JPH0717864A

JPH0717864A - 精製テトラヒドロピリミジン誘導体

Info

Publication number: JPH0717864A
Application number: JP5051221A
Authority: JP
Inventors: Aviva Lapidot; ラピドットアビバ; Livia Inbar; インバーリビア; Yosef Aloni; アロニヨゼフ; Edna Ben-Asher; ベン − アッシャーエドナ
Original assignee: Yeda Research and Development Co Ltd
Current assignee: Yeda Research and Development Co Ltd
Priority date: 1992-01-30
Filing date: 1993-02-01
Publication date: 1995-01-20
Also published as: IL100810A; EP0553884A1; US5789414A; CA2088390A1; AU3213993A; DE69320075D1; CN1080172A; ATE169339T1; HUT67711A; EP0553884B1; DE69320075T2; HU9300251D0; NZ245797A; EP0845539A1; ZA93652B; IL100810A0

Abstract

(57)【要約】【目的】本発明はテトラヒドロピリミジン誘導体とそ
れらを含む薬剤組成物に関する。さらに詳しくは、本発
明はＤＮＡ結合性薬剤、化学発癌物質および放射線照射
による障害からのＤＮＡの保護に有用なテトラヒドロピ
リミジン誘導体に関する。【構成】本発明の薬剤組成物は活性成分としての、２
−メチル−４−カルボキシ−５−ヒドロキシ−３，４，
５，６−テトラヒドロピリミジン［ＴＨＰ（Ａ）］、そ
の塩、５−エーテルまたは５−エステル、および２−メ
チル−４−カルボキシ−３，４，５，６−テトラヒドロ
ピリミジン［ＴＨＰ（Ｂ）］、またはその塩よりなる群
から選択される少なくとも１つのテトラヒドロピリミジ
ン誘導体と、薬剤として許容される担体よりなる。ＴＨ
Ｐ（Ａ）、ＴＨＰ（Ｂ）またはこれらを組合せたものを
使用することにより、ＤＮＡ結合性薬剤による障害から
非腫瘍性組織のＤＮＡが保護される。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】本発明は、精製されたテトラヒドロピリミ
ジン誘導体とそれらを含む薬剤組成物に関する。さらに
詳しくは、本発明は、ＤＮＡ結合性薬剤、化学発癌物質
や突然変異誘発物質および放射線照射による障害からの
ＤＮＡの保護に有用なテトラヒドロピリミジン誘導体に
関する。

【０００２】癌の化学療法に使用される１つのクラスの
抗腫瘍性抗生物質であるアクチノマイシンは、自身をＤ
ＮＡの平面塩基対の間に置き、従って２重らせんの巻戻
しを妨害し、また転写（すなわちＤＮＡ依存性ＲＮＡ合
成）をインビボおよびインビトロで阻害することによ
り、細胞の複製を防ぐ。インビボまたはインビトロにお
けるこの転写阻害は、伸張時のＤＮＡへの薬剤の結合と
ＲＮＡポリメラーゼの妨害により起きると考えられてい
る。アクチノマイシンＤやダウマイシンのようなＤＮＡ
の挿入剤（ｉｎｔｅｒｃａｌａｔｏｒｓ）は、ＤＮＡの
２次構造に影響することが証明された。

【０００３】ダクチノマイシンとも呼ばれるアクチノマ
イシンＤ（以後ＡｃｔＤと呼ぶ）やアドリアマイシ
ンは、公知の抗腫瘍性抗生物質である。しかしこれらは
その強い毒性のために化学療法での一般的な使用が限定
されている。ＡｃｔＤや他の抗腫瘍性および細胞毒
性抗生物質の毒性を下げ、これらが抗癌療法での有効に
使用されるようになれば極めて好ましい。

【０００４】本出願の発明者により、２つの未知の代謝
物のテトラヒドロピリミジン誘導体である、２−メチル
−４−カルボキシ−５−ヒドロキシ−３，４，５，６−
テトラヒドロピリミジン（以後ＴＨＰ（Ａ）と呼ぶ）と
２−メチル−４−カルボキシ−３，４，５，６−テトラ
ヒドロピリミジン（以後ＴＨＰ（Ｂ）と呼ぶ）は、アク
チノマイシンＤ産生グラム陽性の放線菌であるストレプ
トミセス・パルブルス（Ｓｔｒｅｐｕｔｏｍｙｃｅｓ
ｐａｒｖｕｌｕｓ）の細胞内に蓄積することが見いださ
れ、インビボとインビトロのＮＭＲ試験により同定され
たが、いずれも単離もされなかったし精製もされなかっ
た（インバーとラピドット（ＩｎｂａｒａｎｄＬａｐ
ｉｄｏｔ）、１９８８ａ，１９８８ｂ，１９９１）。

【０００５】ＴＨＰ（Ｂ）はすでに、極めて好塩性の細
菌であるエクトチオロドスピラ・ハロクロリス（Ｅｃｔ
ｏｔｈｉｏｒｈｏｄｏｓｐｉｒａｈａｌｏｃｈｌｏｒ
ｉｓ）の培養物から抽出されていた。これは「エクトイ
ン」（”ｅｃｔｏｉｎｅ”）と呼ばれ、浸透圧調節機能
を有することが示唆されている（ガリンスキー（Ｇａｌ
ｉｎｓｋｉ）ら、１８８５）。ＴＨＰ（Ｂ）・ＣＨ_３
ＯＨの結晶は水を含まないメタノールから結晶化された
（シュー（Ｓｃｈｕｈ）ら、１９８５）。環状のアミノ
酸であるエクトインは後に、極度に塩分のある環境の生
物である種々の異なる好塩性および耐塩性のユーバクテ
リア（ｅｕｂａｃｔｅｒｉａ）（例えばハロモナス・エ
ロンガタ（Ｈａｌｏｍｏｎａｓｅｌｏｎｇａｔａ）、
デレバ・ハロフィラ（Ｄｅｌｅｖａｈａｌｏｐｈｉｌ
ａ）、ハロモナス・ハルモフェラ（Ｈａｌｏｍｏｎａｓ
ｈａｌｍｏｐｈｉｌａ）、バクテリウム・Ｂａｌ（Ｂ
ａｃｔｅｒｉｕｍＢａｌ）、ビブリオ・コスチコラ
（Ｖｉｂｒｉｏｃｏｓｔｉｃｏｌａ）およびブレビバ
クテリウム・リネンズ（Ｂｒｅｖｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ
ｌｉｎｅｎｓ））中に見いだされた。これらの微生物
の天然の環境（塩水湖およびソーダ水湖、天日塩田、海
岸のラグーンまたは海水）の特徴は、高いイオン濃度と
低い水活性である。浸透圧平衡の維持のために、多くの
好塩性ユーバクテリアおよび酵母、藻類や菌類は、無機
イオン（例えばＫ^＋、Ｎａ^＋およびＣｌ⁻）および低分
子量の中性の非イオン性物質（ポリオール、糖、ある種
のアミノ酸、ベタインおよびエクトインなどの主要なク
ラスがある）を蓄積する。これらの溶質は浸透圧を補正
し、その定義のように細胞の代謝に融和性があるため、
「融和性溶質」として呼ばれる。純粋に浸透圧の機能と
は別に、エクトインを含む融和性溶質は酵素に対して
（加熱、凍結および乾燥に対して）保護的作用も示す
（ウォールファース（Ｗｏｈｌｆａｒｔｈ）ら、１９９
０；レゲブ（Ｒｅｇｅｖ）ら、１９９０；ピーターズ
（Ｐｅｔｅｒｓ）ら、１９９０：ガリンスキーとリペル
ト（ＧａｌｉｎｓｋｉａｎｄＬｉｐｐｅｒｔ）ら、
１９９１）。タケダ化学工業（ＴａｋｅｄａＣｈｅｍ
ｉｃａｌＩｎｄ．）の日本特許出願第３０３１２６５
号は、エクトインの化学合成を開示し、これは医薬、農
薬または有機電子工学物質の中間体として有用であるこ
とをつけ加えている。これら先行技術はどれもＴＨＰ
（Ａ）とＴＨＰ（Ｂ）の薬剤としての作用を開示してお
らず、特に障害からＤＮＡを保護する作用については開
示していない。

【０００６】本発明者らは、アクチノマイシンＤ産生細
菌と好塩性ユーバクテリアの自己防御方法の間には共通
点があることを提唱する。抗生物質産生生物がいかにし
て自身が死滅するのを避けることができるかという問題
は、多くの研究の対象となっている。薬剤作用の標的
は、抗生物質を産生する生物中では内因性の抗生物質に
対して耐性があることは知られているが、多くの場合こ
のような耐性の基礎は充分に解明されていない。ほんの
わずかの抗生物質標的の自己修飾の機構しか性状解析さ
れていない。抗生物質が蛋白合成に関係している場合、
自己防御はリボゾームＲＮＡ標的の特異的なメチル化に
依存している。しかしＤＮＡ標的で抗生物質が結合する
能力に対する妨害は達成されていない。

【０００７】アクチノマイシンＤはＤＮＡ依存性ＲＮＡ
合成の強力なインヒビターである。ストレプトミセス・
パルブルス（Ｓ．Ｐａｒｖｕｌｕｓ）はその正常な成長
過程においてＡｃｔＤを産生し、その産生と同時に
ＲＮＡを合成するため、ＡｃｔＤに対する転写機構の
耐性はこの細胞に特徴的なものかも知れない。

【０００８】同様に高電解質濃度に対する好塩性微生物
の転写機構の耐性は、これらの細胞の本質的な特徴かも
知れない。生理学的ｐＨにおけるＤＮＡは強く荷電して
いる多価陰イオンであり、従って陽イオンに囲まれてい
るため、蛋白がＤＮＡに結合するとこれらがＤＮＡから
排除される。細胞内イオン濃度の変動という悪影響に対
して好塩性細菌でインビボでいかにＤＮＡ−蛋白相互作
用が緩衝化されているかということは、浸透圧制御の分
野では難しい問題である。好塩性生物は、細胞内高カリ
ウムイオン濃度での細胞内巨大分子の構造の破壊を避け
るための生存方法を獲得しなければならない。ストレプ
トミセス属の種々の抗生物質産生株は、土壌の塩濃度が
局所的に変化した部分に接触させることにより、土壌か
ら単離された。これらの細菌においては抗生物質と浸透
圧ストレスに対する応答は共通の機構が存在することを
本明細書中では提唱している。

【０００９】抗生物質産生生物において自己防御の機構
を解明するためにＮＭＲ法を用いて、細胞内エフェクタ
ーが観察された。ストレプトミセス・パルブルス（Ｓ．
ｐａｒｖｕｌｕｓ）によるＡｃｔＤ生合成の調節機
構の研究において、ＴＨＰ（Ａ）とＴＨＰ（Ｂ）が同定
され細胞内に蓄積されることが見いだされた（インバー
とラピドット（ＩｎｂａｒａｎｄＬａｐｉｄｏ
ｔ）、１９８８ａ）。標識実験によりＴＨＰはＡｃｔ
Ｄの前駆体ではないことが確立された（インバーとラ
ピドット（ＩｎｂａｒａｎｄＬａｐｉｄｏｔ）、１
９８８ｂ）。本発明により単離され精製されたＴＨＰ
（Ａ）とＴＨＰ（Ｂ）のＮＭＲとＸ線結晶解析により、
ＴＨＰは半椅子構造（ｈａｌｆ−ｃｈａｉｒ）の両性イ
オン性（ｚｗｉｔｅｒｉｏｎｉｃ）分子を形成すること
が証明される（図１）。

【００１０】本発明においては、ＴＨＰ（Ａ）とＴＨＰ
（Ｂ）はストレプトミセス・パルブルス（Ｓ．ｐａｒｖ
ｕｌｕｓ）のみでなく、密接に関連するＡｃｔＤ産
生微生物（例えばストレプトミセス・クリソマルス（Ｓ
ｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓｃｈｒｙｓｏｍａｌｌｕｓ）
とストレプトミセス・アンチビオチクス（Ｓｔｒｅｐｔ
ｏｍｙｃｅｓａｎｔｉｂｉｏｔｉｃｕｓ））中にも存
在することが、本発明の^１３ＣＮＭＲ実験により証明さ
れた。この実験はこれらの株においてＡｃｔＤ合成の
時にＴＨＰ（Ａ）とＴＨＰ（Ｂ）が産生されることを明
瞭に示した。ＡｃｔＤを産生する種々のストレプト
ミセスにおけるＴＨＰの発見、ＡｃｔＤ合成中にそれ
らが比較的高濃度で存在すること、そしてそれらの合成
時期がＡｃｔＤの合成時期と一致することは、これ
らがＡｃｔＤ産生生物の防御機構で機能しているか
も知れないことを示している。さらにＲＮＡポリメラー
ゼＩＩがＡｃｔＤにより完全に阻害されるインビト
ロ転写系（カデッシュとチェンバーリン（Ｋａｄｅｓｃ
ｈａｎｄＣｈａｍｂｅｒｌｉｎ）、１９８２）を用
いて、ＴＨＰ（Ａ）とＴＨＰ（Ｂ）は共同して作用して
ＲＮＡポリメラーゼ活性を部分的に回復させることが見
いだされた。

【００１１】すなわち本発明においてＴＨＰ（Ａ）のみ
およびＴＨＰ（Ａ）とＴＨＰ（Ｂ）は組合せで、制限エ
ンドヌクレアーゼによる消化からＤＮＡを保護すること
が見いだされた。これらはまた、大腸菌の増殖を防ぐよ
うな条件である高塩濃度またはアドリアマイシンの存在
下での大腸菌の効率的な増殖を可能にし、ＴＨＰ（Ａ）
とＴＨＰ（Ｂ）は相乗効果にによりＤＮＡ−ＡｃｔＤ
複合体形成を防ぐ。インビトロの転写測定法で示され
るように、ＴＨＰ（Ａ）のみおよびＴＨＰ（Ａ）とＴＨ
Ｐ（Ｂ）の混合物はさらに、ＡｃｔＤの存在下でＲ
ＮＡ転写に直接の作用を示す。

【００１２】本発明の目的は、ＴＨＰ（Ａ）および／ま
たはＴＨＰ（Ｂ）、そして薬剤として許容される担体よ
りなる薬剤組成物を与えることである。これらの組成物
は特にＤＮＡ結合性薬剤（例えば毒性のある抗腫瘍性薬
剤）、または化学発癌物質や突然変異誘発物質または放
射線照射（例えば紫外線照射）による障害から非腫瘍性
組織のＤＮＡを保護する。

【００１３】本発明の薬剤組成物は、活性成分として
の、２−メチル−４−カルボキシ−５−ヒドロキシ−
３，４，５，６−テトラヒドロピリミジン（ＴＨＰ
（Ａ））、その塩、５−エーテルまたは５−エステル、
および／または２−メチル−４−カルボキシ−３，４，
５，６−テトラヒドロピリミジン（ＴＨＰ（Ｂ））、ま
たはその塩よりなる群から選択されるテトラヒドロピリ
ミジン誘導体と、薬剤として許容される担体よりなる。

【００１４】本発明の別の目的は、実質的に純粋で結晶
型のＴＨＰ（Ａ）および結晶性のＴＨＰ（Ｂ）・２Ｈ_２
Ｏを与えることである。固体状態におけるＴＨＰ
（Ａ）とＴＨＰ（Ｂ）の構造はそれらの溶液中の構造と
同じであることはわかっている。

【００１５】本発明のさらに別の目的は、実質的に純粋
な型のＴＨＰ（Ａ）とＴＨＰ（Ｂ）を得る方法を与える
ことである。ＴＨＰ（Ａ）とＴＨＰ（Ｂ）はラセミ体す
なわち光学活性のある形として存在してもよい。本発明
により精製された天然の生成物はＳ型を有し、生物活性
があることが見いだされた。

【００１６】本発明の他の目的や利点は本発明の開示か
ら明らかであろう。

【００１７】ＴＨＰ（Ａ）とＴＨＰ（Ｂ）は合成により
得られるか、または以下のような天然のソースから精製
された形で得られる：ストレプトミセス種の微生物（例
えばストレプトミセス・パルブルス（Ｓ．Ｐａｒｖｕｌ
ｕｓ）、ストレプトミセス・クリソマルス（Ｓ．ｃｈｒ
ｙｓｏｍａｌｌｕｓ）、またはストレプトミセス・アン
チビオチクス（Ｓ．ａｎｔｉｂｉｏｔｉｃｕｓ）および
これらの突然変異体）のＡｃｔＤ産生微生物の細胞
抽出物。ＴＨＰ（Ｂ）のみは塩ストレス下の好塩性およ
び体塩性の細菌（エクトチオロドスピラ・ハロクロリス
（Ｅ．ｈａｌｏｃｈｌｏｒｉｓ）、エクトチオロドスピ
ラ・ハロフィラ（Ｅ．ｈａｌｏｐｈｉｌａ）、およびこ
れらの突然変異体のようなエクトチオロドスピラ属、ま
たはハロモナダッシー（Ｈａｌｏｍｏｎａｄａｃｅａ
ｅ）科の従属栄養の好塩性ユーバクテリア）から、単離
され精製される。ＴＨＰ（Ａ）のみは、低塩濃度ストレ
ス下のストレプトミセス種の土壌微生物（例えばストレ
プトミセス・クラブリゲルス（Ｓ．ｃｌａｖｕｌｉｇｅ
ｒｕｓ）、ストレプトミセス・グリセウス（Ｓ．ｇｒｉ
ｓｅｕｓ）およびこれらの突然変異体）により産生され
る。

【００１８】本発明の実施態様において、ＴＨＰ（Ａ）
とＴＨＰ（Ｂ）は、以下の工程よりなる、ＡｃｔＤ
産生ストレプトミセス微生物の細胞抽出物から単離され
精製される：（ａ）適切な増殖培地中でストレプトミセス株を培養
し；（ｂ）細胞を集め、洗浄した細胞から細胞抽出物を調
製し；（ｃ）いくつかのカラムクロマトグラフィー分離工程
により、付随する炭水化物、ポリオール、アミノ酸、ペ
プチドおよび蛋白からテトラヒドロピリミジン誘導体で
あるＴＨＰ（Ａ）とＴＨＰ（Ｂ）を分離し；（ｄ）２つのテトラヒドロピリミジン誘導体を含む溶
液をイオン交換クロマトグラフィーカラムにかけて；（ｅ）異なる溶出液により各テトラヒドロピリミジン
誘導体を溶出して、実質的に純粋なＴＨＰ（Ａ）とＴＨ
Ｐ（Ｂ）を得る。

【００１９】本発明で使用されるＡｃｔＤ産生スト
レプトミセス株は、ストレプトミセス・パルブルス
（Ｓ．ｐａｒｖｕｌｕｓ）であり、さらに好ましくはス
トレプトミセス・パルブルス（Ｓ．Ｐａｒｖｕｌｕｓ）
ＡＴＣＣ１２４３４であり、これはＡＴＣＣ（アメリカ
ンタイプカルチャーコレクション）から自由に入手可能
である。

【００２０】細胞抽出物は当該分野で公知の方法（例え
ば洗浄した細胞ペレットを水に懸濁し１００℃で加熱す
る方法かまたは過塩素酸法）により得られる。次に細胞
抽出物をまず酢酸と混合してから、分離操作を行う。ま
ず例えば水により炭水化物とポリオールを除去し、次に
陰イオン交換クロマトグラフィーによりアミノ酸を除去
し、セファデックスＧ２５により細胞内ペプチドと蛋白
の残渣を除去する。次にダウエックス５０Ｗ（ＮＨ_４ ^＋
型）カラムで工程（ｄ）のＴＨＰ（Ａ）からＴＨＰ
（Ｂ）の分離を行い、工程（ｅ）でＴＨＰ（Ａ）を水で
溶出し、ＴＨＰ（Ｂ）を３Ｍの水酸化アンモニウムで溶
出する。

【００２１】別の好適な実施態様において、ＴＨＰ
（Ａ）は土壌から単離されたストレプトミセス株の細胞
抽出物から、前述の方法と類似の以下の工程よりなる方
法により単離され精製される：（ａ）０．２５Ｍ−０．５ＭのＮａＣｌ中の適切な増
殖培地中で上記ストレプトミセス株を培養し；（ｂ）細胞を集め、洗浄した細胞から抽出物を調製
し；（ｃ）いくつかのカラムクロマトグラフィー分離工程
により、付随する炭水化物、アミノ酸および蛋白からＴ
ＨＰ（Ａ）を分離し；（ｄ）ＴＨＰ（Ａ）を含む溶液をイオン交換カラムク
ロマトグラフィーにかけて；（ｅ）水でＴＨＰ（Ａ）を溶出して、実質的に純粋な
ＴＨＰ（Ａ）を得る。

【００２２】本発明で使用される好適な土壌ストレプト
ミセス株はストレプトミセス・クラブリゲルス（Ｓ．ｃ
ｌａｖｕｌｉｇｅｒｕｓ）であり、さらに詳しくはスト
レプトミセス・クラブリゲルス（Ｓ．ｃｌａｖｕｌｉｇ
ｅｒｕｓ）ＮＲＲＬ３５８５（これはＮＲＲＬより自由
に入手可能である）、およびストレプトミセス・グリセ
ウス（Ｓ．ｇｒｉｓｅｕｓ）、特にストレプトミセス・
グリセウス（Ｓ．ｇｒｉｓｅｕｓ）ＡＴＣＣ１０１３７
（これはＡＴＣＣより自由に入手可能である）である。

【００２３】本発明の薬剤組成物に使用されるＴＨＰ
（Ａ）とＴＨＰ（Ｂ）の塩は、無機および有機の塩基と
形成される生理学的に許容される塩である。ＴＨＰ
（Ａ）の５−エーテルは低級アルキルエーテルおよび糖
部分と形成されるエーテル（例えばヌクレオシド）があ
り、当該分野で公知の方法により適当なアルコールとの
反応により調製される。ＴＨＰ（Ａ）の５−エステル
は、適当な低級アルカノン酸との反応により調製される
低級アルカノイルエステルがある。

【００２４】ＴＨＰ（Ａ）またはＴＨＰ（Ｂ）またはこ
れらを組合せたものは、ＤＮＡ結合性薬剤による治療を
受けている患者において、ＤＮＡ結合性薬剤による障害
から非腫瘍性組織のＤＮＡを保護するために使用され
る。ＤＮＡ結合性薬剤は現在化学療法で使用されている
任意の抗腫瘍性抗生物質でよく、例えばダクチノマイシ
ン（ＡｃｔＤ）、ダウノルビシン、ドキソルビシン
（アドリアマイシン）、ブレオマイシン、マイトマイシ
ンなどがある。これらの抗腫瘍性抗生物質は正常組織に
は毒性があるため、ＴＨＰ（Ａ）またはＴＨＰ（Ｂ）ま
たはＴＨＰ（Ａ）とＴＨＰ（Ｂ）を組合せたものはこれ
らの毒性作用を低下させる。毒性が強すぎるため現在化
学療法に使用されていない他の抗腫瘍性抗生物質（例え
ばアントラサイクリン抗生物質であるシネルビン（ｃｉ
ｎｅｒｕｂｉｎ）ＡとＢ）は、ＴＨＰ（Ａ）、ＴＨＰ
（Ｂ）またはＴＨＰ（Ａ）＋ＴＨＰ（Ｂ）により毒性が
低下して、将来抗腫瘍療法に使用されるかも知れない。

【００２５】ＴＨＰ（Ａ）、ＴＨＰ（Ｂ）またはこれら
を組合せたものは、化学発癌物質や突然変異誘発物質
（放射線照射を含む）からＤＮＡを保護するのに有用で
ある。

【００２６】ＴＨＰ（Ａ）およびＴＨＰ（Ｂ）は哺乳動
物には毒性はない。体重１００ｇ当り１、１０および１
００ｍｇの投与量でマウスに投与した時、毒性は見られ
なかった。ＴＨＰ（Ａ）とＴＨＰ（Ｂ）はまた、グラム
陽性細菌およびグラム陰性細菌のいくつかの培養物で行
われた試験で証明されたように、抗生物質活性はなかっ
た。

【００２７】ＴＨＰ（Ａ）、その塩、５−エーテルまた
は５−エステルおよびＴＨＰ（Ｂ）またはその塩は、こ
れらの化合物の有効量を薬剤として許容される担体と混
合することにより、薬剤組成物に製剤化される。この薬
剤組成物に安定剤のような添加物を加えてもよい。

【００２８】任意の適当な投与法の薬剤組成物が本発明
に含まれるが、好適な投与法は単回投与の静脈注射と静
脈潅流である。

【００２９】ＴＨＰ（Ａ）とＴＨＰ（Ｂ）の両方を含む
本発明の薬剤組成物中のＴＨＰ（Ａ）とＴＨＰ（Ｂ）の
モル比は異なる。本発明の薬剤組成物は好ましくはＴＨ
Ｐ（Ａ）とＴＨＰ（Ｂ）を等モルで含む。

【００３０】本発明の組成物中のＴＨＰ（Ａ）とＴＨＰ
（Ｂ）のみまたはこれらを組合せたものの有効用は、患
者の状態、疾患の重症度および投与される抗腫瘍性薬剤
の量により異なる。１つの実施態様においては、これら
は抗腫瘍性薬剤に対して過剰に加えられる。

【００３１】本発明の薬剤組成物は、抗腫瘍性抗生物質
の投与の前、投与と一緒にまたは投与後に投与される。
これらは有効量では、抗腫瘍性薬剤の毒性作用を低下さ
せる。

【００３２】本発明を添付の図面を参照して例としての
み記載する。

【００３３】図１は精製した（ａ）精製したＴＨＰ
（Ｂ）と（ｂ）精製したＴＨＰ（Ａ）の（５００−ＭＨ
ｚ）１ＨＮＭＲスペクトルを示す。

【００３４】図２は、ＴＨＰ（Ａ）とＴＨＰ（Ｂ）の立
体化学構造（Ｓ型）の分子構造を示す。

【００３５】図３は、（ａ）０．６：１の比率のＡｃｔ
Ｄ −ｄ（ＡＴＧＣＡＴ）混合物；（ｂ）この混合物
に０．６：１：３０の比率でＴＨＰ（Ｂ）を添加後；
（ｃ）（ｂ）中のの混合物に０．６：１：３０：３０の
比率でＴＨＰ（Ａ）を添加後の、陽子ＮＭＲスペクトル
（７．６−８．４ｐｐｍ；５００ＭＨｚ）を示す。スペ
クトルは捕捉遅延（ａｃｑｕｉｓｉｔｉｏｎｄｅｌａ
ｙ）中の放射線照射による溶媒サプレッション（ｓｏｌ
ｖｅｎｔｓｕｐｐｒｅｓｓｉｏｎ）を用いて、Ｄ_２Ｏ
リン酸緩衝液、ｐＨ７中で１０℃で得られた。これら
の実験は、リン酸緩衝液中の４．０ｍＭのＡｃｔＤ
保存液とＴＨＰ（Ａ）とＴＨＰ（Ｂ）の１００ｍＭの保
存液を用いて行った。各１ＨＮＭＲ実験で、０．４５
ｍｌのリン酸緩衝液中の１．８ｍｇのｄ（ＡＴＧＣＡ
Ｔ）を使用した。

【００３６】図４は、プロット（ａ−ｅ）に示した種々
の薬剤：ＤＮＡ比のＡｃｔＤ −ｄ（ＡＴＧＣＡＴ）
混合物、およびモル比１：３０：３０のｄ（ＡＴＧＣＡ
Ｔ）、ＴＨＰ（Ａ）とＴＨＰ（Ｂ）の混合物、およびプ
ロット（ａ’−ｅ’）に示した種々の薬剤：ＤＮＡ比の
ＡｃｔＤの基礎芳香族陽子領域スペクトル（５００
ＭＨｚ）を示す。（ａ）と（ａ’）の拡張した図はそれ
ぞれスペクトル（Ａ）と（Ａ’）に示されている。スペ
クトルは（図３のように）ｐＨ７で得られた。Ａｃｔ
Ｄ −ｄ（ＡＴＧＣＡＴ）の陽子共鳴はスペクトルに示
されている：アデノシン（内部）Ｈ２陽子は８．０３と
８．００ｐｐｍ、アデノシン（末端）Ｈ２陽子は７．８
６ｐｐｍ、そしてグアノシンＨ８陽子は７．７０と７．
６３ｐｐｍ。ＡｃｔＤ −ｄ（ＡＴＧＣＡＴ）の化学
シフトの割当はブラウン（Ｂｒｏｗｎ）ら（１９８４）
のものと同じである。

【００３７】図５は、ＡｃｔＤによるＲＮＡポリメ
ラーゼＩＩ転写の阻害と、ＴＨＰ（Ａ）とＴＨＰ（Ｂ）
の添加によるその回復を示す放射線写真である。各レー
ンの構成物は表６に示してある。ＤＮＡの濃度は７１．
４μＭであった。

【００３８】図６は、ＴＨＰによるアドリアマイシンに
よるＤＮＡ合成の阻害の逆転を示す。これは略図の下の
表の、取り込まれた［^３Ｈ］チミジンとアドリアマイシ
ン濃度の割合の略図である。中ぬきの四角−［^３Ｈ］チ
ミジン取り込み対アドリアマイシン濃度。黒四角−ＴＨ
Ｐ存在下での［^３Ｈ］チミジン取り込み対アドリアマイ
シン濃度（１００μｇ／ｍｌ）。

【００３９】図７は、ＨｅＬａＷＣＥシステムを用
いるＴＨＰによる転写のアクチノマイシン阻害の逆転を
示す。パルスチェース（ｐｕｌｓｅｃｈａｓｅ）条件
下での転写は例６に記載したように行った。ＤＮＡを増
加する濃度のＴＨＰ（Ａ＋Ｂ）と３０℃で２０分間プレ
インキュベートし、次に０．４μｇ／ｍｌのアクチノマ
イシンＤを加えた。

【００４０】２０分間のインキュベートの後ＷＣＥ（１
０μｌ）を加えて３０℃で２０分間インキュベートし
た。放射性ヌクレオチド混合物を５分のパルスで加え、
続いて１０ｍＭのＣＴＰを含むチェースミックスを添加
した。３０℃で３０分転写をした後停止させた。ＲＮＡ
を抽出し、例６に記載したように分析した。レーンＭ−
分子量マーカー。レーンＣ−アドリアマイシンまたはＴ
ＨＰのない対照反応。０．４μｇ／ｍｌのアクチノマイ
シンＤとの反応のレーンはマーク（＋）がしてある。Ｔ
ＨＰ濃度の増加するレーン（０、５、１０、２０、５
０、１００、２００、５００μｇ／ｍｌ）もまたレーン
の上にマークがしてある。バンドの相対強度は例６に記
載したように推定し、割合は対照（レーンＣ）に対する
ものである。

【００４１】図８は、異なる塩濃度の化学規定培地中で
増殖させたストレプトミセス・クラブリゲルス（Ｓ．ｃ
ｌａｖｕｌｉｇｅｒｕｓ）細胞の抽出物の、陽子脱カッ
プリングしたナチュラルアバダンス（ｐｒｏｔｏｎ−ｄ
ｅｃｏｕｐｌｅｄｎａｔｕｒａｌａｂｕｎｄａｎｃ
ｅ） ^１２ＣＮＭＲ（１２６．７ＭＨｚ）スペクト
ルを示す。（Ａ）０．５ＭのＮａＣｌ、（Ｂ）０．２５
ＭのＮａＣｌ、（Ｃ）塩なし。^１３Ｃピークは以下を含
む：Ａ、ＴＨＰ（Ａ）；Ｔｒｅ、トレハロース；Ｇｌ
ｕ、グルタミン酸。

【００４２】図９は、図８に示すＮＭＲスペクトルから
計算した、種々の塩濃度の化学規定培地で増殖させたス
トレプトミセス・クラブリゲルス（Ｓ．ｃｌａｖｕｌｉ
ｇｅｒｕｓ）中の細胞内代謝物を示す。グルタミン酸は
アミノ酸分析機で測定し、ＴＨＰ（Ａ）とトレハロース
の値はＮＭＲスペクトルからの取り込みにより計算し
た。

【００４３】図１０は、０．５ＭのＮａＣｌの化学規定
培地中で６６時間増殖させたストレプトミセス・グリセ
ウス（Ｓ．ｇｒｉｓｅｕｓ）細胞の抽出物の、陽子脱カ
ップリングした１２ＣＮＭＲ（１２６．７ＭＨｚ）
スペクトルを示す。^１３Ｃピークは以下を含む：Ａ−Ｔ
ＨＰ（Ａ）；Ｔｒｅ−トレハロース；Ｇｌｕ−グルタミ
ン酸；Ｅｈ−エタノール（ＴＨＰ（Ａ）の定量測定のた
めに加えた）。

【００４４】図１１は、ストレプトミセス・グリセウス
（Ｓ．ｇｒｉｓｅｕｓ）から得た精製したＴＨＰ（Ａ）
の、陽子脱カップリングした^１３ＣＮＭＲ（１２
６．７ＭＨｚ）スペクトルを示す。

【００４５】本発明を以下の非限定例でさらに説明す
る。

【００４６】実施例例１：ストレプトミセス・パルブルス（Ｓ．ｐａｒｖ
ｕｌｕｓ）ＡＴＣＣ１２４３４の細胞抽出物からのＴＨ
Ｐ（Ａ）とＴＨＰ（Ｂ）の単離と精製

【００４７】（ａ）増殖培養物の培養４℃の土壌培養で維持したストレプトミセス・パルブル
ス（Ｓ．ｐａｒｖｕｌｕｓ）（ＡＴＣＣ１２４３４）
を、旋回振盪インキュベーター中で３０℃で２日間、Ｎ
Ｚアミン培地（シェフィールドケミカルズ（Ｓｈｅｆｆ
ｉｅｌｄＣｈｅｍｉｃａｌｓ）、ニューヨーク、米
国）上で増殖させた。遠心分離後０．３％ＫＣｌで２回
洗浄し、菌糸の懸濁液（３％）を、化学規定培地（１０
００ｍｌの脱イオン水中４０ｇのＤ−フラクトース、
１．０ｇのＫ_２ＨＰＯ_４、２５ｍｇのＺｎＳＯ_４・７
Ｈ_２Ｏ、２５ｍｇのＣａＣｌ_２・２Ｈ_２Ｏ、２５ｍｇの
ＭｇＳＯ_４・７Ｈ_２Ｏ、２５ｍｇのＦｅＳＯ_４・７Ｈ_２
Ｏ、および２．１ｇのＬ−グルタミン酸、ｐＨ７．１）
の接種菌とした。

【００４８】（ｂ）細胞抽出物の調製１リットルのストレプトミセス・パルブルス（Ｓ．ｐａ
ｒｖｕｌｕｓ）増殖培養物から、ストレプトミセス・パ
ルブルス（Ｓ．ｐａｒｖｕｌｕｓ）の細胞の抽出物を調
製した。４℃で遠心分離（５，０００×ｇで５分間）し
て細胞を集めた。細胞を０．２％のＫＣｌで２回洗浄し
て微量の増殖培地を除去した。洗浄した細胞ペレットを
１０ｍｌの水に懸濁し１００℃で１５分間加熱するか、
または過塩素酸法（インバーとラピドット（Ｉｎｂａｒ
ａｎｄＬａｐｉｄｏｔ）、１９８８ａ）により、細
胞内抽出物を得た。遠心分離（１５，０００×ｇで１５
分間）して上澄液を分離し、減圧下で１ｍｌに濃縮し
た。

【００４９】（ｃ）ストレプトミセス・パルブルス
（Ｓ．ｐａｒｖｕｌｕｓ）細胞抽出物からのＴＨＰ
（Ａ）とＴＨＰ（Ｂ）の分離細胞抽出物試料を４倍量の１Ｍの酢酸と混合してから、
ダウエックス５０Ｗクロマトグラフィーで分離した。カ
ラムを脱イオン水（カラムの５倍量）で洗浄して炭水化
物とポリオールを除去した。アミノ酸、ＴＨＰ（Ａ）と
ＴＨＰ（Ｂ）を３ＭのＮＨ_４ＯＨで溶出した。アンモ
ニアを蒸発させて乾燥し、残渣をｐＨ５にしダウエック
ス１陰イオン（酢酸型）交換クロマトグラフィーで分離
した。グルタミン酸のようなアミノ酸は陰イオン交換カ
ラムに結合したまま残った。ＴＨＰ（Ａ）とＴＨＰ
（Ｂ）を水で溶出した。

【００５０】（ｄ）ペプチドと蛋白からのＴＨＰ（Ａ）
とＴＨＰ（Ｂ）の分離工程（ｃ）で得られたＴＨＰ（Ａ）とＴＨＰ（Ｂ）の混
合物を、４０ｍｌのセファデックスＧ−２５のカラムに
加えた。カラムを水で洗浄した。最初の画分はペプチド
と低分子量の蛋白（黄色）を含み、次にＴＨＰ（Ａ）と
ＴＨＰ（Ｂ）が溶出した。

【００５１】（ｅ）ＴＨＰ（Ｂ）からのＴＨＰ（Ａ）の分離工程（ｄ）で得られたＴＨＰ（Ａ）＋ＴＨＰ（Ｂ）の混
合物を４倍量の１Ｍの酢酸と混合してから、７０ｍｌの
ダウエックス５０Ｗ×８のカラム（ＮＨ_４ ^＋型）に加え
た。水で少量のＴＨＰ（Ｂ）とともにＴＨＰ（Ａ）が溶
出された。３Ｍの水酸化アンモニウムにより、少量のＴ
ＨＰ（Ａ）とともにＴＨＰ（Ｂ）が排除された。これら
の操作をもう一度繰り返してから、ＴＨＰ（Ｂ）からＴ
ＨＰ（Ａ）が完全に分離した。ＴＨＰ（Ｂ）の画分は少
量のアラニンを含んでいた。後の画分を（ＨＣｌで）ｐ
Ｈ２にし、７０ｍｌのダウエックス１陰イオン（ＯＨ−
型）交換クロマトグラフィーで分離した。カラムを水で
洗浄し、１５０ｍｌの１％蟻酸によりＴＨＰ（Ｂ）が排
除された（アラニンは６００ｍｌの１％蟻酸で溶出され
た）。精製したＴＨＰ（Ａ）とＴＨＰ（Ｂ）の１ＨＮ
ＭＲスペクトルをそれぞれ図１の（ｂ）と（ａ）に示
す。その分子構造を図２に示す。

【００５２】例２：ＴＨＰ（Ａ）とＴＨＰ（Ｂ）・２Ｈ
_２Ｏの結晶化（ａ）例１に従い得られた純粋なＴＨＰ（Ａ）を熱メタ
ノールに溶解し、この溶液をベンゼン蒸気下でデシケー
ター中に放置して結晶化させた。７日後に結晶が現れ
た。０．２×０．１×０．０５ｍｍの大きさの透明の斜
方晶系の結晶を集めてＸ線結晶構造解析を行った。（Ｃ
_６Ｈ_１０Ｎ_２Ｏ_３）の結晶構造はスペース基Ｐ３^ｘを有
する三方晶系であった。結晶の結合の長さと結合の角度
はそれぞれ表１と２に示してある。ＴＨＰ（Ａ）の立体
化学構造はＳ型であった。

【００５３】（ｂ）例１に従い得られた純粋なＴＨＰ
（Ｂ）をエタノールに溶解し、この溶液に数滴の塩化メ
チレンを加えた。溶液を放置してゆっくり蒸発させた。
数日後溶液中に結晶が現れた。０．４×０．３×０．２
ｍｍの大きさの透明の斜方晶系の結晶を集めてＸ線結晶
構造解析を行った。Ｃ_６Ｈ_１０Ｎ_２Ｏ_２・２［Ｈ_２Ｏ］
の結晶構造はスペース基Ｐ４^３を有する正四方晶系であ
った。結晶の結合の長さと結合の角度はそれぞれ表１と
２に示してある。ＴＨＰ（Ｂ）の立体化学構造はＳ型で
あった。

【００５４】

【表１】

【００５５】

【表２】

【００５６】例３：ＴＨＰ（Ａ）とＴＨＰ（Ｂ）の存在
下でのオリゴヌクレオチドへのＡｃｔＤの結合−ＮＭ
Ｒ研究ＡｃｔＤとＤＮＡとの結合の性状解析は抗腫瘍性活
性の基礎であると考えられているため、大いに興味を持
たれている問題である。フェノキサゾン環上に付属して
いるペプチド鎖は、ＡｃｔＤがＤＮＡのＧｐＣ部位
に結合しやすいことに大いに関係がある。ＡｃｔＤ
とｄ（ＡＴＧＣＡＴ）の１：１複合体について、溶液の
詳細な構造モデルの研究が行われた（リブランド（Ｌｙ
ｂｒａｎｄ）ら、１９８６）。

【００５７】ＡｃｔＤの存在下または非存在下での
ＴＨＰのＤＮＡへの結合様式は、^１ＨＮＭＲスペクト
ルにより研究された。いくつかの理由によりこの研究の
ためにオリゴヌクレオチドｄ（ＡＴＧＣＡＴ）を選択し
た：これはユニークな強い結合部位を有し、ＡｃｔＤ
のペンタペプチドラクトンと相互作用するのに充分な
長さを有し、ＡｃｔＤ −ｄ（ＡＴＧＣＡＴ）会合の
動力学はゆっくりしており、ＡｃｔＤ −ＤＮＡ会合
の動力学に類似している（ブラウン（Ｂｒｏｗｎ）ら、
１９８４；ゾウ（Ｚｈｏｕ）ら、１９８９）。ＤＮＡ
−ＴＨＰ（Ａ）と（Ｂ）複合体に関する１ＨＮＭＲス
ペクトル試験は、ＴＨＰ（Ａ）とＴＨＰ（Ｂ）はこのオ
リゴヌクレオチドに結合し、そのＡｃｔＤとの複合
体形成を強く妨害することを示している。

【００５８】（ａ）ＴＨＰのｄ（ＡＴＧＣＡＴ）への結
合遊離ｄ（ＡＴＧＣＡＴ）と、ｄ（ＡＴＧＣＡＴ）とＴＨ
Ｐ（Ａ）とＴＨＰ（Ｂ）との複合体中の、交換不可能な
陽子の化学シフトの比較を表３に示す。この６量体にＴ
ＨＰ（Ａ）とＴＨＰ（Ｂ）を加えると、７．９４ｐｐｍ
のグアニジンＨ８（ＧＨ８）シグナルは大きく下方にシ
フト（２０Ｈｚ）し、アデノシン（末端）Ｈ８陽子は１
０Ｈｚだけ下方にシフトしたが、ＴＨＰ（Ａ）のすべて
の基礎芳香族陽子はほんのわずかの変化した示さなかっ
た。

【００５９】（ｂ）ＴＨＰのＡｃｔＤ −ｄ（ＡＴＧ
ＣＡＴ）複合体への結合ＡｃｔＤ −ｄ（ＡＴＧＣＡＴ）複合体へＴＨＰ
（Ｂ）を加える（６量体１モルに対しＡｃｔＤ０．
６４モル）と、ＧＨ８陽子の化学シフトは０．０１８ｐ
ｐｍだけ下方に移動したが、７．９９ｐｐｍのＡｃｔ
Ｄ −６量体複合体のアデノシン（内部）Ｈ２陽子は変
化しなかった（図３ｂ）。ＴＨＰ（Ａ）を加えるとＧＨ
８陽子の下方へのシフト（０．２２ｐｐｍ）がさらに認
められた（図３ｃ）。これらの結果は、ＴＨＰはＡｃｔ
Ｄの存在下でも遊離のオリゴヌクレオチドに結合す
ることを示している。

【００６０】（ｃ）ＡｃｔＤのｄ（ＡＴＧＣＡＴ）への結合ＡｃｔＤの遊離オリゴヌクレオチドおよびオリゴヌ
クレオチド−ＴＨＰ複合体への結合を、１ＨＮＭＲ力
価測定法により調べた。６量体に０．１６モル当量のＡ
ｃｔＤを添加すると、複合体の新しいピークが現れ
（図４ｂ）、その強度は１：１ＡｃｔＤ対ｄ（ＡＴ
ＧＣＡＴ）に増加した（図４ａ、ｂ、ｃ、ｄ、ｅ）。遊
離の６量体とＡｃｔＤに結合した６量体のシグナル
比は表４に示してある。

【００６１】（ｄ）ＡｃｔＤのｄ（ＡＴＧＣＡＴ）
−ＴＨＰ複合体への結合６量体−ＴＨＰ複合体へ０．１６モル当量のＡｃｔＤ
を加えたが、ＡｃｔＤ −６量体複合体の新しい陽子
ピークは現れなかった（図４ｂ’）；０．３２モル当量
のＡｃｔＤを加えると、ＡｃｔＤ −６量体複合
体のわずかに１つの陽子ピークが８．０３ｐｐｍに検出
された（図４ｃ’）。６量体−ＴＨＰ複合体に０．４８
モル当量のＡｃｔＤを加えた時のみ、ＡｃｔＤ
−６量体の新しい陽子ピークが区別された（図４ｄ’、
ｅ’）。ＡｃｔＤ −６量体の２つの共鳴が消失して
おり、７．９９ｐｐｍのＡｃｔＤ −６量体複合体の
アデノシン（内部）Ｈ２シグナルは、７．９８ｐｐｍの
ＴＨＰ−６量体複合体のＧＨ８の強い共鳴のため検出す
ることはできず、ＡｃｔＤ −６量体複合体の７．８
７ｐｐｍのアデノシン（末端）Ｈ２の共鳴は、７．８８
ｐｐｍのＴＨＰ（Ｂ）のＮＨ陽子の同時に存在する共鳴
により弱められた。ＴＨＰの存在下または非存在下での
ＡｃｔＤ −ｄ（ＡＴＧＣＡＴ）の平衡結合性（表
４）は、遊離の６量体と結合したＡｃｔＤ −６量体
複合体の陽子ピーク面積比に由来していた。６量体に結
合したＡｃｔＤの低値での正確な結合データを得る
ことは困難なため、結合定数を決めることはできなかっ
た。しかし平衡測定（図４と表４）は、ＤＮＡへのある
種の結合（おそらく抗生物質との競合）によりＴＨＰは
ＡｃｔＤの挿入（ｉｎｔｅｒｃａｌａｔｉｏｎ）か
らＤＮＡを保護する可能性があることを示している。

【００６２】

【表３】

【００６３】

【表４】

【００６４】例４：ＡｃｔＤの存在下でのインビト
ロ転写研究：ＴＨＰ（Ａ）＋ＴＨＰ（Ｂ）の保護作用

【００６５】（ａ）ＡｃｔＤによる転写阻害ＡｃｔＤのＤＮＡへの結合によるＲＮＡポリメラー
ゼ転写阻害を、カデシュとチェンバーリン（Ｋａｄｅｓ
ｃｈａｎｄＣｈａｍｂｅｒｌｉｎ，１９８２）の方
法を用いて試験した。この系では哺乳動物細胞からの精
製されたＲＮＡポリメラーゼ（例えばＨｅＬａ細胞から
のＲＮＡポリメラーゼＩ、ＩＩおよびＩＩＩ）は、規定
されたｄＣＭＰが末端に結合したＤＮＡ鋳型を効率的か
つ特異的に転写することができる。ｄＣＭＰが末端に結
合したＤＮＡ系は、他の蛋白因子の非存在下でもポリメ
ラーゼ蛋白自身による転写反応の定量的研究を可能に
し、従って転写過程へのＤＮＡ結合性薬剤の直接の作
用、およびＡｃｔＤの存在下での転写へのＴＨＰ
（Ａ）とＴＨＰ（Ｂ）の保護作用を解析するための適切
な系である。

【００６６】ＨｅＬａ細胞からのＤＮＡ依存性ＲＮＡポ
リメラーゼＩ、ＩＩおよびＩＩＩ（それぞれＰｏｌＩ、
ＰｏｌＩＩおよびＰｏｌＩＩＩ）を、ホドとブラチ（Ｈ
ｏｄｏａｎｄＢｌａｔｔｉ，１９７７）の記載した
方法を修飾した方法により精製した。

【００６７】鋳型ＤＮＡを制限酵素ＰｓｔＩにより３’
突出末端を作成し、末端トランスフェラーゼ（ベーリン
ガーマンハイム（ＢｏｅｈｒｉｎｇｅｒＭａｎｎｈｅ
ｉｍ））を用いて両端にｄＣＴＰを結合させた。エタノ
ール沈澱の後、末端にｄＣＭＰの結合したＤＮＡを第２
の制限酵素で消化し、選択した末端の結合した断片をカ
デシュとチェンバーリン（ＫａｄｅｓｃｈａｎｄＣ
ｈａｍｂｅｒｌｉｎ，１９８２）の記載するようにアガ
ロースゲルから精製した。

【００６８】転写反応混合物を、７０ｍＭのトリス−塩
酸（ｐＨ７．９）、０．１ＭのＮＨ_４Ｃｌ、６ｍＭの
ＭｇＣｌ_２、５ｍＭのスペルミジン、１０％のグリセロ
ール、０．１５ｍＭのジチオスレイトール、ｄＣＭＰが
末端に結合した０．６μｇの鋳型、および０．５μｌの
ＨｅＬａＲＮＡポリメラーゼ（３Ｕ）を含有する転写緩
衝液１５μｌ中で、３０℃で１０分間インキュベートし
た。４．３ｍＭのＡＴＰ、ＧＴＰおよびＣＴＰ、そして
１７０μＭのＵＴＰ、２０μＣｉの［α−^３２Ｐ］ＵＴ
Ｐを含有するパルス緩衝液（３．５μｌ）を、転写反応
混合物に加えて２０秒間インキュベートした。０．０６
μｇのＡｃｔＤの存在下または非存在下で７ｍＭの
ＵＴＰを含有する１．５μｌのチェース緩衝液を加える
ことにより、転写伸張が起きた。転写伸張は１０分間行
い、次にプロテイナーゼＫ緩衝液（０．６％ＳＤＳ；２
５ｍＭのトリスｐＨ７．９；２５ｍＭのＥＤＴＡ最終濃
度）２００μｇ／ｍｌのプロテイナーゼＫ、および３０
μｇのｔＲＮＡを添加して停止させ、６５℃で２５分間
インキュベートした。試料をエタノール沈澱させ、ペレ
ットを充填緩衝液（ｌｏａｄｉｎｇｂｕｆｆｅｒ）
（９０％のホルムアミド；０．５×トリスホウ酸緩衝
液）に再懸濁し、６％ポリアクリルアミド−尿素ゲル電
気泳動にかけた。ゲルの放射能写真を、分子動力学コン
ピューター密度測定法を用いてバンドの相対強度を求め
ることにより解析した。ヌクレオシド三リン酸とｔＲＮ
Ａはシグマ（Ｓｉｇｍａ）から、ブロテイナーゼＫはベ
ーリンガーマンハイム（ＢｏｅｈｒｉｎｇｅｒＭａｎ
ｎｈｅｉｍ）から、そして［α−^３２Ｐ］ＵＴＰはアマ
シャムインターナショナル（ＡｍｅｒｓｈａｍＩｎｔ
ｅｒｎａｔｉｏｎａｌ、英国）から購入した。

【００６９】精製されたポリメラーゼと、ＰｏｌＩにつ
いては２２５塩基対の、そしてＰｏｌＩＩおよびＰｏｌ
ＩＩＩについては４２０塩基対のｄＣＭＰが末端に結合
した鋳型を用いて、種々の濃度のＡｃｔＤに対する
ＨｅＬａ細胞からの３つのＲＮＡポリメラーゼの感度を
求めた。ＲＮＡポリメラーゼは１本鎖テイルと２本鎖の
結合部分の不連続な部位で転写を開始するため、これら
の鋳型はそれぞれ２２５と４２０のヌクレオチドの同数
の形質転換体を与えることが予想される。すべての実験
でパルス−チェース法が使用された。

【００７０】ＡｃｔＤによる３つのポリメラーゼ
（それぞれＰｏｌＩ、ＰｏｌＩＩおよびＰｏｌＩＩＩ）
の転写阻害パターンは表５に要約されており、酵素はＡ
ｃｔＤに同様に感受性であることを示している。チェ
ースとともに１μｇ／ｍｌのＡｃｔＤが加えられる
と、１０−２０％の残存する転写が起きるが、３−５μ
ｇ／ｍｌの濃度ではわずかに０．１−３％の残存転写の
みが得られる。

【００７１】この知見は、ＡｃｔＤ阻害は反応混合
物中のＤＮＡ濃度に依存するという理論によく一致す
る。

【００７２】

【表５】

【００７３】（ｂ）ＡｃｔＤに阻害された転写のＴ
ＨＰ（Ａ）とＴＨＰ（Ｂ）による再開この測定は９７％以上の転写阻害を引き起こすＡｃｔ
Ｄ濃度（これは３μｇ／ｍｌとした）で行われた。Ａ
ｃｔＤの濃度はＤＮＡのｄ（ＧｐＣ）含量に比例し
ているが、ＴＨＰ（Ａ）とＴＨＰ（Ｂ）はＤＮＡ一般を
保護し、これは必ずしもｄ（ＧｐＣ）塩基対（ｂｐ）で
起きるのではないと考えられるため、ＤＮＡへのＡｃｔ
Ｄの結合を阻害するのに必要なＴＨＰ（Ａ）とＴＨ
Ｐ（Ｂ）の濃度はＡｃｔＤの濃度より高いと考えら
れた。図５のレーン２、６、１０と表６に見られるよう
に、これらの実験でＴＨＰ（Ａ）とＴＨＰ（Ｂ）自身は
転写反応を阻害しなかった。ＴＨＰ（Ａ）のみおよびＴ
ＨＰ（Ｂ）のみの存在下では、ＡｃｔＤに引き起こ
される転写阻害は影響を受けなかった（図５でレーン３
−５と７−９、そして表６）。しかし１：１の比でＴＨ
Ｐ（Ａ）とＴＨＰ（Ｂ）を一緒に加えると、これらの効
果は劇的であった。２００μＭの濃度では２．５μＭの
ＡｃｔＤ（これ自身は反応の９７％を阻害する）の
存在下で転写の７５％が回収された。これらの結果はＴ
ＨＰ（Ａ）とＴＨＰ（Ｂ）の組合せは、ＡｃｔＤの
ＤＮＡへの結合からのＤＮＡの保護に対して相乗効果を
有することを示している。上記の条件は、３０塩基対に
ついて１分子のＡｃｔＤにより転写阻害（９７％）が
得られること、そしてＤＮＡ−ＡｃｔＤ複合体形成
は１：１０の比率が必要であることを示す。転写の７５
％を回収するために、１分子のＡｃｔＤに対して８０
分子のＴＨＰ（Ａ）とＴＨＰ（Ｂ）（すなわち１塩基対
について１対のＴＨＰ（Ａ）とＴＨＰ（Ｂ））が必要で
ある。これらの結果はＡｃｔＤ結合に対するＤＮＡ
の保護におけるＴＨＰ（Ａ）とＴＨＰ（Ｂ）の役割（Ａ
ｃｔＤの存在下で転写の再開を可能にする）を示唆
している。

【００７４】

【表６】

【００７５】例５．細胞増殖と薬剤処理：ＤＮＡ合成の
アドリアマイシン阻害のＴＨＰによる逆転ＨＬ６０細胞をマイクロウェルプレート（ヌンク（Ｎｕ
ｎｃ））中の１０％胎児牛血清（バイオオロジカルラボ
ラトリーズ（ＢｉｏｌｏｇｉｃａｌＬａｂｏｒａｔｏ
ｒｉｅｓ） −ベットヘメック（ＢｅｔＨａｅｍｅｋ
））を含むＲＰＭＩ培地（ギブコ（Ｇｉｂｃｏ））中
で増殖させた。細胞を２×１０^５細胞／ｍｌの濃度で培
地に懸濁し、１００μｌずつプレートのウェルに分注し
た。３７℃で２０時間インキュベートした後細胞をＴＨ
Ｐ（１００μｇ／ｍｌ）とアドリアマイシン（図６に示
したように濃度を増加させて）で処理した。２４時間後
［^３Ｈ］チミジン（１μＣｉ／ウェル、１２０μｌ）を
添加し、３時間インキュベートを続けた。２５μｌのト
リクロロ酢酸（ＴＣＡ）を２０％になるように加えてチ
ミジンの取り込みを停止させ、プレートを一晩４℃に置
いた。ＴＣＡ沈澱物を１０％ＴＣＡ（１００μｌ）で洗
浄し、１００μｌのＮａＯＨに可溶化し、バイアルに移
して、トルエンを含む３ｍｌのシンチレーション液：ル
マックス（Ｌｕｍａｘ）（ルマック（Ｌｕｍａｃ）、オ
ランダ）３：２の混合物の存在下で計測した。測定は３
重測定で行った。

【００７６】図６に見られるように、ＨＬ６０細胞を
０．０１−０．０２μｇ／ｍｌの濃度のアドリアマイシ
ンで処理すると、［^３Ｈ］チミジン取り込みはそれぞれ
３０−４０％阻害される。ＴＨＰ（Ａ＋Ｂ）（１：１の
比率）を１００μｇ／ｍｌの最終濃度で加えると、アド
リアマイシンの阻害作用が逆転され、アドリアマイシン
（０．０１−０．０２μｇ／ｍｌ）の存在にもかかわら
ず、［^３Ｈ］チミジン取り込みは非常に効率的であり、
それぞれ１０７−９３％である。この結果は、ＹＨＰは
障害性薬剤からＤＮＡを保護することをさらに示してい
る。

【００７７】例６．ＨｅＬａ全細胞（ＷＣＥ）を用いる
インビトロ転写：ＴＨＰの存在による転写のアクチノマ
イシンＤ阻害の逆転マンレイ（Ｍａｎｌｅｙ，１９８４）の方法に従いＷＣ
Ｅを調製した。２０μｌの反応物は１０μｌのＷＣＥ、
１μｇのＤＮＡ、４ｍＭのクレアチンホスフェート、５
００μＭのＡＴＰ、ＧＴＰ、ＵＴＰ、５０μＭのＣＴ
Ｐ、２０μＣｉの［α−^３２Ｐ］ＣＴＰを含有してお
り、転写は３０℃で行った。すべての反応物を２０分プ
レインキュベートしてから、放射性ヌクレオチドを３ｍ
ｌ添加した（パルス）。１０ｍＭの非標識ＣＴＰを含む
チェースミックスを添加し、転写をさらに２０分継続し
た。反応を停止し、例４のようにＲＮＡを分析した。

【００７８】予備的実験でＨｅＬａ−ＷＣＥ系中のアク
チノマイシンＤによる転写阻害の程度を調べた。０．４
μｇ／ｍｌの濃度を使用し、これは約８０％の阻害を与
えた。図７に示す実験では、０．４μｇ／ｍｌのＡｃｔ
Ｄのみでは転写反応を８０％阻害することは明らか
である（レーン０からレーンＣを比較）。低濃度のＴＨ
Ｐの添加は２０μｇ／ｍｌまで反応に影響を与えない
が、１００−２００μｇ／ｍｌの濃度では転写が対照の
４０−６５％まで回復される。この実験は、ＴＨＰ（Ａ
＋Ｂ）は転写のＡｃｔＤ阻害を逆転させ、転写をア
クチノマイシンＤのみに引き起こされる残存２０％より
上の約２５−４５％だけ回復させる。

【００７９】これらの結果は、ＴＨＰはＤＮＡに結合す
る薬剤からＤＮＡを保護することをさらに示している。
すなわちＴＨＰはＤＮＡ結合性薬剤の阻害作用を逆転さ
せ、薬剤の存在にもかかわらずポリメラーゼによる核酸
の効率的な合成を可能にする。

【００８０】例７．ＴＨＰによる制限酵素による消化か
らのＤＮＡの保護ＴＨＰとＤＮＡの機能性相互作用のさらなる証拠は、Ｔ
ＨＰ（Ａ）とＴＨＰ（Ｂ）の混合物およびＴＨＰ（Ａ）
のみは、制限エンドヌクレアーゼ（ＥｃｏＲＩ、ＡＶａ
ＩおよびＤｒａＩ）による消化からプラスミッドＤＮＡ
（ｐＧＥＭ１０、プロメガ（Ｐｒｏｍｅｇａ））を保護
することができるという我々の知見からも得られる。Ｔ
ＨＰはＤＮＡと相互作用し、制限エンドヌクレアーゼに
認識される切断部位を有効に（１０^−４Ｍ）保護する。
この結果を表７に要約する。

【００８１】表７に示す最終濃度になるようにＴＨＰを
消化混合物に加えた。１μｇのｐＧＥＭ１０を（供給元
（ニューイングランドバイオラボズ（ＮｅｗＥｎｇｌ
ａｎｄＢｉｏｌａｂｓ）の勧める）最終容量２０μｌ
の緩衝液中の０．２−１μｇの酵素で消化した。インキ
ュベート時間の最後に、７５％のグリセロール、３％の
ブロモフェノールブル−および１０ｍＭのＥＤＴＡを含
む５μｌの停止緩衝液を加えて、１２μｌの反応混合物
を１％アガロースゲルにのせた。ゲルをエチジウムブロ
マイド（０．５μｇ／ｍｌ）で染色し、ＵＶで可視化し
写真を取った。写真のバンドの相対強度を、分子動力学
コンピューター密度測定法で解析した。

【００８２】制限エンドヌクレアーゼによる消化からＤ
ＮＡを保護するのに必要なＴＨＰ（Ａ）とＴＨＰ（Ｂ）
の最小量は２５−１００μｇ／ｍｌの範囲であり、完全
な阻害には１５０−２５０μｇ／ｍｌが必要であった。
ＴＨＰ（Ａ）とＴＨＰ（Ｂ）の両方が存在する時のＡｖ
ａＩとＤｒａＩの比較から、ＴＨＰの阻害作用に対して
ＡｖａＩの方が４倍感受性が高いようである。この知見
はおそらく、ＤｒａＩ部位のＡＴ残基に比較してＡｖａ
Ｉ部位のＧＣ残基（表７参照）に、ＴＨＰが高い親和性
を有している結果と思われる。制限エンドヌクレアーゼ
による消化からＤＮＡを保護するのに必要なＴＨＰ
（Ａ）＋ＴＨＰ（Ｂ）濃度の範囲は、前記したようにＤ
ＮＡに結合するアクチノマイシンＤとジスタマイシンＡ
の量に匹敵する（ノシコフ（Ｎｏｓｉｋｏｖ）ら、１９
７６と１９７７）。

【００８３】本発明の発明者が証明するように、ＤＮＡ
はＴＨＰにより制限エンドヌクレアーゼによる消化から
保護されるが、ＲＮＡポリメラーゼの活性はＴＨＰ
（Ａ）にもＴＨＰ（Ｂ）にもまたはその両方にも影響さ
れないということは注目すべきことである。この差は２
つの酵素の結合様式に起因すると思われる。ＲＮＡポリ
メラーゼは２本鎖ＤＮＡに結合し、塩基対の漏出された
水素ドナーとアクセプター基と一次的な水素結合を形成
することによりプロモーター部位を捜すが、ＥｃｏＲＩ
エンドヌクレアーゼは塩基対をこわさずにＤＮＡのリン
酸骨格への静電結合を介して、パリンドローム標的を認
識する。

【００８４】

【表７】

【００８５】例８．ストレプトミセス・クラブリゲルス
（Ｓ．ｃｌａｖｕｌｉｇｅｒｕｓ）の細胞抽出物からの
ＴＨＰ（Ａ）の単離と精製（ａ）増殖培養物の培養ストレプトミセス・クラブリゲルス（Ｓ．ｃｌａｖｕｌ
ｉｇｅｒｕｓ）（ＮＲＲＬ３５８５）を、前記の例１
（ａ）に記載したストレプトミセス・パルブルス（Ｓ．
ｐａｒｖｕｌｕｓ）と同様の条件下で増殖させた。

【００８６】２０％グリセロール中のストレプトミセス
・クラブリゲルス（Ｓ．ｃｌａｖｕｌｉｇｅｒｕｓ）胞
子懸濁液を−２０℃に維持した。種菌培養物に１００μ
ｌの胞子懸濁液を接種し、０．１％のＮＨ_４Ｃｌと
０．１％の酵母エキスを補足した化学規定培地で旋回振
盪インキュベーター（２１０ｒｐｍ）中で３０℃で２日
間増殖させた。遠心分離し０．９％のＮａＣｌで２回洗
浄後、栄養菌糸（５％）の懸濁液を化学規定培地の接種
菌とした。増殖培地は、１リットル中１．０％のグリセ
ロール、０．２％のＬ−アスタラギン、０．０６％のＭ
ｇＳＯ_４、０．３５％のＫ_２ＨＰＯ_４および０．６８％
のＫＨ_２ＰＯ_４と２ｍｌの微量塩保存液を含有してい
た。微量塩保存液は水１００ｍｌ中、１００ｍｇのＦｅ
ＳＯ_４×７Ｈ_２Ｏ、１００ｍｇのＭｎＣｌ_２×４Ｈ_２
Ｏ、１００ｍｇのＺｎＳＯ_４×４Ｈ_２Ｏ、および１
００ｍｇのＣａＣｌ_２を含有していた。５０ｍｌの培地
を含む２５０ｍｌの三角フラスコ中で３０℃でロータリ
ーシェーカー中で２４０ｒｐｍで細胞を培養した。規定
培地にＮａＣｌを０．２５Ｍと０．５Ｍで加えた時細胞
内にＴＨＰ（Ａ）が蓄積した。^１３ＣＮＭＲ（図９）
で、０．０５ＭのＮａＣｌで増殖させたストレプトミセ
ス・クラブリゲルス（Ｓ．ｃｌａｖｕｌｉｇｅｒｕｓ）
細胞中に最初見られた微量のＴＨＰ（Ａ）（図８）は著
しく増加し、０．５ＭのＮａＣｌ中４００μモル／ｇ乾
燥重量までになった。ＴＨＰ（Ａ）は細胞内プールの主
要な構成物であり、その濃度は３ＭのＮａＣｌで増殖さ
せた好塩性細菌中の濃度と同様に高いものであった。す
なわちＡｃｔＤ産生ストレプトミセス種中にはアク
チノマイシン合成に応答してＴＨＰ（Ａ）とＴＨＰ
（Ｂ）を合成する機構が、そしてβ−ラクタム産生スト
レプトミセス・クラブリゲルス（Ｓ．ｃｌａｖｕｌｉｇ
ｅｒｕｓ）中には塩濃度の変化に応答してＴＨＰ（Ａ）
を合成する機構が存在する。

【００８７】ストレプトミセス・クラブリゲルス（Ｓ．
ｃｌａｖｕｌｉｇｅｒｕｓ）は最小液体培地中の０．５
ＭのＮａＣｌに耐えることができる。塩濃度を０．０５
Ｍから０．５Ｍまで増加させると増殖速度が影響を受け
たが、基本培地中では定常状態のレベルは一定であっ
た。抗生物質産生は培地の塩濃度に極端に感受性があ
り、０．２５ＭのＮａＣｌでは完全に抑圧された。ナチ
ュラルアバンダンス（ｎａｕｒａｌａｂｕｎｄａｎｃ
ｅ）^１３ＣＮＭＲで試験した代謝応答では、ＴＨＰ
（Ａ）は１０倍（基本培地に比較して）増加しておりト
レハロースが蓄積され、細胞内グルタミン酸のレベルは
減少した（図８、９）。増殖の対数中間期にＴＨＰの細
胞内の最大の蓄積が観察され、これはＮａＣｌ濃度の増
加に比例していた（０．５ＭのＮａＣｌで乾燥細胞重量
当り４００μモルのＴＨＰ（Ａ））。増殖８６時間後
（後期対数期）にＴＨＰ（Ａ）は消費された。

【００８８】（ｂ）細胞抽出物調製ストレプトミセス・クラブリゲルス（Ｓ．ｃｌａｖｕｌ
ｉｇｅｒｕｓ）の細胞抽出物を、１リットルのストレプ
トミセス・クラブリゲルス（Ｓ．ｃｌａｖｕｌｉｇｅｒ
ｕｓ）増殖培養物から調製した。約４℃で細胞を遠心分
離（５，０００×ｇで５分間）して細胞を集め、０．２
％のＫＣｌ溶液で２回洗浄して微量の培地を除去した。
洗浄した細胞ペレットを１０ｍｌの水に懸濁し、これを
１００℃で１５分加熱してて細胞内抽出物を得た。遠心
分離（１５，０００×ｇで１５分間）により上澄液を分
離し、減圧下に濃縮して１ｍｌとした。

【００８９】（ｃ）ストレプトミセス・クラブリゲルス
（Ｓ．ｃｌａｖｕｌｉｇｅｒｕｓ）細胞抽出物からのＴ
ＨＰ（Ａ）の分離細胞抽出物試料を４倍量の１Ｍの酢酸と混合してから、
ダウエックス５０Ｗクロマトグラフィーで分離した。カ
ラムを脱イオン水で洗浄（カラム量の５倍）して炭水化
物とポリオールを除去した。３ＭのＮＨ_４ＯＨでグルタ
ミン酸とＴＨＰ（Ａ）を溶出した。アンモニアを蒸発さ
せて乾燥し、残渣をｐＨ５にして、ダウエックス１陰イ
オン（酢酸型）交換クロマトグラフィーで分離した。グ
ルタミン酸はカラムに結合したまま残ったが、ＴＨＰ
（Ａ）は水で溶出された。

【００９０】（ｄ）ＴＨＰ（Ａ）の結晶化前記で得られた純粋なＴＨＰ（Ａ）を熱メタノールに溶
解し、溶液をベンゼン蒸気下でデシケーター中に放置し
て結晶化させた。７日後に結晶が現れた。大きさが０．
２×０．１×０．０５ｍｍの透明で斜方晶系の結晶を集
めてＸ線結晶解析を行った。

【００９１】例９．ストレプトミセス・グリセウス
（Ｓ．ｇｒｉｓｅｕｓ）の細胞抽出物からのＴＨＰ
（Ａ）の単離と精製ストレプトミセス・グリセウス（Ｓ．ｇｒｉｓｅｕｓ）
（ＡＴＣＣ１０１３７）を、１リットル中１％の麦芽エ
キス、０．４％の酵母エキス、０．００１％のＣａＣｌ
_２、２％のバクト寒天そして１ｍｌの微量塩保存液を含
有する寒天培地（ＹＭ）中で増殖させた。発酵培地の組
成は以下の通りである：１リットル中１．０％のグリセ
ロール、０．２％のＬ−アスタラギン、０．０６％のＭ
ｇＳＯ_４、２．９％のＮａＣｌ、０．３５％のＫ_２ＨＰ
Ｏ_４および０．６８％のＫＨ_２ＰＯ_４と１ｍｌの微量塩
保存液。微量塩保存液は水１００ｍｌ中、１００ｍｇの
ＦｅＳＯ_４×７Ｈ_２Ｏ、１００ｍｇのＭｎＣｌ_２×４Ｈ
_２Ｏ、１００ｍｇのＺｎＳＯ_４×４Ｈ_２Ｏ、および
１００ｍｇのＣａＣｌ_２を含有していた。接種培地（Ｓ
Ｍ）はＦＭ以外に、０．１％の酵母エキスと０．１％の
ＮＨ_４Ｃｌを含有していた。

【００９２】接種菌の調製のために、胞子形成培養とし
て菌株を室温でＹＭ寒天プレート中で維持した。接種培
地（１リットルの三角フラスコ中２００ｍｌ）に、無菌
条件下で５ｍｌで洗浄したプレートからの胞子懸濁液を
１ｍｌ接種した。細胞を３０℃でロータリーシェーカー
上で２１０ｒｐｍで３６時間培養した（最終ＯＤ_５４０
＝３．６）。

【００９３】発酵．接種培養からの細胞を遠心分離
（１５，０００×ｇ）して集め、食塩水で洗浄し、細胞
ペレットを組織ホモジナイザー中で食塩水中でホモジナ
イズした。最後に懸濁液を５リットルの三角フラスコ中
の１リットルのＦＭ培地の接種菌とした（ＯＤ_５４０＝
０．４００）。細胞を３０℃でロータリーシェーカー上
で２１０ｒｐｍで３８時間培養した（最終ＯＤ_５４０＝
１．９）。遠心分離により菌糸を集め洗浄して、前記の
例８のようにＴＨＰ（Ａ）を単離した。

【００９４】ストレプトミセス・グリセウス（Ｓ．ｇｒ
ｉｓｅｕｓ）は、０．５ＭのＮａＣｌを含有する増殖培
地１０リットル中１５００ｍｇのＴＨＰ（Ａ）を蓄積す
ることができ、これは同様の条件でストレプトミセス・
クラブリゲルス（Ｓ．ｃｌａｖｕｌｉｇｅｒｕｓ）で
得られたものよりはるかに多い量である。０．５ＭのＮ
ａＣｌを含む培地中で６６時間増殖させたストレプトミ
セス・グリセウス（Ｓ．ｇｒｉｓｅｕｓ）の抽出物の陽
子がデカプリングした^１３ＣＮＭＲスペクトルを図１
０に示し、精製後の産生したＴＨＰ（Ａ）のそれは図１
１に示す。

【００９５】

【図面の簡単な説明】

【図１】精製した（ａ）精製したＴＨＰ（Ｂ）と（ｂ）
精製したＴＨＰ（Ａ）の（５００−ＭＨｚ）１ＨＮＭ
Ｒスペクトルを示す。

【図２】ＴＨＰ（Ａ）とＴＨＰ（Ｂ）の立体化学構造
（Ｓ型）の分子構造を示す。

【図３】（ａ）０．６：１の比率のＡｃｔＤ −ｄ
（ＡＴＧＣＡＴ）混合物；（ｂ）この混合物に０．６：
１：３０の比率でＴＨＰ（Ｂ）を添加後；（ｃ）（ｂ）
中のの混合物に０．６：１：３０：３０の比率でＴＨＰ
（Ａ）を添加後の、陽子ＮＭＲスペクトル（７．６−
８．４ｐｐｍ；５００ＭＨｚ）を示す。

【図４】プロット（ａ−ｅ）に示した種々の薬剤：ＤＮ
Ａ比のＡｃｔＤ −ｄ（ＡＴＧＣＡＴ）混合物、およ
びモル比１：３０：３０のｄ（ＡＴＧＣＡＴ）、ＴＨＰ
（Ａ）とＴＨＰ（Ｂ）の混合物、およびプロット（ａ’
−ｅ’）に示した種々の薬剤：ＤＮＡ比のＡｃｔＤ
の基礎芳香族陽子領域スペクトル（５００ＭＨｚ）を示
す。

【図５】ＡｃｔＤによるＲＮＡポリメラーゼＩＩ転
写の阻害と、ＴＨＰ（Ａ）とＴＨＰ（Ｂ）の添加による
その回復を示す放射線写真である。

【図６】ＴＨＰによるアドリアマイシンによるＤＮＡ合
成の阻害の逆転を示す。

【図７】ＨｅＬａＷＣＥシステムを用いるＴＨＰに
よる転写のアクチノマイシン阻害の逆転を示す。

【図８】異なる塩濃度の化学規定培地中で増殖させたス
トレプトミセス・クラブリゲルス（Ｓ．ｃｌａｖｕｌｉ
ｇｅｒｕｓ）細胞の抽出物の、陽子脱カップリングした
ナチュラルアバンダンス（ｐｒｏｔｏｎ−ｄｅｃｏｕｐ
ｌｅｄｎａｔｕｒａｌａｂｕｎｄａｎｃｅ） ^１２Ｃ
ＮＭＲ（１２６．７ＭＨｚ）スペクトルを示す。

【図９】図８に示すＮＭＲスペクトルから計算した、種
々の塩濃度の化学規定培地で増殖させたストレプトミセ
ス・クラブリゲルス（Ｓ．ｃｌａｖｕｌｉｇｅｒｕｓ）
中の細胞内代謝物を示す。

【図１０】０．５ＭのＮａＣｌの化学規定培地中で６６
時間増殖させたストレプトミセス．グリセウス（Ｓ．ｇ
ｒｉｓｅｕｓ）細胞の抽出物の、陽子脱カップリングし
た^１２ＣＮＭＲ（１２６．７ＭＨｚ）スペクトルを
示す。

【図１１】ストレプトミセス・グリセウス（Ｓ．ｇｒｉ
ｓｅｕｓ）から得た精製したＴＨＰ（Ａ）の、陽子脱カ
ップリングした^１３ＣＮＭＲ（１２６．７ＭＨｚ）
スペクトルを示す。文献文献

─────────────────────────────────────────────────────

【手続補正書】

【提出日】平成５年３月２９日

【手続補正１】

【補正対象書類名】図面

【補正対象項目名】全図

【補正方法】変更

【補正内容】

【図１】

【図２】

【図３】

【図４】

【図５】

【図６】

【図７】

【図８】

【図９】

【図１０】

【図１１】

【手続補正書】

【提出日】平成６年７月１日

【手続補正１】

【補正対象書類名】明細書

【補正対象項目名】図５

【補正方法】変更

【補正内容】

【図５】電気泳動の結果を示す写真であって、Ａｃｔ
ＤによるＲＮＡポリメラーゼＩＩ転写の阻害と、ＴＨ
Ｐ（Ａ）とＴＨＰ（Ｂ）の添加によるその回復を示す放
射線写真である。

【手続補正２】

【補正対象書類名】明細書

【補正対象項目名】図７

【補正方法】変更

【補正内容】

【図７】電気泳動の結果を示す写真であって、ＨｅＬａ
ＷＣＥシステムを用いるＴＨＰによる転写のアクチ
ノマイシン阻害の逆転を示す。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁶ 識別記号庁内整理番号ＦＩ技術表示箇所 // Ａ６１Ｋ 31/71 ＡＤＱ 9454−4Ｃ 38/00 ＡＤＵ (Ｃ１２Ｐ 17/12 Ｃ１２Ｒ 1:465） (Ｃ１２Ｐ 17/12 Ｃ１２Ｒ 1:545） (72)発明者ヨゼフアロニイスラエル国レホボト，ピンスカー５ (72)発明者エドナベン − アッシャーイスラエル国テルアビブ，レムブラント 40

Claims

【特許請求の範囲】

【請求項１】活性成分としての、２−メチル−４−カ
ルボキシ−５−ヒドロキシ−３，４，５，６−テトラヒ
ドロピリミジン［ＴＨＰ（Ａ）］、その塩、５−エーテ
ルまたは５−エステル、および２−メチル−４−カルボ
キシ−３，４，５，６−テトラヒドロピリミジン［ＴＨ
Ｐ（Ｂ）］、またはその塩よりなる群から選択される少
なくとも１つのテトラヒドロピリミジン誘導体と、薬剤
として許容される担体よりなる薬剤組成物。
【請求項２】２−メチル−４−カルボキシ−５−ヒド
ロキシ−３，４，５，６−テトラヒドロピリミジン［Ｔ
ＨＰ（Ａ）］よりなる、請求項１に記載の薬剤組成物。
【請求項３】２−メチル−４−カルボキシ−３，４，
５，６−テトラヒドロピリミジン［ＴＨＰ（Ｂ）］より
なる、請求項１に記載の薬剤組成物。
【請求項４】ＴＨＰ（Ａ）とＴＨＰ（Ｂ）よりなる、
請求項１から請求項３までのいずれか１項に記載の薬剤
組成物。
【請求項５】ＴＨＰ（Ａ）とＴＨＰ（Ｂ）は等モル量
で存在する、請求項４に記載の薬剤組成物。
【請求項６】ＤＮＡ結合性薬剤による障害から非腫瘍
性組織のＤＮＡを保護するための、請求項１から５まで
のいずれか１項に記載の薬剤組成物。
【請求項７】癌の化学療法における抗腫瘍性抗生物質
の毒性作用を低下させるための、請求項１から５までの
いずれか１項に記載の薬剤組成物。
【請求項８】抗腫瘍性抗生物質はアクチノマイシンＤ
である、請求項７に記載の薬剤組成物。
【請求項９】ＤＮＡ結合性薬剤による障害から非腫瘍
性組織のＤＮＡを保護するための、ＴＨＰ（Ａ）、ＴＨ
Ｐ（Ｂ）またはこれらを組合せたものの使用。
【請求項１０】癌の化学療法における抗腫瘍性抗生物
質の毒性作用を低下させるための、ＴＨＰ（Ａ）、ＴＨ
Ｐ（Ｂ）またはこれらを組合せたものの使用。
【請求項１１】ＤＮＡ結合性薬剤による治療を受けて
いる患者において、ＤＮＡ結合性薬剤による障害から非
腫瘍性組織のＤＮＡを保護するための方法であって、請
求項１から５までのいずれか１項に記載の組成物の有効
量を患者に投与することよりなる上記方法。
【請求項１２】ＤＮＡ結合性薬剤は抗腫瘍性抗生物質
である、請求項１１に記載の方法。
【請求項１３】抗腫瘍性抗生物質はアクチノマイシン
Ｄまたはアドリアマイシンである、請求項１２に記載の
方法。
【請求項１４】抗腫瘍性抗生物質による治療を受けて
いる癌患者において抗腫瘍性抗生物質の毒性作用を低下
させるための方法であって、抗腫瘍性抗生物質の投与の
前、投与と一緒にまたは投与後に、請求項１から５まで
のいずれか１項に記載の組成物の有効量を患者に投与す
ることよりなる上記方法。
【請求項１５】抗腫瘍性抗生物質はアクチノマイシン
Ｄである、請求項１４に記載の方法。
【請求項１６】以下の工程よりなる、アクチノマイシ
ンＤ産生ストレプトミセス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅ
ｓ）微生物の細胞抽出物からのＴＨＰ（Ａ）とＴＨＰ
（Ｂ）の単離と精製法：（ａ）適切な増殖培地中で微生物を培養し；（ｂ）細胞を集め、洗浄した細胞から抽出物を調製
し；（ｃ）カラムクロマトグラフィー分離工程により、付
随する炭水化物、ポリオール、アミノ酸、ペプチドおよ
び蛋白からテトラヒドロピリミジン誘導体であるＴＨＰ
（Ａ）とＴＨＰ（Ｂ）を分離し；（ｄ）ＴＨＰ（Ａ）とＴＨＰ（Ｂ）を含む溶液をイオ
ン交換クロマトグラフィーカラムにかけて；（ｅ）異なる溶出液によりＴＨＰ（Ａ）とＴＨＰ
（Ｂ）を溶出して、実質的に純粋なＴＨＰ（Ａ）とＴＨ
Ｐ（Ｂ）を得る。
【請求項１７】ストレプトミセス株はストレプトミセ
ス・パルブルス（Ｓ．Ｐａｒｖｕｌｕｓ）である、請求
項１６に記載の方法。
【請求項１８】請求項１６または１７に記載の方法で
あって、工程（ｄ）においてイオン交換クロマトグラフ
ィーカラムによる分離はダウエックス（Ｄｏｗｅｘ）５
０Ｗ（ＮＨ_４ ^＋型）カラムで行われ、工程（ｅ）におい
てＴＨＰ（Ａ）の溶出は水で行われ、ＴＨＰ（Ｂ）の溶
出は３Ｍの水酸化アンモニウムで行われる上記方法。
【請求項１９】以下の工程よりなる、低塩ストレス条
件下で、土壌から単離されたストレプトミセス（Ｓｔｒ
ｅｐｔｏｍｙｃｅｓ）微生物の細胞抽出物からのＴＨＰ
（Ａ）の単離と精製法：（ａ）０．２５Ｍ−０．５ＭのＮａＣｌ中の適切な増
殖培地中で微生物を培養し；（ｂ）細胞を集め、洗浄した細胞から抽出物を調製
し；（ｃ）いくつかのカラムクロマトグラフィー分離工程
により、付随する炭水化物、アミノ酸および蛋白からＴ
ＨＰ（Ａ）を分離し；（ｄ）ＴＨＰ（Ａ）を含む溶液をイオン交換カラムク
ロマトグラフィーにかけて；（ｅ）水でＴＨＰ（Ａ）を溶出して、実質的に純粋な
ＴＨＰ（Ａ）を得る。
【請求項２０】微生物はストレプトミセス・クラブリ
ゲルス（Ｓ．ｃｌａｖｕｌｉｇｅｒｕｓ）またはストレ
プトミセス・グリセウス（Ｓ．ｇｒｉｓｅｕｓ）であ
る、請求項１９に記載の方法。
【請求項２１】実質的に純粋な２−メチル−４−カル
ボキシ−５−ヒドロキシ−３，４，５，６−テトラヒド
ロピリミジン、その塩、５−エーテルまたは５−エステ
ル。