JPH07170976A - Ｎ−メチルバリンオキシダーゼ活性を有する新規な酵素 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 【目的】Ｎ−メチルバリンの測定に有用であるＮ−メチ
ルバリンオキシダーゼを提供する。 【構成】ザルコシンオキシダーゼ活性を有するタンパク
質を蛋白工学的手法により改変したＮ−メチルバリンオ
キシダーゼ活性を有する新規な酵素およびその製法。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【産業上の利用分野】本発明はＮ−メチルバリンオキシ
ダーゼ活性を有する新規な酵素、その製造法およびその
用途に関し、特にザルコシンオキシダーゼ活性を有する
タンパク質を構成するアミノ酸配列を改変することによ
り得られたＮ−メチルバリンオキシダーゼ活性を有する
新規酵素、その製造法およびその用途に関する。

【０００２】

【従来の技術】Ｎ−メチルバリンに作用して過酸化水素
を生成する酵素は、未だ自然界から見い出されていず、
また人工的にも生産されていない。

【０００３】

【発明が解決しようとする課題】本発明はＮ−メチルバ
リンの測定に有用であるＮ−メチルバリンオキシダーゼ
を求めるべく、鋭意検討していたところ、ザルコシンオ
キシダーゼ活性を有するタンパク質を蛋白工学的手法に
より改変し、Ｎ−メチルバリンオキシダーゼ活性を有す
る新規な酵素を造成することを見出した。

【０００４】

【課題を解決するための手段】すなわち本発明は水およ
び酸素の存在下でＮ−メチルバリンに作用して、バリ
ン、ホルムアルデヒドおよび過酸化水素を生成すること
を特徴とするＮ−メチルバリンオキシダーゼ活性を有す
る新規な酵素である。

【０００５】また本発明はザルコシンオキシダーゼ活性
を有するタンパク質を構成するアミノ酸配列のフェニル
アラニンを他のアミノ酸に置換することを特徴とするＮ
−メチルバリンオキシダーゼ活性を有する新規な酵素の
製造法である。具体的には、配列表・配列番号１に記載
されるアミノ酸配列の第１０３番目のフェニルアラニン
をコードする遺伝子を部位特異的変異させることによ
り、他のアミノ酸に置換して、Ｎ−メチルバリンオキシ
ダーゼ活性を有する酵素を製造することを特徴とする。
他のアミノ酸としてはバリンが好ましい。

【０００６】さらに本発明は検体中のＮ−メチルバリン
に、水および酸素の存在下でＮ−メチルバリンに作用し
てバリン、ホルムアルデヒドおよび過酸化水素を生成す
るＮ−メチルバリンオキシダーゼ活性を有する新規な酵
素を作用させ、消費する酸素または生成するバリン、ホ
ルムアルデヒドあるいは過酸化水素を測定することを特
徴とするＮ−メチルバリンの定量法である。

【０００７】水および酸素の存在下でＮ−メチルバリン
に作用して、バリン、ホルムアルデヒドおよび過酸化水
素を生成するＮ−メチルバリンオキシダーゼ活性を有す
る本発明の酵素の具体例としては、下記理化学的性質を
有する酵素が挙げられる。作用：水および酸素の存在下
でＮ−メチルバチンに作用して、バリン、ホルムアルデ
ヒドおよび過酸化水素を生成する。 基質特異性：Ｎ−メチルバリン １００％ ザルコシン ≦１％ 至適ｐＨ：７〜９ 至適温度：４０〜５０℃ 分子量：４３Ｋｄ

【０００８】さらに具体的な例としては、アミノ酸配列
が配列表・配列番号１に記載されるアミノ酸配列の第１
０３番目のフェニルアラニンがバリンに置換されたＮ−
メチルバリンオキシダーゼ活性を有する新規なタンパク
が挙げられる。

【０００９】本発明の新規な酵素は、ザルコシンオキシ
ダーゼ活性を有するタンパク質を構成するアミノ酸配列
のうちフェニルアラニンを他のアミノ酸に置換して、製
造される。

【００１０】本発明に使用されるザルコシンオキシダー
ゼとしては、例えばバチルス属、コリネバクテリウム
属、アースロバクター属のザルコシンオキシダーゼなど
があり、特に限定されないが、本発明の実施例において
は、アースロバクター・エスピーＴＥ１８２６のザルコ
シンオキシダーゼ（Jounal of Fermentation and Bioen
gineering Vol.75 No.4 pp239-244 (1993)に記載）を用
いた。

【００１１】ザルコシンオキシダーゼ活性を有するタン
パク質を構成するアミノ酸配列を改変する方法として
は、通常行われる遺伝情報を改変する手法が用いられ
る。すなわち、ザルコシンオキシダーゼ活性を有するタ
ンパク質の遺伝情報を有するＤＮＡの特定の塩基を変換
することにより、或いは特定の塩基を挿入または欠失さ
せることにより、改変タンパク質の遺伝情報を有するＤ
ＮＡが作成される。

【００１２】ＤＮＡ中の塩基を変換する具体的な方法と
しては、例えば市販のキット（TransformerTM ；Clonet
ech 製，T7-GEN in vitro mutagenesis kit ；Stratage
ne製）の使用、或いはＰＣＲ法の利用が挙げられる。

【００１３】具体的にはまず親タンパク質を産生する細
胞から染色体ＤＮＡを分離する。得られた染色体ＤＮＡ
を制限酵素、例えばSau3aIで部分分解させ、断片に分離
した後、同じ制限酵素で切断したプラスミドとＤＮＡリ
ガーゼによりＤＮＡを連結する。連結したＤＮＡはエシ
ェリヒア・コリーのコンピテントセルを用いて形質転換
する。得られたコロニーは培地で培養し、遺伝子が挿入
された組換えＤＮＡをスクリーニングする。次いで挿入
ＤＮＡ断片を種々の制限酵素により切断して他のプラス
ミドにサブクローニングし、挿入ＤＮＡ断片を有するプ
ラスミドを得る。種々のサブクローンは常法に従い、SE
QUENASE VERSION2.0 7-deaza-d GTP kit(東洋紡績製)
を用いて、配列決定を行う。

【００１４】次いでフェニルアラニンをコードする塩基
を他のアミノ酸をコードする塩基に置換したオリゴヌク
レオチドおよびTransformerTM(Clonetech 製) を用い、
TransformerTM のプロトコールに従い、フェニルアラニ
ン残基が他のアミノ酸、好ましくはバリンに置換された
改変タンパク質の遺伝情報を有するＤＮＡを作成する。

【００１５】作成された改変タンパク質の遺伝情報を有
するＤＮＡは、プラスミドと連結された状態にて宿主微
生物中に移入され、改変タンパク質を生産する形質転換
体となる。この際のプラスミドとしては、例えばエシェ
リヒア・コリーを宿主微生物とする場合には、pBluescr
ipt, pUC18などが使用できる。

【００１６】宿主微生物としては、例えばエシェリヒア
・コリー W3110、エシェリヒア・コリーC600、エシェリ
ヒア・コリーJM109 、エシェリヒア・コリーDH5 αなど
が利用できる。宿主微生物に組換えベクターを移入する
方法としては、例えば宿主微生物がエシェリヒア属に属
する微生物の場合には、カルシウムイオンの存在下で組
換えDNA の移入を行なう方法などを採用することがで
き、更にエレクトロポレーション法を用いても良い。

【００１７】こうして得られた形質転換体である微生物
は、栄養培地で培養されることにより、多量の改変タン
パク質を安定して生産し得る。形質転換体である宿主微
生物の培養形態は宿主の栄養生理的性質を考慮して培養
条件を選択すればよく、通常多くの場合は液体培養で行
うが、工業的には通気撹拌培養を行うのが有利である。
培地の栄養源としては微生物の培養に通常用いられるも
のが広く使用され得る。炭素源としては資化可能な炭素
化合物であればよく、例えばグルコ−ス、シュークロー
ス、ラクトース、マルトース、フラクトース、糖蜜、ピ
ルビン酸などが使用される。窒素源としては利用可能な
窒素化合物であればよく、例えばペプトン、肉エキス、
酵母エキス、カゼイン加水分解物、大豆粕アルカリ抽出
物などが使用される。その他、リン酸塩、炭酸塩、硫酸
塩、マグネシウム、カルシウム、カリウム、鉄、マンガ
ン、亜鉛などの塩類、特定のアミノ酸、特定のビタミン
などが必要に応じて使用される。

【００１８】培養温度は菌が発育し、改変タンパク質を
生産する範囲で適宜変更し得るが、エシェリヒア・コリ
ーの場合、好ましくは20〜42℃程度である。培養時間は
条件によって多少異なるが、改変タンパク質が最高収量
に達する時期を見計らって適当時期に培養を終了すれば
よく、通常は６〜48時間程度である。培地pHは菌が発育
し改変タンパク質を生産する範囲で適宜変更し得るが、
特に好ましくはpH6.0〜9.0 程度である。

【００１９】培養物中の改変タンパク質を生産する菌体
を含む培養液をそのまま採取し利用することもできる
が、一般には常法に従って改変タンパク質が培養液中に
存在する場合は濾過，遠心分離などにより、改変タンパ
ク質含有溶液と微生物菌体とを分離した後に利用され
る。改変タンパク質が菌体内に存在する場合には、得ら
れた培養物を濾過または遠心分離などの手段により菌体
を採取し、次いでこの菌体を機械的方法またはリゾチー
ムなどの酵素的方法で破壊し、また必要に応じてEDTA等
のキレート剤及びまたは界面活性剤を添加して改変タン
パク質を可溶化し、水溶液として分離採取する。

【００２０】この様にして得られた改変タンパク質含有
溶液を例えば減圧濃縮、膜濃縮、更に硫酸アンモニウ
ム、硫酸ナトリウムなどの塩析処理、或いは親水性有機
溶媒、例えばメタノール、エタノール、アセトンなどに
よる分別沈澱法により沈澱せしめればよい。また、加熱
処理や等電点処理も有効な精製手段である。吸着剤或い
はゲル濾過剤などによるゲル濾過、吸着クロマトグラフ
ィー、イオン交換クロマトグラフィー、アフィニティー
クロマトグラフィーにより、精製されたＮ−メチルバリ
ンオキシダーゼ活性を有する改変タンパク質を得る事が
できる。

【００２１】本発明のＮ−メチルバリンオキシダーゼ活
性を有する新規な酵素は、検体中のＮ−メチルバリンオ
キシダーゼに水および酸素の存在下で作用して、バリ
ン、ホルムアルデヒドおよび過酸化水素を生成させる。
次いで消費する酸素量または生成するアリン、ホルムア
ルデヒドあるいは過酸化水素を測定することによりＮ−
メチルバリンを定量することができる。検体としては、
アミノ酸誘導体合成中間物、医薬品合成中間物、Ｎ−メ
チルアミノ酸研究試料等が挙げられる。

【００２２】消費する酸素の測定法としては、酸素電極
を利用する方法などがある。また生成したバリンを測定
する方法としては、アミノ酸分析計を用いる方法などが
ある。さらに生成するホルムアルデヒドを測定する方法
としては、ホルムアルデヒド脱水素酵素を利用する方法
などがある。生成する過酸化水素を測定する方法として
は、従来から公知の方法を使用すればよく、例えばペル
オキシダーゼと４−アミノアンチピリンとフェノール誘
導体またはアニリン誘導体を使用する方法などがある。
フェノール誘導体としては、フェノール、２，４−ジク
ロロフェノール、ｐ−クロロフェノールなどが挙げられ
る。アニリン誘導体としては、ジメチルアニリン、ジエ
チルアニリン、Ｎ−エチル−Ｎ−（２−ヒドロキシ−３
−スルホプロピル）−ｍ−トルイジンなどが挙げられ
る。

【００２３】

【実施例】以下、本発明を実施例により具体的に説明す
る。実施例中、酵素特性を示す指標であるＫｍ，ｋｃａ
ｔを求める際のＮ−メチルバリンオキシダーゼ活性また
はザルコシンオキシダーゼ活性の測定は以下のように行
なった。すなわち、48mMトリス緩衝液(pH8.0) 、任意の
濃度の基質（Ｎ−メチルバリンまたはザルコシン）、0.
47mM４−アミノアンチピリン、2.0mM フェノール、0.04
5%トリトンＸ−１００、4.5U/ml ペルオキシダーゼ中で
酵素を37℃、10分反応させ、500nm における吸光度を測
定する。

【００２４】実施例１ Ｎ−メチルバリンオキシダーゼ
の遺伝情報を有するＤＮＡの作成 ザルコシンオキシダーゼの遺伝情報を有する組換え体プ
ラスミド、pSAOEP3 は以下の方法により作成した。アー
スロバクター・エスピーＴＥ１８２６（微工研菌寄第 1
0637号）の染色体ＤＮＡを次の方法で分離した。同菌株
を100ml の２×ＹＴ培地（1.6%ポリペプトン、1%酵母エ
キス、0.5%塩化ナトリウム(pH7.2) で37℃一晩振盪培養
後、遠心分離(8000 rpm,10分) により集菌した。15mMク
エン酸ナトリウム、 0.15M塩化ナトリウムを含んだ溶液
で菌体を洗浄した後、 20%シュークロース、 1mMＥＤＴ
Ａ、50mMトリス塩酸(pH 7.6)を含んだ溶液 5mlに懸濁さ
せ、 0.5mlのリゾチーム溶液(100mg/ml)を加えて 37
℃、30分間保温した。次いで11mlの 1% ラウロイルサル
コシン酸、0.1MＥＤＴＡ (pH9.6)を含む溶液を加えた。
この懸濁液に臭化エチジウム溶液を0.5%、塩化セシウム
を約100%加え、撹拌混合し、55.000rpm 、20時間の超遠
心でＤＮＡを分取した。分取したＤＮＡは、10mMトリス
塩酸(pH8.0) 、1mM ＥＤＴＡを含んだ溶液(TE)で透析
し、精製したＤＮＡ標品とした。エシェリヒア・コリー
JM109 のコンピテントセルはHanahan の方法により作成
し、ライブラリー作成の宿主として用いた。

【００２５】染色体ＤＮＡ 1μg を制限酵素 Sau3AＩ
（東洋紡製）で部分分解反応させ、2kbp以上の断片に分
解した後、SalI（東洋紡製）で切断したｐＵＣ１８ 0.5
μg とM.G.LoftusらのBACKFILLING 法（Biotechniques
Vol12,No.2(1992)) に従い、T4- ＤＮＡリガーゼ（東洋
紡製）1 ユニットで16℃、12時間反応させ、ＤＮＡを連
結した。連結したＤＮＡはエシェリヒア・コリーJM109
のコンピテントセルを用いて形質転換した。使用したＤ
ＮＡ 1μg 当たり約 1×10⁶ 個の形質転換体のコロニー
が得られた。得られたコロニーは50μg/mlアンピシリ
ン、0.5%ザルコシン、0.005%パラロースアニリン及び0.
025%ソディウムハイドロジェンサルファイト入りＬ培地
（1%ポリペプトン，0.5%酵母エキス，0.5%塩化ナトリウ
ム）で37℃、18時間培養し、赤色コロニーを指標にザル
コシンオキシダーゼ遺伝子の入った組換えＤＮＡをスク
リーニングした。その結果約 1,000個のコロニーのうち
１株の割合で赤色を示すコロニーを得た。この中の１株
が保有するプラスミドには約8.7kbpの挿入ＤＮＡ断片が
存在しており、このプラスミドをｐＳＡＯ１とした。次
いでｐＳＡＯ１より挿入ＤＮＡ断片を種々の制限酵素に
より切断してｐＵＣ１８にサブクローニングし、約1.7k
bpの挿入ＤＮＡ断片を有するｐＳＡＯＥＰ３を得た。

【００２６】ｐＳＡＯＥＰ３の約1.7kbpの挿入ＤＮＡ断
片について種々の制限酵素で切断してサブクローンを調
製した。種々のサブクローンは常法に従い、SEQUENASE
VERSION2.0 7-deaza-dGTP kit （東洋紡製）を用いて、
ＤＮＡ配列の決定を行った（配列表・配列番号２）。該
ＤＮＡ配列から決定したアミノ酸配列を配列表・配列番
号１に示した。次いで、配列表の配列番号３のオリゴヌ
クレオチドとTransformerTM (Clonetech製) を用い、Tr
ansformerTM のプロトコールに従い、配列表の配列番号
１記載の第１０３番目のフェニルアラニンがバリンに置
換された改変タンパク質（Ｆ１０３Ｖ）の遺伝情報を有
するＤＮＡを作成した。Ｆ１０３Ｖの遺伝情報を有する
ＤＮＡを保持する組換え体プラスミドを、pSAOEP3-F103
V と命名した。（図１参照)

【００２７】実施例２ 形質転換体の作成 プラスミド、pSAOEP3-F103V でエシェリヒア・コリーJM
109 のコンピテントセルを氷中３０分間接触後、４２℃
で４５秒間ヒートショックを行うことにより形質転換
し、形質転換体JM109(pSAOEP3-F103V)を得た。

【００２８】実施例３ 形質転換体の培養と改変タンパ
ク質の精製 ２×ＹＴ培地(1.6% ポリペプトン、1%酵母エキス、0.5%
塩化ナトリウム(pH7.2))50mlを 500mlフラスコに分注
し、 121℃、15分間オートクレーブを行い放冷後、別途
無菌濾過した 50mg/mlアンピシリン（ナカライテスク
製）を0.1%添加した。この培地に上記と同一組成の培地
で予め37℃で18時間振盪培養した形質転換体(JM109(pSA
OEP3-F103V))の培養液 1mlを接種し、37℃で通気撹拌培
養した。培養液より改変タンパク質（Ｆ１０３Ｖ）を、
菌体破砕，除核酸，塩析後、イオン交換カラムクロマト
グラフィーを実施することにより(Journal of Fermenta
tion and Bioengineering Vol.75 No.4 pp239-244 (199
3)参照) 、ＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動に
て単一のバンドを形成するまで精製した。精製タンパク
質の分子量は４３Ｋｄ、至適ｐＨは７〜９、至適温度は
４０〜５０℃であった。

【００２９】精製された改変タンパク質（Ｆ１０３Ｖ）
とアースロバクター・エスピーＴＥ１８２６のザルコシ
ンオキシダーゼ (東洋紡績製) のＫｍ，ｋｃａｔ測定値
を表１に示した。

【００３０】

【表１】

【００３１】改変タンパク質（Ｆ１０３Ｖ）の特性は、
Ｎ−メチルバリンオキシダーゼ活性を有することであ
る。酵素の反応性を示す指標であるｋｃａｔ／Ｋｍを見
ると、ザルコシンオキシダーゼはザルコシンに対する反
応性がＮ−メチルバリンの反応性の約５４倍であるのに
対し、改変タンパク質（Ｆ１０３Ｖ）はＮ−メチルバリ
ンに対する反応性がザルコシンに対する反応性の約１０
５倍であった。すなわち、改変タンパク質（Ｆ１０３
Ｖ）はＮ−メチルバリンオキシダーゼ活性を有する新規
酵素であることが明らかとなった。

【００３２】実施例４ Ｎ−メチルバリンオキシダーゼ
を用いたＮ−メチルバリンの測定 検体中のＮ−メチルバリン濃度を、下記試薬を用いて下
記測定法により測定した。 試薬 トリス緩衝液（ｐＨ８．０） ５０ｍＭ Ｆ１０３Ｖまたはザルコシンオキシダーゼ ０．１ｍｇ／ｍｌ ４−アミノアンチピリン ０．４２ｍＭ フェノール １．８ｍＭ ペルオキシダーゼ ４．７Ｕ／ｍｌ

【００３３】測定方法 Ｎ−メチルバリン水溶液２ｍＭ（１００ｍＭトリス緩衝
液（ｐＨ８．０）にて溶解）の１０段階希釈液を検体と
し、各１００μｌを採取し、これに上記試薬３ｍｌを加
えて３０℃で３分間反応させて、５００ｎｍにおける吸
光度を求めた。なお、ブランクはＮ−メチルバリン含有
被検液の代わりに蒸留水を用いた。図１に検体の希釈直
線性を示した。図１より明らかなように、本発明のＮ−
メチルバリンオキシダーゼ活性を有する新規酵素を用い
ることにより、短時間に正確かつ簡単にＮ−メチルバリ
ンを測定することができる。ザルコシンオキシダーゼを
使用すると、感度不足でＮ−メチルバリンを測定できな
かった。

【００３４】

【発明の効果】本発明によって、ザルコシンオキシダー
ゼ活性を有するタンパク質を蛋白工学的手法を用いて改
変し、Ｎ−メチルバリンオキシダーゼ活性を有する新規
酵素を供給することが可能となった。本発明のＮ−メチ
ルバリンオキシダーゼ活性を有する新規酵素は、検体中
のＮ−メチルバリン量の測定に使用することができる。

【００３５】

【配列表】

配列番号：１ 配列の長さ：３８９ 配列の型：アミノ酸 トポロジー：直鎖状 配列の種類：蛋白質 起源 生物名：アースロバクター・エスピー(Arthrobacter S
P.) 株名：ＴＥ１８２６ 配列 Met Ser Ile Lys Lys Asp Tyr Asp Val Ile Val Val Gly Ala Gly Ser 1 5 10 15 Met Gly Met Ala Ala Gly Tyr Tyr Leu Ser Lys Gln Gly Val Lys Thr 20 25 30 Leu Leu Val Asp Ser Phe His Pro Pro His Thr Asn Gly Ser His His 35 40 45 Gly Asp Thr Arg Ile Ile Arg His Ala Tyr Gly Glu Gly Arg Glu Tyr 50 55 60 Val Pro Phe Ala Leu Arg Ala Gln Glu Leu Trp Tyr Glu Leu Glu Lys 65 70 75 80 Glu Thr His His Lys Ile Phe Thr Lys Thr Gly Val Leu Val Phe Gly 85 90 95 Pro Lys Gly Glu Ala Pro Phe Val Ala Glu Thr Met Glu Ala Ala Lys 100 105 110 Glu His Ser Leu Asp Val Asp Leu Leu Glu Gly Ser Glu Ile Asn Lys 115 120 125 Arg Trp Pro Gly Val Thr Val Pro Glu Asn Tyr Asn Ala Ile Phe Glu 130 135 140 Lys Asn Ser Gly Val Leu Phe Ser Glu Asn Cys Ile Arg Ala Tyr Arg 145 150 155 160 Glu Leu Ala Glu Ala Asn Gly Ala Lys Val Leu Thr Tyr Thr Pro Val 165 170 175 Glu Asp Phe Glu Ile Ala Glu Asp Phe Val Lys Ile Gln Thr Ala Tyr 180 185 190 Gly Ser Phe Thr Ala Ser Lys Leu Ile Val Ser Met Gly Ala Trp Asn 195 200 205 Ser Lys Leu Leu Ser Lys Leu Asn Ile Glu Ile Pro Leu Gln Pro Tyr 210 215 220 Arg Gln Val Val Gly Phe Phe Glu Cys Asp Glu Lys Lys Tyr Ser Asn 225 230 235 240 Thr His Gly Tyr Pro Ala Phe Met Val Glu Val Pro Thr Gly Ile Tyr 245 250 255 Tyr Gly Phe Pro Ser Phe Gly Gly Cys Gly Leu Lys Ile Gly Tyr His 260 265 270 Thr Tyr Gly Gln Lys Ile Asp Pro Asp Thr Ile Asn Arg Glu Phe Gly 275 280 285 Ile Tyr Pro Glu Asp Glu Gly Asn Ile Arg Lys Phe Leu Glu Thr Tyr 290 295 300 Met Pro Gly Ala Thr Gly Glu Leu Lys Ser Gly Ala Val Cys Met Tyr 305 310 315 320 Thr Lys Thr Pro Asp Glu His Phe Val Ile Asp Leu His Pro Gln Phe 325 330 335 Ser Asn Val Ala Ile Ala Ala Gly Phe Ser Gly His Gly Phe Lys Phe 340 345 350 Ser Ser Val Val Gly Glu Thr Leu Ser Gln Leu Ala Val Thr Gly Lys 355 360 365 Thr Glu His Asp Ile Ser Ile Phe Ser Ile Asn Arg Pro Ala Leu Lys 370 375 380 Gln Lys Glu Thr Ile 385

【００３６】配列番号：２ 配列の長さ：１６７０ 配列の型：核酸 鎖の数：二本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：ｇｅｎｏｍｉｃＤＮＡ 起源： 生物名：アースロバクター・エスピー(Arthrobacter s
p.) 株名：ＴＥ１８２６ 配列の特徴 特徴を表す記号：−３５ｓｉｇｎａｌ 存在位置：１１４．．１１９ 特徴を決定した方法：Ｓ 特徴を表す記号：−１０ｓｉｇｎａｌ 存在位置：２３７．．２４２ 特徴を決定した方法：Ｓ 特徴を表す記号：ＣＤＳ 存在位置：２９８．．１４６４ 特徴を決定した方法：Ｐ 特徴を表す記号：ｍａｔ ｐｅｐｔｉｄｅ 存在位置：３０１．．１４６４ 特徴を決定した方法：Ｅ 他の情報：ザルコシンオキダーゼ活性を有する蛋白質を
コードする遺伝子。 配列 CTGCAGTTCT TCCTCCAGCT TTTGAATCCT CACGGTAACA TAAGATTGAA CATAATTTAA 60 ACTTTTGGCC GCCTTTGAAA CGCTGCCATA TTCAACTACC TTTTGAAAAA TCTGCAAATC 120 TTTAATTTCC AAGTATAATC ACTCCCAAAA CGTTCTTTTA CTACTAGCAC TAGAATATTT 180 CTAAAAGTGA TAGCTGCTAT CACTTTTAAG CATTTTACAT GATGGCCAAT AGGCCGTATG 240 ATGTAAATAG ATAATTAAGA AAATTCAAAT TACCTGTTTG AAAAAGGAGA GGAAACA 297 ATG AGT ATT AAA AAA GAT TAT GAT GTA ATT GTG GTT GGC GCT GGT TCC 345 Met Ser Ile Lys Lys Asp Tyr Asp Val Ile Val Val Gly Ala Gly Ser 1 5 10 15 ATG GGA ATG GCA GCT GGG TAC TAT CTG TCT AAA CAA GGT GTT AAA ACA 393 Met Gly Met Ala Ala Gly Tyr Tyr Leu Ser Lys Gln Gly Val Lys Thr 20 25 30 CTA TTG GTA GAT TCA TTT CAT CCT CCC CAT ACA AAT GGC AGC CAT CAT 441 Leu Leu Val Asp Ser Phe His Pro Pro His Thr Asn Gly Ser His His 35 40 45 GGC GAT ACA CGG ATC ATT CGT CAC GCA TAT GGC GAA GGA AGA GAG TAT 489 Gly Asp Thr Arg Ile Ile Arg His Ala Tyr Gly Glu Gly Arg Glu Tyr 50 55 60 GTA CCG TTT GCC TTG AGA GCA CAA GAG TTA TGG TAT GAA TTA GAA AAG 537 Val Pro Phe Ala Leu Arg Ala Gln Glu Leu Trp Tyr Glu Leu Glu Lys 65 70 75 80 GAG ACT CAT CAT AAA ATA TTT ACA AAA ACA GGT GTA CTC GTT TTT GGT 585 Glu Thr His His Lys Ile Phe Thr Lys Thr Gly Val Leu Val Phe Gly 85 90 95 CCT AAA GGA GAA GCT CCT TTC GTT GCC GAA ACA ATG GAA GCC GCA AAG 633 Pro Lys Gly Glu Ala Pro Phe Val Ala Glu Thr Met Glu Ala Ala Lys 100 105 110 GAA CAT TCA TTA GAT GTT GAT TTA CTA GAA GGA AGT GAA ATA AAT AAG 681 Glu His Ser Leu Asp Val Asp Leu Leu Glu Gly Ser Glu Ile Asn Lys 115 120 125 CGT TGG CCA GGT GTA ACG GTT CCT GAG AAT TAT AAT GCT ATT TTT GAA 729 Arg Trp Pro Gly Val Thr Val Pro Glu Asn Tyr Asn Ala Ile Phe Glu 130 135 140 AAA AAT TCT GGT GTC TTA TTT AGT GAA AAT TGT ATT CGC GCT TAC CGT 777 Lys Asn Ser Gly Val Leu Phe Ser Glu Asn Cys Ile Arg Ala Tyr Arg 145 150 155 160 GAA TTG GCG GAA GCA AAT GGT GCG AAA GTT CTA ACG TAC ACA CCC GTT 825 Glu Leu Ala Glu Ala Asn Gly Ala Lys Val Leu Thr Tyr Thr Pro Val 165 170 175 GAA GAT TTC GAG ATT GCC GAG GAC TTC GTC AAA ATC CAA ACC GCC TAT 873 Glu Asp Phe Glu Ile Ala Glu Asp Phe Val Lys Ile Gln Thr Ala Tyr 180 185 190 GGC TCC TTT ACA GCC AGT AAA TTA ATT GTT AGC ATG GGC GCT TGG AAT 921 Gly Ser Phe Thr Ala Ser Lys Leu Ile Val Ser Met Gly Ala Trp Asn 195 200 205 AGC AAA CTG CTA TCA AAA TTA AAT ATT GAA ATC CCA TTG CAG CCA TAC 969 Ser Lys Leu Leu Ser Lys Leu Asn Ile Glu Ile Pro Leu Gln Pro Tyr 210 215 220 CGT CAA GTT GTC GGA TTC TTC GAA TGT GAT GAA AAA AAA TAT AGC AAT 1017 Arg Gln Val Val Gly Phe Phe Glu Cys Asp Glu Lys Lys Tyr Ser Asn 225 230 235 240 ACA CAT GGT TAT CCG GCG TTC ATG GTC GAA GTC CCA ACT GGC ATC TAT 1065 Thr His Gly Tyr Pro Ala Phe Met Val Glu Val Pro Thr Gly Ile Tyr 245 250 255 TAC GGA TTT CCA AGC TTC GGC GGC TGC GGC TTG AAA ATA GGC TAT CAT 1113 Tyr Gly Phe Pro Ser Phe Gly Gly Cys Gly Leu Lys Ile Gly Tyr His 260 265 270 ACG TAT GGT CAA AAA ATC GAT CCA GAT ACG ATT AAT CGT GAA TTT GGT 1161 Thr Tyr Gly Gln Lys Ile Asp Pro Asp Thr Ile Asn Arg Glu Phe Gly 275 280 285 ATT TAC CCG GAG GAT GAA GGG AAT ATT CGC AAA TTC CTG GAA ACA TAT 1209 Ile Tyr Pro Glu Asp Glu Gly Asn Ile Arg Lys Phe Leu Glu Thr Tyr 290 295 300 ATG CCG GGA GCA ACC GGC GAA TTA AAA AGT GGG GCA GTT TGC ATG TAC 1257 Met Pro Gly Ala Thr Gly Glu Leu Lys Ser Gly Ala Val Cys Met Tyr 305 310 315 320 ACA AAA ACA CCT GAT GAG CAT TTC GTG ATT GAT TTA CAT CCT CAA TTC 1305 Thr Lys Thr Pro Asp Glu His Phe Val Ile Asp Leu His Pro Gln Phe 325 330 335 TCG AAT GTC GCG ATT GCA GCC GGA TTC TCC GGA CAT GGG TTT AAA TTC 1353 Ser Asn Val Ala Ile Ala Ala Gly Phe Ser Gly His Gly Phe Lys Phe 340 345 350 TCA AGC GTA GTT GGT GAA ACA TTA AGT CAA TTA GCT GTA ACC GGT AAA 1401 Ser Ser Val Val Gly Glu Thr Leu Ser Gln Leu Ala Val Thr Gly Lys 355 360 365 ACA GAA CAC GAT ATT TCC ATC TTT TCA ATC AAT CGC CCT GCT TTA AAA 1449 Thr Glu His Asp Ile Ser Ile Phe Ser Ile Asn Arg Pro Ala Leu Lys 370 375 380 CAA AAA GAA ACG ATT TAAAAACGCA AGCAAGCCGT ACATAAATTT CGATAGATAT 1504 Gln Lys Glu Thr Ile 385 TATGTACGGC TTACTTTATT TACAACTTAA AAATCTGCAT ATCAATCCTG TCCCTCTACT 1564 GATTGAAGCA CAAACTGTAC TTGAACGGCT TTTTTATTAA CTTGTAACGA TAACAGGAAC 1624 GCTAAAATAA GAAGACCGCT GCATAAGAAT AGTACGGGAG GAATTC 1670

【００３７】配列番号：３ 配列の長さ：３９ 配列の型：核酸（ＤＮＡ） 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：合成ＤＮＡ 配列 GGTCC TAAAG GAGAA GCTCC TGTCG TTGCC GAAAC AATG 39

【図面の簡単な説明】

【図１】プラスミド、pSAOEP3-F103V の構造を示す。

【図２】Ｎ−メチルバリン測定の希釈直線性を示す。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁶ 識別記号 庁内整理番号 ＦＩ 技術表示箇所 Ｃ１２Ｒ 1:19） (Ｃ１２Ｎ 1/21 Ｃ１２Ｒ 1:19）

Claims (7)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 水および酸素の存在下でＮ−メチルバリ
   ンに作用して、バリン、ホルムアルデヒドおよび過酸化
   水素を生成することを特徴とするＮ−メチルバリンオキ
   シダーゼ活性を有する新規な酵素。
2. 【請求項２】 下記理化学的性質を有する請求項１記載
   のＮ−メチルバリンオキシダーゼ活性を有する新規な酵
   素。 作用：水および酸素の存在下でＮ−メチルバリンに作用
   して、バリン、ホルムアルデヒドおよび過酸化水素を生
   成する。 基質特異性：Ｎ−メチルバリン １００％ ザルコシン ≦１％ 至適ｐＨ：７〜９ 至適温度：４０〜５０℃ 分子量：４３Ｋｄ
3. 【請求項３】 配列表・配列番号１に記載されるアミノ
   酸配列の第１０３番目のフェニルアラニンがバリンに置
   換されたことを特徴とする請求項１記載のＮ−メチルバ
   リンオキシダーゼ活性を有する新規な酵素。
4. 【請求項４】 ザルコシンオキシダーゼ活性を有するタ
   ンパク質を構成するアミノ酸配列のフェニルアラニンを
   他のアミノ酸に置換することを特徴とするＮ−メチルバ
   リンオキシダーゼ活性を有する新規な酵素の製造法。
5. 【請求項５】 配列表・配列番号１に記載されるアミノ
   酸配列の第１０３番目のフェニルアラニンをコードする
   遺伝子を部位特異的変異させることにより、他のアミノ
   酸に置換して、Ｎ−メチルバリンオキシダーゼ活性を有
   する酵素を製造することを特徴とする請求項４に記載さ
   れるＮ−メチルバリンオキシダーゼ活性を有する新規な
   酵素の製造法。
6. 【請求項６】 他のアミノ酸がバリンであることを特徴
   とする請求項４または５記載のＮ−メチルバリンオキシ
   ダーゼ活性を有する新規な酵素の製造法。
7. 【請求項７】 検体中のＮ−メチルバリンに、水および
   酸素の存在下でＮ−メチルバリンに作用して、バリン、
   ホルムアルデヒドおよび過酸化水素を生成するＮ−メチ
   ルバリンオキシダーゼ活性を有する新規な酵素を作用さ
   せ、消費する酸素または生成するバリン、ホルムアルデ
   ヒトあるいは過酸化水素を測定することを特徴とするＮ
   −メチルバリンの定量法。