JPH07179A - 新規微生物及び殺虫剤 - Google Patents
新規微生物及び殺虫剤Info
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- JPH07179A JPH07179A JP4019307A JP1930792A JPH07179A JP H07179 A JPH07179 A JP H07179A JP 4019307 A JP4019307 A JP 4019307A JP 1930792 A JP1930792 A JP 1930792A JP H07179 A JPH07179 A JP H07179A
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- Japan
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- japonensis
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- bacillus thuringiensis
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- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
- Agricultural Chemicals And Associated Chemicals (AREA)
Abstract
(57)【要約】
【構成】 バチルス・チューリンゲンシス・セロバー・
ヤポネンシスに属し、甲虫目幼虫に対する殺虫性毒素タ
ンパク質を産生する能力を有するバチルス・チューリン
ゲンシス・セロバー・ヤポネンシス・ストレイン・ブイ
ブイ及びバチルス・チューリンゲンシス・セロバー・ヤ
ポネンシス・ストレイン・ブイブイが産生する毒素タン
パク質を有効成分として含有する殺虫剤。 【効果】 本微生物は、従来のヤポネンシス株にはない
甲虫目昆虫の幼虫に対する殺虫活性を示す結晶性タンパ
ク質を生産するために、その生産した結晶性の毒素タン
パク質を有効成分として含有する新規な微生物由来の殺
虫剤を製剤することで、甲虫目幼虫に対する化学的に生
産した殺虫剤よりも安全で安価なものとなる。
ヤポネンシスに属し、甲虫目幼虫に対する殺虫性毒素タ
ンパク質を産生する能力を有するバチルス・チューリン
ゲンシス・セロバー・ヤポネンシス・ストレイン・ブイ
ブイ及びバチルス・チューリンゲンシス・セロバー・ヤ
ポネンシス・ストレイン・ブイブイが産生する毒素タン
パク質を有効成分として含有する殺虫剤。 【効果】 本微生物は、従来のヤポネンシス株にはない
甲虫目昆虫の幼虫に対する殺虫活性を示す結晶性タンパ
ク質を生産するために、その生産した結晶性の毒素タン
パク質を有効成分として含有する新規な微生物由来の殺
虫剤を製剤することで、甲虫目幼虫に対する化学的に生
産した殺虫剤よりも安全で安価なものとなる。
Description
【０００１】
【産業上の利用分野】本発明は、バチルス・チューリン
ゲンシス・セロバー・ヤポネンシス属に属する新規微生
物及び新規微生物由来の殺虫剤に関する。
ゲンシス・セロバー・ヤポネンシス属に属する新規微生
物及び新規微生物由来の殺虫剤に関する。
【０００２】
【従来の技術】従来、バチルス・チューリンゲンシス・
セロバー・ヤポネンシス属で知られている菌株は、鱗翅
目昆虫の幼虫に対する殺虫性タンパク質を産生するもの
が知られている。また、バチルス・チューリンゲンシス
・サンディエゴ、バチルス・チューリンゲンシス・テネ
ブリオニスの様に、ハムシの仲間、コロラドポテトビー
トルやゴミムシダマシの仲間チャイロコメノゴミムシダ
マシを殺すバチルス・チューリンゲンシス菌が知られて
いる（J. Appl. Ent. 104(1987),417-424)。
セロバー・ヤポネンシス属で知られている菌株は、鱗翅
目昆虫の幼虫に対する殺虫性タンパク質を産生するもの
が知られている。また、バチルス・チューリンゲンシス
・サンディエゴ、バチルス・チューリンゲンシス・テネ
ブリオニスの様に、ハムシの仲間、コロラドポテトビー
トルやゴミムシダマシの仲間チャイロコメノゴミムシダ
マシを殺すバチルス・チューリンゲンシス菌が知られて
いる（J. Appl. Ent. 104(1987),417-424)。
【０００３】
【発明が解決しようとする課題】しかし、ヤポネンシス
属の菌株では鱗翅目昆虫の幼虫に対する殺虫性タンパク
質以外の毒素タンパク質を産生するものが知られていな
いために、鱗翅目以外の他の昆虫に対する殺虫剤には利
用できなかった。また、バチルス・チューリンゲンシス
・サンディエゴ、バチルス・チューリンゲンシス・テネ
ブリオニスなどは、シバ、サトイモ、サツマイモ、ラッ
カセイ等の大害虫であるドウガネブイブイの幼虫には殺
虫効果がない。本発明者らは、バチルス・チューリンゲ
ンシス・セロバー・ヤポネンシス属に属する新菌種が、
鱗翅目昆虫以外の甲虫目幼虫に対する殺虫性タンパク質
を産生すること見出し、有効に利用できる新規微生物及
び新規微生物由来の殺虫剤を提供することを目的とする
ものである。
属の菌株では鱗翅目昆虫の幼虫に対する殺虫性タンパク
質以外の毒素タンパク質を産生するものが知られていな
いために、鱗翅目以外の他の昆虫に対する殺虫剤には利
用できなかった。また、バチルス・チューリンゲンシス
・サンディエゴ、バチルス・チューリンゲンシス・テネ
ブリオニスなどは、シバ、サトイモ、サツマイモ、ラッ
カセイ等の大害虫であるドウガネブイブイの幼虫には殺
虫効果がない。本発明者らは、バチルス・チューリンゲ
ンシス・セロバー・ヤポネンシス属に属する新菌種が、
鱗翅目昆虫以外の甲虫目幼虫に対する殺虫性タンパク質
を産生すること見出し、有効に利用できる新規微生物及
び新規微生物由来の殺虫剤を提供することを目的とする
ものである。
【０００４】
【課題を解決するための手段】本発明の新規微生物は、
バチルス・チューリンゲンシス・セロバー・ヤポネンシ
スに属し、甲虫目幼虫に対する殺虫性毒素タンパク質を
産生する能力を有するバチルス・チューリンゲンシス・
セロバー・ヤポネンシス・ストレイン・ブイブイに特徴
を有する。そして、本発明のバチルス・チューリンゲン
シス・セロバー・ヤポネンシス属に属する新規微生物の
１株であるバチルス・チューリンゲンシス・セロバー・
ヤポネンシス・ストレイン・ブイブイ（Bacillus thuri
ngiensis serovar japonensis strain Buibui)は、微工
研条寄第３４６５号（ＦＥＲＭ ＢＰ−３４６５）とし
て工業技術院微生物工業技術研究所に寄託されている。
また、本発明の新規微生物由来の殺虫剤は、バチルス・
チューリンゲンシス・セロバー・ヤポネンシス・ストレ
イン・ブイブイが産生する毒素タンパク質を有効成分と
して含有するものである。
バチルス・チューリンゲンシス・セロバー・ヤポネンシ
スに属し、甲虫目幼虫に対する殺虫性毒素タンパク質を
産生する能力を有するバチルス・チューリンゲンシス・
セロバー・ヤポネンシス・ストレイン・ブイブイに特徴
を有する。そして、本発明のバチルス・チューリンゲン
シス・セロバー・ヤポネンシス属に属する新規微生物の
１株であるバチルス・チューリンゲンシス・セロバー・
ヤポネンシス・ストレイン・ブイブイ（Bacillus thuri
ngiensis serovar japonensis strain Buibui)は、微工
研条寄第３４６５号（ＦＥＲＭ ＢＰ−３４６５）とし
て工業技術院微生物工業技術研究所に寄託されている。
また、本発明の新規微生物由来の殺虫剤は、バチルス・
チューリンゲンシス・セロバー・ヤポネンシス・ストレ
イン・ブイブイが産生する毒素タンパク質を有効成分と
して含有するものである。
【０００５】
１．各培地における生育状態 本菌は、通常のバクテリアの培養に用いる事の出来る殆
ど全ての培地に於いて生育が可能で、多少なりともトキ
シン蛋白を生産する事が出来る。図１、図２に示すごと
くＮＹＳ，Ｌ−ブロス、ブイヨン培地の代表的培地に於
いて通常の生育を示した。即ち数時間で細胞数は対数的
に増加し始め２４時間で増加は止まった。トキシンは細
胞数の増加にやや遅れ出現する。トキシン量は主バンド
１３０ｋＤａを計測すると、２００〜３０００μｇ／ｍ
ｌ培地である。適当な培地を探索することにより、Ｂｔ
菌に於いて到達している５０００μｇ／ｍｌの生産量も
可能である。 ２．形態学的性質 図３、図４に示すごとく、生じたコロニーは寒天培地上
で表面に光沢を持ち、盛り上がらず寒天表面に薄く広が
り周囲が凹凸（ラフ）の通常のバチルス菌の特徴を示
す。コロニーの色はうすいベージュである。走査顕微鏡
を用いて観察すると、図５、図６に示すようにバチルス
・チューリンゲンシス・セロバー・ヤポネンシス（以下
ヤポネンシス株と略称する）及びバチルス・チューリン
ゲンシス・セロバー・ヤポネンシス・ストレイン・ブイ
ブイ（以下ブイブイ株と略称する）は共に球形の結晶蛋
白が観察された。これらは鱗翅目幼虫に対して殺虫活性
を示す他のＢｔ菌によく見られるバイピラミッド型の結
晶と異なるものである。 ３．生化学的性状 本菌であるブイブイ株の生化学的性状を、従来のヤポネ
ンシス株と比較しながら次の各々の試験を行った。 （試験例１） 鞭毛抗原に由来する抗体を用いたセロタ
イピング バチルス属菌の持つ鞭毛の蛋白に対する抗体を用いて、
未知の菌の鞭毛タンパク質を抗原として抗原抗体反応を
利用し同定する用法である。ヤポネンシス株はセロタイ
ピングによって、Ｈ２３型に分類され既に公認されてい
る亜種である（J.Invertebr. Pathol. 32,303-309, 197
8; J.Invertebr. Pathol. 48129-130,1986）。これに対
し、ブイブイ株はヤポネンシス株のＨ抗原と反応する。
そして、これらの性質は、ヤポネンシス株と血清学的に
等しい。従って分類学上はヤポネンシス株と同亜種に属
する。以下に実験の詳細を示す。 （１）鞭毛Ｈ血清の調整 バチルス・チューリンゲンシスの既知の４０種類のＨ抗
原基準株を用いた。Ｃraigie管（０．５％半流動寒天培
地）を用いて運動性の良好な細菌を選択し、それを用い
てホルマリン死菌を作製し、これを家兎に免疫した。Ｈ
血清はそれぞれの抗血清から相応するバチルス・チュー
リンゲンシス菌体抗原に対する抗体を吸収して調整し
た。菌体抗原は１００度で加熱して鞭毛を剥離し調整し
た。 （２）Ｈ抗原の同定 Ｈ抗原の血清型は、のせガラス凝集反応（Ohba and, Ai
zawa, I. Invertebr.Pathol.,32,303-309,1978)によっ
て同定した。またＨ血清の凝集素価は試験管凝集反応
（Ohba and Aizawa, 1978)で定量した。 （３）結果 ヤポネンシス株は既知の４０種類の鞭毛の抗体のみ含む
標準血清の内Serovarjaponensis（Ｈ抗原２３）の基準
菌株に対する血清によってのみ特異的に凝集した。また
ブイブイ株に対するＨ血清は、ヤポネンシス株のみを特
異的に凝集した。ヤポネンシスＨ血清の相応するホモの
抗原に対する凝集素価は、１２，８００倍であり、ブイ
ブイ株に対する凝集素価は６，４００倍であった。ブイ
ブイ株Ｈ血清のホモに対する凝集素価は、１２，８００
倍であり、ヤポネンシス基準株に対する凝集素価は、
６，４００倍であった。従って、両菌株は同じ類と判断
される。 （試験例２） ヤポネンシス株及びブイブイ株の生産す
る結晶蛋白の殺虫スペクトル 表１に示したように、ブイブイ株の生産する殺虫性蛋白
は、甲虫目昆虫のドウガネブイブイ（Anomala cuprea H
ope ）に対して０．１２５〜１２．５μｇ／ｍｌの濃度
で殺虫効果を示したが、ヤポネンシス株の生産する殺虫
性蛋白は、１００μｇ／ｍｌの濃度でも殺虫活性を示さ
なかった。表２に示したように、ヤポネンシス株のもの
は、鱗翅目昆虫のうちコナガ（Plutella xylostella)、
チャノコカクモンハマキ（Adoxophyes sp.）及び、カイ
コ(Bombyx mori) の幼虫に高い活性を示すが、一方ブイ
ブイ株ものは、非常に低いか殆ど活性を示さなかった。
これらの結果は両者の結晶性タンパク質が異なる組成を
持っていることを示唆している。従って、両株は全く同
一の菌株とは言えないことが判る。
ど全ての培地に於いて生育が可能で、多少なりともトキ
シン蛋白を生産する事が出来る。図１、図２に示すごと
くＮＹＳ，Ｌ−ブロス、ブイヨン培地の代表的培地に於
いて通常の生育を示した。即ち数時間で細胞数は対数的
に増加し始め２４時間で増加は止まった。トキシンは細
胞数の増加にやや遅れ出現する。トキシン量は主バンド
１３０ｋＤａを計測すると、２００〜３０００μｇ／ｍ
ｌ培地である。適当な培地を探索することにより、Ｂｔ
菌に於いて到達している５０００μｇ／ｍｌの生産量も
可能である。 ２．形態学的性質 図３、図４に示すごとく、生じたコロニーは寒天培地上
で表面に光沢を持ち、盛り上がらず寒天表面に薄く広が
り周囲が凹凸（ラフ）の通常のバチルス菌の特徴を示
す。コロニーの色はうすいベージュである。走査顕微鏡
を用いて観察すると、図５、図６に示すようにバチルス
・チューリンゲンシス・セロバー・ヤポネンシス（以下
ヤポネンシス株と略称する）及びバチルス・チューリン
ゲンシス・セロバー・ヤポネンシス・ストレイン・ブイ
ブイ（以下ブイブイ株と略称する）は共に球形の結晶蛋
白が観察された。これらは鱗翅目幼虫に対して殺虫活性
を示す他のＢｔ菌によく見られるバイピラミッド型の結
晶と異なるものである。 ３．生化学的性状 本菌であるブイブイ株の生化学的性状を、従来のヤポネ
ンシス株と比較しながら次の各々の試験を行った。 （試験例１） 鞭毛抗原に由来する抗体を用いたセロタ
イピング バチルス属菌の持つ鞭毛の蛋白に対する抗体を用いて、
未知の菌の鞭毛タンパク質を抗原として抗原抗体反応を
利用し同定する用法である。ヤポネンシス株はセロタイ
ピングによって、Ｈ２３型に分類され既に公認されてい
る亜種である（J.Invertebr. Pathol. 32,303-309, 197
8; J.Invertebr. Pathol. 48129-130,1986）。これに対
し、ブイブイ株はヤポネンシス株のＨ抗原と反応する。
そして、これらの性質は、ヤポネンシス株と血清学的に
等しい。従って分類学上はヤポネンシス株と同亜種に属
する。以下に実験の詳細を示す。 （１）鞭毛Ｈ血清の調整 バチルス・チューリンゲンシスの既知の４０種類のＨ抗
原基準株を用いた。Ｃraigie管（０．５％半流動寒天培
地）を用いて運動性の良好な細菌を選択し、それを用い
てホルマリン死菌を作製し、これを家兎に免疫した。Ｈ
血清はそれぞれの抗血清から相応するバチルス・チュー
リンゲンシス菌体抗原に対する抗体を吸収して調整し
た。菌体抗原は１００度で加熱して鞭毛を剥離し調整し
た。 （２）Ｈ抗原の同定 Ｈ抗原の血清型は、のせガラス凝集反応（Ohba and, Ai
zawa, I. Invertebr.Pathol.,32,303-309,1978)によっ
て同定した。またＨ血清の凝集素価は試験管凝集反応
（Ohba and Aizawa, 1978)で定量した。 （３）結果 ヤポネンシス株は既知の４０種類の鞭毛の抗体のみ含む
標準血清の内Serovarjaponensis（Ｈ抗原２３）の基準
菌株に対する血清によってのみ特異的に凝集した。また
ブイブイ株に対するＨ血清は、ヤポネンシス株のみを特
異的に凝集した。ヤポネンシスＨ血清の相応するホモの
抗原に対する凝集素価は、１２，８００倍であり、ブイ
ブイ株に対する凝集素価は６，４００倍であった。ブイ
ブイ株Ｈ血清のホモに対する凝集素価は、１２，８００
倍であり、ヤポネンシス基準株に対する凝集素価は、
６，４００倍であった。従って、両菌株は同じ類と判断
される。 （試験例２） ヤポネンシス株及びブイブイ株の生産す
る結晶蛋白の殺虫スペクトル 表１に示したように、ブイブイ株の生産する殺虫性蛋白
は、甲虫目昆虫のドウガネブイブイ（Anomala cuprea H
ope ）に対して０．１２５〜１２．５μｇ／ｍｌの濃度
で殺虫効果を示したが、ヤポネンシス株の生産する殺虫
性蛋白は、１００μｇ／ｍｌの濃度でも殺虫活性を示さ
なかった。表２に示したように、ヤポネンシス株のもの
は、鱗翅目昆虫のうちコナガ（Plutella xylostella)、
チャノコカクモンハマキ（Adoxophyes sp.）及び、カイ
コ(Bombyx mori) の幼虫に高い活性を示すが、一方ブイ
ブイ株ものは、非常に低いか殆ど活性を示さなかった。
これらの結果は両者の結晶性タンパク質が異なる組成を
持っていることを示唆している。従って、両株は全く同
一の菌株とは言えないことが判る。
【０００６】
【表１】
【０００７】
【表２】
【０００８】（試験例３） ヤポネンシス株及びブイブ
イ株の細胞中に蓄積する殺虫性蛋白質の電気泳動 標記微生物は、ヤポネンシス株と同様に球状の結晶性タ
ンパク質を細胞内に生産する（図５、図６）。この結晶
性タンパク質を、常法（Goodman,N.S.,R.J.Gottfried a
nd M.H.Rogoff, J.Bacteriol. 94:485,1967)に従って培
養培地から単離して、精製後０．４Ｎアルカリ溶液で溶
解してナトリウムドデシル硫酸ポリアクリルアマイドゲ
ル電気泳動（ＳＤＳＰＡＧＥ）を行って分析した。図７
に示したようにヤポネンシス株の主バンドは約７６キロ
ダルトン（ｋＤａ）で、他に５２ｋＤａが認められた。
一方ブイブイ株の主バンドは１３０ｋＤａで他に５２ｋ
Ｄａ，４５ｋＤａが認められた。これらの電気泳動パタ
ーンは両結晶蛋白を構成している成分が異なることを明
瞭に示している。 （試験例４） ヤポネンシス株及びブイブイ株の培養に
於ける資化性の差異 表３に示したようにヤポネンシス株はグルコース、サリ
シン、マルトース、を資化し、マンノース、を資化でき
ず、セロビオースは多少資化した。ブイブイ株は上記全
ての化合物を資化することが出来た。以上述べた諸点
は、ブイブイ株がセロタイプにより分類学上ヤポネンシ
ス株に分類されるが、ヤポネンシス株とは明らかに異な
る菌であることを示している。
イ株の細胞中に蓄積する殺虫性蛋白質の電気泳動 標記微生物は、ヤポネンシス株と同様に球状の結晶性タ
ンパク質を細胞内に生産する（図５、図６）。この結晶
性タンパク質を、常法（Goodman,N.S.,R.J.Gottfried a
nd M.H.Rogoff, J.Bacteriol. 94:485,1967)に従って培
養培地から単離して、精製後０．４Ｎアルカリ溶液で溶
解してナトリウムドデシル硫酸ポリアクリルアマイドゲ
ル電気泳動（ＳＤＳＰＡＧＥ）を行って分析した。図７
に示したようにヤポネンシス株の主バンドは約７６キロ
ダルトン（ｋＤａ）で、他に５２ｋＤａが認められた。
一方ブイブイ株の主バンドは１３０ｋＤａで他に５２ｋ
Ｄａ，４５ｋＤａが認められた。これらの電気泳動パタ
ーンは両結晶蛋白を構成している成分が異なることを明
瞭に示している。 （試験例４） ヤポネンシス株及びブイブイ株の培養に
於ける資化性の差異 表３に示したようにヤポネンシス株はグルコース、サリ
シン、マルトース、を資化し、マンノース、を資化でき
ず、セロビオースは多少資化した。ブイブイ株は上記全
ての化合物を資化することが出来た。以上述べた諸点
は、ブイブイ株がセロタイプにより分類学上ヤポネンシ
ス株に分類されるが、ヤポネンシス株とは明らかに異な
る菌であることを示している。
【０００９】
【表３】
【００１０】（試験例５） 甲虫目昆虫ドウガネブイブ
イに対するブイブイ株の殺虫活性 ブイブイ株は、先にも述べたように、未だ報告されてい
ない非常に高い殺虫活性を、ドウガネブイブイ（A. cup
rea Hope) に対して示す。１〜３令のドウガネブイブイ
の幼虫を用いて、ブイブイ株の殺虫活性を調査した。活
性の評価は次のように行った。乾燥腐葉土２ｇに殺虫成
分を含んだ２ｍｌの水を加え、それをプラスチックカッ
プにいれ、一頭ずつ幼虫を入れて所定時間飼育した。前
記殺虫成分としては、ブイブイ株を培養した培養液（つ
まり菌体を含む液）と、培養液から結晶性毒素タンパク
質を単離して精製したものとを用い、夫々について殺虫
活性を調べた。尚、死亡率とは死亡幼虫数を全幼虫数で
除した値である。それによると、図８に示すように、前
記培養液から成る殺虫成分（トキシン）の量によって死
亡率が経時的にどの様に変化するかを示したが、０．１
２５μｇ／ｍｌの低いトキシンの投与量でも、１２．５
μｇ／ｍｌの高いトキシンの投与量でも１００％の死亡
率が得られるが、低濃度の場合、全供試虫が死亡するの
には倍の時間がかかることが判った。尚、図中のｃｏｎ
ｔｒｏｌとは、トキシンを含んでいない水のみを与えた
場合の変化を示すものである。また、前記単離精製した
結晶性蛋白から成る殺虫成分に関しては、表４に示した
ように結晶性蛋白単独で殺虫活性を示した。しかし結晶
０．１μｇ／ｍｌでは殺虫活性は検出できなかったが、
およそ０．１μｇ／ｍｌの１３０ｋＤａ蛋白質を含む前
記培養液を、ドウガネブイブイに与えた場合は、既に述
べたように（図８）ゆっくりであるが、１００％の致死
率を示した。これは結晶性タンパク質を精製する過程
で、タンパク質の変性などにより活性が失われるためで
はなく、菌体中に存在する胞子がドウガネブイブイ中で
結晶性タンパク質と協同してより高い活性を示すのでは
ないかと思われる。従って殺虫製剤としては菌体を含ん
でもよい。
イに対するブイブイ株の殺虫活性 ブイブイ株は、先にも述べたように、未だ報告されてい
ない非常に高い殺虫活性を、ドウガネブイブイ（A. cup
rea Hope) に対して示す。１〜３令のドウガネブイブイ
の幼虫を用いて、ブイブイ株の殺虫活性を調査した。活
性の評価は次のように行った。乾燥腐葉土２ｇに殺虫成
分を含んだ２ｍｌの水を加え、それをプラスチックカッ
プにいれ、一頭ずつ幼虫を入れて所定時間飼育した。前
記殺虫成分としては、ブイブイ株を培養した培養液（つ
まり菌体を含む液）と、培養液から結晶性毒素タンパク
質を単離して精製したものとを用い、夫々について殺虫
活性を調べた。尚、死亡率とは死亡幼虫数を全幼虫数で
除した値である。それによると、図８に示すように、前
記培養液から成る殺虫成分（トキシン）の量によって死
亡率が経時的にどの様に変化するかを示したが、０．１
２５μｇ／ｍｌの低いトキシンの投与量でも、１２．５
μｇ／ｍｌの高いトキシンの投与量でも１００％の死亡
率が得られるが、低濃度の場合、全供試虫が死亡するの
には倍の時間がかかることが判った。尚、図中のｃｏｎ
ｔｒｏｌとは、トキシンを含んでいない水のみを与えた
場合の変化を示すものである。また、前記単離精製した
結晶性蛋白から成る殺虫成分に関しては、表４に示した
ように結晶性蛋白単独で殺虫活性を示した。しかし結晶
０．１μｇ／ｍｌでは殺虫活性は検出できなかったが、
およそ０．１μｇ／ｍｌの１３０ｋＤａ蛋白質を含む前
記培養液を、ドウガネブイブイに与えた場合は、既に述
べたように（図８）ゆっくりであるが、１００％の致死
率を示した。これは結晶性タンパク質を精製する過程
で、タンパク質の変性などにより活性が失われるためで
はなく、菌体中に存在する胞子がドウガネブイブイ中で
結晶性タンパク質と協同してより高い活性を示すのでは
ないかと思われる。従って殺虫製剤としては菌体を含ん
でもよい。
【００１１】
【表４】
【００１２】（試験例６） ブイブイ株の他の甲虫目昆
虫の幼虫に対する殺虫効果 表５に示したようにブイブイ株はドウガネブイブイ以外
にもヒメコガネ（Anomala rufocuprea Motschulsky),
チビサクラコガネ（Anomala schoenfeldti Ohaus) に対
しても高い殺虫活性を示した。従って他のいくつかのコ
ガネムシの幼虫に対して殺虫効果を示す事が期待でき
る。従って殺虫剤の対象はこれら３種類の甲虫目幼虫に
限定されるものではない。
虫の幼虫に対する殺虫効果 表５に示したようにブイブイ株はドウガネブイブイ以外
にもヒメコガネ（Anomala rufocuprea Motschulsky),
チビサクラコガネ（Anomala schoenfeldti Ohaus) に対
しても高い殺虫活性を示した。従って他のいくつかのコ
ガネムシの幼虫に対して殺虫効果を示す事が期待でき
る。従って殺虫剤の対象はこれら３種類の甲虫目幼虫に
限定されるものではない。
【００１３】
【表５】
【００１４】尚、ヒメコガネの３令幼虫以外は１令を用
いた。結晶はＮＹＳで培養した菌体から精製し、供試頭
数は１０である。上記コントロールとは、トキシンを与
えないで水だけを与えた場合の結果（比較実験）を示す
ものである。
いた。結晶はＮＹＳで培養した菌体から精製し、供試頭
数は１０である。上記コントロールとは、トキシンを与
えないで水だけを与えた場合の結果（比較実験）を示す
ものである。
【００１５】（試験例７） 他の甲虫目昆虫に対する殺
虫効果 甲虫目アオドウガネ（Anomala albopilosa）の１令幼
虫、サクラコガネ（Anomala daimiana）の１令幼虫、コ
ガネムシ（Minela splendens）の１令幼虫、マメコガネ
（Popillia japonica ）の１令幼虫、セマダラコガネ
（Blitopertha orientalis）の２令幼虫を用いてブイブ
イ株の各幼虫に対する殺虫活性を調査した。各供試虫は
野外より成虫を採集し、市販の腐葉土にて一時飼育し産
卵させた卵より発生した幼虫の若い令のものを用いた。
試験方法は１６０℃、６０分ドライオーブンで乾熱滅菌
した腐葉土を１グラム、容量約３０ｍｌの蓋付きプラス
チックカップに秤量し、そこに所定の濃度のブイブイ培
養物を混入して、充分攪拌して幼虫を１頭いれたものを
複数用意し、これらを２５℃恒温室で飼育し、７、１
４、２１日後の死亡率を調査してブイブイの力価の検定
を行う方法とした。 〔試験結果〕
虫効果 甲虫目アオドウガネ（Anomala albopilosa）の１令幼
虫、サクラコガネ（Anomala daimiana）の１令幼虫、コ
ガネムシ（Minela splendens）の１令幼虫、マメコガネ
（Popillia japonica ）の１令幼虫、セマダラコガネ
（Blitopertha orientalis）の２令幼虫を用いてブイブ
イ株の各幼虫に対する殺虫活性を調査した。各供試虫は
野外より成虫を採集し、市販の腐葉土にて一時飼育し産
卵させた卵より発生した幼虫の若い令のものを用いた。
試験方法は１６０℃、６０分ドライオーブンで乾熱滅菌
した腐葉土を１グラム、容量約３０ｍｌの蓋付きプラス
チックカップに秤量し、そこに所定の濃度のブイブイ培
養物を混入して、充分攪拌して幼虫を１頭いれたものを
複数用意し、これらを２５℃恒温室で飼育し、７、１
４、２１日後の死亡率を調査してブイブイの力価の検定
を行う方法とした。 〔試験結果〕
【００１６】
【表６】
【００１７】サクラコガネ、セマダラコガネの供試虫数
はそれぞれ８頭及び５頭であるが、他はすべて１０頭で
ある。
はそれぞれ８頭及び５頭であるが、他はすべて１０頭で
ある。
【００１８】〔結論〕以上示したように、ブイブイ株は
アオドウガネ、サクラコガネ、コガネムシ、マメコガ
ネ、セマダラコガネに対して殺虫活性を示した。サクラ
コガネの場合２１日後での死亡率は他の昆虫幼虫に比較
して７０％と、まだ低いが、体重の増加が全く見られ
ず、この後死亡していくことは明らかである。従って多
少の効果の遅延が観察されるものの、摂食の停止、死亡
という効果は全く同等と判断できる。特にJapanese bee
tle と称してアメリカ合衆国で大問題となっているマメ
コガネに対する殺虫特性は特に重要である。以上いくつ
かの甲虫目に対する活性を特定したが、Anomala 属以外
にもPopillia, Minela,Blitopertha属にも対象が見出さ
れた事は、この菌の対象害虫が表５、表６に示した種の
みに限定されるものでなくAnomala,Popillia,Minela,Bl
ithopertha属で上記以外のもの、或いは広く上記以外の
属の甲虫目昆虫にも及ぶことを示唆している。 （試験例８） ベーターエキソトシンの活性 バチルス属の菌の中には、培地中にヌクレオチドの誘導
体であるベーターエキソトキシンを分泌する菌株もあ
る。これはトキシン蛋白と同様に殺虫効果を有するもの
である。ベーターエキソトキシンはイエバエの幼虫に対
して催奇作用を示し、それを以ってベーターエキソトキ
シン活性の評価をしている。ところが、表７に示すよう
に、常法に従ってブイブイ株の培地から培養上清を調整
してイエバエに与えても、蛹化率羽化率ともに影響され
ず、ブイブイ株の催奇性は示されなかった。前記のブイ
ブイ株の処理培地を、ドウガネブイブイに与えたとこ
ろ、表８に示すように１４日を経過しても幼虫は死なな
かった。この実験結果はドウガネブイブイに対するブイ
ブイ株の殺虫効果はベーターエキソトキシンに由来する
ものでないことを示している。つまり、ベーターエキソ
トキシンは、前記の実験結果に影響を及ぼすほどには存
在しないことが判る。
アオドウガネ、サクラコガネ、コガネムシ、マメコガ
ネ、セマダラコガネに対して殺虫活性を示した。サクラ
コガネの場合２１日後での死亡率は他の昆虫幼虫に比較
して７０％と、まだ低いが、体重の増加が全く見られ
ず、この後死亡していくことは明らかである。従って多
少の効果の遅延が観察されるものの、摂食の停止、死亡
という効果は全く同等と判断できる。特にJapanese bee
tle と称してアメリカ合衆国で大問題となっているマメ
コガネに対する殺虫特性は特に重要である。以上いくつ
かの甲虫目に対する活性を特定したが、Anomala 属以外
にもPopillia, Minela,Blitopertha属にも対象が見出さ
れた事は、この菌の対象害虫が表５、表６に示した種の
みに限定されるものでなくAnomala,Popillia,Minela,Bl
ithopertha属で上記以外のもの、或いは広く上記以外の
属の甲虫目昆虫にも及ぶことを示唆している。 （試験例８） ベーターエキソトシンの活性 バチルス属の菌の中には、培地中にヌクレオチドの誘導
体であるベーターエキソトキシンを分泌する菌株もあ
る。これはトキシン蛋白と同様に殺虫効果を有するもの
である。ベーターエキソトキシンはイエバエの幼虫に対
して催奇作用を示し、それを以ってベーターエキソトキ
シン活性の評価をしている。ところが、表７に示すよう
に、常法に従ってブイブイ株の培地から培養上清を調整
してイエバエに与えても、蛹化率羽化率ともに影響され
ず、ブイブイ株の催奇性は示されなかった。前記のブイ
ブイ株の処理培地を、ドウガネブイブイに与えたとこ
ろ、表８に示すように１４日を経過しても幼虫は死なな
かった。この実験結果はドウガネブイブイに対するブイ
ブイ株の殺虫効果はベーターエキソトキシンに由来する
ものでないことを示している。つまり、ベーターエキソ
トキシンは、前記の実験結果に影響を及ぼすほどには存
在しないことが判る。
【００１９】
【表７】
【００２０】
【表８】
【００２１】（尚、上記ブイブイ培地とは、培地から菌
株を遠心分離により除去した残りの培地を示す。）
株を遠心分離により除去した残りの培地を示す。）
【００２２】
【発明の効果】本発明の微生物の有効性は、これを培養
することによって、従来のヤポネンシス株にはない甲虫
目昆虫の幼虫に対する殺虫活性を示す結晶性タンパク質
を生産し、その生産した結晶性の毒素タンパク質を有効
成分として含有する新規な微生物由来で、甲虫目幼虫に
選択的に活性を示す殺虫剤を製剤することで、化学的に
生産した殺虫剤よりも安全性が高く安価なものとなる。
することによって、従来のヤポネンシス株にはない甲虫
目昆虫の幼虫に対する殺虫活性を示す結晶性タンパク質
を生産し、その生産した結晶性の毒素タンパク質を有効
成分として含有する新規な微生物由来で、甲虫目幼虫に
選択的に活性を示す殺虫剤を製剤することで、化学的に
生産した殺虫剤よりも安全性が高く安価なものとなる。
【００２３】
【実施例】ブイブイ株は、Ｌ−ブロスやヌートリエント
ブロス等の普通に細菌の培養に用いられる培地で容易に
成育し、胞子、結晶蛋白を生産するが、ブイブイ株を培
養して結晶タンパク質を含む殺虫成分を生産する上で、
生産性の高い培地の検討を行った。先ず、９ｃｍシャー
レの寒天培地に胞子３．３×１０5 個を接種して、１０
日後に生産された結晶性タンパク質を顕微鏡観察した。
その結果、次のようにＬ−ブロスにＭｎＳＯ4 （１０-3
Ｍ）を添加した培地が最も生産がよく、以下の次のよう
な順序であった。 Ｌ−ブロス＋ＭｎＳＯ4 ＞スピチーゼン＋アミノ酸＞Ｌ
−ブロス＞ＰＧＳＭ＞スピチーゼン＋カザミノ酸＋ビタ
ミン＞スピチーゼン＋カザミノ酸＞ＮＹＳ＞ＮＹＳ＋カ
ザミノ酸 尚、各培地は以下のような組成を持っている。 Ｌ−ブロス：各成分含量は１リットル当たり、トリプト
ース１０ｇ、酵母抽出物５ｇ、食塩５ｇで、ｐＨ＝７．
１８〜７．２である。 スピチーゼン：各成分含量は１リットル当たり、燐酸１
水素カリウム１４ｇ、燐酸２水素カリウム６ｇ、硫安２
ｇ、硫酸マグネシウム７Ｈ2Ｏ０．２ｇ、クエン酸ナト
リウム１ｇ、グルコース５ｇで、ｐＨ＝７．０である。 ＮＹＳ：各成分含量は１リットル当たり、ヌートリエン
トブロス１．２５ｇ、トリプトン１．２５ｇ、酵母抽出
物０．５ｇ、塩化カルシウム２Ｈ2Ｏ１０．３ｇ、塩化
マグネシウム６Ｈ2Ｏ２０．３５ｇ、塩化マンガン４Ｈ2
Ｏ１．０ｇ、硫酸鉄７Ｈ2Ｏ０．０２ｇ、硫酸亜鉛７Ｈ2
Ｏ０．０２ｇで、ｐＨ＝７．２である。 ＮＹＳ＋カザミノ酸：上記ＮＹＳ培地にカザミノ酸２．
０ｇを加えた培地。ｐＨ＝７．２ 次に、本菌が生産する殺虫性結晶蛋白を用いた甲虫目昆
虫の幼虫に対する殺虫剤を製剤するにあたっては、本微
生物を前述した種々の培地、あるいは魚粉、大豆粉等の
固形培地を用いた培地、コーンシロップ、コンスティー
プなどの澱粉工業、製糖過程の廃棄物などを用いて培養
し、この様な様々な方法で培養した菌体を、濃縮してク
リーム状の物とし、これを水などに適当に希釈して散布
するための殺虫剤にする。前記クリーム状の物には常法
に従って防腐剤、増量剤などを混ぜてもよく、あるい
は、この後にスプレイドライヤーを用いて粉態にするこ
ともできる。以上のような方法はトキシンタンパク質を
生産している細胞そのものを用いて行うが、細胞が自己
分解を起こすまで培養して結晶性のタンパク質のみを用
いることもできる。結晶体の濃縮は遠心分離でも、膜を
用いても行うことができる。この様に造られた製剤は当
該菌が胞子を生産するために生菌製剤として用いること
になる。本菌が生産する毒素蛋白は蚕に対する毒性を示
さず、従って胞子を持った生菌製剤として用いても養蚕
に対する打撃は全く無い生菌製剤である。また、適当な
化合物を用いて、胞子を殺し死菌製剤として用いること
も出来る。上記製剤を散布する方法に関して説明する
と、対象とする甲虫目昆虫の幼虫は通常土壌中に生息し
ており、そのために、当該菌を有効成分とする殺虫剤
は、土壌中に散布するか、もしくは腐葉土などと共に散
布して直後に耕うん機などで鋤込むことが出来、また、
直接散布して鋤込むこともできる。更に自動または手動
の注射器様の器具を用いて、上記殺虫剤の懸濁液を、直
接土壌中に注入することもでき、そのために、耕うん機
等に全自動の注入器を設置してもよい。尚、前記ブイブ
イ株が生産するトキシンタンパク質は、そのタンパク質
をコードする遺伝子を使って遺伝子工学的に造り出すこ
ともできる。
ブロス等の普通に細菌の培養に用いられる培地で容易に
成育し、胞子、結晶蛋白を生産するが、ブイブイ株を培
養して結晶タンパク質を含む殺虫成分を生産する上で、
生産性の高い培地の検討を行った。先ず、９ｃｍシャー
レの寒天培地に胞子３．３×１０5 個を接種して、１０
日後に生産された結晶性タンパク質を顕微鏡観察した。
その結果、次のようにＬ−ブロスにＭｎＳＯ4 （１０-3
Ｍ）を添加した培地が最も生産がよく、以下の次のよう
な順序であった。 Ｌ−ブロス＋ＭｎＳＯ4 ＞スピチーゼン＋アミノ酸＞Ｌ
−ブロス＞ＰＧＳＭ＞スピチーゼン＋カザミノ酸＋ビタ
ミン＞スピチーゼン＋カザミノ酸＞ＮＹＳ＞ＮＹＳ＋カ
ザミノ酸 尚、各培地は以下のような組成を持っている。 Ｌ−ブロス：各成分含量は１リットル当たり、トリプト
ース１０ｇ、酵母抽出物５ｇ、食塩５ｇで、ｐＨ＝７．
１８〜７．２である。 スピチーゼン：各成分含量は１リットル当たり、燐酸１
水素カリウム１４ｇ、燐酸２水素カリウム６ｇ、硫安２
ｇ、硫酸マグネシウム７Ｈ2Ｏ０．２ｇ、クエン酸ナト
リウム１ｇ、グルコース５ｇで、ｐＨ＝７．０である。 ＮＹＳ：各成分含量は１リットル当たり、ヌートリエン
トブロス１．２５ｇ、トリプトン１．２５ｇ、酵母抽出
物０．５ｇ、塩化カルシウム２Ｈ2Ｏ１０．３ｇ、塩化
マグネシウム６Ｈ2Ｏ２０．３５ｇ、塩化マンガン４Ｈ2
Ｏ１．０ｇ、硫酸鉄７Ｈ2Ｏ０．０２ｇ、硫酸亜鉛７Ｈ2
Ｏ０．０２ｇで、ｐＨ＝７．２である。 ＮＹＳ＋カザミノ酸：上記ＮＹＳ培地にカザミノ酸２．
０ｇを加えた培地。ｐＨ＝７．２ 次に、本菌が生産する殺虫性結晶蛋白を用いた甲虫目昆
虫の幼虫に対する殺虫剤を製剤するにあたっては、本微
生物を前述した種々の培地、あるいは魚粉、大豆粉等の
固形培地を用いた培地、コーンシロップ、コンスティー
プなどの澱粉工業、製糖過程の廃棄物などを用いて培養
し、この様な様々な方法で培養した菌体を、濃縮してク
リーム状の物とし、これを水などに適当に希釈して散布
するための殺虫剤にする。前記クリーム状の物には常法
に従って防腐剤、増量剤などを混ぜてもよく、あるい
は、この後にスプレイドライヤーを用いて粉態にするこ
ともできる。以上のような方法はトキシンタンパク質を
生産している細胞そのものを用いて行うが、細胞が自己
分解を起こすまで培養して結晶性のタンパク質のみを用
いることもできる。結晶体の濃縮は遠心分離でも、膜を
用いても行うことができる。この様に造られた製剤は当
該菌が胞子を生産するために生菌製剤として用いること
になる。本菌が生産する毒素蛋白は蚕に対する毒性を示
さず、従って胞子を持った生菌製剤として用いても養蚕
に対する打撃は全く無い生菌製剤である。また、適当な
化合物を用いて、胞子を殺し死菌製剤として用いること
も出来る。上記製剤を散布する方法に関して説明する
と、対象とする甲虫目昆虫の幼虫は通常土壌中に生息し
ており、そのために、当該菌を有効成分とする殺虫剤
は、土壌中に散布するか、もしくは腐葉土などと共に散
布して直後に耕うん機などで鋤込むことが出来、また、
直接散布して鋤込むこともできる。更に自動または手動
の注射器様の器具を用いて、上記殺虫剤の懸濁液を、直
接土壌中に注入することもでき、そのために、耕うん機
等に全自動の注入器を設置してもよい。尚、前記ブイブ
イ株が生産するトキシンタンパク質は、そのタンパク質
をコードする遺伝子を使って遺伝子工学的に造り出すこ
ともできる。
【図１】ブイブイ株の成長曲線を示すグラフ
【図２】ブイブイ株の成長曲線を示すグラフ
【図３】ＬＢ培地でのブイブイ株のコロニーを示す写真
【図４】各培地におけるブイブイ株のコロニーを示す写
真
真
【図５】ヤポネンシス株の走査型電子顕微鏡写真
【図６】ブイブイ株の走査型電子顕微鏡写真
【図７】ナトリウムドデシル硫酸ポリアクリルアマイド
ゲル電気泳動を示す写真
ゲル電気泳動を示す写真
【図８】ドウガネブイブイ幼虫の経時的死亡曲線を示す
グラフ
グラフ
─────────────────────────────────────────────────────
【手続補正書】
【提出日】平成４年２月５日
【手続補正１】
【補正対象書類名】図面
【補正対象項目名】全図
【補正方法】変更
【補正内容】
【図１】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図７】
【図６】
【図８】 ─────────────────────────────────────────────────────
【手続補正書】
【提出日】平成４年１０月２９日
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】図面の簡単な説明
【補正方法】変更
【補正内容】
【図面の簡単な説明】
【図１】ブイブイ株の成長曲線を示すグラフ
【図２】ブイブイ株の成長曲線を示すグラフ
【図３】生物の形態を示す写真
【図４】生物の形態を示す写真
【図５】生物の形態を示す走査型電子顕微鏡写真
【図６】生物の形態を示す走査型電子顕微鏡写真
【図７】電気泳動を示す写真
【図８】ドウガネブイブイ幼虫の経時的死亡曲線を示す
グラフ
グラフ
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.6 識別記号 庁内整理番号 ＦＩ 技術表示箇所 (Ｃ１２Ｎ 1/20 Ｃ１２Ｒ 1:07） (Ｃ１２Ｐ 21/00 Ｃ１２Ｒ 1:07） (72)発明者 鈴木 伸和 茨城県竜ヶ崎市向陽台５―６ 株式会社ク ボタ技術開発研究所つくば研究室内 (72)発明者 荻原 克俊 茨城県竜ヶ崎市向陽台５―６ 株式会社ク ボタ技術開発研究所つくば研究室内 (72)発明者 坂中 一敦 茨城県竜ヶ崎市向陽台５―６ 株式会社ク ボタ技術開発研究所つくば研究室内 (72)発明者 堀 秀隆 茨城県竜ヶ崎市向陽台５―６ 株式会社ク ボタ技術開発研究所つくば研究室内 (72)発明者 浅野 昌司 茨城県竜ヶ崎市向陽台５―６ 株式会社ク ボタ技術開発研究所つくば研究室内 (72)発明者 河杉 忠昭 茨城県竜ヶ崎市向陽台５―６ 株式会社ク ボタ技術開発研究所つくば研究室内
Claims (2)
- 【請求項１】 バチルス・チューリンゲンシス・セロバ
ー・ヤポネンシスに属し、甲虫目昆虫の幼虫に対する殺
虫性毒素タンパク質を産生する能力を有するバチルス・
チューリンゲンシス・セロバー・ヤポネンシス・ストレ
イン・ブイブイ（微工研条寄第３４６５号）。 - 【請求項２】 バチルス・チューリンゲンシス・セロバ
ー・ヤポネンシス・ストレイン・ブイブイが産生する毒
素タンパク質を有効成分として含有する殺虫剤。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP4019307A JP2842578B2 (ja) | 1991-08-02 | 1992-02-05 | 新規微生物及び殺虫剤 |
Applications Claiming Priority (3)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP3-193810 | 1991-08-02 | ||
| JP19381091 | 1991-08-02 | ||
| JP4019307A JP2842578B2 (ja) | 1991-08-02 | 1992-02-05 | 新規微生物及び殺虫剤 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH07179A true JPH07179A (ja) | 1995-01-06 |
| JP2842578B2 JP2842578B2 (ja) | 1999-01-06 |
Family
ID=26356142
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP4019307A Expired - Fee Related JP2842578B2 (ja) | 1991-08-02 | 1992-02-05 | 新規微生物及び殺虫剤 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JP2842578B2 (ja) |
Cited By (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US6962977B2 (en) | 2000-08-03 | 2005-11-08 | Sds Biotech K.K. | Protein having pesticidal activity, DNA encoding the protein, and noxious organism-controlling agent and method |
| CN106905420A (zh) * | 2017-04-06 | 2017-06-30 | 中国农业科学院植物保护研究所 | 一种新的杀虫蛋白及其核苷酸序列 |
-
1992
- 1992-02-05 JP JP4019307A patent/JP2842578B2/ja not_active Expired - Fee Related
Cited By (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US6962977B2 (en) | 2000-08-03 | 2005-11-08 | Sds Biotech K.K. | Protein having pesticidal activity, DNA encoding the protein, and noxious organism-controlling agent and method |
| CN106905420A (zh) * | 2017-04-06 | 2017-06-30 | 中国农业科学院植物保护研究所 | 一种新的杀虫蛋白及其核苷酸序列 |
| CN106905420B (zh) * | 2017-04-06 | 2020-11-24 | 中国农业科学院植物保护研究所 | 一种新的杀虫蛋白及其核苷酸序列 |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| JP2842578B2 (ja) | 1999-01-06 |
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