの吸光度変化を測定した。その結果を第１図に
示した。この結果により、グルコース10g/dlを含む溶液
までの直線性があり、反応速度法としてきわめて有効で
あることを確認した。
0.25mMのNADPHを含む100mMリン酸カリ緩衝液（pH7.0）
を2mlキューベットに取り、37℃に温度調節された分光
光度計にセットした後、０から10g/dlのグルコースを含
む標準液をそれぞれ20μ添加し、340nmにおける１分
間あたりの吸光度変化を測定した。その結果を第１図に
示した。この結果により、グルコース10g/dlを含む溶液
までの直線性があり、反応速度法としてきわめて有効で
あることを確認した。
実施例２ 反応液として約2u/mlのアルドースダクターゼ及び0.25m
MのNADPHを含む100mMリン酸カリ緩衝液（pH7.0）を2ml
キューベットに取り、37℃に温度調節された分光光度計
にセットした後、０から約5,000mg/dlのグルコースを含
む血清をそれぞれ20μ添加し、340nmにおける１分間
あたりの吸光度変化を測定した。測定結果は次の表１に
示される。
MのNADPHを含む100mMリン酸カリ緩衝液（pH7.0）を2ml
キューベットに取り、37℃に温度調節された分光光度計
にセットした後、０から約5,000mg/dlのグルコースを含
む血清をそれぞれ20μ添加し、340nmにおける１分間
あたりの吸光度変化を測定した。測定結果は次の表１に
示される。
第１図は実施例１においてグルコース測定の際の直線性
をみた図である。
をみた図である。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (56)参考文献 Ａｒｃｈ Ｂｉｏｃｈｅｍ Ｂｉｏｐｈ ｙｓ，238（２），1985，Ｐ．670−679 Ｃｈｅｍ Ｐｈａｒｍ Ｂｕｌｌ （Ｔ ｏｋｙｏ），31（７），1983，Ｐ．2395− 2403 丸尾，田宮監修「酵素ハンドブック」朝 倉書店（1982−12−１）Ｐ．333−335
Claims (1)
- 【請求項１】グルコースを含有する試料（グルコース単
独溶液を除く）に還元型ニコチンアミドアデニンジヌク
レオタイド又は還元型ニコチンアミドアデニンジヌクレ
オタイドホスフェート、及びアルドースリダクターゼを
作用させ、還元型ニコチンアミドアデニンジヌクレオタ
イド又は還元型ニコチンアミドアデニンジヌクレオタイ
ドホスフェートの減少速度を測定することを特徴とする
グルコースのみを選択的に測定する方法。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP60243849A JPH0716440B2 (ja) | 1985-11-01 | 1985-11-01 | グルコ−スの測定法 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP60243849A JPH0716440B2 (ja) | 1985-11-01 | 1985-11-01 | グルコ−スの測定法 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPS62104595A JPS62104595A (ja) | 1987-05-15 |
| JPH0716440B2 true JPH0716440B2 (ja) | 1995-03-01 |
Family
ID=17109865
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP60243849A Expired - Lifetime JPH0716440B2 (ja) | 1985-11-01 | 1985-11-01 | グルコ−スの測定法 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JPH0716440B2 (ja) |
-
1985
- 1985-11-01 JP JP60243849A patent/JPH0716440B2/ja not_active Expired - Lifetime
Non-Patent Citations (3)
| Title |
|---|
| ＡｒｃｈＢｉｏｃｈｅｍＢｉｏｐｈｙｓ，２３８（２），１９８５，Ｐ．６７０−６７９ |
| ＣｈｅｍＰｈａｒｍＢｕｌｌ（Ｔｏｋｙｏ），３１（７），１９８３，Ｐ．２３９５−２４０３ |
| 丸尾，田宮監修「酵素ハンドブック」朝倉書店（１９８２−１２−１）Ｐ．３３３−３３５ |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| JPS62104595A (ja) | 1987-05-15 |
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